CN103784434A - 原花青素b2在药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。在一种具体的实施方式中，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。在另一种具体实施方式中，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05～1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05～0.4wt%的混合物。在该发明中，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种。本发明提供的原花青素B2能保护骨髓造血干细胞，缓解放疗或化疗药物引起的小鼠骨髓DNA抑制，还能够升高白细胞数量。

Description

原花青素B2在药物中的用途
本申请是申请号为201180038931.5的分案申请，母案申请日为2011年9月14日，母案的发明名称为一种地榆鞣质提取物及其制备方法和用途。
技术领域
本发明涉及原花青素B2在药物中的用途。
背景技术
骨髓抑制，是指骨髓中的血细胞前体的活性下降。血液里的红细胞和白细胞都源于骨髓中的造血干细胞。血液里的血细胞寿命短，常常需要不断补充。为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂。化学治疗和放射治疗以及许多其它抗肿瘤治疗方法，都是针对快速分裂的细胞，因而常常导致正常骨髓细胞抑制，引起患者骨髓造血功能障碍，使得患者体内红细胞、白细胞、血小板等降低，从而导致贫血、出血、免疫机制下降等现象。
白细胞减少症，为常见血液病，它是指外周血液中白细胞持续低于4×109/L。白细胞是人体防御细菌入侵的巡逻兵。白细胞数减少，就会削弱人体抗菌能力，容易受感染。特别是放、化疗、感染患者、风湿病科系统性红斑狼疮等使用免疫抑制剂、传染病科使用抗结核药物利福平等均能引起的外周血白细胞的减少，从而削弱人体抗菌能力，导致免疫力下降等不良反应。目前，白细胞减少症主要分为原因不明性和继发性两种，前者多见，而后者多是由放疗、化疗、感染、免疫因素等引起的骨髓损伤而造成。
白细胞减少症和骨髓抑制都存在白细胞减少这一显著现象，但是，在用药时还是存在一定差异，目前，某些具有升白作用的药物，并不具有骨髓保护的作用，如rhG-CSF具有较强的升白作用，但其对骨髓细胞的损害作用不可忽视。因此，寻找能够升高白细胞浓度并能有效保护骨髓细胞的药物显得十分必要。
地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆Sanguisorbad officinalisL.var.longifolia(Bert.)Yu et Li的干燥根，具有凉血止血、解毒敛疮之功效。地榆药材中含有大量的鞣质类成分（约20%左右），除此之外，还含有皂苷、黄酮等化合物。当前对地榆的大多数研究都围绕地榆皂苷进行，普遍认为地榆升高白细胞作用以及骨髓保护作用的有效成分为地榆皂苷，国内对地榆升白作用的物质基础研究认为，地榆皂苷是促进小鼠骨髓细胞体外增殖的主要活性部位，地榆皂苷也能升高骨髓抑制小鼠的白细胞、红细胞以及血小板数量，而地榆鞣质和地榆黄酮不能促进骨髓细胞增殖，反而在高浓度下会产生骨髓抑制作用（高小平等，地榆促造血作用的有效部位筛选，中国天然药物，2006年4卷2期）。
目前，对地榆鞣质的药效研究较为少见，国外有文献报道称，地榆鞣质具有抗癌作用[Bastow kF.Bort LD.Fukushrma Y et al.Inhibition of DNA topoisomerases by sanguim H-6,acytotoxic dimeric ella-gitan-ton from sanguisorba officinalis.Planta Med,1993;59(3):240-245.]。对地榆鞣质的提取也有部分报道，如高小平等，采用70%含水丙酮对地榆进行提取，得到的提取物中鞣质含量为43.86%（中国天然药物，2006年4卷2期）；由于该方法是采用丙酮提取，未经过分离，得到提取物中除含有鞣质外，还含有皂苷类成分，其中皂苷含量经检测约占15%；王满力等，也采用氧化铝柱来对地榆鞣质和地榆皂苷进行分离，最终将两者分离开（贵州工学院学报，1993年22卷2期）。
目前尚未见将原花青素B2应用于骨髓保护以及治疗白细胞减少症的相关报道。
发明内容
本发明提供原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。
在一种具体的实施方式中，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。
在本发明另一种具体实施方式中，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05～1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05～0.4wt%的混合物。在该发明中，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种，更优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素。
在一个具体实施例中，所述混合物中儿茶素的含量为1～5wt%，优选为2～5wt%，所述混合物中地榆素的含量为0.05～3wt%，优选为1～2wt%。
在上述实施方式中，具体地，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的抑制正常骨髓细胞的药物。或者是，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的贫血、白细胞减少症或血小板减少症的药物。
本发明还提供原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
本发明还提供一种预防和/或治疗骨髓细胞抑制或白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的原花青素B2加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂，优选所述制剂为口服制剂。
本发明的目的在于提供一种地榆鞣质提取物；本发明的另一目的是提供该地榆鞣质提取物，地榆鞣质中含有的化合物的新用途。
本发明提供了一种地榆鞣质提取物，该提取物中含有鞣质的重量百分含量为35%-98.5%w/w；提取物中地榆总皂苷含量＜10%w/w和地榆皂苷Ⅰ的含量＜5%w/w。
优选地，一种地榆鞣质提取物，该提取物中含有鞣质的重量百分含量为35%-98.5%w/w；提取物中地榆总皂苷含量＜10%w/w和地榆皂苷Ⅰ的含量＜5%w/w。
进一步优选地，该提取物中，鞣质的重量百分含量为50%～98.5%。更进一步地，鞣质的重量百分含量为55%～98.5%。
进一步优选地，该提取物中，提取物中地榆总皂苷含量＜7.2%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量＜4.9%w/w。更进一步优选地，提取物中地榆总皂苷含量＜0.001%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量＜0.0001%w/w。
进一步地，地榆鞣质中含有地榆素、儿茶素、原花青素B2，其占该提取物中重量百分含量为地榆素0.05%-3.0%w/w，儿茶素1.0%-5.0%w/w，原花青素B20.05%-1.5%w/w。进一步优选地，其占该提取物中重量百分含量为地榆素1.0%-2.0%w/w，儿茶素2.0%-4.0%w/w，原花青素B20.05%-0.4%w/w。
更进一步地，该提取物中，鞣质的重量百分含量为62%～98.5%。
其中，该提取物来源于蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yu et Li的干燥根。
其中，该提取物是由下述方法制备而成：
（1）提取：取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
（2）纯化：取浓缩液，再经鞣质的常规分离方法处理后，即得地榆鞣质提取物。
其中，所述鞣质的常规分离方法包括色谱法、蛋白质沉淀法、溶剂法、或上述方法的结合。
进一步地，所述色谱法为吸附色谱，优选使用凝胶、大孔吸附树脂。
进一步地，所述蛋白质沉淀法，优选采用明胶进行沉淀。
进一步地，所述溶剂法，是指将含浓缩液的水溶液脱脂处理后，再用乙酸乙酯提取，即得地榆鞣质提取物；
或将浓缩液溶于乙醇和乙酸乙酯中，加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣质提取物。
更进一步地，该提取物是由下述方法制备而成：
（1）提取：取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、10%-90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
（2）纯化：取浓缩液，采用大孔吸附树脂进行吸附除杂，先用水洗脱至无色，再用10%乙醇洗脱，最后用60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，干燥，即得地榆鞣质提取物；或，
取浓缩液，脱脂后，用乙酸乙酯萃取，即得地榆鞣质提取物。
优选地，所述的含水乙醇的浓度为70%；含水丙酮的浓度为70%。
其中，所述大孔吸附树脂为非极性树脂或低极性树脂，优选DA-201、D-101、LSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附树脂。
本发明还提供了上述地榆鞣质提取物的制备方法，它包括如下操作步骤：
（1）提取：取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
（2）纯化：取浓缩液，再经鞣质的常规分离方法处理后，即得地榆鞣质提取物。
其中，所述鞣质的常规分离方法包括色谱法、蛋白质沉淀法、溶剂法、或上述方法的结合。
进一步地，所述色谱法为吸附色谱，优选使用凝胶、大孔吸附树脂。
进一步地，所述蛋白质沉淀法，优选采用明胶进行沉淀。
进一步地，所述溶剂法，是指将含浓缩液的水溶液脱脂处理后，再用乙酸乙酯提取，即得地榆鞣质提取物；
或将浓缩液溶于乙醇和乙酸乙酯中，加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣质提取物。
更进一步地，该提取物是由下述方法制备而成：
（1）提取：取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、10%-90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
（2）纯化：取浓缩液，采用大孔吸附树脂进行吸附除杂，先用水洗脱至无色，再用10%乙醇洗脱，最后用60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，干燥，即得地榆鞣质提取物；或，
取浓缩液，脱脂后，用乙酸乙酯萃取，即得地榆鞣质提取物。
优选地，所述的含水乙醇的浓度为70%；含水丙酮的浓度为70%。
其中，所述大孔吸附树脂为非极性树脂或低极性树脂，优选DA-201、D-101、LSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附树脂。
本发明还提供了上述地榆鞣质提取物在制备具有骨髓保护作用的药物中的用途。
其中，所述的药物是预防或/和治疗骨髓抑制的药物。
进一步地，所述的药物是预防或/和治疗由放疗、化疗引起的正常骨髓细胞抑制的药物。
更进一步地，所述的药物是预防或/和治疗放疗或化疗引起的贫血、白细胞或血小板减少症的药物，优选为预防或/和治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症的药物。
本发明还提供了上述地榆鞣质提取物在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
本发明还提供了地榆素、原花青素B2在制备具有骨髓保护作用的药物中的用途。
其中，所述的药物是预防或/和治疗骨髓抑制的药物。
进一步地，所述的药物是预防或/和治疗由放疗、化疗引起的正常骨髓细胞抑制的药物。
更进一步地，所述的药物是预防或/和治疗放疗或化疗引起的贫血、白细胞或血小板减少症的药物，优选为预防或/和治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症的药物。
本发明还提供了地榆素、原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
本发明还提供了一种预防或治疗骨髓抑制、白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的地榆素、原花青素B2或上述的地榆鞣质提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
其中，所述的制剂为口服制剂。
本发明还提供了肿瘤化疗药物与上述的地榆鞣质提取物在制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。
其中，所述的肿瘤化疗药物为烷化剂类抗肿瘤药。
进一步地，所述的肿瘤化疗药物为环磷酰胺。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，它是由有效量的肿瘤化疗药物和上述的地榆鞣质提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
其中，所述的肿瘤化疗药物为烷化剂类抗肿瘤药。
进一步地，所述的肿瘤化疗药物为环磷酰胺。
本发明地榆鞣质提取物中活性成分为地榆鞣质，具有保护骨髓造血干细胞的作用，其对化学物质和辐射引起的小鼠骨髓DNA抑制有显著保护作用，为临床缓解因放疗、化疗引起的正常骨髓细胞的抑制提供一种新的用药选择。此外，地榆鞣质还能够升高白细胞，具有明显的升白作用。本发明地榆鞣质提取物与化疗药物联合使用时，不但增强了对肿瘤的疗效，还可以保护骨髓细胞和全血细胞，降低或避免化疗药物对骨髓细胞和全血细胞的损伤。因此，在采用放疗、化疗方法治疗癌症前、后，或在治疗过程中，均可以采用放、化疗手段与本发明地榆鞣质提取物联合治疗的方法，以便减轻或避免放、化疗对患者骨髓细胞以及白细胞带来的损害。
具体实施方式
1、本发明中地榆鞣质含量测定：
照《中国药典》2010年版一部附录ⅩB鞣质含量测定项下：
本实验应避光操作。
对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含没食子酸0.05mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.50ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见光光度法（附录V A），在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取提取物粉末约0.1g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置（使固体物沉淀），滤过，弃去初滤液50ml,精密量取滤20ml,置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法
总酚：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。
不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中报温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。
按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚量—不被吸附的多酚量。
2、地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量测定方法见参照文献：地榆多酚的组分分析及功能研究，刘海英，陕西师范大学，2009年。具体测定方法为：
2.1.仪器与试验材料
2.1.1仪器
Agilent1200高效液相色谱仪（Agilent1200二极管阵列检测器；四元泵在线脱气系统；Agilent1200色谱工作站）（美国安捷伦科技有限公司）；
Mettler AE240十万分之一电子分析天平（德国Mettler公司）；
FA1104万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；
KQ3200型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
2.1.2试药
原花青素B2（纯度：HPLC≥99%）；
儿茶素（纯度：HPLC≥99%）；
地榆素（纯度：HPLC≥99%）；
甲醇为色谱纯，水为重蒸水(自制)，其它试剂均为分析纯。
2.1.3地榆鞣质提取物
取实施例的方法制备的地榆鞣质提取物。
2.2.供试品溶液制备
取地榆鞣质提取物约1g，精密称定置100mL容量瓶中，加水90mL，超声处理（功率250W，频率20KHz）30min，取出，放冷，加水定容至刻度，滤过，即得。
2.3.色谱条件的研究
2.3.1检测波长的选择
为了保证图谱的最大信息量化，尽可能多地反映地榆组分全貌，采用甲醇：磷酸缓冲盐二元梯度洗脱，将成分大致分开，柱温30℃。利用二极管阵列检测器（DAD）采集各色谱成分在195nm～400nm光谱区的所有色谱光谱信息，比较了各考察波长下的色谱图中各峰的吸收情况，在265nm下各峰吸收值较大，且基线表现平稳。所以最终确定265nm作为检测波长。
2.3.2色谱条件
试验过程中采用了几种流动相进行试验，以确定最佳流动相，见表1。
表1流动相和洗脱程序
时间（分） 甲醇（%） 0.05%磷酸缓冲盐（%）
0 5 95
80 45 55
90 55 45
91 5 95
100 5 95
2.3.3耐用性考察
取同一批地榆鞣质提取物，分别使用三根不同的品牌和厂家的色谱柱进行试验，以色谱峰分离度和色谱峰数量为评价指标，考察仪器耐用性。
环球柱在所选色谱条件下，所得色谱图及各峰分离效果优于其他两根色谱柱。故综合考虑，选用环球柱。
通过以上试验，确定色谱条件为：
环球色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；DAD检测器；甲醇-0.05%磷酸缓冲盐梯度洗脱程序：0min→80min，甲醇5%→45%，0.05%磷酸缓冲盐95%→55%；80min→90min，甲醇45%→55%，0.05%磷酸缓冲盐55%→45%；90min→91min，甲醇55%→5%，0.05%磷酸缓冲盐45%→95%；91min→100min，甲醇5%→5%，0.05%磷酸缓冲盐95%→95%；检测波长265nm；色谱柱温度30℃；流速1.0ml/min；运行时间：100min。
2.3.4.专属性研究
照“2”项下方法制备供试品溶液，照“3”项下色谱方法检测，记录90min内色谱峰及其保留时间和峰面积。分别精密吸取水溶液、混合对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录90min色谱，并记录各对照物质的光谱图，结果表明，在此条件下空白无干扰。
2.3.5含量测定
3、地榆鞣质提取物中地榆总皂苷和地榆皂苷Ⅰ进行测定，测定方法如下：
1）地榆总皂苷的含量测定方法
对照品溶液制备取5mg地榆皂苷Ⅰ于10ml容量瓶中，加无水乙醇约9ml，超声溶解，放冷，加无水乙醇定容至刻度，即得(每1ml中含0.5mg)。
标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0、200、300、400、500、600、800、1000μl分别置于10ml具塞中试管中，精密加入新配制的8%香草醛乙醇溶液（取香草醛8g，用无水乙醇定容至100ml）1ml，70%硫酸10ml（取70ml硫酸，缓缓注入30ml水中，即得），摇匀，密塞，置60℃水浴15min，放入冰水中冷却2min，摇匀，以未加对照品的比色液为空白，照分光光度法(附录VIB)，在530nm波长处测定吸收度，以吸收度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液制备取地榆鞣质提取物约5g，研细，精密称定，置250ml容量瓶中，加无水乙醇约200ml，超声提取30min，滤过，收集滤液于250ml容量瓶中，用无水乙醇定容至250ml，即得。
测定精密吸取供试品溶液1ml，置于10ml具塞中试管中，照标准曲线项下的方法依法测定吸收度，代入回归方程计算，即得。
2）地榆皂苷Ⅰ的含量测定方法研究
色谱条件色谱柱，安捷伦-Zorbax（4.6mm×250mm，5μm）；流动相，乙腈:水（32:68）；流速，1ml/min；柱温40℃；蒸发光散射检测器。
对照品溶液制备取25mg地榆皂苷Ⅰ于25ml容量瓶中，加无水乙醇约20ml，超声溶解，放冷，加无水乙醇定容刻度，即得(每1ml中含1mg)。
标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5ml，分别置于5ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，精密吸取各溶液10μl，照上述色谱条件，进行测定，以峰面积的自然对数(Y)为纵坐标，进样量的自然对数(X)为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液制备取地榆鞣质提取物约5g，研细，精密称定，置100ml容量瓶中，加无水乙醇约90ml，超声提取30min，放冷，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤头滤过，即得。
测定精密吸取供试品溶液10μl，照上述色谱条件，进行测定，代入回归方程计算，即得。
实施例1：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，70%丙酮闪式提取2次，每次2min，溶媒量第一次10倍量，第二次8倍量，合并滤液，减压浓缩，乙醚与浓缩液1：1体积比萃取脱脂至乙醚层无色，然后用乙酸乙酯与母液1：1体积比萃取富集总酚6次，合并乙酸乙酯，45℃减压低温浓缩至适量，45℃减压干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质62%，地榆素1.32%，儿茶素2.61%，原花青素B20.08%，地榆皂苷:6.2%、地榆皂苷Ⅰ:3.7%，均为重量百分含量。
实施例2：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次2h，溶媒量第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并滤液，减压浓缩，乙醚与浓缩液1：1体积比萃取脱脂至乙醚层无色，然后用乙酸乙酯与母液1：1体积比萃取富集总酚6次，合并乙酸乙酯，45℃减压低温浓缩至适量，45℃减压干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质65%，地榆素1.41%，儿茶素2.65%，原花青素B20.09%，地榆皂苷:5.4%、地榆皂苷Ⅰ:3.1%，均为重量百分含量。
实施例3：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次2h，溶媒量第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并滤液，减压浓缩，乙醚与浓缩液1：1体积比萃取脱脂至乙醚层无色，浓缩液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，55℃减压浓缩至适量，喷雾干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质73%，地榆素1.52%，儿茶素2.88%，原花青素B20.11%，地榆皂苷:3.2%、地榆皂苷Ⅰ:1.7%，均为重量百分含量。
实施例4：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次2h，溶媒量第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并滤液，减压浓缩，除去沉淀，上清液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，经膜浓缩至适量，然后喷雾干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质79%，地榆素1.72%，儿茶素3.24%，原花青素B20.13%，地榆皂苷:2.4%、地榆皂苷Ⅰ:1.3%，均为重量百分含量。
实施例5：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，水煎煮3次，每次2h，加水第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并滤液，减压浓缩，浓缩至适量，除去沉淀，药液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，55℃减压浓缩至适量，然后喷雾干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质61%，地榆素1.22%，儿茶素2.43%，原花青素B20.07%，地榆皂苷:6.9%、地榆皂苷Ⅰ:4.3%，均为重量百分含量。
实施例6：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，水煎煮3次，每次2h，加水第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并滤液，减压浓缩，浓缩至适量，除去沉淀，药液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，经膜浓缩至适量，然后喷雾干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质67%，地榆素1.34%，儿茶素2.59%，原花青素B20.08%，地榆皂苷:5.5%、地榆皂苷Ⅰ:3.4%，均为重量百分含量。
实施例7：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇闪式提取2次，每次2min，溶媒量第一次10倍量，第二次8倍量，合并滤液，膜浓缩至适量，药液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，经膜浓缩至适量，然后喷雾干燥，即得。
含量测定结果为：提取物中含鞣质78%，地榆素1.69%，儿茶素3.35%，原花青素B20.13%，地榆皂苷:3.1%、地榆皂苷Ⅰ:1.4%，均为重量百分含量。
实施例8：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粗粉，用12倍量水60℃温浸2次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至0.5g生药/ml，置于离心机内，4000/转离心10min，取上清液，以流速2BV/h缓缓上样于D-101型大孔吸附树脂，径高比1：5，静态吸附30min后，用2BV水以2BV/h洗涤，再用1BV10%乙醇以2BV/h洗涤，再用2BV60%乙醇以1BV/h洗涤，收集洗脱液，浓缩，干燥即得。
含量测定结果为：提取物中含有鞣质55%。本发明鞣质提取率高达13%以上。地榆皂苷:7.2%、地榆皂苷Ⅰ:4.9%。
其中，选择10批该实施例制备的地榆鞣质，测定其中地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量，测定结果为：
表2十批地榆鞣质提取物含量测定
Figure BDA0000461002760000101
地榆素、儿茶素、原花青素B2的平均含量分别为：1.61%、3.02%、0.12%，均为重量百分含量。
实施例9：本发明地榆鞣质提取物的制备
取地榆药材粉碎成粗粉，水煎煮2次，每次1.5h，加水第一次10倍量，第二次8倍量，合并滤液，减压浓缩，浓缩至适量，除去沉淀，药液进行大孔树脂分离，先用水洗脱至无色，再用2倍柱体积的10%乙醇洗脱，最后用3倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩至适量，然后喷雾干燥，加水溶解，放置1h，滤过沉淀，滤液置于蒸发皿中，缓慢喷入明胶溶液，放置1h，收集沉淀，冷冻干燥12h后取出，研磨成细分，用90%丙酮解析2h，药液于45℃减压回收丙酮至完全，倒出浓缩液，冷冻干燥12h，即得、高纯度的地榆鞣质，鞣质含量为98.5%。
1、地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量为：地榆素2.29%，儿茶素4.85%，原花青素B20.38%
2、鞣质含量测定
照《中国药典》2010年版一部附录ⅩB鞣质含量测定项下：
本实验应避光操作。
对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品48.30mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含没食子酸0.0483mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.50ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见光光度法（附录VA），在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
Figure BDA0000461002760000111
供试品溶液的制备：取三份提取物粉末0.101、0.105、0.997g，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置（使固体物沉淀），滤过，弃去初滤液50ml,精密量取滤20ml,置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法
总酚：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。
不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中报温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。
按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚量－不被吸附的多酚量。
Figure BDA0000461002760000112
3、地榆鞣质提取物中地榆总皂苷和地榆皂苷I的测定：
测定3批地榆鞣质提取物，结果HPLC分析完全检测不到地榆皂苷Ⅰ的峰，紫外测定地榆总皂苷含量其吸光度为0.001，可推断，地榆总皂苷含量＜0.001%和地榆皂苷Ⅰ的含量＜0.0001%。因此，当鞣质含量为98%以上时，地榆总皂苷和地榆皂苷Ⅰ的含量几乎为零。
批号 地榆总皂苷（%） 地榆皂苷Ⅰ（%）
20100609 ＜0.001 ＜0.0001
20100613 ＜0.001 ＜0.0001
20100617 ＜0.001 ＜0.0001
结合实施例1-9中对地榆素、儿茶素、原花青素B2的测定结果可知，本发明地榆鞣质提取物中地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量较为稳定，其占该提取物中重量百分含量为地榆素0.05%-3.0%w/w，儿茶素1.0%-5.0%w/w，原花青素B20.05%-1.5%w/w。进一步优选地，提取物中地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量分别为1.0-2.0%w/w，儿茶素2.0-4.0%w/w，原花青素B20.05-0.4%w/w。
实施例10：大孔树脂纯化地榆鞣质的优化工艺考察
1树脂种类的考察
1.1试验方法大孔树脂经晾干后，分别称取15g，放入100ml具塞锥形瓶中，分别加入2%盐酸50ml浸泡3h，然后用水冲洗至PH为中性，再分别加入2%NaOH溶液50ml浸泡3h，然后用水冲洗至PH为中性，分别加入60ml95%醇使其活化。分别量取地榆鞣质提取液（0.33g/ml）50ml置于已活化的装有大孔树脂的具塞锥形瓶中，使药液完全浸没大孔树脂，使其浸泡24h。然后测定锥形瓶中剩余药液中体积，确定大孔树脂的吸附量；取出锥形瓶中大孔树脂，用95%乙醇浸泡超声1h，然后测定洗脱液中鞣质的含量，再根据吸附前后药液鞣质含量确定其洗脱率。
最大吸附量=(吸附前鞣质含量-吸附后鞣质含量)/大孔树脂质量
洗脱率=洗脱液中鞣质含量/（吸附前药液鞣质含量-吸附后药液鞣质含量）
根据DA-201、D-101、LSA-20、HP-10及AB-8五种大孔树脂的最大吸附量、洗脱率确定树脂种类。
1.2试验结果试验数据见表3。
表3树脂种类的筛选试验
Figure BDA0000461002760000121
通过以上试验，可确定，大孔树酯对地榆鞣质具有较好地吸附、洗脱能力，因此，可以选择大孔树脂来进行鞣质的纯化，本发明中选用D-101为优选树脂。
2D-101大孔树脂渗漏曲线的考察
将预处理的D-101大孔树脂20g装柱，柱体积为30.4cm3，径高比为1:4，用地榆鞣质提取液60ml（0.33g生药材/ml）动态法上样，控制流速为0.77ml/min，使其恒定，从柱底收集流出液，每瓶收集5ml，共收集11瓶，测定各份流出液中鞣质含量。进而确定大孔树脂的渗漏曲线。以体积为横坐标，鞣质含量为纵坐标绘制大孔树脂的渗漏曲线。
从每瓶中精密移取1ml，加水稀释至100ml，精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，然后用29%碳酸钠溶液定容至刻度，静置30min后测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)计算，即得。
表4D-101大孔树脂渗漏曲线数据
综上，药液在30ml后开始渗漏。最佳的上样体积为30ml，药液浓度为0.33g/ml生药材，大孔树脂的用量为20g，因此，最佳药材与大孔树脂的用量比为1:2。
3洗脱曲线的考察
取0.33g生药材/ml的地榆鞣质提取液60ml，然后取筛选出的D-101大孔树脂20g上柱，上样流速控制恒定，柱体积为30.4cm3，径高比为1:4，吸附1h，使其饱和，分别用1倍柱体积的水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇进行洗脱，控制流速恒定，收集洗脱液，测定其鞣质的含量，比较不同洗脱剂浓度对大孔树脂吸附的影响。
取洗脱液0.5ml，稀释至100ml，精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，然后用29%碳酸钠溶液定容至刻度，静置30min后测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)计算，即得。试验数据见表5。
表5不同洗脱溶剂对洗脱曲线的影响
综合考虑洗脱曲线与实际生产成本，选用60%乙醇对鞣质进行洗脱。
4均匀设计优化工艺参数
以鞣质含量、转移率及总评归一值（OD值）为评价指标，采用U5（54）均匀设计表考察径高比、药液浓度、流速、60%醇用量5个水平对鞣质纯化效果的影响。均匀设计表安排各因素、水平如表6，试验数据如表7：
表6均匀设计因素水平表
Figure BDA0000461002760000141
表7均匀设计试验数据表
Figure BDA0000461002760000142
经spss17.0软件分析结果，主要输出结果显示选入了x3，R2=0.85，方差分析显示F=16.192，P=0.026，逐步回归有统计学意义。
Anovab
Figure BDA0000461002760000143
a.预测变量:(常量),x3。
b.因变量:y
方程系数，x3的偏回归系数t统计量=-4.112，单侧P=0.026，应保留，即回归方程为y=1.092—0.172x3，因回归方程x3项为负号，且不含x1，x2，x4项，故x3应取试验范围最小值。根据实际可取x1=1：5，x2=2，x4=0.5。最优点的近似估计为：x3=1，即，最佳工艺参数为：径高比1:5、药液浓度0.5、流速1BV/h、60%醇用量2倍。
系数a
Figure BDA0000461002760000151
a.因变量:y
5大孔吸附树脂纯化地榆鞣质工艺验证试验
按照上述最佳工艺，其OD值预测值为0.92，对该结果进行验证。
表8工艺验证(HPLC)
Figure BDA0000461002760000152
结果表明，纯化工艺结果较稳定。
6小结
根据以上实验结果，拟定地榆纯化条件为：取地榆提取液，浓缩至0.5g生药/ml，置于离心机内，4000/转离心10min，取上清液，以流速2BV/h缓缓上样于D-101型大孔吸附树脂，径高比1：5，静态吸附30min后，用2BV水以2BV/h洗涤，再用1BV10%乙醇以2BV/h洗涤，再用2BV60%乙醇以1BV/h洗涤，收集洗脱液，浓缩，干燥即得。
在应用过程中，也可以选择其他大孔吸附树脂对地榆鞣质进行纯化。现有技术报道的地榆鞣质提取方法的得率低，均在10%以下；本发明方法提取率高，达13%以上。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明地榆鞣质骨髓保护作用
1、地榆鞣质提取物
取实施例9制备的高纯度地榆鞣质，鞣质含量为98.5%。
2、地榆鞣质对化学物质引起的骨髓抑制药效研究
2.1实验材料
KM小鼠（♀各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；高纯度地榆鞣质（鞣质含量98%以上）；注射用环磷酰胺；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水。
2.2实验方法
2.2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将60只小鼠按性别分层完全随机分为6组（具体分组与给药情况见表9，于造模前预防ig给药3d。第4d除空白组ip给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重ip环磷酰胺100mg/kg·d，连续3d。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表9动物分组与给药剂量
Figure BDA0000461002760000161
2.2.2评价指标与数据处理
在造模后第7d眼眶采血，采用全自动血球计数仪检测外周血常规参数，包括白细胞WBC数，红细胞RBC，血红蛋白HGB，血小板PLT，同时取脾脏称重，计算脾脏系数。处死上述小鼠,取左侧完整股骨,除净软组织,用0.005mol/L CaCl210mL将全部骨髓冲入试管中,置4℃冰箱30min,2500r/min离心15min,弃去上清,将沉淀物加0.2mol/L HClO45mL充分混匀,90℃加热15min,放冷后3500r/min离心10min,取上清,用酶标仪于260nm波长处测定OD值。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
2.2.3结果分析
地榆鞣质对环磷酰胺所致小鼠外周血象的白细胞、红细胞、血小板减少及脾脏系数的影响见表10。小鼠腹腔注射环磷酰胺可使外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数明显降低，脾脏系数、骨髓DNA含量明显降低，与空白组比较有统计学差异。与模型组比较，地榆鞣质高、中、低剂量组以及rhG-CSF可明显升高白细胞数（P＜0.05），提高脾脏系数；地榆鞣质高剂量组可明显升高外周红细胞数与血小板数，地榆鞣质与rhG-CSF对血红蛋白含量影响不大；地榆鞣质高剂量组可明显升高骨髓DNA含量（P＜0.05），而rhG-CSF对骨髓DNA含量反而起到损害作用。
表10地榆鞣质对化学物质引起的骨髓抑制药效研究
（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000171
Δ:与模型组比P＜0.05；
由上述实验可知，rhG-CSF具有较强的升白作用，可使白细胞数显著高过正常组（P＜0.05），但rhG—CSF没有保护骨髓作用，还通过刺激加速骨髓细胞分化，进一步加重造血干细胞的负荷，这是其骨痛等副作用发生的原因之一。rhG—CSF是调节骨髓中粒系造血的主要细胞因子之一，对放化疗所致的白细胞、红细胞和血小板减少症有显著治疗作用，其升白机理为选择性作用于粒系造血祖细胞，直接促进其增殖、分化，并可增加粒系终末分化细胞的功能，从而使白细胞快速升高。
本发明地榆鞣质对化学物质环磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制，包括外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数明显降低、骨髓DNA含量减少均有显著保护作用（P＜0.05），且呈现一定量效关系：高＞中＞低。本发明制备得到的地榆鞣质纯度高达98%以上，试验证明，地榆鞣质对化学物质所致的骨髓抑制以及白细胞、红细胞和血小板减少症具有明显的治疗作用。
3、地榆鞣质对辐射引起的骨髓抑制药效研究
3.1实验材料
KM小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000172
各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；地榆鞣质（鞣质含量98%以上）；钴60射线外照机；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水。
3.2实验方法
3.2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将60只小鼠按性别分层完全随机分为6组（具体分组与给药情况同“地榆鞣质对化学物质引起的骨髓抑制药效研究”内容），于造模前预防ig给药3d。第4d除了正常组，其余各组均置于分隔好的圆形塑料盒中，以盒盖为中心定距离，用钴60射线一次性全身照射7.5Gy，剂量率为82.6cGy/min，照射距离80cm。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
3.2.2评价指标与数据处理
本实验采用白细胞WBC数为观察指标。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
3.3结果分析
地榆鞣质对钴射线所致小鼠骨髓抑制的影响见表11。
表11地榆鞣质对钴射线所致小鼠骨髓抑制的影响（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000181
Δ:P＜0.05，与模型组比较；另，地榆鞣质也对红细胞、血小板等有升高趋势（P＜0.05）。
由结果可知，rhG-CSF具有极强的升白作用，可使白细胞数显著高过正常组（P＜0.05），但是，与“地榆鞣质对化学物质引起的骨髓抑制药效研究”相同，给予rhG-CSF组的骨髓DNA含量反而呈降低趋势。
地榆鞣质对化学物质所致小鼠骨髓DNA含量减少以及白细胞降低均有显著保护作用（P＜0.05），且呈现一定量效关系：高＞中＞低。本发明地榆鞣质纯度高于98%以上，试验证明，地榆鞣质对辐射引起的骨髓抑制以及白细胞、红细胞和血小板减少症具有明显的治疗作用。
试验例2本发明地榆鞣质及其组分的药效研究
有文献报道称地榆鞣质中含有地榆素、儿茶素、原花青素B2、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯（地榆多酚的组分分析及功能研究，刘海英，陕西师范大学，2009年），因此，设计以下实验以揭示本发明地榆鞣质中的主要活性物质，并与单一化合物进行活性的对比。
1、地榆鞣质及其组分对化学物质引起的骨髓抑制药效研究
1.1实验材料
KM小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000182
各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；注射用环磷酰胺；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水；高纯度地榆鞣质(实施例9制得，鞣质含量98%以上)；地榆素（HPLC＞99%）；儿茶素（HPLC＞99%）；原花青素B2（HPLC＞99%）；没食子儿茶素（HPLC＞99%）；儿茶素没食子酸酯（HPLC＞99%）；表儿茶素（HPLC＞99%）；表没食子儿茶素没食子酸酯（HPLC＞99%），上述单体化合物均购买于成都普瑞法科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将110只小鼠按性别分层完全随机分为11组（具体分组与给药情况见表12），于造模前预防ig给药3d。第4d除空白组ip给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重ip环磷酰胺100mg/kg·d，连续3d。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表12动物分组与给药剂量
1.2.2评价指标与数据处理
本实验采用白细胞WBC数为观察指标。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
1.2.3结果分析
表13地榆鞣质及其组分对化学物质引起的骨髓抑制药效研究（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000201
Δ:P＜0.05，与模型组比较；☆:P＜0.05，地榆鞣质与儿茶素比较；另，地榆鞣质也对红细胞、血小板等有升高趋势（P＜0.05）。
上述实验结果证明，地榆鞣质中所含的儿茶素、地榆素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯等组分，均对环磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制有一定治疗作用，其中地榆素、儿茶素、原花青素B2有显著性作用（P＜0.05），且地榆素药效最强，儿茶素次之，原花青素B2稍弱。此外，相同剂量下，地榆鞣质的作用较地榆素、儿茶素等组分强，揭示各组分之间有协同作用。
2、地榆鞣质及其组分对辐射引起的骨髓抑制药效研究
2.1实验材料
KM小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000202
各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；钴60射线外照机；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水；高纯度地榆鞣质(实施例9制得，鞣质含量98%以上)；地榆素（HPLC＞99%）；儿茶素（HPLC＞99%）；原花青素B2（HPLC＞99%）；没食子儿茶素（HPLC＞99%）；儿茶素没食子酸酯（HPLC＞99%）；表儿茶素（HPLC＞99%）；表没食子儿茶素没食子酸酯（HPLC＞99%）。
2.2实验方法
2.2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将110只小鼠按性别分层完全随机分为11组（具体分组与给药情况同“地榆鞣质及其组分对化学物质引起的骨髓抑制药效研究”内容），于造模前预防ig给药3d。第4d除了正常组，其余各组均置于分隔好的圆形塑料盒中，以盒盖为中心定距离，用钴60射线一次性全身照射7.5Gy，剂量率为82.6cGy/min，照射距离80cm。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
2.2.2评价指标与数据处理
同试验例1。
2.3结果分析
表14地榆鞣质及其组分对辐射引起的骨髓抑制药效研究
（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000211
Δ:P＜0.05，与模型组比较；☆:P＜0.05，地榆鞣质与儿茶素比较；另，地榆鞣质提取物也对红细胞、血小板等有升高趋势（P＜0.05）。
实验证明，地榆鞣质中所含的儿茶素、地榆素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯等组分，均对辐射所致的小鼠骨髓抑制有一定治疗作用，其中地榆素、儿茶素、原花青素B2有显著性作用（P＜0.05），且地榆素药效最强，原花青素B2次之，儿茶素稍弱。此外，相同剂量下，地榆鞣质的作用较地榆素、儿茶素、原花青素B2等组分强，各组分之间有协同作用。
综上，地榆鞣质对化学损伤和辐射损伤所造成的骨髓抑制和白细胞、红细胞、血小板减少的主要活性成分为地榆素、原花青素B2、儿茶素，其中地榆素对两种模型治疗作用均较强，而儿茶素和原花青素B2各有侧重，儿茶素对化学损伤保护作用较好，原花青素B2侧重于对物理损伤的保护。通过上述研究也表明了，地榆鞣质各组分之间有协同作用。
上述实验充分说明，地榆鞣质能够对抗由化学损伤和辐射损伤所造成的骨髓抑制，以及由此引起的白细胞、红细胞、血小板减少，可以预见因其对骨髓的保护作用使得其与抗肿瘤药物联合使用时，具有极乐观的临床应用前景。
由于现有技术均认为地榆皂苷为升高白细胞的活性物质，发明人谨慎地进行了一系列实验，对地榆升白作用的物质基础作了进一步研究。
试验例3本发明地榆鞣质升白作用的物质基础研究
1、实验材料
KM小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000222
各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；高纯度地榆鞣质（鞣质含量98%以上，实施例9制备）；注射用环磷酰胺；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水。
2、实验方法
2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将70只小鼠按性别分层完全随机分为7组（具体分组与给药情况见表15），于造模前预防ig给药3d。第4d除空白组ip给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重ip环磷酰胺100mg/kg·d，连续3d。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表15动物分组与给药剂量
2.3评价指标与数据处理
本实验采用白细胞WBC数为观察指标。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
3、结果分析
通过表16白细胞数WBC实验结果分析可知，①空白组与模型组之间有显著性差异（P＜0.05），说明环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的动物模型造模成功。②地榆鞣质高、低剂量组、阳性组与模型组之间有显著性差异（P＜0.05），说明地榆鞣质对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症有良好治疗作用；其余给药组与模型组之间无显著性差异（P＞0.05），其余给药组对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症无治疗作用③地榆鞣质的药效强度呈现明显量效关系：高剂量＞低剂量（P＜0.05）。
表16白细胞数WBC实验结果（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000231
Δ:与模型组比P＜0.05
☆:与除鞣质组比P＜0.05
试验例4本发明地榆鞣质提取物升白作用的物质基础研究
1、实验材料
KM小鼠（♀各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；地榆鞣质提取物（实施例8所制，提取物中含有鞣质55%，地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量分别为：1.61%、3.02%、0.12%，均为重量百分含量。地榆皂苷的百分含量为7.2%、地榆皂苷Ⅰ为4.9%）；注射用环磷酰胺；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水。
2、实验方法
2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将70只小鼠按性别分层完全随机分为7组（具体分组与给药情况见表17），于造模前预防ig给药3d。第4d除空白组ip给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重ip环磷酰胺100mg/kg·d，连续3d。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表17动物分组与给药剂量
Figure BDA0000461002760000232
Figure BDA0000461002760000241
2.3评价指标与数据处理
本实验采用白细胞WBC数为观察指标。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
3、结果分析
通过表18白细胞数WBC实验结果分析可知，①空白组与模型组之间有显著性差异（P＜0.05），说明环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的动物模型造模成功。②地榆鞣质高、低剂量组、阳性组与模型组之间有显著性差异（P＜0.05），说明地榆鞣质对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症有良好治疗作用；其余给药组与模型组之间无显著性差异（P＞0.05），其余给药组对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症无治疗作用③地榆鞣质的药效强度呈现明显量效关系：高剂量＞低剂量（P＜0.05）。
表18白细胞数WBC实验结果（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000242
Δ:与模型组比P＜0.05
☆:与除鞣质组比P＜0.05
4、结论
试验例3和试验例4的试验表明，本发明地榆鞣质提取物对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症有显著的治疗作用（P＜0.05），与此同时，采用明胶除去地榆鞣质提取物中的鞣质成分后，无治疗效果，进一步证明地榆鞣质是治疗白细胞减少症的有效成分。
试验例5地榆皂苷升白以及骨髓保护作用研究
1实验材料
KM小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000252
各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；地榆皂苷提取物（98.18%）；注射用环磷酰胺；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水。
地榆皂苷的制备：取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，70℃减压浓缩药液至适量（无乙醇味），转移至分液漏斗，先用水饱和的乙醚脱脂2次，母液70℃减压回收混入的乙醚，然后加水定溶至，再用水饱和的正丁醇萃取2次，萃取液80℃减压浓缩，加一定浓度的乙醇将固形物溶解，转移至烧杯中，加水适量，调pH至10-14，放置，离心，取出沉淀，70℃真空干燥2h，转移至具塞三角瓶中，加无水乙醇超声提取，滤过，滤液70℃减压回收乙醇至刚有固形物析出，转移至蒸发皿中，80℃水浴挥干乙醇，70℃真空干燥12h，取出，研磨，即得。地榆皂苷含量98.18%。
2实验方法
2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将60只小鼠按性别分层完全随机分为6组（具体分组与给药情况见表19），于造模前预防ig给药3d。第4d除空白组ip给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重ip环磷酰胺100mg/kg·d，连续3d。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表19动物分组与给药剂量
Figure BDA0000461002760000251
2.2评价指标与数据处理
在造模后第7d眼眶采血，采用全自动血球计数仪检测外周血常规参数，包括白细胞WBC数，红细胞RBC，血红蛋白HGB，血小板PLT，同时取脾脏称重，计算脾脏系数。处死上述小鼠,取左侧完整股骨,除净软组织,用0.005mol/L CaCl210mL将全部骨髓冲入试管中,置4℃冰箱30min,2500r/min离心15min,弃去上清,将沉淀物加0.2mol/L HClO45mL充分混匀,90℃加热15min,放冷后3500r/min离心10min,取上清液,用酶标仪于260nm波长处测定OD值。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
2.3结果分析
地榆皂苷提取物对环磷酰胺所致小鼠外周血象的白细胞、红细胞、血小板减少及脾脏系数的影响见表20。与模型组比较，地榆皂苷提取物高、中、低剂量组均无明显升高白细胞数（P＞0.05），对环磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制无明显治疗作用（P＞0.05）。
表20地榆皂苷提取物的药效研究（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000261
Δ:与模型组比P＞0.05
目前普遍认为“地榆升高白细胞作用以及骨髓保护作用的有效成分为地榆皂苷，地榆皂苷能升高骨髓抑制小鼠的白细胞、红细胞以及血小板数量，而地榆鞣质和地榆黄酮不能促进骨髓细胞增殖，反而在高浓度下会产生骨髓抑制作用”，在生产制备地榆提取物时，当然以获得地榆皂苷为目标，然而，发明人通过上述实验，却意外地发现，地榆中升高白细胞的活性成分，并不是地榆皂苷，而是地榆鞣质。
试验例6地榆鞣质以及地榆皂苷对肿瘤影响试验
1实验材料
C57小鼠（♀
Figure BDA0000461002760000262
各半，18～22g，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；注射用环磷酰胺；地榆鞣质提取物（实施例9制得，鞣质含量98%以上）；生理盐水。
路易斯肺癌瘤株混悬液：选择接种瘤细胞后7天的小鼠脱颈处死，无菌抽取腹水，离心，去除上清液，取下层瘤细胞用生理盐水稀释成250mg/ml的瘤细胞液。
地榆皂苷的制备：取地榆药材粉碎成粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，70℃减压浓缩药液至适量（无乙醇味），转移至分液漏斗，先用水饱和的乙醚脱脂2次，母液70℃减压回收混入的乙醚，然后加水定溶，再用水饱和的正丁醇萃取2次，萃取液80℃减压浓缩，加一定浓度的乙醇将固形物溶解，转移至烧杯中，加水适量，调pH至10-14，放置，离心，取出沉淀，70℃真空干燥2h，转移至具塞三角瓶中，加无水乙醇超声提取，滤过，滤液70℃减压回收乙醇至刚有固形物析出，转移至蒸发皿中，80℃水浴挥干乙醇，70℃真空干燥12h，取出，研磨，即得。地榆皂苷含量98.18%。
2分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。取C57小鼠60只，按体重随机分成模型组、环磷酰胺组、地榆鞣质组、地榆鞣质+环磷酰胺组、地榆皂苷组、地榆皂苷+环磷酰胺组共6组（具体分组与给药情况见表21）。各组动物通过腋下皮下注射的方式接种0.2ml路易斯肿瘤株混悬液，造模1次。除给予环磷酰胺通过ip.的方式给药外，各组动物按照每10g体重给予0.2ml药液的方式灌胃给药，模型组给予相应的生理盐水，连续给药14天。
表21动物分组与给药剂量
Figure BDA0000461002760000271
3评价指标与数据处理
各组动物于第15天处死，切取动物腋下肿瘤，称重，记录肿瘤抑制率。实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
抑瘤率（%）=[模型组平均（瘤重/体重）-实验组平均（瘤重/体重）]/模型组平均（瘤重/体重）×100%
4结果分析
表22地榆鞣质以及地榆皂苷对肿瘤影响试验
Figure BDA0000461002760000272
Δ:与模型组比P＜0.05
虽然文献报道了地榆皂苷具有抗肿瘤的作用，但从上述实验结果可以看出，地榆皂苷组对肿瘤没有抑制作用，反而有刺激肿瘤生长的副作用，而且，地榆皂苷与环磷酰胺联合使用后，其肿瘤抑制率低于环磷酰胺，这表明，地榆皂苷拮抗了化疗药物对肿瘤的治疗作用；而在使用地榆鞣质后，不但增强了对肿瘤的疗效，同时，还可以保护骨髓细胞和全血细胞，降低或避免化疗药物对骨髓细胞和全血细胞的损伤。因此，需控制本发明地榆鞣质提取物中地榆皂苷的含量，以防止地榆皂苷产生的副作用。根据实施例和试验例结果，地榆鞣质提取物中地榆总皂苷的重量百分含量＜10%w/w、地榆皂苷Ⅰ重量百分含量＜5%w/w，优选地，提取物中地榆总皂苷含量＜0.001%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量＜0.0001%w/w。
试验例7本发明地榆鞣质提取物对骨髓保护的药效实验
1实验材料
KM小鼠（♀各半，18～22g，清洁级，合格证号：SCXK(川)2004-15，购自于四川省医学科学院实验动物研究所）；全自动血球计数仪（MEK-6318，购自于日本光电工业株式会社）；电子分析天平（BP211D，购自于德国赛多利斯公司）；酶标仪；钴60射线外照机；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75μg）；生理盐水；实施例1-8所得地榆鞣质提取物（其中，鞣质的重量百分含量在55%～79%之间，皂苷重量百分含量＜10%w/w）。
2实验方法
2.1分组与给药
本实验动物饲养于成都中医药大学药理实验动物观察室，于实验开始前适应环境3天，正常给予饮食和水。将110只小鼠按性别分层完全随机分为11组（具体分组与给药情况见表23），于造模前预防ig给药3d。第4d除了正常组，其余各组均置于分隔好的圆形塑料盒中，以盒盖为中心定距离，用钴60射线一次性全身照射7.5Gy，剂量率为82.6cGy/min，照射距离80cm。除西药阳性组外，从造模当日起继续ig给药6d。第7～9天皮下注射rhG-CSF。
表23分组与给药
2.2评价指标与数据处理
在造模后第7d眼眶采血，采用全自动血球计数仪检测外周血常规参数，包括白细胞WBC数，红细胞RBC，血红蛋白HGB，血小板PLT，同时取脾脏称重，计算脾脏系数。处死上述小鼠,取左侧完整股骨,除净软组织,用0.005mol/L CaCl210mL将全部骨髓冲入试管中,置4℃冰箱30min,2500r/min离心15min,弃去上清,将沉淀物加0.2mol/L HClO45mL充分混匀,90℃加热15min,放冷后3500r/min离心10min,取上清,用酶标仪于260nm波长处测定OD值。
实验数据以mean±S.D.表示，采用SPSS软件，统计检验用成组t检验和单因素F检验，检验水平α=0.05。
2.3结果分析
地榆鞣质对钴射线所致小鼠骨髓抑制的影响见表24。
表24不同制备方法的地榆鞣质的药效对比研究（mean±S.D.，n=10）
Figure BDA0000461002760000292
Δ:与模型组比P＜0.05
由结果可知，本发明地榆鞣质提取物对化学物质所致小鼠骨髓DNA含量减少以及白细胞降低均有显著保护作用（P＜0.05），且随着地榆鞣质含量越高，地榆素、儿茶素、原花青素B2等组分的含量越高，则药效呈上升趋势。
试验例8地榆鞣质提取物的副作用研究
1急性毒性实验
KM小鼠随机分为空白组和给药组，每组20只动物，空白组灌胃给予生理盐水，给药组以动物能耐受的最大浓度、最大体积的药量一次灌胃给予动物，折算为提取物2g/ml，连续观察两周。结果，无明显毒副作用。经计算得小鼠对地榆鞣质提取物（实施例9制备）的最大耐受量为80g/kg。
2不同给药途径试验
KM小鼠随机分为肌肉注射组、灌胃组、腹腔注射组、皮下注射、静脉注射组，每组10只动物，除空白组外分别给以等同剂量的地榆鞣质提取物（实施例9制备）10mg/kg，连续14天，处死动物，解剖观测动物组织形态学变化，拍照。
结果，鞣质的其他给药途径具有很强的副作用，表现为：
腹腔注射：组织、肌肉的粘连病变
肌肉注射：肌肉有诸多瘀血
皮下注射：皮下组织充血
静脉注射：小鼠立即死亡
但是，灌胃无明显不良反应，说明地榆鞣质适宜于灌胃给药。
通过上述药效实验可以证明，本发明地榆鞣质提取物中含有鞣质的重量百分含量为35%-98.5%w/w；地榆总皂苷的重量百分含量＜10%w/w、地榆皂苷Ⅰ重量百分含量＜5%w/w，其中的活性成分为地榆鞣质，且随着地榆鞣质含量越高，药效呈上升趋势，且高纯度地榆鞣质在同等剂量下，优于其中含有的化合物地榆素、儿茶素等，具有保护骨髓造血干细胞的作用，其对化学物质和辐射引起的小鼠骨髓DNA抑制有显著保护作用，能够升高白细胞，与化疗药物联合使用时，不但增强了对肿瘤的疗效，还可以保护骨髓细胞和全血细胞，降低或避免化疗药物对骨髓细胞和全血细胞的损伤，且制备工艺简单，得率高，为临床治疗和预防因放疗、化疗引起的正常骨髓细胞的抑制提供一种新的用药选择。
工业应用性
本发明地榆鞣质具有保护骨髓造血干细胞的作用，其对化学物质和辐射引起的小鼠骨髓DNA抑制有显著保护作用。同时，地榆鞣质还能够升高白细胞，具有明显的升白作用。该产品为临床缓解因放疗、化疗引起的正常骨髓细胞的抑制提供一种新的用药选择，具有极好的临床应用和工业化前景。

Claims (10)

1.原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05～1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05～0.4wt%的混合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述混合物中儿茶素的含量为1～5wt%，优选为2～5wt%，所述混合物中地榆素的含量为0.05～3wt%，优选为1～2wt%。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的抑制正常骨髓细胞的药物。
7.根据权利要求1～5中任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的贫血、白细胞减少症或血小板减少症的药物。
8.原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
9.一种预防和/或治疗骨髓细胞抑制或白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的原花青素B2加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
10.根据权利要9所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为口服制剂。
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