EA018012B1 - Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации - Google Patents

Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации Download PDF

Info

Publication number
EA018012B1
EA018012B1 EA200971119A EA200971119A EA018012B1 EA 018012 B1 EA018012 B1 EA 018012B1 EA 200971119 A EA200971119 A EA 200971119A EA 200971119 A EA200971119 A EA 200971119A EA 018012 B1 EA018012 B1 EA 018012B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleotide
sequence
foreign dna
nucleotide sequence
adjacent
Prior art date
Application number
EA200971119A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200971119A1 (ru
Inventor
Линда Тролиндер
Софи Мунс
Верле Хабекс
Димитри Палинк
Эвелин Бергхман
Original Assignee
Байер Кропсайенс Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байер Кропсайенс Н.В. filed Critical Байер Кропсайенс Н.В.
Publication of EA200971119A1 publication Critical patent/EA200971119A1/ru
Publication of EA018012B1 publication Critical patent/EA018012B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Изобретение предоставляет специфические трансгенные хлопчатники, растительный материал и семена, характеризующиеся тем, что эти продукты несут специфический результат трансформации в специфическом положении в геноме хлопка. Также предоставлены способы, которые позволяют быструю и несомненную идентификацию результата в биологических образцах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Это изобретение относится к трансгенным растениям хлопчатника, растительным материалам и семенам, характеризующимся носительством особого результата трансформации, в особенности наличием гена, кодирующего белок, который придает устойчивость к насекомым, в определенном месте генома хлопка. Растения хлопчатника по изобретению сочетают устойчивость к насекомым с агрономическим преимуществом, генетической стабильностью и адаптивностью к различным генетическим средам, эквивалентным нетрансформированным линиям хлопчатника в отсутствие насекомых. Это изобретение дополнительно предоставляет способы и наборы для идентификации наличия растительного материала, включающего особенно результат трансформации ЕЕ-ОН6 в биологических образцах.
Уровень техники
Фенотипическая экспрессия трансгена в растении определяется как структурой самого гена, так и его расположением в геноме растения. В то же время наличие трансгена (в виде чужеродной ДНК) в различных местоположениях в геноме будет влиять на весь фенотип растения различными путями. Агрономически или производственно успешное введение коммерчески интересной характеристики в растения с помощью генетической манипуляции может быть длительной процедурой в зависимости от различных факторов. Фактическая трансформация и регенерация генетически трансформированных растений является лишь первым в последовательности селекционных шагов, которые включают обширную генетическую характеризацию, скрещивание и оценку в полевых испытаниях, с течением времени приводящие к селекции элитного результата.
Хлопковое волокно является наиболее важным текстильным сырьем во всем мире. Примерно 32 миллиона гектаров хлопка возделывается ежегодно в мире. Хлопок является пятой по величине сельскохозяйственной культурой в США в соответствии с посевной площадью, с более чем 6 миллионами гектаров, возделанных в 2000 году.
Наиболее вредными видами насекомых, питающихся хлопчатником, являются Нейсоуегра хеа (совка хлопковая или коробочный червь), НеНсоуетра агш1дега (американский коробочный червь), Не1ю11п5 У1ге8сеи8 (табачная листовертка) апб Нейсоуетра рипсбдета.
Целенаправленная идентификация элитного результата становится все более важной в свете обсуждения новых продуктов/пищи, разделения ГМО и не-ГМО продуктов и идентификации патентных материалов. В идеале, такой идентификационный способ является как простым, так и быстрым, без необходимости в пространных лабораторных исследованиях. Более того, способ должен предоставлять результаты, которые позволяют целенаправленную идентификацию элитного результата без интерпретации экперта, но выдерживают экспертную оценку в случае необходимости. Здесь описываются определенные способы для использования в идентификации элитного результата ЕЕ-ОН6 в биологических образцах.
ЕЕ-ОН6 был идентифицирован как элитный результат из популяции трансгенных растений хлопчатника при выведении устойчивого к насекомым хлопка (Ооккуршт Ыг8и1ит), содержащего ген, кодирующий инсектицидный кристаллический белок из ВасШик бшппщещБ. Трансгенные растения хлопчатника содержат химерный ген, кодирующий В1 инсектицидный кристаллический белок (как описано в \УО02/057664) под контролем растительного промотера.
Растения хлопчатника, содержащие ген устойчивости к насекомым, были описаны в области техники. Однако, ни одно из описаний в области техники не обучает или рекомендует настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к трансгенному растению хлопчатника или его семенам, клеткам или тканям, включая стабильно интегрированную в их геном экспрессионную кассету, которая содержит ген устойчивости к насекомым, содержащий кодирующую последовательность гена сгу2Ае (как описано здесь в примере 1.1), который устойчив к насекомым и, в отсутствие давления насекомых, имеет агрономические параметры в значительной степени эквивалентные нетрансгенной изогенной линии. Под давлением насекомых, растение будет иметь превосходящий агрономический фенотип по сравнению с нетрансгенным растением.
В соответствии с настоящим изобретением растение хлопчатника или его семена, клетки или ткани содержат элитный результат ЕЕ-ОН6.
Точнее говоря, настоящее изобретение относится к трансгенному растению хлопчатника, его семенам, клеткам или тканям, геномная ДНК которого характеризуется тем, что при анализе по ПЦР идентификационному протоколу, который описан здесь, с использованием двух праймеров, направленных на 5'или З'-прилегающие области ЕЕ-ОН6 и чужеродной ДНК, соответственно, дает фрагмент, специфический для ЕЕ-ОН6. Праймеры могут быть направлены на 5'-прилегающую область в последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 или БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 и чужеродную ДНК соответственно, как праймеры включающие или состоящие из нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 5 и БЕЦ ΙΌ Ыо. 7 соответственно, и дающие фрагмент ДНК между 100 и 700 пн, преимущественно 197 пн. Праймеры также могут быть направлены на З'-прилегающую область в последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 и чужеродную ДНК соответственно, как праймеры содержащие или состоящие из нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 4 и БЕЦ ΙΌ Ыо. 3 соответственно, и давать фрагмент ДНК между 100 и 700 пн, преимущественно около 189 пн.
Эталонные семена, содержащие элитный результат по изобретению, были помещены в АТСС под
- 1 018012 номером РТА-8398. Один вариант осуществления настоящего изобретения является семенами, содержащими элитный результат ЕЕ-ОН6, размещенными как АТСС номер РТА-8398, которые вырастут в растение хлопчатника, устойчивое к насекомым, особенно Нсйеоусгра 8р. или Не1ю1Ы8 ер. Семена с АТСС номером РТА-8398, являются партией семян, состоящей по крайней мере из 95% трансгенных семян, гомозиготных по трансгену, содержащих элитный результат по изобретению, которые вырастут в устойчивые к насекомым растения, также толерантные к глюфозинату. Семена могут быть высеяны и растущие растения обработаны глюфозинатом, как описано здесь для получения 100% устойчивых к глюфозинату растений, содержащих элитный результат по изобретению. Изобретение далее относится к клеткам, тканям, потомкам и потомству от растений, содержащих элитный результат по изобретению, выросших из семян, размещенных в АТСС с номером РТА-8398. Изобретение также относится к растениям, которые могут быть получены размножением и/или скрещиванием с растениями хлопчатника, содержащими элитный результат по изобретению, выращенными из семян, помещенных в АТСС под номером РТА-8398. Изобретение также относится к растениям хлопчатника, содержащим элитный результат ЕЕОН6.
Изобретение также относится к способу идентификации трансгенных растений, или их клеток или тканей, содержащих элитный результат ЕЕ-ОН6, который является способом, основанным на идентификации наличия характеризующих последовательностей ДНК или аминокислот, кодируемых таковой последовательностью ДНК, в трансгенных растениях, клетках или тканях. В соответствии с предпочтительным вариатом осуществления изобретения, такие характеризующие последовательности ДНК являются последовательностями длиной 15 пн, предпочтительно 20 пн, наиболее предпочтительно 30 пн или более, которые содержат сайт вставки трансгена, то есть часть чужеродной ДНК и часть генома хлопчатника (5'- или 3'-прилегающую область) непосредственно прилегающие друг к другу, что позволяет специфическую идентификацию элитного результата.
Настоящее изобретение также относится к способам идентификации элитного результата ЕЕ-ОН6 в биологических образцах, эти способы основаны на праймерах или зондах, которые специфически распознают 5'- и/или 3'-прилегающие области ЕЕ-ОН6.
Более определенно, изобретение относится к способу, состоящему из амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в биологических образцах, с использованием полимеразной цепной реакции с по крайней мере двумя праймерами, один из которых распознает 5'- и/или 3'прилегающую область ЕЕ-ОН6, а другой распознает последовательность внутри чужеродной ДНК так, чтобы получить фрагмент преимущественно 100-500 пн. Праймеры могут распознавать последовательность внутри 5'-прилегающей области ЕЕ-ОН6 (БЕО ΙΌ Νο. 1, от позиции 1 до позиции 140 или БЕО ΙΌ Νο. 11 от позиции 1 до позиции 463) или внутри 3'-прилегающей области ЕЕ-ОН6 (фрагмент БЕО ΙΌ Νο. 2 от позиции 113 до позиции 438) и последовательность внутри чужеродной ДНК (фрагмент БЕО ΙΌ Νο. 1 от позиции 141 до 192 или БЕО ΙΌ Νο. 2 от позиции 1 до позиции 112), соответственно. Праймер, распознающий 5'-прилегающую область может содержать нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 7 и праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК может содержать нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 5, описанные здесь. Праймер, распознающий 3'-прилегающую область может включать нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 3 или БЕО ΙΌ Νο. 6, и праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК может содержать нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 4, описанную здесь.
Настоящее изобретение более определенно относится к способу идентификации элитного результата ЕЕ-ОН6 в биологических образцах, этот метод заключается в амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце, с применением полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, имеющими нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 3 и -БЕО ΙΌ Νο. 4 соответственно, для получения фрагмента ДНК примерно 189 пн, или с двумя праймерами, имеющими нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 5 или БЕО ΙΌ Νο. 7 соответственно, для получения фрагмента примерно 197 пн.
Настоящее изобретение таже относится к специфическим прилегающим последовательностям ЕЕОН6, описанным здесь, которые могут быть использованы для разработки специфических способов идентификации для ЕЕ-ОН6 в биологических образцах. Такие специфические прилегающие области могут быть также использованы как материал контроля сравнения в идентификационном анализе. Более конкретно, изобретение относится к 5'- и 3'-прилегающим областям ЕЕ-ОН6, которые могут быть использованы для разработки специфических праймеров и зондов, как далее описывается здесь. Также подходят в качестве референсного материала нуклеиновые кислоты, преимущественно около 180-200 пн, содержащие последовательность, которая может быть амплифицирована с праймерами, имеющими нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 7 и БЕО ΙΌ Νο. 5 или БЕО ΙΌ Νο. 4 и БЕО ΙΌ Νο. 3.
Изобретение также относится к способам идентификции наличия ЕЕ-ОН6 в биологических образцах, основанным на использовании таких специфических праймеров и зондов. Праймеры могут состоять из нуклеотидной последовательности от 17 до 200 последовательных нуклеотидов, вабраных из нуклеотидной последовательности БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклетида 1 до нуклеотида 140, или БЕО ΙΌ Νο. 11 от позиции 1 до позиции 463, или комплементарной последовательности нуклеотидов БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклео
- 2 018012 тида 113 до нуклеотида 438, комбинированной с праймерами, состоящими из нуклеотидной последовательности от 17 до 200 последовательных нуклеотидов, выбранным из комплементарной нуклеотидной последовательности 8ΕΟ ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192, или нуклеотидной последовательности 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112. Праймеры могут также включать эти нуклеотидные последовательности в расположении на их З'-конце, и также содержать неотносящиеся последовательности или последовательности, производные от упомянутых нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствующие основания.
Изобретение также относится к наборам для идентификации элитного результата ΕΕ-СНб в биологических образцах, названные наборы содержат по крайней мере один праймер или зонд, которые специфически распознают 5'- или З'-прилегающую область ΕΕ-СНб или специфическую перестановку в чужеродной последовательности ДНК в ΕΕ-СНб.
Набор по изобретению может содержать, в дополнение к первому праймеру, который специфически распознает 5'- или З'-прилегающую область ΕΕ-СНб, второй праймер, который специфически распознает последовательность внутри чужеродной ДНК ΕΕ-СНб, для использования в ПЦР идентификационном протоколе. Наборы по изобретению могут содержать по крайней мере два специфических праймера, один из который распознает последовательность внутри 5'-прилегающей области ΕΕ-СНб, а другой распознает последовательность внутри чужеродной ДНК. Праймер, распознающий 5'-прилегающую область, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3, и праймер, распознающий трансген, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4, или другой праймер или комбинацию праймеров, как описано здесь.
Изобретение далее относится к набору для идентификации элитного результата ΕΕ-СНб в биологических образцах, названный набор включает ПЦР праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3 и 8ΕΩ ΙΌ Νο. 4 для использования в ΕΕ-СНб ПЦР идентификационном протоколе описанном здесь.
Изобретение также относится к набору для идентификации элитного результата ΕΕ-СНб в биологических образцах, где этот набор содержит зонд, имеющий последовательность, соответствующую (или комплементарную ей) последовательности, имеющей 80-100% идентичности со специфической областью ΕΕ-СНб. Преимущественно, последовательность зонда соответствует специфической области, включающей часть 5'- или 3'-прилегающей области ΕΕ-СНб. Наиболее предпостительно специфический зонд имеет последовательность (или комплементарную ей) с 80-100% идентичности с последовательностью от 120 до 1б0 нуклеотида 8ΕΟ ΙΌ Νο. 1 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 102 до 123.
В соответствии с другой особенностью изобретения, обнаруженные ДНК последовательности содержат сайт вставки результата и имеют достаточную длину полинуклеотидов как геномной ДНК, так и чужеродной ДНК (трансгена), так что могут применяться как праймеры или как зонды для определения ΕΕ-СНб. Такие последовательности могут содержать как минимум 9 нуклеотидов геномной ДНК хлопка и такое же количество нуклеотидов чужеродной ДНК (трансгена) ΕΕ-СНб сразу же по обе стороны от места вставки, соответственно. Более предпочтительно, такие последовательности ДНК содержат по крайней мере 9 нуклеотидов геномной ДНК хлопка и такое же количество нуклеотидов чужеродной ДНК непрерывно с сайтом вставки в 8ΕΟ ΙΌ Νο. 1 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 2.
Способы и наборы, охваченные данным изобретением, могут быть использованы для других целей, таких как, но не ограничивающихся, следующими: определение наличия или отсутствия ΕΕ-СНб в растениях, растительном материале или продуктах, таких как, но не ограничивающихся, пищевые или кормовые продукты (свежие или обработанные), включающие или состоящие из растительного материала; дополнительно или альтернативно, способы и наборы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации трансгенного растительного материала в целях разделения трансгенного и нетрансгенного материала; дополнительно или альтернативно, способы и наборы по настоящему изобретению могут быть использованы для определения качества (то есть процента чистого материала) растительного материала, содержащего ΕΕ-СНб.
Кроме того, изобретение относится к 5'- и 3'-прилегающим областям ΕΕ-СНб, также как и к специфическим праймерам и зондам, разработанным на основе 5'- и/или 3'-прилегающих последовательностей ΕΕ-СНб.
Изобретение также относится к геномной ДНК, полученной из растений, содержащих элитный результат ΕΕ-СНб. Такая геномная ДНК может быть использована как материал контроля сравнения в идентификационном анализе описанном здесь.
Краткое описание чертежей
Следующие примеры, неподразумевающиеся как ограничивающие изобретение описанными здесь конкретными вариантами осуществления, могут быть поняты в сочетании с сопутствующими чертежами, включенными здесь посредством ссылки, на которых фиг. 1 схематически представляет взаимосвязь между цитированными нуклеотидными последовательностями и праймерами, черная полоска: чужеродная ДНК; заштрихованная черная полоска: перестройка в чужеродной ДНК, специфическая для ΕΕ-СНб; светлая полоска: ДНК растительного происхождения; заштрихованная светлая полоска: делеция мишени перед вставкой; стрелки: олигонуклеотидные
- 3 018012 праймеры, числа под полосками показывают нуклеотидные позиции; (с) относится к комплементарной нуклеотидной последовательности; ΝΑ: не применимо.
Фиг. 2 представляет результаты, полученные в ПЦР идентификационном протоколе, разработанном для ЕЕ-СН6. Последовательность нанесения на гель: линия 1: маркер молекулярного веса (100 пн лестница); линии 2-5: образцы ДНК из хлопчатников, содержащих трансгенный результат ЕЕ-СН6; линии 6 и 7: образцы ДНК из трансгенных хлопчатников не содержащие элитный результат ЕЕ-СН6, но содердащих сходный ген устойчивости к насекомым; линия 8: негативный контроль (без ДНК); линия 9: маркер молекулярного веса.
Фиг. 3: представляет результаты, полученные в ПЦР протоколе оценки зиготности, разработанном для ЕЕ-СН6. Последовательность нанесения на гель: линия 1: маркер, молекулярного веса (100 пн лестница); линии 2 и 3: Образцы ДНК хлопчатников, содержащих трансгенный результат ЕЕ-ОН6 в гомозиготной форме; линии 4-6: образцы ДНК хлопчатников, содержащих трансгенный результат ЕЕ-ОН6 в гетерозиготной форме; линия 7: контрольный образец ДНК из хлопчатника дикого типа; линия 8: негативный контроль (без ДНК); линия 9: маркер молекулярного веса.
Подробное описание
Включение рекомбинантной ДНК молекулы в растительный геном в основном происходит вследствие трансформации клетки или ткани. Конкретный сайт включения обычно возникает из-за случайной интеграции.
ДНК, введенная в растительный геном, как результат трансформации растительной клетки или ткани рекомбинантной ДНК или трансформирующей ДНК и берущая начало из такой трансформирующей ДНК, здесь и далее упоминается как чужеродная ДНК, содержащая один или более трансгенов. Растительная ДНК в контексте настоящего изобретения будет упоминаться как ДНК, происходящая из растений, которые были трансформированы. Растительная ДНК обычно будет находиться в том же самом генетическом локусе, что и в растениях дикого типа. Чужеродная ДНК может быть охарактеризована расположением и конфигурацией в сайте включения рекомбинантной молекулы ДНК в растительный геном. Сайт растительного генома, в который была вставлена рекомбинантная ДНК, также упоминается как сайт вставки или сайт-мишень. Вставка рекомбинантной ДНК в область растительного генома, упоминаемой как растительная ДНК перед вставкой, может быть ассоциирована с делецией растительной ДНК, упоминаемой как делеция сайта-мишени. Прилегающая область или прилегающая последовательность используются здесь в отношении последовательностей по крайней мере 20 пн, преимущественно не менее 50 пн, и до 5000 пн ДНК, отличной от введенной ДНК, преимущественно ДНК из растительного генома, которые расположены или непоспедственно выше (положение апстрим) и являются непрерывными или непосредственно ниже (положение даунстрим) и являются непрерывными с чужеродной ДНК. Процедуры трансформации, приводящие к случайной интеграции чужеродной ДНК, будут приводить к трансформантам с различными прилегающими областями, которые являются характерными и уникальными для каждого трансформанта. Когда рекомбинантная ДНК введена в растительный геном посредством традиционного скрещивания, его сайт вставки в растительный геном, или его прилегающие обычно не изменяются. Область вставки, как используется здесь, относится к области, соответствующей области по крайней мере 40 пн, предпочтительно 100 пн, и до 10000 пн, окруженной последовательностью, которая содержит верхнюю и/или нижнюю прилегающие области чужеродной ДНК в растительном геноме.
Принимая во внимание минорные различия из-за мутаций внутри видов, область вставки будет сохранить, при скрещивании с растениями того же вида, по крайней мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 100% идентичность последовательности с последовательностью, содержащей вверх- и вниз-прилегающие области чужеродной ДНК в растении, первоначально полученном после трансформации.
Результат определен как (искусственный) генетический локус, который, в результате генетической инженерии, несет трансген, содержащий по крайней мере одну копию интересующего гена. Типичным аллельным состоянием результата является наличие или отсутствие чужеродной ДНК. Результат характеризуется фенотипически экспрессией трансгена. На генетическом уровне, результат является частью генетической организации растения. На молекулярном уровне, результат может быть охарактеризован посредством рестрикционной карты (например, как определено на Саузерн-блоттинге), по вверх- и внизприлегающим последовательностям трансгена, расположением молекулярных маркеров и/или молекулярной конфигурацией трансгена. Обычно трансформация растений трансформирующей ДНК, содержащей по крайней мере один интересующий ген, приводит к популяции трансформантов, содержащих массу различных результатов, каждый из которых является уникальным.
Элитный результат, как используется здесь, является результатом, выбранным из группы результатов, полученных путем трансформации одной и той же трансформирующей ДНК или путем возвратного скрещивания с растениями, полеченными путем такой трансформации, на основе экспрессии и стабильности трансгена(-ов) и их совместимости с оптимальными агрономическими характеристиками растения, содержащего его. Так, критериями выбора элитного результата являются один или более, предпочтительно два или более, преимущественно все из нижеследующих:
- 4 018012
а) что наличие чужеродной ДНК не ставит под угрозу другие желаемые характеристики растения, такие как относящиеся к агрономическим показателям или коммерческой ценности;
б) что результат характеризуется хорошо определенной молекулярной конфигурацией, которая стабильно наследуется и для которой могут быть разработаны соответствующие способы контроля идентичности;
в) что интересующий ген(-ы) демонстрирует корректную, подходящую и стабильную пространственную и временную фенотипическую экспрессию, как в гетерозиготном (или гемизиготном), так и в гомозиготном состоянии результата, на коммерчески приемлемом уровне в пределах условий окружающей среду, в которые растения, содержащие результат, вероятно будут помещены при нормальном агрономическом использовании.
Предпочтительно, чтобы чужеродная ДНК была ассоциирована с позицией в растительном геноме, которая позволяет легкую интрогрессию в желаемую коммерческую генетическую среду.
Статус результата как элитного результата подтверждается интрогрессией элитного результата в различные подходящие генетические среды и наблюдением выполнения одного, двух или всех из вышеупомянутых а), б) и в) критериев.
Так, элитный результат относится к генетическому локусу, содержащему чужеродную ДНК, которая соответствует критериям, описанным выше. Растение, растительный материал или потомство, такое как семена, могут содержать один или более элитных результатов в их геноме.
Способы, разработанные для идентификации элитного результата или растения, растительного материала, или продуктов, которые содержат растительный материал, содержащий элитный результат, основаны на специфических геномных характеристиках элитного результата, таких как специфическая рестрикционная карта области генома, содержащей чужеродную ДНК, молекулярные маркеры или последовательности прилегающих области(-ей) чужеродной ДНК.
Когда одна или обе прилегающие области чужеродной ДНК отсеквенированы, могут быть разработаны праймеры и зонды, которые специфически распознают эту (эти) последовательность(-и) в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца посредством методов молекулярной биологии. Например, метод ПЦР может быть разработан для идентификации элитного результата в биологических образцах (таких как образцы растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал) . Такая ПЦР основана на по крайней мере двух специфических праймерах, один из которых распознает последовательность внутри 5'- или 3'-прилегающей области элитного результата, а другой распознает последовательность внутри чужеродной ДНК. Праймеры предпочтительно имеют последовательность между 15 и 35 нуклеотидами, которые при оптимальных ПЦР условиях специфически распознают последовательность внутри 5'- или 3'-прилегающей области элитного результата и чужеродной ДНК элитного результата соответственно, таким образом, что специфический фрагмент (интеграционный фрагмент или дискриминирующий ампликон) амплифицируется из образца нуклеиновой кислоты, содержащего элитный результат. Это означает, что только целевой интеграционный фрагмент, и никакие другие последовательности с растительного генома или чужеродной ДНК, амплифицируется при оптимальных условиях ПЦР.
ПЦР праймеры, подходящие для изобретения, могут быть следующими:
олигонуклеотиды длиной 17-100 пн, содержащие нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'-прилегающей последовательности (8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или 8ЕО ГО Νο. 11 от позиции 1 до позиции 463) на своем З'-конце (праймеры, распознающие 5'-прилегающие последовательности); или олигонуклеотиды длиной 17-200 пн, содержащие нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 3'-прилегающей последовательности (комплементарная последовательность 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438) на своем 3'-конце (праймеры, распознающие 3'-прилегающие последовательности); или олигонуклеотиды длиной 17-200 пн, содержащие нуклеотидную последовательность, по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из ДНК последовательностей вставки (комплементарная последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192) на своем 3'-конце (праймеры, распознающие чужеродную ДНК); или олигонуклеотиды длиной 17-40 пн, содержащие нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из ДНК последовательностей вставки (8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112).
Праймеры могут быть, конечно же, длиннее, чем упомянутые 17 последовательных нуклеотидов, и могут быть длиной, например, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 пн и даже длиннее. Праймеры могут целиком состоять из последовательности нуклеотидов, выбранной из упомянутых нуклеотидных последовательностей прилегающих областей и чужеродной ДНК. Однако нуклеотидная последовательность праймеров на их 5'-конце (то есть за пределами расположенных на 3'-конце 17 последовательных нуклеотидов) является менее критичной. Так, 5'-последовательность праймеров может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из прилегающей последовательности или чужеродной ДНК, соответствующим образом, но может содержать несколько (например, 1, 2, 5, 10 несоответствий). 5'
- 5 018012 концевая последовательность праймера может даже полностью состоять из нуклеотидной последовательности, не имеющей отношения к прилегающим последовательностям или чужеродной ДНК, такой как, например, нуклеотидная последовательность, представляющая собой сайт распознавания для фермента рестрикции. Такие посторонние последовательности или прилегающие ДНК последовательности с несоответствиями должны быть, предпочтительно, не более 50 или даже 25 нуклеотидов.
Более того, подходящие праймеры могут содержать или состоять из нуклеотидной последовательности на их 3'-конце, перекрывающей область соединения последовательностей растительной ДНК и чужеродной ДНК (расположенной в нуклеотидах 14-141 в БЕР ΙΌ Νο. 1 и нуклеотидах 112-113 в БЕР ΙΌ Νο. 2), предоставляя упомянутые З'-расположенные 17 последовательных нуклеотидов, не полученные исключительно не из чужеродной ДНК, не из растительных последовательностей в БЕР ΙΌ Νο. 1 или 2.
Специалисту в данной области техники будет также немедленно очевидно, что правильно выбранные ПЦР праймеры также не должны содержать последовательностей, комплементарных друг другу.
В контексте изобретения, комплементарная нуклеотидной последовательности, предаставленной в БЕР ΙΌ Νο: X является нуклеотидная последовательность, которая может быть получена из представленной нуклеотидной последовательности посредством замены нуклеотидов на их комплементарные нуклеотиды в сответствии с правилами Чаргаффа (СйагдаГГ’5 ги1ср (А<=>Т; С<=>С) и чтением последовательности в 5'-3' напрвлении, то есть в обратном направлении с представленной нуклеотидной последовательностью.
Примерами подходящих праймеров являются олигонуклеотидные последовательности БЕр ΙΌ Νο. 7 (праймеры, распознающие 5'-прилегающую область), БЕр ΙΌ Νο. 5 (праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 5'-прилегающую область), БЕр ΙΌ Νο. 4 (праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 3'прилегающую область), БЕр ΙΌ Νο. 3, БЕр ΙΌ Νο. 6 (праймеры, распознающие З'-прилегающую область).
Другие примеры подходящих олигонуклеотидных праймеров содержат на их 3'-конце следующие последовательности или состоят из таких последовательностей:
a. праймеры, распознающие 5'-прилегающую последовательность: нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 111 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 104 до нуклеотида 123; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 10 6 до нуклеотида 125; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 112 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 103 до нуклеотида 123; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 109 до нуклеотида 125; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 109 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 113 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 116; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 102 до нуклеотида 123; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 104 до нуклеотида 125; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 108 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 114 до нуклеотида 130; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 100 до нуклеотида 116; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 101 до нуклеотида 123; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 103 до нуклеотида 125; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 110 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 109 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 111 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 108 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 112 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 107 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 113 до нуклеотида 129; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 287 до нуклеотида 306; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 288 до нуклеотида 306; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 289 до нуклеотида 306; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 290 до нуклеотида 306; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 264 до нуклеотида 281; нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 265 до нуклеотида 281;
b. праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 5'-прилегающую последовательность:
комплементарная нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 140 до нуклеотида 159;
комплементарная нуклеотидная последовательность БЕр ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 140 до нуклеотида 158;
- 6 018012
158;
160;
184;
157;
157;
157;
159;
161;
156;
156;
158;
160;
155;
161;
385;
384;
386;
383;
387;
142;
382;
115;
комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 1 от нуклеотида 139 до нуклеотида от нуклеотида 140 до нуклеотида от нуклеотида 167 до нуклеотида от нуклеотида 136 до нуклеотида от нуклеотида 137 до нуклеотида от нуклеотида 140 до нуклеотида от нуклеотида 139 до нуклеотида от нуклеотида
140 до нуклеотида от нуклеотида
140 до нуклеотида от нуклеотида
139 до нуклеотида от нуклеотида
136 до нуклеотида от нуклеотида
139 до нуклеотида от нуклеотида
139 до нуклеотида от нуклеотида
139 до нуклеотида
с. праймеры, распознающие 3'-прилегающую последовательность:
комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 125 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 366 до нуклеотида комплементарная нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 94 до нуклеотида
б. праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 3'-прилегающую последовательность:
нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 95 до нуклеотида 114; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 96 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 95 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 96 до нуклеотида 114; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 97 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 93 до нуклеотида 114; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 94 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 98 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 92 до нуклеотида 114; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 93 до нуклеотида 115; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 98 до нуклеотида 114; нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. 2 от нуклеотида 99 до нуклеотида 115.
Как использовано здесь, нуклеотидная последовательность 8ЕО Ш Νο. Ζ от позиции X до позиции Υ означает нуклеотидную последовательность, включающую оба нуклеотидных конца.
Предпочтительно амплифицируемый фрагмент имеет длину между 50 и 500 нуклеотидами, такую
- 7 018012 как длина между 100 и 350 нуклеотидами. Специфические праймеры могут иметь последовательность, которая на 80-100% идентична последовательности внутри 5'- или 3'-прилегающей области элитного результата и чужеродной ДНК элитного результата, соответственно, наделенную несовпадениями, которые все еще позволяют специфическую идентификацию элитного результата с помощью этих праймеров при оптимизированных условиях ПЦР. Диапазон допустимых несоответствий, однако, может быть легко определен экспериментально и известен специалистам в данной области техники.
Определение интеграционного фрагмента может происходить различными путями, например, посредством определения размера на гель-электрофорезе. Интеграционные фрагменты могут также быть прямо отсеквенированы. Другие последовательность-специфические методы определения амплифицированных фрагментов ДНК также известны в области техники.
Поскольку последовательности праймеров и их относительное расположение в геноме являются уникальными для элитного результата, амплификация интеграционного фрагмента будет происходить только в биологических образцах, содержащих элитный результат (его нуклеиновую кислоту). Предпочтительно, когда проводят ПЦР для идентификации наличия ЕЕ-СН6 в неизвестных образцах, включают контроль с набором праймеров, с которыми фрагмент гена домашнего хозяйства растительных видов может быть амплифицирован. Гены домашнего хозяйства являются генами, которые экспрессируются в большинстве типов клеток и которые связаны с основными метаболическими активностями, свойственными всем клеткам. Предпочтительно, фрагмент, амплифицированный из гена домашнего хозяйства, является фрагментом, который длиннее, чем амплифицированный интеграционный фрагмент. В зависимости от анализируемых образцов могут быть включены другие контроли.
Стандартные ПЦР протоколы описаны в области техники, например в РСК Лррйсайоик Мапиа1 Воейе Мо1еси1аг ВюсйсписаЕ. 2ηά Εάίίίοη, 1999) и других источниках. Оптимальные условия для ПЦР, включая последовательность специфических праймеров, точно определены в Протоколе ПЦР идентификации для каждого элитного результата. Тем не менне, понятно, что некоторые параметры протокола ПЦР идентификации могут нуждаться в регулировке в соответствии с конкретными условиями лаборатории и могут быть слегка модифицированы для достижения сходных результатов. Например, использование различных способов выделения ДНК может потребовать регулировки, например, количества праймеров, полимеразы и используемых условий отжига. Подобным образом, выбор других праймеров может потребовать других оптимальных условий для протокола ПЦР идентификации. Эти в условиях, однако, будут очевидны специалисту в области техники и, более того, детально описаны в руководствах по применению ПЦР, таких как цитированные выше.
Как вариант, специфические праймеры могут быть использованы для амплификации интеграционного фрагмента, который может быть использован в качестве специфического зонда для идентификации ЕЕ-СН6 в биологических образцах. Контакт нуклеиновых кислот образца с зондом при условиях, позволяющих гибридизацию зонда и соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, приводит к образованию гибридов нуклеиновая кислота/зонд. Образование таких гибридов может быть определено (например, посредством мечения нуклеиновой кислоты или зонда), в результате чего образование таких гибридов указывает на наличие ЕЕ-СН6. Такие методы идентификации, основанные на гибридизации со специфическим зондом (как на твердом носителе, так и в растворе) описаны в области техники. Специфический зонд является предпочтительно последовательностью, которая при оптимизированных условиях специфически гибридизуется с участком в 5'- или З'-прилегающей области элитного результата и предпочтительно также содержит непрерывную с ним часть чужеродной ДНК (здесь и далее называемую специфическая область). Предпочтительно, специфический зонд содержит последовательность 50-500 пн, предпочтительно 100-350 пн, которая по крайней мере на 80%, предпочтительно на 80-85%, более предпочтительно на 85-90%, особенно предпочтительно на 90-95%, наиболее предпочтительно на 95100% идентична (или комплементарна) нуклеотидной последовательности специфической области. Предпочтительно, специфический зонд будет содержать последовательность около 15-100 последовательных нуклеотидов, идентичных (или комплементарных) специфической области элитного результата.
Олигонуклеотиды, подходящие в качестве ПЦР праймеров для определения элитного результата ЕЕ-СН6 могут также быть использованы для разработки ПЦР-основанного протокола для определения статуса зиготности элитного результата. С этой целью, два праймера, распознающие локус дикого типа, разработаны таким образом, что они направлены друг к другу и сайт вставки расположен между праймерами. Эти праймеры могут быть праймерами, специфически распознающими 5'- и З'-прилегающие последовательности, содержащиеся в 8ЕЦ ΙΌ Νο. 1 (8ЕЦ ΙΌ Νο. 11) или 8ЕЦ ΙΌ Νο. 2, соответственно. Эти праймеры могут быть также праймерами, специфически распознающими 5'- или 3'-прилегающие последовательности (такие как праймеры, имеющие последовательность 8ЕЦ ΙΌ Νο. 7 или 8ЕЦ ΙΌ Νο. 6). Этот набор праймеров, вместе с третьим праймером, комплементарным последовательности трансформирующей ДНК (таким как праймер, имеющий последовательность 8ЕЦ ΙΌ Νο. 5) позволяет одновременную диагностическую ПЦР амплификацию ЕЕ-СН6 специфического локуса, также как и локуса дикого типа. Если растение гомозиготно по трансгенному локусу или по локусу дикого типа, то диагностическая ПЦР приведет к одиночному типичному ПЦР продукту, предпочтительно типичной по длине, как для трансгенного, так и для XVI (дикого типа) локуса. Если растение является гомизиготным по трансгенному ло
- 8 018012 кусу, возникнут два локус-специфических ПЦР продукта, отражая амплификацию как трансгенного, так и локуса дикого типа.
Более того, способы определения, специфические для элитного результата ЕЕ-СН6, которые отличны от ПЦР-основанных методов амплификации, также могут быть разработаны с использованием предоставленной здесь информации о последовательностях, специфических для элитного результата. Такие альтернативные способы определения включают методы детекции амплификации линейного сигнала, основанные на инвазивном расщеплении определенных структур нуклеиновых кислот, также известном как технология 1пуабетТМ, (как описывается, например в патентах И8 5985557 'Тпуаыуе С1еауаде οί Νυс1е1с Аабк, 6001567 ОеТесбоп οί ΝιιοΕίο Λοίά 5ес.|иепсе5 Ьу 1пуабет Ойес1еб С1еауаде, включенных здесь посредством ссылки). С этой целью, целевая последовательность может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 148 или его комплементарной последовательностью, или упомянутого выше меченного зонда нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО Νο. 2 от нуклеотида 95 до нуклеотида 112 или комплементарную ей, и далее гибридизуется со вторым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО Νο. 1 от нуклеотида 123 до нуклеотида 140 или комплементарную ей, или с упомянутым выше меченным зондом нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 130 или комплементарную ей, где первый и второй олигонуклеотиды перекрываются по крайней мере на 1 нуклеотид. Дуплексная или триплексная структура, полученная в результате такой гибридизации, позволяет провести селективное расщепление зонда ферментом (С1еауа§е®), оставляющим целевую последовательность интактной. Расщепленный меченый зонд впоследствии детектируется, потенциально посредством промежуточного шага, приводящего к дальнейшей амплификации сигнала.
Набор, как используется здесь, относится к комплекту реагентов для использования в способах по изобретению, более детально, идентификации элитного результата ЕЕ-СН6 в биологических образцах или определения зиготности ЕЕ-СН6-содержащего растительного материала. Более детально, предпочтительный вариант осуществления набора по изобретению содержит по крайней мере один или два специфических праймера, как описано выше для идентификации элитного результата, или три специфических праймера для определения зиготности. При желании, набор может также содержать любой другой реагент, описанный здесь в протоколе ПЦР идентификации. Альтернативно, в соответствии с другим вариантом осуществления этого изобретения, набор может содержать специфический зонд, как описано выше, который специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой биологического образца для идентификации наличия в нем ЕЕ-СН6. Добавочно, набор может дополнительно содержать любой другой реагент (такой как, но не ограничивающийся этим, гибридизационный буффер, метка) для идентификации ЕЕ-СН6 в биологических образцах, с использованием специфического зонда.
Набор по изобретению может быть использован, и его компоненты могут быть специфически изменены, в целях контроля качества (например, чистоты партий семян), определения наличия или отсутствия элитного результата в растительном материале или материале, содержащем или происходящем из растительного материала, таком как, но не ограничиваясь, пищевые или кормовые продукты.
Как используется здесь, идентичность последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности (ДНК или РНК), относится к числу позиций с идентичными нуклеотидами разделенному на число нуклеотидов в более короткой из двух последовательностей. Сравнение двух нуклеотидных последовательностей осуществляется по алгоритму Вилбура и Липмана (АбЬнг апб Ыршапи, 1983, Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 80:726) с использованием размера окна 20 нуклеотидов, размера слова 4 нуклеотида, и размера пропуска 4. Выполняемый с помощью компьютера анализ и интерпретация данных последовательности, включая сравнение последовательностей как описано выше, может, например, быть удобно осуществлен с использованием пакета программ для анализа последовательностей Сепебсх СотрШег Сгоир(ССС, ИшуегаНу οί Αί^οη^η Β^οΐесйηο1οду сеп1ет). Последовательности отмечены как существенно одинаковые, когда такие последовательности имеют идентичность последовательностей по крайней мере примерно 75%, особенно примерно 80%, более особенно примерно 85%, наиболее особенно примерно 90%, в особенности 95%, главным образом примерно 100%. Понятно, когда РНК последовательности указаны как существенно одинаковые, или имеющие определенный уровень идентичности последовательности с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в ДНК последовательности рассматривается эквивалентным урацилу (И) в последовательностях РНК.
Термин праймер, как использовано здесь, включает любую нуклеиновую кислоту, которая способна служить затравкой для синтеза образующейся нуклеиновой кислоты в матрица-зависимом процессе, таком как ПЦР. Типично, праймеры являются олигонуклеотидами от 10 до 30 нуклеотидов, но и более длинные последовательности могут быть использованы. Праймеры могут быть представлены в двухцепочечной форме, однако одноцепочечная форма является более предпочтительной. Зонды могут быть использованы в качестве праймеров, но они предназначены для связывания с целевой ДНК или РНК, и не должны использоваться в процессе амплификации.
Термин распознавание, как используется здесь, когда относится к специфическим праймерам, указывает на факт, что специфические праймеры специфически гибридизуются с последовательностью
- 9 018012 нуклеиновой кислоты в элитном результате при условиях, описанных в методе (такие как условия для протокола ПЦР идентификации), при этом специфичность определяется наличием позитивного и негативного контролей.
Термин гибридизирование, как используется здесь, когда относится к специфическим зондам, указывает на факт, что зонд связывается со специфической областью последовательности нуклеиновой кислоты элитного результата в условиях стандартной строгости. Условия стандартной строгости, как используется здесь, относится к условиям гибридизации, описанным здесь, или к традиционным условиям гибридизации, как описано БатЬгоок с1 а1., 1989 (Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬота!огу Мапиа1, Бесоий Εάίΐίοη, Со1й 8ртшд НагЬоиг ЬаЬота!огу Ргекк, ΝΥ), которые, например, содержат следующие шаги: 1) иммобилизация фрагментов растительной геномной ДНК на фильтр, 2) предгибридизация фильтра в течение 1-2 часов при 42°С в 50% формамид, 5 X 88ΡΕ, 2 X Реагента Денхарта и 0,1% 8Ό8, или в течение 1-2 часов при 68°С в 6 X 88С, 2 X Реагента Денхарта и 0,1% 8Ό8, 3) добавление меченого гибридизационного зонда, 4) инкубация в течение 16-24 часов, 5) отмывка фильтра в течение 20 мин при комнатной температуре в 1 X 88С, 0,1 %8Ό8, 6) отмывка фильтра 3 раза по 20 минут каждая при 68°С в 0,2 X 88С, 0,1 %8Ό8, и 7) экспозиция фильтра в течение 24-48 ч с рентгеновской пленкой при -70°С с усиливающим экраном.
Как использовано здесь, биологические образцы - это образцы растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал. Термин растение подразумевается охватывать ткани растений хлопчатника (Соккуршт Ыткйит) на любой стадии зрелости, как и любые клетки, ткани или органы, взятые или произошедшие из любого такого растения, включая без ограничения какие-либо семена, листья, стебли, цветы, корни, одиночные клетки, гаметы, клеточные культуры, культуры тканей или протопласты, Растительный материал, как используется здесь, относится к материалу, который получен или произошел из растений. Продукты, содержащие растительный материал, имеют отношение к пище, кормам или другим продуктам, которые получены с использованием растительного материала или могут быть загрязнены растительным материалом. Понятно, что в контексте настоящего изобретения, такие биологические образцы тестируются на наличие нуклеиновой кислоты, специфической для ΕΕ-ΟΗ6, подразумевая наличие нуклеиновой кислоты в образце. Так, методы, относящиеся здесь к идентификации элитного результата ΕΕ-ΟΗ6 в биологических образцах, указывают на идентификацию в биологических образцах нуклеиновых кислот, которые содержат элитный результат.
Как использовано здесь, содержащий должно толковаться как определяющий наличие заявленных признаков, чисел, шагов, реагентов или компонентов, как указано, но не исключает наличия или добавления одного или более признаков, чисел, шагов, реагентов или компонентов, или их групп. Так, например, нуклеиновая кислота или белок, содержащие последовательность нуклеотидов или аминокислот, могут содержать больше нуклеотидов или аминокислот, чем фактически указано, то есть быть вставленной в большую нуклеиновую кислоты или белок. Химерный ген, содержащий последовательность ДНК, которая функционально или структурно определена, может содержать дополнительные последовательности ДНК, и так далее.
Настоящее изобретение также относится к развитию элитного результата ΕΕ-ΟΗ6 в хлопке в растениях, содержащих этот результат, в потомство, полученное от этих растений и в растительные клетки, или растительный материал, полученный из этого результата. Растения, содержащие элитный результат ΕΕ-ΟΗ6, были получены как описано в примере 1.
Растения хлопчатника или растительный материал, содержащий ΕΕ-ΟΗ6, могут быть идентифицированы в соответствии с протоколом ПЦР идентификации, описанном для ΕΕ-ΟΗ6 в Примере 2. Коротко, геномная ДНК хлопка, представленная в биологическом образце, амплифицируется ПЦР с использованием праймера, который специфически распознает последовательность внутри 5'- или З'-прилегающей области ΕΕ-ΟΗ6, такого как праймер с последовательностью 8ΕΟ ΙΌ №. 3, и праймера, который распознает последовательность в чужеродной ДНК, такого как праймер с последовательностью 8ΕΟ ΙΌ №. 4. ДНК праймеры, которые амплифицируют часть эндогенной последовательности хлопка, используются как положительный контроль ПЦР амплификации. Если при ПЦР амплификации материал дает фрагмент ожидаемого размера, то материал содержит растительный материал из хлопчатника, несущего элитный результат ΕΕ-ΟΗ6.
Растения, несущие элитный результат ΕΕ-ΟΗ6, характеризуются их устойчивостью к насекомым, также как и толерантностью к глюфозинату. Растения, несущие элитный результат ΕΕ-ΟΗ6, также характеризуются наличием агрономических свойств, которые сравнимы с коммерчески доступными сортами хлопка в США, в отсутствие давления насекомых. Наблюдалось, что наличие чужеродной ДНК в области вставки в геноме растения хлопчатника, описанное здесь, привносит особенно интересные фенотипические и молекулярные характеристики в растения, содержащие этот результат.
Нижеследующие примеры описывают идентификацию элитного результата и разработку способов для специфической идентификации элитного результата ΕΕ-ΟΗ6 в биологических образцах.
Если не указано обратное в Примерах, все рекомбинантные техники проводились в соответствии со стандартными протоколами, описанными в БатЬгоок 1 аий РиккеИ Э\У (ейк.) (2001) Мо1еси1аг С1ои1ид: А ЬаЬота!огу Маииа1, Згй ΕΦΐΦη Со1й 8ртшд ШтЬот ЬаЬота!огу Ргекк, №\ν Υο^к и в Аи8иЬе1 ЕА, Втеи1 В,
- 10 018012
Κίη§5ΐοη КБ, Мооге ΌΌ, 8е1бтап 1С, 8ιηί11ι 1Л апб 8ΐπ.ι1ι1 К (ебк.) (2006) Сиггеп! Рто1осок ίη Мо1еси1аг Βίо1оду. 1оЬп ^11еу & 8опк, Ыете Уотк.
Стандартные материалы и ссылки описаны в Сгоу КОИ (еб.) (1993) Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1о§у ЬаЬРах, ΒΙΘ8 8с1епНПс РиЬНккега Ыб., ОхГогб апб В1аск^е11 8аепЦПс РиЬйсаДопк, ОхГогб и в Вго\\п ТА, (1998) Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬРах, 2пб Ебйюп, Асабетю Ргекк, 8ап И1едо. Стандартные материалы и методы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут быть найдены в МсРкеткоп М1 апб Мо11ег 80 (2000) РСК (Тке Ваыск), ΒΙΟ8 8аепиПс РиЬкккега Ыб., ОхГогб и в РСК Аррксакопк Мапиа1, 3гб Ебйюп (2006), Коске П1адпо811с8 0тЬН, Маппкет или \\л\лт.госке-аррНеб-5с1епсе.сот
В описании и примерах сделаны ссылки на следующие последовательности:
8Е0 ΙΌ Ыо. 1 : нуклеотидная последовательность, содержащая 5'-прилегающую область ЕЕ-0Н6; 8Е0 ΙΌ Ыо. 2: нуклеотидная последовательность, содержащая З'-прилегающую область ЕЕ-0Н6; 8Е0 ΙΌ Ыо. 3: праймер 0ΗΙ058;
8Е0 ΙΌ Ыо. 4: праймер 0ΗΙ059;
8Е0 ΙΌ Ыо. 5: праймер ИРА286;
8Е0 ΙΌ Ыо. 6: праймер ЫЕЬ115;
8Е0 ΙΌ Ыо. 7: праймер ЫЕЬ117;
8Е0 ΙΌ Ыо. 8: праймер 1 для амплификации контрольного фрагмента;
8Е0 ΙΌ Ыо. 9: праймер 2 для амплификации контрольного фрагмента;
8Е0 ΙΌ Ыо. 10: Нуклеотидная последовательность растительной геномной целевой последовательности перед вставкой ЕЕ-0Н6;
8Е0 ΙΌ Ыо. 11: нуклеотидная последовательность, содержащая 5'-прилегающую область ЕЕ-0Н6 (длинная)
Примеры
1. Идентификация элитного результата ЕЕ-0Н6.
Устойчивый к насекомым хлопок был разработан путем трансформации хлопка вектором, содержащим кодирующую последовательность модифицированного сгу2Ае гена, функционально связанную с транзитным пептидом малой субъединицы КиЬщсо под контролем промотора 358 СаиНПо\уег Мокаю VIТИ8.
Элитный результат ЕЕ-0Н6 был отобран на основании обширной процедуры отбора, основанной на хорошей экспрессии и стабильности гена устойчивости к насекомым, и была оценена его совместимость с оптимальными агрономическими характеристиками, такими как высота растения, высота до вершины, крепление семенной коробочки, устойчивость, мощность, длина волокна, прочность волокна и выход волокна хлопчатника.
Отобранный результат был введен в различные коммерческие генетические среды, и были сравнены результаты полевых испытаний в различных местоположениях. Растения были подвергнуты действию насекомых-вредителей в различных вариантах. Растения показали хороший контроль насекомых.
Более того, результат имел нормальную морфологию листьев, цветов и семенных коробочек, отличную фертильность, и не показал заболеваний или ненормальной восприимчивости к насекомым во множестве генетических сред. В течение интрогрессии во множественные генетические среды не наблюдалось абберантных проблем или аномалий.
2. Идентификация прилегающих областей элитного результата ЕЕ-0Н6.
Последовательность областей, прилегающих к чужеродной ДНК в элитном результате ЕЕ-0Н6, была определена с использованием, когда возможно, методики ТА!Ь-ПЦР (чередующейся ассиметричнотемпературной (ТАШ-) РСК), описанного Ьш е! а1. (1995, Р1ап1 1. 8(3):457-463). В этой методике используются три вложенных праймера в последовательных реакциях вместе с более коротким случайно вырожденным праймером таким образом, что относительная эффективность амплификации специфических и неспецифических продуктов может контролироваться при помощи температуры. Специфические праймеры были отобраны так, чтобы отжиг происходил на границе чужеродной ДНК и на основании условий отжига. Небольшое количество (5 мкл) неочищенных, вторичных и четвертичных, ПЦР продуктов были проанализированы в 1% агарозном геле. Четвертичные ПЦР продукты были очищены, и была установлена их нуклеотидная последовательность.
2.1. Правая (5') прилегающая область.
Нуклеотидная последовательность фрагмента, определенного как содержащего 5'-прилегающую область, была определена (8Е0 ΙΌ Ыо. 1). Последовательность между нуклеотидами 1-140 соответствует растительной ДНК, когда как последовательность между нуклеотидами 141-192 соответствует чужеродной ДНК. Была также определена нуклеотидная последовательность более длинного фрагмента, содержащего 5'-прилегающую область (8Е0 ΙΌ Ыо. 11). Последовательность между нуклеотидами 1-463 соответствует растительной ДНК, когда как последовательность между нуклеотидами 464-555 соответствует чужеродной ДНК.
2.2. Левая (3') прилегающая область.
Нуклеотидная последовательность фрагмента, определенного как содержащего 3'-прилегающую область, полученного на ТАГЬ-ПЦР, была определена (8Е0 ΙΌ Ыо. 2). Последовательность между нук
- 11 018012 леотидами 1-112 соответствует чужеродной ДНК, когда как последовательность между нуклеотидами 113-438 соответствует растительной ДНК.
2.3. Идентификация растительной ДНК перед вставкой.
Растительная ДНК перед вставкой была амплифицирована ПЦР амплификацией с использованием праймеров ИЕЬ115 (8ЕО ΙΌ Νο. 6) и ΝΕΕ117 (8ЕО ГО Νο. 7). Была определена нуклеотидная последовательность амплифицированного фрагмента (8ЕО ГО Νο. 10). Область между нуклеотидными позициями 141-148 была определена, как подвергшаяся перестановке (делеция целевого сайта), при сравнении с полученной из растений нуклеотидной последовательностью в 5'- и З'-прилегающих областях элитного результата ЕЕ-ОН6.
3. Разработка протокола идентификации ЕЕ-ОН6 с применением полимеразной цепной реакции.
3.1. Праймеры.
Специфические праймеры, распознающие последовательность внутри элитного результата, были разработаны.
Был разработан праймер, который распознает последовательность внутри 3'-прилегающей области ЕЕ-ОН6. Второй праймер был далее выбран внутри последовательности чужеродной ДНК так, чтобы праймеры перекрывали последовательность примерно 189 пн. Следующие праймеры были определены как дающие особенно чистые и воспроизводимые результаты в реации ПЦР для ЕЕ-ОН6 ДНК:
ΟΗΙ058: 5'-дАА.АТТ.дСд.ТдА.СТС.ААА.ТТС.С-3' (8ЕО ГО Νο.: 3) (цель: растительная ДНК);
ОНЮ59: 5'-ддТ.ТТС.дСТ.САТ.дТд.ТТд.АдС-3' (8ЕО ГО Νο.: 4) (цель: ДНК вставки).
Праймеры, выявляющие эндогенную последовательность, преимущественно добавляются в ПЦРсмесь. Эти праймеры служат внутренним контролем в неизвестных образцах и в ДНК-положительном контроле. Положительный результат с парой эндогенных праймеров (наличие ПЦР амплифицированного фрагмента 445 пн) указывает на наличие в препарате геномной ДНК достаточного количества ДНК подходящего качества для синтеза ПЦР продукта. Были выбраны эндогенные праймеры для распознавания гена домашнего хозяйства в хлопке:
6Н1001: 5'-ААС.СТА.ддС.ТдС.ТдА.Адд.АдС-3' (8ЕО ГО Νο.: 8)
СН1002: 51-САА.СТС.СТС.САд. ТСА.ТСТ.ССд-31 (8ЕО ГО Νο.: 9).
3.2. Амплифицированные фрагменты.
Ожидаемые амплифицированные фрагменты в ПЦР реации:
для пары праймеров 0Н1001-0Н1002: 445 пн (эндогенный контроль).
для пары праймеров 0Н1058-0Н1059: 189 пн (ЕЕ-ОН6 элитный результат).
3.3. ДНК-матрица.
ДНК-матрица была выделена из листовой массы в соответствии с Еб\\агб5 с1 а1. (№.1с1с1с Асй Ке5сагс11. 19, ρί 349, 1991). Когда используемая ДНК выделяется другим способом, должна быть проведена тестовая ПЦР с использованием различного количества ДНК-матрицы. Обычно 50 нг геномной ДНКматрицы дает наилучшие результаты.
3.4. Назначенные положительные и отрицательные контроли.
Для избежания ложных положительных или отрицательных результатов, было определено, что следующие позитивные и негативные контроли должны быть включены в ПЦР прогон.
Мастер-микс контроль (ДНК-негативный контроль). Это ПЦР, в котором не добавляется ДНК в реакцию. Когда наблюдается ожидаемый результат, то есть отсутствие ПЦР продукта, это означает, что ПЦР смесь не была загрязнена целевой ДНК.
ДНК-положительный контроль (образец геномной ДНК, содержащей последовательность трансгена). Успешная амплификация положительного контроля указывает на то, что ПЦР проходила при условиях, которые позволяют амплификацию целевой последовательности.
Контроль с ДНК дикиго типа. Это ПЦР, в котором ДНК-матрица является геномной ДНК, выделенной из нетрансгенных растений. В качестве ожидаемого результата, отсутствие амплификации трансгенного ПЦР продукта, а только амплификация эндогенного ПЦР-продукта указывает на отсутствие детектируемой фоновой амплификации трансгена в образце геномной ДНК.
3.5. Условия ПЦР.
Оптимальные результаты были получены при следующих условиях:
ПЦР-смесь для 25 мкл реакций содержит:
2,5 мкл ДНК-матрицы 2,5 мкл 10х Атр1Шса1юп ВиГГег (поставляемого вместе с Тад-полимеразой);
0,5 мкл 10 тМ άΝΓΡ'κ;
0,4 мкл 6Н1001 (10 пмоль/мкл);
0,4 мкл СН1002 (10 пмоль/мкл);
0,7 мкл ОН1058 (10 пмоль/мкл);
0,7 мкл ОН1059 (10 пмоль/мкл);
0,1 мкл Тад ДНК-полимеразы (5 МЕ/мкл) вода до 25 мкл;
профиль термоциклирования для достижения оптимальных результатов следующий:
мин при 95°С.
Далее:
- 12 018012 мин при 95°С;
мин при 57°С;
мин при 72°С;
в течение 5 циклов.
Далее:
с при 92°С;
с при 57°С;
мин при 72°С;
в течение 25 циклов.
Далее:
мин при 72°С.
3.6. Анализ в агарозном геле.
Для оптимальной визуализации результатов ПНР было определо, что 10-20 мкл ПЦР образца должны быть нанесены на 1,5% агарозный гель (трис-боратный буфер) с подходящим маркером молекулярного веса (например, 100 пн лестница РНАКМАОА).
3.7. Подтверждение результатов.
Было определено, что данные образцов трансгенной растительной ДНК внутри одного ПЦР прогона и одной и той же ПЦР-смеси не должны быть акцептируемыми, если не 1) ДНК-положительный контроль показал ожидаемый ПЦР-продукт (трансгенный и эндогенный фрагменты), 2) ДНК-негативный контроль является отрицательным по ПЦР амплификации (фрагментов нет) и 3) контроль ДНК дикого типа показывает ожидаемый результат (амплификация эндогенного фрагмента).
Если следовать Протоколу ПЦР идентификации ΕΕ-СНб, как описано выше, то линии, содержащие видимое количество трансгенного и эндогенного ПЦР продуктов ожидаемого размера, указывают, что соответствующее растение, из которого была выделена матрица геномной ДНК, унаследовало элитный результат ΕΕ-СНб. Линии, не содержащие видимого количества трансгенного ПЦР продукта и содержащие видимое количество эндогенного продукта, указывают, что соответствующее растение, из которого была выделена матрица геномной ДНК, не содержит элитного результата. Линии, не содержащие видимого количества ни трансгенного ни эндогенного ПЦР продуктов, указывают, что качество и/или количество геномной ДНК не позволило пройти синтезу ПЦР продуктов. Эти растения не должны учитываться. Выделение геномной ДНК должно быть повторено, и проведена новая ПЦР с соответствующими контролями.
3.8. Применение определяющего ПЦР протокола для идентификации ΕΕ-СНб.
Перед попыткой скрининга должна быть проведена тестовая ПЦР со всеми соответствующими контролями. Разработанный протокол может потребовать оптимизации для компонентов, которые могут быть различны для разных лабораторий (выделение ДНК матрицы, Тас.| ДНК-полимераза, качество праймеров, άΝΤΡ'δ, амплификатор, и так далее).
Амплификация эндогенной последовательности играет ключевую роль в протоколе. Необходимо достигнуть таких условий ПЦР и амплификации, при которых амплифицируется эквимолярные количества эндогенной и трансгенной последовательностей на известной трансгенной геномной ДНК-матрице. Когда же целевой эндогенный фрагмент не амплифицируется, или когда целевая последовательность не амплифицируется при той же самой интенсивности окрашивания этидиум-бромидом, как можно судить по электрофорезу в агарозном геле, может потребоваться оптимизация условий ПЦР.
Материал листьев ряда растений хлопчатника, некоторые из которых содержат ΕΕ-СНб, был протестирован в соответствии с описанным выше протоколом. Образцы элитного результата ΕΕ-СНб и хлопка дикого типа были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей, соответственно.
Фиг. 2 иллюстрирует результат, полученный в протоколе ПЦР идентификации ΕΕ-СНб для ряда образцов хлопчатника. Было обнаружено, что образцы в линиях 2-5 содержат элитный результат, поскольку была детектирована полоска 189 пн, когда образцы в линиях б и 7 не содержат ΕΕ-СНб. Линии б и 7 содержат другой хлопковый элитный результат (включая растения, содержащие другой химерный ген устойчивости к насекомым); линия 8 представляет образец с отрицательным контролем (вода), и линии 1 и 9 представляют маркер молекулярного веса (100 пн лестница).
4. Применение специфического фрагмента интеграции в качестве зонда для определения материала, содержащего ΕΕ-СНб.
Специфический фрагмент интеграции ΕΕ-СНб получен ПЦР амплификацией с использованием специфических праймеров СНЮ58 (8ΕΩ ΙΌ Νο. 3) и СНЮ59 (8ΕΟ ΙΌ Νο. 4), или путем химического синтеза и помечен. Фрагмент интеграции использовался в качестве зонда для определения ΕΕ-СНб в биологических образцах. Нуклеиновая кислота была экстрагирована из образцов в соответствии со стандартными процедурами. Эта нуклеиновая кислота затем контактировала со специфическим зондом в условиях гибридизации, оптимизированных для образования гибрида. Образование гибрида далее было детектировано для проверки наличия нуклеиновой кислоты ΕΕ-СНб в образце. Необязательно, перед контактом со специфическим зондом нуклеиновая кислота в образце была амплифицирована с использованием
- 13 018012 специфических праймеров. Альтернативно, нуклеиновая кислота метилась перед контактом со специфическим зондом вместо интеграционного фрагмента. Необязательно, специфические зонды связывались с твердым носителем (таким как, но не ограничиваясь, фильтр, полоска или шарики), перед контактом с образцами.
5. Протокол для ПЦР-основанного определения зиготности ЕЕ-СН6 в растительном материале хлопка.
5.1. Праймеры.
Два праймера, распознающие нуклеотидную последовательность локуса дикого типа перед вставкой элитного результата, были разработаны таким образом, что они направлены навстречу друг другу и сайт вставки располагается между ними. Этот комплект праймеров, вместе с третьим праймером, комплементарным последовательности чужеродной ДНК и направленным в сторону прилегающей ДНК, позволяет одновременную ПЦР амплификацию как локуса ЕЕ-СН6, так и локуса дикого типа.
Следующие праймеры были найдены дающими особенно чистые и воспроизводимые результаты в ПЦР реакциях определения зиготности на ДНК ЕЕ-6Н6:
ЫЕЬ115 5'-АСТ.дАТ.ддС.ТСА.АСд.дТТ.АС-3' (БЕО ΙΌ Νο.: 6) (цель: растительная ДНК выше 5'прилегающей области) ЭРА286 5'-дАТ.СдС.САТ.ддА.дСС.АТТ-3' (БЕО ГО Νο.: 5) (цель: ДНК вставки);
ЫЕЬ117 5'-ААА.ТСА.САд.дСА.дАд.ддА.Ад-3' (БЕО ГО Νο.: 7) (цель: растительная ДНК 3'прилегающей области).
5.2. Амплифицируемые фрагменты.
Ожидаемые амплифицируемые фрагменты в ПЦР реакциях:
для пары праймеров СН1065-СН1066: 451 пн (локус дикого типа);
для пары праймеров 6Н1057-6Н1065 : 197 пн (локус ЕЕ-6Н6).
5.3. ДНК- матрица.
ДНК-матрица была выделена из листовой массы в соответствии с Ей\\агЙ5 с1 а1. (Νιιοίοίο Асй Ке5саге11. 19, ρί 349, 1991). Когда используемая ДНК выделяется другим способом, должна быть проведена тестовая ПЦР с использованием различного количества ДНК-матрицы. Обычно 50 нг геномной ДНКматрицы дает наилучшие результаты.
5.4. Назначенные положительные и отрицательные контроли. Для избежания ложных положительных или отрицательных результатов было определено, что следующие позитивные и негативные контроли должны быть включены в ПЦР прогон.
Мастер-микс контроль (ДНК-негативный контроль). Это ПЦР, в котором не добавляется ДНК в реакцию. Когда наблюдается ожидаемый результат, то есть отсутствие ПЦР продукта, это означает, что ПЦР смесь не была загрязнена целевой ДНК.
ДНК-положительный контроль (образец геномной ДНК, содержащей последовательность трансгена). Успешная амплификация положительного контроля указывает на то, что ПЦР проходила при условиях, которые позволяют амплификацию целевой последовательности.
Контроль с ДНК дикого типа. Это ПЦР, в котором ДНК-матрица является геномной ДНК, выделенной из нетрансгенных растений. В качестве ожидаемого результата, отсутствие амплификации трансгенного ПЦР-продукта, а только амплификация эндогенного ПЦР-продукта указывает на отсутствие детектируемой фоновой амплификации трансгена в образце геномной ДНК.
5.5. Условия ПЦР.
Оптимальные результаты были получены при следующих условиях:
ПЦР-смесь для 25 мкл реакций содержит:
х мкл ДНК-матрицы (150 нг);
2,5 мкл 10х Λтρ1^Πсаι^οη ВиЕЕег (поставляемого вместе с Тад-полимеразой);
0,5 мкл 10 тМ άΝΓΡ'κ;
0,5 мкл ЫЕЬ115 (10 пмоль/мкл);
0,5 мкл ЫЕЬ117 (10 пмоль/мкл);
0,2 мкл ЭРА286 (10 пмоль/мкл);
0,1 мкл Тад ДНК-полимеразы (5 МЕ/мкл);
вода до 25 мкл.
Профиль амплификации для достижения оптимальных результатов следующий:
мин при 95°С.
Далее:
мин при 95°С;
мин при 57°С;
мин при 72°С;
в течение 5 циклов.
Далее:
с при 92°С;
с при 57°С;
мин при 72°С;
- 14 018012 в течение 25 циклов
Далее:
мин при 72°С.
5.6. Анализ в агарозном геле.
Для оптимальной визуализации результатов ПЦР было определо, что 10-20 мкл ПЦР образца должны быть нанесены на 1,5% агарозный гель (трис-боратный буфер) с подходящим маркером молекулярного веса (например, 100 пн лестница РНАКМАС1А).
5.7. Подтверждение результатов.
Данные образцов трансгенной растительной ДНК внутри одного ПЦР прогона и одной и той же ПЦР-смеси не должны быть акцептируемыми, если не:
положительный контроль показал ожидаемый ПЦР-продукт (амплификация трансгенной цели), положительный контроль ДНК дикого типа показывает ожидаемый результат (амплификация эндогенной цели), негативный контроль является отрицательным по ПЦР амплификации (фрагментов нет).
Линии, содержащие видимое количество трансгенного ПЦР продукта ожидаемого размера и не содержащие видимого количества ПЦР продукта дикого типа, указывают, что соответствующее растение, из которого была выделена матрица геномной ДНК, является гомозиготным по трансгенной кассете.
Линии, содержащие видимое количество трансгенного ПЦР продукта и ПЦР продукта дикого типа ожидаемых размеров, указывают, что соответствующее растение, из которого была выделена матрица геномной ДНК, является гемозиготным по трансгенной кассете. Линии, не содержащие видимого количества трансгенного ПЦР продукта и содержащие видимое количество ПЦР продукта дикого типа, указывают, что соответствующее растение, из которого была выделена матрица геномной ДНК, не унаследовало соответствующей последовательности трансгена и, таким образом, гомозиготно по локусу дикого типа.
Линии, не содержащие видимого количества ни трансгенного ни дикого типа ПЦР продуктов, указывают, что качество и/или количество геномной ДНК не позволило пройти синтезу ПЦР продуктов. Эти растения не могут учитываться. Выделение геномной ДНК должно быть повторено, и проведена новая ПЦР с соответствующими контролями.
5.8. Применение протокола определения зиготности для идентификации зиготности растений, содержащих ЕЕ-СН6.
Фиг. 3 иллюстрирует результат, полученный в ПЦР для определения зиготности ЕЕ-СН6 для ряда образцов растений хлопчатника. Образцы в линиях 2-3 содержат ПЦР фрагмент (197 пн) , характерный для элитного результата ЕЕ-ОН6, когда образцы в линиях 4-7 содержат фрагмент, характерный для наличия локуса дикого типа. Линии 4-6 содержат оба фрагмента. Линии 2-3, таким образом, содержат ЕЕОН6 в гомозиготной форме, линии 4-6 содержат ЕЕ-ОН6 в гомизиготной форме, и линия 7 содержит локус дикого типа в гомозиготной форме (азиготной по ЕЕ-ОН6). Линия 8 представляет образец отрицательного контроля (вода), и линии 1 и 9 представляют маркер молекулярного веса (100 пн лестница).
6. Интрогрессия ЕЕ-ОН6 в предпочтительные сорта.
Элитный результат ЕЕ-ОН6 введен посредством повторяющихся возвратных скрещиваний в коммерческие сорта хлопка, такие как, но не ограничиваясь, ЕМ5013, ЕМ5015, ЕМ5017, ЕМ989, ЕМ832, ЕМ966 и ЕМ958, ЕМ989, ЕМ958, ЕМ832, ЕМ991, ЕМ819, ЕМ800, ЕМ960, ЕМ966, ЕМ981, ЕМ5035, ЕМ5044, ЕМ5045, ЕМ5013, ЕМ5015, ЕМ5017 или ЕМ5024.
Наблюдалось, что интрогрессия элитного результата в эти сорта не влияет значительно на какуюлибо из желательных фенотипических или агрономических характеристик этих сортов (отсутствие прочного связывания), когда экспрессия трансгена, как определено по уровню толерантности к глюфозинату, соответствует коммерчески приемлемым уровням. Это подтверждает статус результата ЕЕ-ОН6 как элитного результата.
Элитный результат ЕЕ-ОН6 может быть преимущественно комбинирован с другими элитными результатами, доступными на рынке, особенно другими элитными результатами генами устойчивости к насекомым для управления устойчивостью к насекомым, такими как, но не ограничивающимся, результат 3006-210-23 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 03-036-02р) результат 281-24-236 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 03-036-01р); результат ΜΟΝ1 58985 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 00-342-О1р); результат ΜΟΝ531 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 94-308-01р), результат СОТ102 (=8уидеи1а у1р3А) Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 03-155-01р, результат ЕЕ-СН5 описанный в патентной заявке ЕР 07075299.3. Элитный результат ЕЕ-СН6 может также быть комбинирован с элитным результатом устойчивости к гербициду, таким как результат ΜΟΝ1 445 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 95-045-01р) или результат ΜΟΝ88913 (Сообщение службы инспекции о здоровых растениях и животных при госдепартаменте сельского хозяйства США 04-086- 15 018012
0Ιρ).
Как использовано в формуле изобретения ниже, если четко не указано обратное, термин растение подразумевается охватывать растительные ткани, на любой стадии зрелости, также как и любые клетки, ткани или органы, взятые или произошедшие из таких растений, включая без ограничений, любые семена, листья, стебли, цветы, корни, одиночные клетки, гаметы, клеточные культуры или протопласты.
Референсные семена, содержащие элитный результат ЕЕ-СН6, были помещены как ЕЕ-СН6 в АТСС (10801 ишуегкйу Βίνά., Мапаккак, УА 20110-2209) 19 апреля 2007, под АТСС номером доступа РТА-8398. Альтернативное название ЕЕ-6Н6 - 6ΒΗ119.
Как использовано в формуле изобретения ниже, если четко не указано обратное, термин растение подразумевается охватывать растительные ткани, на любой стадии зрелости, также как и любые клетки, ткани или органы, взятые или произошедшие из таких растений, включая без ограничений, любые семена, листья, стебли, цветы, корни, одиночные клетки, гаметы, клеточные культуры или протопласты.
Рассмотренное выше описание изобретения предполагается быть иллюстративным и неограничивающим.
Различные изменения или модификации в описанных вариатах осуществления могут возникнуть у специалиста в области техники. Данные изменения или модификации могут быть произведены без отклонения от смысла или объема изобретения.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ идентификации присутствия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы ΚυΒί^ο, под контролем промотора 358 ί.';·ιιι1ίΠο\\ΌΓ ΜοκαΚ Упик, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям, представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает амплификацию фрагмента ДНК размером 100-500 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных биологических образцах, с использованием полимеразной цепной реакции по крайней мере с двумя праймерами, один из которых распознает указанную 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, или указанную 3'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, другой праймер из указанных праймеров, распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеет последовательность комплементарную 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192, или нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112, и анализ присутствия характерной последовательности ДНК, которая содержит часть указанной чужеродной ДНК и часть указанных непосредственно фланкирующих ее 5'- и 3'-прилегающих областей.
  2. 2. Способ по п.1, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 141 или 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.
  3. 3. Способ по п.1, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной 8ЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438.
    - 16 018012
  4. 4. Способ по п.З, где указанные праймеры содержат последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 3 и БЕЦ ΙΌ Ыо. 4, соответственно, или последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 5 и БЕЦ ΙΌ Ыо. 7, соответственно.
  5. 5. Способ по п.4, где способ включает амплификацию фрагмента примерно 189 или 197 пн с использованием протокола ПЦР идентификации указанной чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'прилегающими областями.
  6. 6. Набор для идентификации присутствия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы КиЫксо, под контролем промотора 35Б Саи1|По\уег Мокаю Уник, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированых в АТСС под номером РТА-8398, при этом набор включает один праймер, распознающий указанную 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, или один праймер, распознающий указанную 3'прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и один праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, где указанная чужеродная ДНК имеет нуклеотидную последовательность комплементарную БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192, или нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.
  7. 7. Набор по п.6, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'прилегающую область, состоящую из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 141 или БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.
  8. 8. Набор по п.6, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.
  9. 9. Набор по п.6, включающий праймер, содержащий последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 4, и праймер, содержащий последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 3, или включающий праймер, содержащий последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 5, и праймер, содержащий последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 7.
  10. 10. Способ скрининга семян на наличие чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы КиЫксо, под контролем промотора 35Б Оаи1|По\\ег Мокаю У1гик, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает определение последовательности ДНК, специфичной для указанной чужеродной ДНК, фланкированной по 5'- и 3'-прилегающим областям, со специфическими праймером, который специфически распознают указанную 5'- или 3'прилегающую область, в партиях образцов семян после амплификации фрагмента ДНК между 100 и 500
    - 17 018012 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных образцах семян, используя полимеразную цепную реакцию с применением по меньшей мере двух праймеров, где один из указанных праймеров распознает 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида в позиции 1 до нуклеотида в позиции 140 или нуклеотидной последовательности БЕО ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида в позиции 1 до нуклеотида в позиции 463, или 3'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида в позиции 113 до нуклеотида в позиции 438, а другой праймер из указанных праймеров распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности БЕО ΙΌ Νο.1 от нуклеотида в позиции 141 до нуклеотида в позиции 192 или нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 2 от позиции 1 до позиции 112.
  11. 11. Способ определения зиготности растений, растительного материала или семян, содержащих чужеродную ДНК, содержащую кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы ΕιιΕί^ο. под контролем промотора 35Б ί.’αιι1ίΠο\\ΌΓ ΜοδαΚ У1ги8, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает амплификацию фрагментов ДНК 100-500 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных биологических образцах с использованием полимеразной цепной реакции по крайней мере с тремя праймерами, два из указанных праймеров специфически распознают растительную ДНК перед вставкой, такой как 5'-прилегающую область указанного элитного результата, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 11 от позиции 1 до позиции 463, или 3'-прилегающую область указанного элитного результата, где указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, или ДНК перед вставкой, имеющую нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 10 или комплементарную ей, третий из указанных праймеров распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112, и анализ присутствия характерной последовательности ДНК, которая содержит часть указанной чужеродной ДНК и часть указанных непосредственно фланкирующих ее 5'- и 3'-прилегающих областей.
  12. 12. Способ определения наличия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы КиЫ8СС, под контролем промотора 35Б ί.’αιι1ίΠο\\ΌΓ Μο8;·ιχ У1ги8, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, посредством гибридизации с комплементарно меченым зондом нуклеиновой кислоты, в котором соотношение зонд:целевая нуклеиновая кислота амплифицировано посредством рециклинга целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где указанный способ включает:
    a) гибридизацию указанной целевой последовательности нуклеиновой кислоты с первым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 158 или комплементарную ей, или с указанным первым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 95 до нуклеотида 112 или комплементарную ей;
    b) гибридизацию указанной целевой последовательности нуклеиновой кислоты со вторым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 123 до нуклеотида 140 или комплементарную ей, или указанным меченым зондом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность БЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 130 или комплементарную ей, где указанные первый и второй олигонуклеотиды перекрываются по крайней мере на один нуклеотид, и где или первый, или второй указанный олигонуклеотид является меченым и является указанным меченым зондом;
    c) расщепление только меченого зонда внутри дуплекса зондщелевая последовательность нуклеи
    - 18 018012 новой кислоты с помощью фермента, который вызывает селективное расщепление зонда, приводящее к диссоциации дуплекса, оставляющей целевую последовательность интактной;
    6) рециклинг целевой последовательности нуклеиновой кислоты повторением стадий (а)-(с) и
    е) детекция расщепленного меченого зонда и, таким образом, определение наличия названной целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
  13. 13. Трансгенное растение хлопчатника, или клетки, части, его семя или потомство, где каждый из них содержит в своем геноме чужеродную ДНК, содержащую кодирующую последовательность гена модифицированного сгу2Ае, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы КиЫвео, под контролем промотора 358 СаийНо^ег Мовак У1гив, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ Νο. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по З'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, геномная ДНК которых при анализе с применением протокола для идентификации указанной чужеродной ДНК, фланкированной по указанным 5'- и 3'прилегающим областям, с двумя праймерами, включающими нуклеотидные последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 3 и 8ЕО ΙΌ Νο. 4 соответственно, дает фрагмент ДНК примерно 189 пн.
EA200971119A 2007-06-11 2008-06-09 Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации EA018012B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07075460 2007-06-11
US93443107P 2007-06-13 2007-06-13
EP07075485 2007-06-18
PCT/EP2008/004652 WO2008151780A1 (en) 2007-06-11 2008-06-09 Insect resistant cotton plants comprising elite event ee-gh6 and methods for identifying same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200971119A1 EA200971119A1 (ru) 2010-04-30
EA018012B1 true EA018012B1 (ru) 2013-04-30

Family

ID=39790009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200971119A EA018012B1 (ru) 2007-06-11 2008-06-09 Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8309818B2 (ru)
EP (2) EP2615173B1 (ru)
CN (2) CN103937904B (ru)
AP (1) AP3195A (ru)
AR (1) AR066951A1 (ru)
AU (1) AU2008261312B2 (ru)
BR (2) BR122017022360B1 (ru)
CO (1) CO6251334A2 (ru)
EA (1) EA018012B1 (ru)
MX (2) MX2009013493A (ru)
WO (1) WO2008151780A1 (ru)
ZA (1) ZA200908664B (ru)

Families Citing this family (292)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2615173B1 (en) * 2007-06-11 2020-09-16 Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc Insect resistant cotton plants and methods for identifying same
NZ601341A (en) 2010-01-22 2014-02-28 Bayer Ip Gmbh Acaricide and/or insecticide active substance combinations
CN103119169B (zh) 2010-06-09 2018-11-20 拜尔作物科学公司 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具
EP2646413A1 (de) 2010-11-29 2013-10-09 Bayer Intellectual Property GmbH Alpha-beta-ungesättigte imine
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
AU2011334989A1 (en) 2010-12-01 2013-06-13 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of fluopyram for controlling nematodes in crops and for increasing yield
WO2012092327A2 (en) * 2010-12-29 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Methods to determine zygosity in a bulked sample
CN102331442B (zh) * 2010-12-29 2013-06-12 河南农业大学 一种快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法
CN102175720B (zh) * 2010-12-29 2012-12-05 河南农业大学 一种快速检测转基因抗蚜棉的方法
US20130345058A1 (en) 2011-03-10 2013-12-26 Wolfram Andersch Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds
EP3292761A1 (en) 2011-03-23 2018-03-14 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations
CN103517900A (zh) 2011-04-08 2014-01-15 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
CN103635089B (zh) 2011-04-22 2016-12-14 拜耳知识产权有限责任公司 包含(硫代)羧酰胺衍生物和杀真菌化合物的活性化合物复配物
EP2720543B1 (en) 2011-06-14 2018-08-22 Bayer CropScience AG Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent
WO2013020985A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
CN103981149A (zh) 2011-08-22 2014-08-13 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
CN103874681B (zh) 2011-09-12 2017-01-18 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌性4‑取代的‑3‑{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}‑1,2,4‑噁二唑‑5(4h)‑酮衍生物
BR112014006217B1 (pt) 2011-09-16 2019-01-15 Bayer Intellectual Property Gmbh utilização de acilsulfonamidas para melhorar o rendimento de plantas,método para induzir respostas de regulação de crescimento em plantas úteis ou plantas de cultura e composição.
BR112014005990B1 (pt) 2011-09-16 2019-12-31 Bayer Ip Gmbh método para induzir uma resposta específica de regulação do crescimento de plantas
UA113967C2 (xx) 2011-09-16 2017-04-10 Застосування 5-феніл- або 5-бензил-2-ізоксазолін-3-карбоксилатів для покращення урожайності рослин
WO2013050410A1 (en) 2011-10-04 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh RNAi FOR THE CONTROL OF FUNGI AND OOMYCETES BY INHIBITING SACCHAROPINE DEHYDROGENASE GENE
EP2782920B1 (en) 2011-11-21 2016-12-21 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicide n-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives
AR089656A1 (es) 2011-11-30 2014-09-10 Bayer Ip Gmbh Derivados de n-bicicloalquil- y n-tricicloalquil-(tio)-carboxamida fungicidas
CN104270946B (zh) 2011-12-19 2017-05-10 拜耳农作物科学股份公司 邻氨基苯甲酸二酰胺衍生物用于防治转基因作物中的害虫的用途
KR102028903B1 (ko) 2011-12-29 2019-10-07 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균 3-[(피리딘-2-일메톡시이미노)(페닐)메틸]-2-치환-1,2,4-옥사디아졸-5(2h)-온 유도체
JP5976837B2 (ja) 2011-12-29 2016-08-24 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ 殺菌性３−［（１，３−チアゾール−４−イルメトキシイミノ）（フェニル）メチル］−２−置換−１，２，４−オキサジアゾール−５（２ｈ）−オン誘導体
HUE052982T2 (hu) 2012-01-23 2021-05-28 Dow Agrosciences Llc Gyomirtótoleráns PDAB4468.19.10.3 gyapotesemény
MX347351B (es) 2012-01-23 2017-04-24 Dow Agrosciences Llc Episodio de algodon resistente a herbicida pdab4468.18.07.1.
EP2806739A1 (en) 2012-01-25 2014-12-03 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent
PL2806740T3 (pl) 2012-01-25 2018-07-31 Bayer Intellectual Property Gmbh Kombinacje związków czynnych zawierające fluopyram, Bacillus i środek do zwalczania biologicznego
PE20190343A1 (es) 2012-02-27 2019-03-07 Bayer Ip Gmbh Combinaciones de compuestos activos
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
JP2015517996A (ja) 2012-04-12 2015-06-25 バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ 殺真菌剤として有用なｎ−アシル−２−（シクロ）アルキルピロリジンおよびピペリジン
JP6109295B2 (ja) 2012-04-20 2017-04-05 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（ヘテロシクリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体
WO2013156560A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
JP6262208B2 (ja) 2012-05-09 2018-01-17 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト ピラゾールインダニルカルボキサミド類
US9375005B2 (en) 2012-05-09 2016-06-28 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
AR091202A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un agente de control biologico y un insecticida
EP3360418A1 (en) 2012-05-30 2018-08-15 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Composition comprising a biological control agent and a fungicide
WO2013178656A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Bayer Cropscience Ag Composition comprising a biological control agent and a fungicide
KR20150021539A (ko) 2012-05-30 2015-03-02 바이엘 크롭사이언스 아게 생물학적 방제제, 및 유사분열 및 세포 분열의 억제제 또는 다중부위 작용을 갖는 화합물로부터 선택된 살진균제를 포함하는 조성물
CN107926985B (zh) 2012-05-30 2021-02-02 拜尔农作物科学股份公司 包含生物防治剂和杀真菌剂的组合物
AR091196A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida
KR20150023478A (ko) 2012-05-30 2015-03-05 바이엘 크롭사이언스 아게 생물학적 방제제, 및 복합체 iii에서의 호흡 연쇄의 억제제로부터 선택된 살진균제를 포함하는 조성물
US9585399B2 (en) 2012-05-30 2017-03-07 Bayer Cropscience Ag Compositions comprising a biological control agent and an insecticide
JP2015528017A (ja) 2012-07-31 2015-09-24 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物性テルペン混合物及び殺虫剤を含んでいる組成物
CN104736699B (zh) 2012-09-14 2020-04-14 拜尔作物科学有限合伙公司 Hppd变体及使用方法
EP2719280A1 (en) 2012-10-11 2014-04-16 Bayer CropScience AG Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi
KR102134565B1 (ko) 2012-10-19 2020-07-16 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 카르복사미드 또는 티오카르복사미드 유도체를 사용한 살진균제에 내성을 가지는 진균에 대항하는 식물의 처리 방법
US20150259294A1 (en) 2012-10-19 2015-09-17 Bayer Cropscience Ag Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives
CA2888600C (en) 2012-10-19 2021-08-10 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
WO2014060519A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
US9943082B2 (en) 2012-11-30 2018-04-17 Bayer Cropscience Ag Ternary fungicidal mixtures
WO2014083033A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropsience Ag Binary fungicidal or pesticidal mixture
US9775351B2 (en) 2012-11-30 2017-10-03 Bayer Cropscience Ag Ternary fungicidal and pesticidal mixtures
UA117819C2 (uk) 2012-11-30 2018-10-10 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Подвійні пестицидні і фунгіцидні суміші
JP6367215B2 (ja) 2012-11-30 2018-08-01 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 二成分殺菌剤混合物
EP2925140A2 (en) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Composition comprising a biological control agent and a fungicide
BR112015012925A2 (pt) 2012-12-03 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag composição que compreende um agente de controle biológico e um fungicida
EP2925144A2 (en) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Composition comprising a biological control agent and an insecticide
EP2925143A2 (en) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Composition comprising a biological control agent and an insecticide
CN105451563A (zh) 2012-12-03 2016-03-30 拜耳作物科学股份公司 包含生物防治剂的组合物
MA38142A1 (fr) 2012-12-03 2016-02-29 Bayer Cropscience Ag Composition comprenant un agent de lutte biologique et un fongicide
WO2014086753A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Composition comprising biological control agents
MX352629B (es) 2012-12-03 2017-12-01 Bayer Cropscience Ag Composición que comprende un agente de control biológico y un insecticida.
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
CN104995174A (zh) 2012-12-19 2015-10-21 拜耳作物科学股份公司 二氟甲基-烟酰-四氢萘基胺
WO2014124369A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and a fungicide
MX2015010259A (es) 2013-02-11 2015-10-29 Bayer Cropscience Lp Composiciones que comprenden un agente de control biologico basado en la cepa nrrl b-50550 de streptomyces microflavus y otro agente de control biologico.
WO2014124379A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and an insecticide
WO2014138339A2 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Athenix Corp. Toxin genes and methods for their use
EP2986117A1 (en) 2013-04-19 2016-02-24 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Binary insecticidal or pesticidal mixture
CN105555135B (zh) 2013-04-19 2018-06-15 拜耳作物科学股份公司 涉及邻苯二甲酰胺衍生物应用的用于改善对转基因植物生产潜能的利用的方法
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
EP3013802B1 (en) 2013-06-26 2019-08-14 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
TW201607929A (zh) 2013-12-05 2016-03-01 拜耳作物科學公司 Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物
CA2932484A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
EP2885970A1 (en) 2013-12-21 2015-06-24 Bayer CropScience AG Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide
MX2016011745A (es) 2014-03-11 2017-09-01 Bayer Cropscience Lp Variantes de hppd y metodos de uso.
WO2015160620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide
WO2015160618A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent
WO2015160619A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide
MX2016013982A (es) * 2014-04-28 2017-01-11 Dow Agrosciences Llc Transformacion de maiz haploide.
EP3081085A1 (en) 2015-04-14 2016-10-19 Bayer CropScience AG Method for improving earliness in cotton
US10214510B2 (en) 2015-04-13 2019-02-26 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-(biheterocyclylethylene)-(thio)carboxamide derivatives
CN106191219B (zh) * 2015-05-04 2019-06-11 中国农业科学院生物技术研究所 一种耐草甘膦转基因陆地棉bg2-7的检测方法及侧翼序列
CN106191218B (zh) * 2015-05-04 2019-05-07 中国农业科学院生物技术研究所 耐草甘膦转基因陆地棉bg2-7的检测方法及侧翼序列
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
CN105009731B (zh) * 2015-06-30 2017-11-07 华中农业大学 玉米考种方法及其系统
MX2018003044A (es) 2015-09-11 2018-04-11 Bayer Cropscience Ag Variantes de hppd y metodos de uso.
US9992943B2 (en) 2016-04-11 2018-06-12 Bayer Cropscience Lp Cotton variety ST 4949GLT
US10010041B2 (en) 2016-04-11 2018-07-03 Bayer Cropscience Lp Cotton variety ST 4848GLT
US10448611B2 (en) 2016-04-11 2019-10-22 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Cotton variety FM 1911GLT
AU2017253562B2 (en) 2016-04-20 2023-02-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event EE-GH7 and methods and kits for identifying such event in biological samples
BR112019001764A2 (pt) 2016-07-29 2019-05-07 Bayer Cropscience Ag combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas
US11091772B2 (en) 2016-11-23 2021-08-17 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC AXMI669 and AXMI991 toxin genes and methods for their use
WO2018114393A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018136611A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Bayer Cropscience Lp Use of bp005 for the control of plant pathogens
EP3571303A1 (en) 2017-01-18 2019-11-27 Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc Bp005 toxin gene and methods for its use
US20170150692A1 (en) 2017-02-13 2017-06-01 Bayer Cropscience Lp Cotton variety fm 1953gltp
US20170150691A1 (en) 2017-02-13 2017-06-01 Bayer Cropscience Lp Cotton variety st 5020glt
BR112019015338B1 (pt) 2017-02-21 2023-03-14 Basf Se Compostos de fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso dos compostos e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos
US11708565B2 (en) 2017-03-07 2023-07-25 BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC HPPD variants and methods of use
CA3056347A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CA3061009A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Bayer Cropscience Lp Method of improving crop safety
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CN110621669A (zh) 2017-05-04 2019-12-27 巴斯夫欧洲公司 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018234139A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 Basf Se 2 - [[5- (TRIFLUOROMETHYL) -1,2,4-OXADIAZOL-3-YL] ARYLOXY] (THIO) ACETAMIDES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
MX2020000971A (es) 2017-07-27 2020-07-13 Basf Se Uso de composiciones herbicidas a base de l-glufosinato en cultivos de campo tolerantes.
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
BR112020004441B1 (pt) 2017-09-18 2024-01-16 Basf Se Compostos da fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso de compostos e método não-terapêutico de combate de fungos
WO2019068811A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Bayer Aktiengesellschaft COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
US11147275B2 (en) 2017-11-23 2021-10-19 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
CN111669972A (zh) 2018-01-29 2020-09-15 巴斯夫农业公司 新农业化学制剂
WO2019154663A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
US11917995B2 (en) 2018-03-01 2024-03-05 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions of mefentrifluconazole
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
EP3802521A1 (de) 2018-06-04 2021-04-14 Bayer Aktiengesellschaft Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole
EP3613736A1 (en) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituted glutarimide derivatives
EP3628158A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide
BR112021006121A2 (pt) 2018-10-23 2021-07-20 Basf Se compostos, uso dos compostos de fórmula (i), mistura de pesticidas, composições agroquímicas ou veterinárias, métodos para controlar pragas invertebradas e para tratar ou proteger animais e semente
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
EP3670501A1 (en) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
PL3908584T3 (pl) 2019-01-11 2023-08-14 Basf Se Krystaliczne postacie 1-(1,2-dimetylopropylo)-n-etylo-5-metylo-n-pirydazyny-4-ylopirazolo-4-karboksyamidu
EP3696177A1 (en) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2020231751A1 (en) 2019-05-10 2020-11-19 Bayer Cropscience Lp Active compound combinations
WO2020239517A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
EP3769623A1 (en) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
AU2020286573A1 (en) 2019-06-06 2021-12-23 Basf Se Fungicidal n-(pyrid-3-yl)carboxamides
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
CA3147858A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituted pyrazoles and triazoles as pest control agents
CN118496198A (zh) 2019-07-23 2024-08-16 拜耳公司 作为农药的新的杂芳基-三唑化合物
TW202118391A (zh) 2019-07-23 2021-05-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物（二）
WO2021022069A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Bayer Cropscience Lp Method of improving cold stress tolerance and crop safety
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
EP4034656A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft Rnai-mediated pest control
JP2022550564A (ja) 2019-10-02 2022-12-02 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 脂肪酸を含んでいる活性化合物組み合わせ
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
DK4041721T3 (da) 2019-10-09 2024-05-27 Bayer Ag Hidtil ukendte heteroaryltriazolforbindelser som pesticider
EP4041393A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
US20220380318A1 (en) 2019-11-07 2022-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Substituted sulfonyl amides for controlling animal pests
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
EP4061131A1 (en) 2019-11-18 2022-09-28 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
AR121242A1 (es) 2020-01-31 2022-05-04 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de escape a la sombra en plantas
US20230148601A1 (en) 2020-02-18 2023-05-18 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
MX2022012878A (es) 2020-04-16 2022-12-08 Pairwise Plants Services Inc Metodos para controlar el tama?o del meristema para la mejora de cultivos.
EP4139304A1 (de) 2020-04-21 2023-03-01 Bayer Aktiengesellschaft 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4143167B1 (en) 2020-04-28 2024-05-15 Basf Se Pesticidal compounds
EP3903583A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii
EP3903584A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv
EP3903582A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii
EP3903581A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
EP4146628A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Bayer Aktiengesellschaft Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds
BR112022023012A2 (pt) 2020-05-12 2022-12-20 Bayer Ag (tio)amidas de triazina e pirimidina como compostos fungicidas
EP3909950A1 (en) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
BR112022023550A2 (pt) 2020-05-19 2023-01-03 Bayer Cropscience Ag (tio)amidas azabicíclicas como compostos fungicidas
EP4156909A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
BR112022024394A2 (pt) 2020-06-04 2023-01-31 Bayer Ag Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas
EP3945089A1 (en) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
US20230234945A1 (en) 2020-06-10 2023-07-27 Bayer Aktiengesellschaft Azabicyclyl-substituted heterocycles as fungicides
CA3186972A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
EP4168404A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection
US20230292747A1 (en) 2020-06-18 2023-09-21 Bayer Aktiengesellschaft Composition for use in agriculture
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
BR112022025710A2 (pt) 2020-06-19 2023-03-07 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
BR112022025692A2 (pt) 2020-06-19 2023-02-28 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas
EP3929189A1 (en) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides
US20230247994A1 (en) 2020-07-02 2023-08-10 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclene derivatives as pest control agents
EP3939961A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
EP3970494A1 (en) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
CN116209355A (zh) 2020-10-27 2023-06-02 巴斯夫农业公司 包含氯氟醚菌唑的组合物
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
EP4259627A1 (en) 2020-12-14 2023-10-18 Basf Se Sulfoximine pesticides
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
MX2023007290A (es) 2020-12-18 2023-07-04 Bayer Ag Uso del inhibidor de dhodh para el control de hongos fitopatogenicos resistentes en cultivos.
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022173885A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants
EP4043444A1 (en) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
US20220380792A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 Pairwise Plants Services, Inc Methods and compositions for modifying root architecture in plants
BR112023019400A2 (pt) 2021-03-30 2023-12-05 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
AU2022270888A1 (en) 2021-05-03 2023-11-09 Basf Se Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms
US20240254121A1 (en) 2021-05-06 2024-08-01 Bayer Aktiengesellschaft Alkylamide substituted, annulated imidazoles and use thereof as insecticides
CN117651702A (zh) 2021-05-12 2024-03-05 拜耳公司 作为害虫防治剂的2-(杂)芳基取代的稠合杂环衍生物
EP4091451A1 (en) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
KR20240008856A (ko) 2021-05-18 2024-01-19 바스프 에스이 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘
CA3218889A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Wassilios Grammenos New substituted pyridines as fungicides
BR112023023989A2 (pt) 2021-05-18 2024-01-30 Basf Se Compostos, composição, método para combater fungos fitopatogênicos e semente
CN117897050A (zh) 2021-06-17 2024-04-16 成对植物服务股份有限公司 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CN117794358A (zh) 2021-07-01 2024-03-29 成对植物服务股份有限公司 用于增强根系发育的方法和组合物
EP4119547A1 (en) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
MX2024001593A (es) 2021-08-02 2024-02-15 Basf Se (3-piridil)-quinazolina.
US20230078990A1 (en) 2021-08-12 2023-03-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
EP4384016A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
EP4388110A1 (en) 2021-08-17 2024-06-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
EP4140986A1 (en) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4392419A1 (en) 2021-08-25 2024-07-03 Bayer Aktiengesellschaft Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides
EP4140995A1 (en) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
MX2024002276A (es) 2021-08-30 2024-03-07 Pairwise Plants Services Inc Modificacion de genes de peptidasa de union a ubiquitinaen plantas para mejorar rasgos de rendimiento.
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4151631A1 (en) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2023049720A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
AR127236A1 (es) 2021-10-04 2024-01-03 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas
AR127300A1 (es) 2021-10-07 2024-01-10 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
CN118541353A (zh) 2021-11-03 2024-08-23 拜耳公司 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚(硫代)酰胺
CN118317956A (zh) 2021-11-30 2024-07-09 拜耳公司 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚噁二嗪
EP4194453A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
EP4198033A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
AU2023216389A1 (en) 2022-02-01 2024-08-08 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in cotton
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
EP4238971A1 (en) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023196886A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023205714A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023215704A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
US20230416771A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240002873A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006791A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
EP4342885A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4361126A1 (en) 2022-10-24 2024-05-01 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv
WO2024104815A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
WO2024104818A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
WO2024104823A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se New substituted tetrahydrobenzoxazepine
WO2024104822A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides
EP4385326A1 (en) 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Biogorup Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
WO2024137438A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect toxin genes and methods for their use
EP4389210A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests
WO2024165343A1 (en) 2023-02-08 2024-08-15 Basf Se New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi
US20240279673A1 (en) 2023-02-16 2024-08-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240294933A1 (en) 2023-03-02 2024-09-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024186950A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057664A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-25 Bayer Bioscience N.V. Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
WO2003013224A2 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants and methods for producing and identifying same
US20030167517A1 (en) * 2001-01-09 2003-09-04 Greta Arnaut Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins
WO2006128571A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce44-69d , insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128568A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag T342-142, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128573A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce43- 67b, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128569A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-14a, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2007017186A1 (en) * 2005-08-08 2007-02-15 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI933131A0 (fi) 1993-07-08 1993-07-08 Sunds Defibrator Woodhandling Skaersystem, skaer, styrdel och fyllningsdel foer maskin anvaend i flishuggning samt foerfarande foer bytning av skaer
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US6008438A (en) * 1998-03-17 1999-12-28 Agripio Seeds, Inc. Cotton cultivar DP 2379
US6395485B1 (en) * 2000-01-11 2002-05-28 Aventis Cropscience N.V. Methods and kits for identifying elite event GAT-ZM1 in biological samples
US20030208789A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Wound-inducible expression in plants
PL1620571T3 (pl) * 2003-05-02 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Zdarzenie kukurydzy TC1507 i sposoby jego wykrywania
EP2615173B1 (en) * 2007-06-11 2020-09-16 Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc Insect resistant cotton plants and methods for identifying same

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057664A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-25 Bayer Bioscience N.V. Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
US20030167517A1 (en) * 2001-01-09 2003-09-04 Greta Arnaut Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins
WO2003013224A2 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants and methods for producing and identifying same
WO2006128571A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce44-69d , insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128568A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag T342-142, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128573A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag Ce43- 67b, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128569A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-14a, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2007017186A1 (en) * 2005-08-08 2007-02-15 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same

Also Published As

Publication number Publication date
CO6251334A2 (es) 2011-02-21
WO2008151780A1 (en) 2008-12-18
EP2162542A1 (en) 2010-03-17
CN101680000B (zh) 2014-06-11
AU2008261312B2 (en) 2013-09-05
EP2615173A1 (en) 2013-07-17
CN103937904B (zh) 2016-08-24
AP2009005060A0 (en) 2009-12-31
ZA200908664B (en) 2011-02-23
AP3195A (en) 2015-03-31
US8309818B2 (en) 2012-11-13
MX2009013493A (es) 2010-01-18
US20130125253A1 (en) 2013-05-16
MX336852B (es) 2016-01-28
US9328390B2 (en) 2016-05-03
EA200971119A1 (ru) 2010-04-30
CN103937904A (zh) 2014-07-23
BRPI0813814B1 (pt) 2018-10-23
US20160251678A1 (en) 2016-09-01
BR122017022360B1 (pt) 2023-12-19
AR066951A1 (es) 2009-09-23
EP2615173B1 (en) 2020-09-16
CN101680000A (zh) 2010-03-24
US20100218281A1 (en) 2010-08-26
BRPI0813814A2 (pt) 2015-08-04
AU2008261312A1 (en) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018012B1 (ru) Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации
US10356996B2 (en) Insect resistant cotton plants and methods for identifying same
US9394566B2 (en) Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same
US8313909B2 (en) Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same
US6951929B2 (en) Methods and kits for identifying elite event GAT-ZM1 in biological samples
EP1871901B1 (en) Elite event a5547-127 and methods and kits for identifying such event in biological samples
BR122017012106B1 (pt) Dna genômico de algodão compreendendo o evento elite ee-gh3

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU