CN103764169A - 用于非病毒转移核酸的全氟化化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通式(I)的化合物：A-B-C(F，G′)-D-E-F-G-A′或通式(Ⅱ)结构的化合物：A-B-C(F′，G′)-D-B-E-F-G-A′(Ⅱ)，其特征在于，其中-A为至少一个选自全氟化碳(PFC)、全氟化硅化合物和／或进一步全氟化化合物的组中的分子，-B为至少一个物理、化学或酶可断裂键形式的预定断裂点，-C不存在或为至少一个连接分子，-D不存在或为至少一个间隔分子，-E为至少一个选自核碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、修饰的核碱基、修饰的核苷、修饰的核苷酸、修饰的寡核苷酸、修饰的核酸、肽核酸单体、肽核酸低聚物以及肽核酸或其它核酸类似物的组中的分子，-F，F′不存在或为至少一个配体，-G，G′不存在或为至少一个标记分子，-A′不存在或为A的含义，并且其中化合物i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)除外。本发明还涉及所述化合物用于分子E非病毒转移至细胞中的用途，含有所述化合物的药物组合物，以及所述药物组合物的用途。

Description

用于非病毒转移核酸的全氟化化合物

本发明的主题为根据权利要求1的化合物，根据权利要求15的其用途，根据权利要求16的药物组合物以及根据权利要求18的其用途。

非病毒基因转移是一个基础研究和医学中的受关注的重要领域。可能的应用特别与传统遗传疾病和获得的遗传疾病(如HIV、慢性感染性疾病、肿瘤、心脏和循环系统疾病)有关。过去，在医学中试图建立的基因治疗都是关注病毒载体。然而，它们有实质缺陷。这些应用不足够安全，它在体内一次应用后更加触发免疫反应，这使得不可能有第二次应用。除此之外，多次报告了事故的发生，其中治疗使得病人病重或者甚至去世。

病毒基因转移的一个替代是非病毒基因转移。然而，到目前为止所有已知的方法低效以至于不能在医学中使用。非病毒转移方法包括不涵盖病毒的所有方法。

已经研究了无修饰的DNA或RNA的转移，然而在以前的形式中几乎没有提供可能的实际应用，这是因为要向打开的组织进行输血或者向血管中注射，并且与核酸酶有关的RNA和DNA非常脆弱。更重要的是，转染率非常低。

为了解决上述问题，通过与阳离子聚合物（例如PEI、PEG、PLL、PLA)或与阳离子脂质(例如CTAB、DOTMA、DOTAP)的DNA或RNA复合物的非病毒核酸转移变得越来越重要。这种分子的正电荷中和核酸的糖-磷酸酯结构的负电荷，并促进通过细胞膜进入细胞的细胞质的吸收。这些方法有许多专利。然而，在此背景下的研究结果只标志着一个趋势的开始。毕竟，除了仍然不令人满意的转染率，这些聚合物和脂质的毒性代表了对细胞的重要阻碍。除此之外，由于聚合物的可生物降解能力太低，这些复合物易于在细胞质内凝聚成块。DNA或RNA的载入速率随聚合物或脂质正电荷水平而增加。但正是这些高度带正电的分子，已经被证明对细胞特别有害。为了减少这些阳离子聚合物和脂质的毒性，越来越多地将它们与亲水聚合物结合，但是以这种方式没有达成突出的改善。

以前已知的用于非病毒基因转移的转移分子除了它们的低效率以外，还具有第二个共同的缺点：在转运至细胞内以后它们保留在细胞质中，并在那里累积或与细胞分子反应，或者在细胞膜上带来不良效果。

此外，正在进行对核酸组分进行修饰的研究，以使其适合于核酸的非病毒转移。例如，WO2008／039254和US2010／0016409专利描述了RNA粒子，其部分或者全部为双链或者以其它特定结构存在，且可选择地与其它分子相连。这些RNA粒子，由于它们的构造而比单链mRNA具有更大的稳定性，被推荐用于非病毒基因转移。这些分子的优势是它们非常小，并且可以通过非常细的毛细血管。更重要的是，由此而几乎不会有任何凝聚的危险，该凝聚经常发生于相对较大的聚合物复合物。该分子的一个缺点是，除了治疗序列，还要将其它的序列构建入打算引起特定区域的自聚集的mRNA分子，从而使得发生这样的RNA结构，如针毛、纳米环、方形(quadratic)和其它结构。尽管在生物体中RNA分子比纯粹的单链mRNA具有更长的寿命，但用于转译核糖体的这些双链构造的有效性尚未被证实。

EP1800697B1描述了一种修饰的mRNA，它的G／C含量比野生型高，编码在细胞中相对稀少的tRNA的野生型序列的至少一个密码子取代成编码在细胞中相对常见的tRNA的密码子。在这种方式下修饰的mRNA被额外改变，使得混入了包括硫代磷酰酯(phosphorthioates)、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、肽核苷酸、甲基磷酸酯、7-去氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷的组中的至少一个核苷酸类似物，其在一些其它的RNA方法(siRNA)中已经使用。该方法被描述用于从原始的野生型肽被改变序列的mRNA。

WO99／14346文件还描述了一种通过序列修饰而稳定化的mRNA，特别是通过碱基消除或碱基取代而降低了C-和/或U-的含量。

专利US5,580,859和US6,214,804描述了瞬时基因疗法的构成，其需要一个表达载体和从DNA构成的显现。

WO02／098443描述了编码生物活性肽的mRNA，它要么不在治疗患者中形成，要么形成为不足够或错误的程度，因此不会触发免疫应答。

在非病毒基因治疗领域的另一个发展为“微泡”技术，其中，用核酸填充的稳定的蛋白微球体(Kausik Sarkara等人，J.Acoust.Soc.Am.118，July1，2005，pages：539-550)或者糖微球体(Schlief等人，Ultrasound in medicine&Biology，Volume22，Issue4，1996，pages453-462)被额外填充了超声波气体。可以观察到由于细胞膜短暂地可渗透化，超声造影剂导致空化作用增强(Tachibana等人，Echocardiography.2001May；18(4)：323-8.Review)。这些导致非病毒基因转移的增强吸收构建入细胞。但病毒基因转移的效率仍未实现。

为了提高病毒基因转移的效率，越来越多地使用有造影剂的超声方法(Blomley，09／2003，Radiology，229，297-298)。

除了一系列其它气体，全氟化碳气体已经被证明特别适用于“微泡”技术。由于它们的高亲液性质以及它们极低的表面张力，它们非常适合于干扰细胞膜的完整性，且因此物质能够通过。存在不以某种形式与其他组分键合的纯全氟化碳。然而借助纯全氟化碳的非病毒基因转移实验已经显示出，在进入细胞前，来自纯全氟化碳的核酸扩散开来。如此一来，核酸只能由于随机事件而被带走。

所有先前的解决方案仍远远不能实现病毒基因转移的效率。人们有兴趣发展将核酸非病毒转移入细胞的体系，其效率至少等于病毒基因转移的效率，其成分不会积聚在细胞中，不会与细胞分子反应，并且不会在细胞膜上产生有害影响。

因此，本发明的目的是提供一种稳定的化合物，其可以克服病毒基因转移的缺点，并且适用于非病毒基因转移。

通过提供一种具有权利要求1的特征的核苷酸组分的非病毒基因转移化合物可以实现该目的。

根据本发明的化合物含有通式(I)的结构：

A-B-C(F，G′)-D-E-F-G-A′             (I)

或通式(Ⅱ)的结构

A-B-C(F′，G′)-D-B-E-F-G-A′         (Ⅱ)

其中

-A为至少一个选自全氟化碳（PFC)、全氟化硅化合物和/或其它全氟化化合物的组中的分子，

-B为至少一个物理、化学或酶可断裂键形式的预定断裂点，

-C不存在或为至少一个连接分子，

-D不存在或为至少一个间隔分子，

-E为至少一个选自包括下列的组中的分子：核碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、修饰的核碱基、修饰的核苷、修饰的核苷酸、修饰的寡核苷酸、修饰的核酸、肽核酸单体、肽核酸低聚物以及肽核酸或其它核酸类似物，

-F，F′不存在或为至少一个配体或为识别序列，

-G，G′不存在或为至少一个标记分子，

-A′不存在或为A的含义，且以下化合物除外

优选分子A、B、C、D、E、F、F′、G、G′和A′通过共价键每个连接在一起。然而，可以想象根据本发明的化合物的单个分子或分子基团全部或部分通过离子键连接在一起。

因此，一种新的、有前途的非病毒基因转移的物质组为一种分子化合物，其特别是由通过预定断裂点连接在一起的全氟化碳(PFC)和例如核酸组分组成，称为全氟化核酸组分。

全氟化核酸组分的优点如下：

1)由于它们在生理条件下的高亲液效应(比脂肪酸更亲液)，而且更因为它们极低的表面张力，这些分子很快地粘附在细胞膜的表面。在那里，它们通过常规发生的过程如胞饮、吞噬作用、内吞作用或不依赖于内吞作用的路径被吸收进细胞。在这里，PFCs为核酸组分进入细胞的传递体系，否则核酸组分不轻易被吸收。

2)由于它们强力的C-F键，PFCs具有很大惰性并且不与细胞分子反应。

3)从核酸组分中破出后，PFCs为小的、无电荷的亲液分子，可根据浓度梯度而被动退出细胞。

4)通过PFCs为作为氧载体/人类的血液替代品的医学应用，已经证明PFCs通过肺、肾脏和皮肤从体内排出。

5)既然已经证明PFCs作为血液替代品和造影剂，获得PFCs非病毒基因转移的医疗批准显得容易。

6)全氟化核酸组分与非病毒基因转移的其他物质相比明显地表现出更大的向细胞中的吸收，其是病毒基因转移的真正替代。

7)与在病毒基因转移中不同，全氟化的核酸组分不产生任何机体免疫应答，可根据需要经常使用。

8)与mRNA转移有关地，由于mRNA有限的寿命以及无限的转移可重复性，可实现配量(dosing)。

纯全氟化物最初在高性能润滑油产业中为人所知。在医药行业，由于其高度的氧溶解度，之前它们首先被用作血液替代品，甚至用作造影剂。已经证实在填充有气态纯全氟化碳的非病毒基因转移的微泡的超声应用中，与其它气体相比基因转移的效率提高。

然而，纯全氟化碳很难适用于核酸向细胞中的非病毒基因转移，因为核酸不附着于它们，所以仅通过随机事件而被带走。全氟化碳和核酸组分之间需要一个真正的键，该键可通过预定断裂点断裂。

因此，根据本发明的化合物的特征在于，全氟化核酸组分向细胞中吸收，核酸组分和全氟化碳分子之间的预定断裂点断裂，分解产物释放(一方面为核酸组分，另一方面为全氟化碳分子)进入到细胞质并且随后扩散，或者全氟化碳从细胞中积极排出，也可能发生氟化核酸组分的不依赖胞吞作用的吸收。

如上阐释的那样，全氟化核酸为带电并且非常亲液的分子。这些分子的二级和三级结构非常适合于将细胞膜去稳定化并且适合于被吸收进细胞。在生理条件下，全氟化碳甚至比脂肪酸更加亲液，并且具有极低的表面张力，这样使分子在细胞膜的大的表面上扩展。

进入细胞后，通过核酸组分和分子的全氟化部分之间的预定断裂点，核酸的全氟化部分断裂。这通常通过酸不稳定性的预定断裂点发生。在细胞质中增加的还原电位、更尤其是该内体中的低pH值(低至pH=4.5)为其水解创造了条件。

搜寻该体系的预定断裂点，这样分解产物不经受或经受很少的分子改变。对此，这样的“无痕迹”预定断裂点是非常适合的：留下无变化的核酸，以及获得其非常亲液和非极性特性的全氟化碳基团。这样的预定断裂点的一个实例显示在以下的图解1中：

图解1：“无痕迹的”预定断裂点的实例

释放到细胞质的核酸对细胞来说是可自由进入的。它们在细胞质中具有它们的作用位点，例如mRNA、siRNA、微小RNA、适配子、反义RNA和其它，或者它们可输送至核，例如有或没有核定位序列的DNA、反义寡核苷酸或单个核苷酸和核苷。

释放至细胞质中的带有对应预定断裂点的全氟化碳分子是不带电荷的、亲液且非常小。这些特性是沿浓度梯度通过细胞膜自由扩散的条件。胞吐或其它向细胞外的释放路径也是可能的。全氟化碳分子具有极高惰性，不与细胞分子发生反应。只要其分子结构保持相对不变，它们也不会粘附于脂质。全氟化碳作为血液替代品的医疗应用是已知的，其中它们利用肺、肾功能以及通过皮肤从体内排出。

全氟化的核酸组分可与荧光染料连接，以追随它们在细胞中的路经。通过与特定的配体或其它识别序列连接，可建立该体系用于治疗特定细胞类型。原则上，包括全氟化的核酸组分的转移体系可用于其核酸或修饰的核酸类似物被输送至细胞的任何应用。

在本发明化合物的一个实施方式中，至少一个的分子A选自包括下列的全氟化碳(PFC)的组：直链或支链无环或环状、多环或杂环的脂肪族烷烃、烯烃、炔烃、芳香化合物或这些化合物的组合，其中全部H原子被F原子取代，还任选含有作为一个或多个官能团或杂原子特别是Br、I、Cl、H、Si、N、O、S、P的形式的、至少一个非氟化或部分氟化的取代基，或与一个或多个其它官能团连接的这些取代基。

还优选的是，A选自包括下列的全氟化碳(PFC)的组：C₁-C₂₀₀、优选C₁-C₁₀₀、特别优选C₁-C₅₀、非常优选C₁-C₃₀、最优选C₁-C₂₀的直链、支链、环状、多环或杂环的烷烃、烯烃、炔烃，C₆-C₅₀、优选C₆-C₃₀、特别优选C₁-C₂₀芳香或杂芳香环体系。

典型地，关于本发明，A-分子和A-分子基团可以选自包括下列的PFC的组：-(Cn_nF_(2n+2)-1)，其中n≥1，优选n=1-20，例如-CF₃、-C₂F₅、-C₃F7、-C₄F₉、-C₄F₁₁等；-(Cn_nF_2n-1)，其中n≥2，优选n=2-20，例如-C₂F₃、-C₃F₅、-C₄F₇等；-(Cn_nF(_2n-2)_-1)，其中n≥2，优选n=2-20，例如-C₂F、-C₃F₃、-C₄F₅、-C₅F₇等的PFC基团。

为了制造根据本发明的化合物，使用全氟化合物是明智的，全氟化合物具有适合的官能性以进入与其它分子例如B和E的共价键。作为起始物质的全氟化合物的官能性使得能够添加、取代、酯化、醚化、缩合等。本领域技术人员已知这样的连接反应。优选的官能性选自包括卤代烷、羟基、醚、氨基、巯基、醛基、酮基、羧基、酯和酰胺基的组，具有自由基或离子的基团以及下述物质基团中的分子：羧酸、过氧羧酸、硫代羧酸、磺酸、亚磺酸、次磺酸、亚砜、羧酸盐、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、羧酸酐、羧酸酯、磺酸酯、羧酸卤化物、磺酸卤化物、羧酸酰胺、磺酸酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、硫醛、酮、硫酮、肟、醇、酚、硫醇、胺、亚胺、肼、醚、酯、硫醚、硫酯、卤化氢、硝基化合物、亚硝基化合物、偶氮化合物、重氮化合物、重氮盐、异氰酸酯、氰酸酯、醚、酰胺和硫醚或由于其多重键而具有反应性的化合物。特别优选的杂原子，例如Br、I、Cl、H、Si、N、O、S、P、羟基、氨基、羧基、卤链烷烃、羧酸胺、醇、肼、异氰酸酯、硫氰酸酯和酰胺。

优选地，作为制备根椐本发明化合物中的分子A的起始化合物，为适合亲核取代的物质。具有亲核的离去基团的用于制备分子A的起始物质对本技术领域技术人员来说是可认识的。因此，其它优选的分子A可基于以下起始物质中的任何一个：

-F(CF₂)_nX，其中n=1-50，优选n=1-10且X=Br、I、Cl、H或者X=Si、N、O、S、P与官能团结合，特别是C₈F₁₇l、C₈F₁₇Br，

-F(CF₂)_n(-CH₂)_nX，其中n=1-50，优选n=1-10，m=1-26，优选m=1-6且X=Si、N、O、S、P、Br、I、H；

-F(CF₂)n-O_b-CH＝CH₂，其中n＝1-50，优选n＝1-10且b=0或1，优选b＝0；

-C₆F₁₃CH₂CH₂Mgl、(C₆F₁₃CH₂CH₂)₃SnPh、(C₆F₁₃CH₂CH₂)₃SnBr、(C₆F₁₃CH₂CH₂)₃SnH；

-C₂F₅l、C₃F₇Br、C₄F₉l、C₅F₁₁Br、C₆F₁₃Br、C₈F₁₅Br、C₁₀F₁₇l，

-C₄F₉CH=CHC₄F₉、C₈F₁₆C₁₂、C₁₀F₁₉N、C₆F₁₉Br、C₉F₂₁N、C₁₀F₂₁Br、C₁₁F₂₂N₂O₂、C₆F₁₃CH＝CHC₆F₁₃、C₁₂F₂₇N、C₁₂F₂₇N、C₁₆F₂₅Br；

-C₈F₁₇l、C₈F₁₇Br。

本发明使用的其它优选的全氟化碳氢化合物组中的A分子的起始物质为：全氟化胆甾醇和金刚烷基化合物、全氟化的顺式-十二碳烯(cis-eicosenoic)、全氟化芳香族化合物、全氟化芘、全氟化甘油酯和

其中，R＝全氟化碳基团或脂肪链；

本发明的另一实施方式为至少一个分子A选自包括下列的全氟化硅化合物的组：直链或支链的无环或环状、多环或杂环的脂肪族硅烷类，其中全部H原子被F原子取代，还任选含有带有一个或多个官能团或杂原子特别是Br、I、Cl、H、Al、N、O、S、P的、至少一个非氟化或部分氟化的取代基，或与一个或多个其它的官能团连接的这些取代基。

优选地，使用包括Si1-Si200、优选Si1-Si100、特别优选Si1-Si50、非常优选Si1-Si30、最优选Si1-Si20全氟化硅化合物的组中的全氟化硅化合物。该全氟化硅化合物与PFCs一样也被适合的取代基而官能化。

另外优选的官能化全氟化硅化合物可以选自以下基团：

-通式-[-SiR₂-O-]_n的硅氧烷，其中n≥1并且R＝全氟化碳或F，

-通式HO-A-[-SiR₃R₄-O-]-SiR₃R₄R₅的硅醇(siloxanoles)，其中R_3,4,5=F或-F(CF₂)_n，其中n=1-10且A=烷基链，

-全氟化硅酸盐类、硅酸、硅酸钠、聚硅氮烷、硅化物、四卤化硅、硅、硅油、沸石、硅酸锆，

-通式为C-CH₂-Si(OR)₃的硅烷，X为适合亲核取代的离去基团，其中X＝Cl、Br、I、H、OH或包括氮基、乙烯基、氨基甲酸酯、环氧丙氧基、甲基烷氧基、苯基或乙酰氧基的官能团，且R＝F或-F(CF₂)_n，其中n=1-10，

-通式为X-Si(CF₃)₃或X-Si(R)₃的硅烷，X为适合亲核取代的离去基团，其中X＝Cl、Br、I、H、OH或例如氨基、乙烯基、氨基甲酸酯、环氧丙氧基、甲基烷氧基、苯基或乙酰氧基的官能团，且R=F或-F(CF₂)_n，其中n=1-10。

在另外一个实施方式中，至少一个分子A选自其它全氟化化合物的组，分子A基于选自NF₃、N₂F₄、SNF₃、CF₃SN、SF₄、SF₆，全氟化氮-硫化合物的化合物。

还优选该化合物含有两个或更多个分子A，分子A选自全氟化碳(PFC)、全氟化硅化合物和其它全氟化化合物的组。

典型地，上述官能化的全氟化化合物可以整合为几个单元。下述分子作为实例供参考：

根据本发明化合物中这些分子与其他分子的连接可通过NH₂基团或OH基团或其它适合的基团实现。

在本发明化合物的变型中，所述至少一个预定断裂点B具体为酸不稳定性基团的形式，特别是糖苷键、至少一个二硫键、至少一个酯基、醚基、肽键、亚胺键、腙键、酰基腙键、缩酮键、乙缩醛键、顺-乙腈键、三苯甲基键、β-D-葡糖神经酰胺和/或二硫苏糖醇的形式。

在PFCs和核酸组分结构中预定断裂点有两个重要的功能。第一，预定断裂点用做被称为“渗出”的目的，这里，PFC-核酸化合物的颗粒粘附至细胞膜核内体，必须随后从这些核内体中释放。这种情况是通过破坏膜的完整性而发生，其是通过使结构分离而造成的。第二，PFC分子的基团必须被分离，以使得为细胞提供可用的核酸组分。这里，酸不稳定性的预定断裂点例如以上所列的糖苷键、二硫键、酯或醚在酸性条件下，化学地或在水解酶／酯酶的作用下例如在核苷酸2′位置或其它位置水解(分离)。

更复杂的预定断裂点可以以酶的特定底物、对pH-和光敏感的脂官能团、通过超声波作用或控温脂质修饰而释放的分子，以及可在生理条件下被分离的其它键的形式存在。

以下预定断裂点实例作为参考：

-全氟化的缩醛磷脂，光裂解

在本发明的一个实施方式中，至少一个连接分子C选自包括下列的组：直链或支链的无环或环状、多环或杂环的脂肪族烷烃、烯烃、炔烃、芳香化合物或者具有官能团的这些化合物的组合。

为了在本发明的化合物中获得一个或多个与其它分子例如标记分子G′和/或配体F′或其他识别序列的键合位点，优选使用连接分子C。

优选地，连接分子C选自包括下列的组：特别是卤代烷、羟基、醚、氨基、巯基、醛、酮、羧基、酯和酰胺基团，带有自由基或离子的基团，以及以下物质基团的分子-羧酸、过氧羧酸、硫代羧酸、磺酸、亚磺酸、次磺酸、亚砜、羧酸盐、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、羧酸酐、羧酸酯、磺酸酯、羧酸卤化物、磺酸卤化物、羧酸酰胺、磺酸酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、硫醛、酮、硫酮、肟、醇、酚、硫醇、胺、亚胺、肼、醚、酯、硫醚、硫酯、卤化氢、硝基化合物、亚硝基化合物、偶氮化合物、重氮化合物、重氮盐、异氰酸酯、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、过氧化氢、过氧化物或由于其多重键而具有反应性的化合物，或者被碘、溴或硫原子、氨基甲酸酯、硫醚或二硫化物基团、甘油、丁二酰甘油、磷酸基官能化的全氟化碳，以及被其它基团或原子官能化的全氟化碳，由其能够与核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、修饰的核苷、修饰的核苷酸、修饰的寡核苷酸、修饰的核酸、肽核苷、肽核苷酸、肽寡核苷酸、肽核酸或药物物质建立连接。

优选的连接分子C是基于羟基或氨基、羧基、酯、醚、硫醚、硫酯、羧酸亚胺，具有重键的化合物、氨基甲酸酯、二硫键和酰肼、卤代烷、巯基、醛、酮、羧基、酯和酰胺基团、硫醇、胺、亚胺、肼或二硫基、甘油、丁二酰甘油、原酸酯、磷酸二酯和乙烯基醚、酯和醚基，特别优选二硫键。

如上所述，连接分子C可以用于连接其它标记物G′和／或配体F′或其它识别序列，其实质上含有与如下定义的配体F和标记物G相同、但与在本发明化合物内的排列不同的基团。

标记物G′的适合的实例为荧光染料，例如Dil、Dile、DiO、荧光黄类、罗丹明类、噁嗪类、碱性品红类、派若宁类、吖啶类、金胺类、碱性副品红类、GFP、RFP、DAPI或过氧化物酶染料例如ABTS。

配体和识别序列在某些类型的细胞中被需要以用于特殊转移，因为它们与细胞表面上的受体键合，从而能够特异性地进入细胞。配体通常通过可进入的一侧或末端氨基而键合至该结构。但是也可以通过其它基团键合。

这里，转铁蛋白、叶酸、半乳糖、甘露糖、表皮生长因子、RGD肽、生物素和其它物质可以用作合适的配体F′。识别序列的实例为细胞核定位序列或用于不依赖胞吞作用的吸收的序列。

在本发明化合物的另一个变型中，至少一个间隔分子D选自包括具有一个或多个官能团的直链或支链脂肪族的组，可以使用间隔分子D作为连接分子C。

在本发明的化合物中，间隔分子用于为分子内各种基团提供更多空间以防止空间阻碍或者用于削弱氟组分向其它分子区域的被动进入。特别优选地，间隔分子D选自脂肪酸醇、脂肪酸二醇和脂肪酸多元醇的组。

在本发明的一个优选实施方式中，使用核碱基作为分子E，其选自腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、修饰的核碱基例如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、齐多夫定类、叠氮胸苷类、司他夫定、扎西他滨、二腺苷、碘苷、氟尿苷(fluridine)和利巴韦林、叠氮胸苷、齐多夫定、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤和其“镜像异构体(spiegelmers)”，特别优选的核碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。

如果优选地使用核苷作为分子E，则核苷选自包括下列的组：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷；或修饰的核碱基例如2-硫代胞苷、N4-乙酰胞苷、2′-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、5-(羧基羟基甲基)-尿苷、5-羧甲基氨甲基-尿苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基-羰基甲基-尿苷、5-甲氧基尿苷、2′-O-甲基尿苷、核糖胸核苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、2′-O-甲基腺苷、肌苷、1-甲基肌苷、1-甲基鸟苷、N2-2-甲基鸟苷、N2-2,2-二甲基鸟苷、7+-甲基鸟苷、2′-O-甲基鸟苷、辫苷、β-D-半乳糖基辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、古嘌苷(archaeosine)、2′-O-核糖基磷酸腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰腺苷、赖西丁(lysidine)、烟酸、核黄素和泛酸、NADPH、NADH、FAD、辅酶A以及琥珀酰辅酶A、嘌呤霉素、阿昔洛韦、更昔洛韦及其“镜像异构体”，优选的核苷为腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷。

在本发明化合物的另一优选实施方式中，使用核苷酸作为分子E，其选自AMP、GMP、m5UMP、UMP、CMP、dAMP、dGMP、dTMP、dUMP、dCMP、cAMP、cGMP、c-二-GMP、cADPR、ADP、GDP、m5UDP、UDP、CDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCTP、ATP、GTP、m5UTP、UTP、CTP、dATP、dGTP、dTTP、dUTP、dCTP，或源自上述组分的修饰核酸，在糖-磷酸酯结构带有修饰的核苷酸，两性离子的寡核苷酸和其中磷酸酯被甲基磷酸酯或二甲砜基团取代的核苷酸，特别优选AMP、GMP、m5UMP、UMP、CMP、dAMP、dGMP、dTMP、dUMP、dCMP。

进一步优选使用脱氧核糖核酸、核糖核酸或修饰的核酸作为分子E，举出例如核苷硫代磷酸酯、两性离子的核酸、磷酸酯被取代为甲基磷酸酯或二甲砜基团的核酸，桥接的核酸(锁核酸)，“镜像异构体”，其中的核糖磷酸二酯骨架被取代为各种聚合结构的核酸，如基于己糖醇骨架的链或基于甘油单元的核酸类似物)、吗啉代寡核苷酸、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、环己烯核酸，N3′-PS′-磷酰胺、三环-脱氧核糖核酸，吗啉代磷酰胺酯核酸、苏糖核酸，特别优选的是核苷硫代磷酸酯、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸。

还优选使用肽核酸单体作为分子E，例如(Fmoc)腺嘌呤-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-胞嘧啶-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-鸟嘌呤-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-胸腺嘧啶-(Bhoc)-OH或其完整的核糖磷酸二酯骨架被基于N-(2-氨基乙基)甘氨酸亚单元的非手性肽骨架取代的肽核酸，其中碱基通过羧基亚甲基单元连接至骨架，特别优选(Fmoc)-腺嘌呤-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-胞嘧啶-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-鸟嘌呤-(Bhoc)-OH、(Fmoc)-胸腺嘧啶-(Bhoc)-OH。

如果优选地使用单链或双链寡核苷酸和核酸作为分子E，则它们具有多达大于1,000,000bp的2个碱基对的长度，以下的长度范围每个都为优选：10至50bp、15至25bp、25至200bp、25至100bp、200至300bp、200至500bp、500至1500bp、800至1300bp、1500至20,000bp、1500至5000bp、3000至8000bp、20,000至1,000,000bp或20,000至50,000，特别优选长度在10至50bp、200至500bp以及500至1500bp的寡核苷酸。

在化合物的一个变型中，分子E具有选自下列的组的官能团：酰肼、卤链烷、羟基、醚、氨基、巯基-、醛基、酮、羧基、酯基和酰胺基，具有自由基或离子的基团，和以下物质基团中的分子：羧酸、过氧羧酸、硫代羧酸、磺酸、亚磺酸、次磺酸、亚砜、羧酸盐、磺酸盐、亚磺酸盐、次磺酸盐、羧酸酐、羧酸酯、磺酸酯、羧酸卤化物、磺酸卤化物、羧酸酰胺、磺酸酰胺、羧酸酰肼、腈、醛、硫醛、酮、硫酮、肟、醇、酚、硫醇、胺、亚胺、肼、醚、酯、硫醚、硫酯、卤化氢、硝基化合物、亚硝基化合物、偶氮化合物、重氮化合物、重氮盐、异氰酸酯、氰酸酯、异氰化物、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、过氧化氢、过氧化物或由于其多重键而具有反应性的化合物，或者被碘、溴或硫原子、氨基甲酸酯、硫醚或二硫化物基团、甘油、丁二酰甘油、磷酸基官能化的全氟化碳，或可与被官能化的全氟化碳键合的其它官能团。

该官能团应被理解为核苷酸上的附加取代基。例如，可以在脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸的2′H位引入NH₂，从而将该位点准备用于全氟化，而该位点原来不能用于全氟化。还可以引入SH基团，例如在核糖的2′OH位点引入，从而稍后建立一个二硫键。

分子E优选的取代基或官能团为-OH、NH₂和-SH基团、酰肼、卤代烷、巯基、醛基、酮基、羧基、酯和酰胺基、醚、硫酯和硫醚。

本发明化合物中存在的配体F优选选自包括下列的组：转铁蛋白、叶酸、半乳糖、乳糖、甘露糖、表皮生长因子、RGD肽、生物素和使该化合物能够特异性进入细胞的其他物质。

本发明化合物中存在的标记分子G优选选自包括下列的组：荧光染料例如Dil、Dile、DiO、荧光黄、罗丹明类、噁嗪类、碱性品红类、派若宁类、吖啶类、金胺类、碱性副品红类、GFP、RFP、DAPI，过氧化物酶染料例如ABTS，以及使分子遵循新陈代谢的其它物质。

本发明化合物特别适于并且可用于将至少一个分子E非病毒转移至至少一个真核生物、特别是动物或者人类的细胞中。

特别优选地，本发明化合物以与至少一种表面活性物质的药物组合物的形式使用，适宜的表面活性物质例如泊洛沙姆、卵磷脂或其它细胞耐受性表面活性剂。

本发明的药物组合物可以以分散液、混悬液、乳液、溶液的形式存在，特别是具有2nm和200μm之间、优选20nm至400nm之间、特别优选为50nm的平均粒径。该粒径可以根据应用而改变。通过适合的方法，例如超声波仪、雾化或溶剂的方法，可以设置有利于吸收入细胞的所需粒径。本发明的药物组合物还适于并且可以用于将至少一个分子E非病毒转移到至少一个真核生物、特别是动物或者人类的细胞中。

可以以各种方式制造和修饰本发明化合物。特别是，分子E向全氟化合物例如全氟化碳(PFC)和/或全氟化硅化合物的连接可出现在可用于连接的分子E的不同部位。

根据本发明的应用，全氟化的一侧或位置应理解为特别是分子E中这样的位置：分子E向全氟化分子A或A′的连接优选通过预定断裂点B而发生，并且任选地使用连接分子C和／或间隔分子D的出现。

在下文中，列出各种分子E优选的全氟化位置：a)核碱基、核苷、核苷酸的全氟化，b)肽核酸单体和低聚物、肽核酸的全氟化，c)寡核苷酸的全氟化。

在第一种变型中，作为分子E的核碱基的全氟化可在分子中所有可及的位置发生，优选的全氟化位点为NH₂和NH基团。唯一的限制在向核苷转换时发生于相应的NH基团(箭头)；参见图解2。

图解2：核碱基的全氟化位点

在第二种变型中，全氟化还可以发生于核苷的糖分子的全氟化位点，优选的全氟化位点为核糖的2′、3′和/或5′位。核糖对应的位置还可以以-NH₂和／或-SH的形式修饰，其为对应2′-NH₂、2′-SH等的优选全氟化位点；参见图解3。

图解3：核苷的全氟化位点

对于核苷酸的全氟化来说，除了核糖2′和3′位的全氟化位点外，依据第三个变量在磷酸基团有其它全氟化位点，例如在自由OH基团或在至少一个氧原子上；参见图解4。

图解4：核苷酸的全氟化位点

然而，可选择地，全氟化位点还可出现在有杂原子例如S或N或其它杂原子的修饰的糖-磷酸酯结构中，如图解5所示。

图解5：在修饰的糖-磷酸酯结构上其它的全氟化位点

在第四种变型中，可发生肽核酸单体、肽核酸低聚体和肽核酸的全氟化。它们是肽核酸的类似物。糖-磷酸酯骨架被假肽、例如通过与中性酰胺键连接在一起的氨基乙基甘油单元所替代。由于它们无法通过核酸酶或蛋白酶分解，因此它们非常稳定。它们与作为起始低聚体的互补DNA和RNA序列更加紧密地杂合，并且其它的全氟化位点存在于NH₂和羧基，以及存在于O原子，还存在于修饰的肽结构的官能团上；参见图解6。

图解6：肽核酸单体、肽核酸低聚体和肽核酸上的全氟化位点

在第五种变型中，可能以不同方式发生核酸低聚体或寡核苷酸的全氟化以及核酸大分子的全氟化。

在第一种方式中，将全氟化的核苷酸直接构建入期望的RNA或DNA序列中，例如通过固相合成的方式或PCR的方式。优选使用在2′位(即，在核糖的2′位)全氟化的全氟化核苷酸。其一个原因是因为，在此位点全氟化不会导致聚合或合成期间的链断裂，另一个原因是不会扰乱碱基对的相互作用；参见图解7的上面两个实例。

当RNA分子中只是2^XOH位被全氟化，在DNA分子中2′H位必须首先例如通过可全氟化的基团诸如NH₂代替H或2-氨基-2-脱氧尿苷而被官能化。

在第二种方式中，在DNA序列中结合RNA核苷酸或者在寡核苷酸或DNA大分子的5′或3′末端结合全氟化的DNA核苷酸；参见图解7的第三个实例。在此种方式中，相应地，全氟化化合物例如全氟化核苷酸优选通过化学合成的方式被添加至结束的低聚核苷酸的末端。所使用的核苷酸可在上述任何可能的位点全氟化，优选在2′-和5′-全氟化的核苷酸。在此唯一的例外为在5′位使用C₈F₁₇全氟化的核苷酸。

图解7：核酸低聚体或核酸大分子的全氟化位点

本发明的化合物可以具有不同结构的不同构造，这样就是说，根据分子C、D、F和G的存在，化合物可以具有以下其它基本结构：

-A-B-E-F-G，      (Ⅲ)

-A-B-D-B-E-F-G，   (Ⅳ)，

-A-B-C-B-E-F-G，   (V)，

-A-B-E，          (Ⅵ)，

-A-B-D-B-E，       (Ⅶ)，

-A-B-C-B-E，      (Ⅷ)，

-A-B-E-F，       (Ⅸ)

-A-B-D-B-E-F，     (X)，

-A-B-C-B-E-F，    (Ⅺ)，

-A-B-E-G，        (Ⅻ)

-A-B-D-B-E-G，   (XⅢ)，

-A-B-C-B-E-G，   (ⅪV)，

-A-B-E-A′，     (XV)，

-A-B-D-B-E，        (XⅥ)，

-A-E-C(F′)-B-E     (XⅦ)，

-A-B-C(G′)-B-E     (XⅧ)，

-A-B-C(F′，G′)-B-E，   (ⅪX)，

-A-B-C(F′)-E，       (XX)

-A-B-C(G′)-E，     (XXI)

-A-B-C(F′，G′)-E，      (XXII)

为了举例，以下化合物作为参考：

本发明方法的化合物通过已知的合成方法制备以独立分子组分连续连接，例如通过增加、取代、缩合、醚化或酯化。这样的合成路径对于作为化学合成人员的本领域技术人员来说是已知的。

为了更好地理解本发明，下面以样品实施方式为基础参考附图进行解释，但不限于这些实例。

图1显示了用根据本发明的化合物转染的细胞的显微图像，以及

图2显示了用根据本发明的化合物转染的细胞的FACS分析。

样品实施方式1：全氟化核碱基的合成

通过威廉姆逊醚合成法进行核碱基的全氟化。在这里，NH₂基团相对容易到达。胸腺嘧啶不具有NH₂基团，但可出现六个互变异构结构，其中4个结构具有可全氟化的OH基团。

样品实施方式2：在2′全氟化尿苷基础上的2′-全氟化核苷的合成

尿苷是RNA的重要组分。经糖3′或5′位OH基团而插入RNA链。因此尿苷2′位特别适用于在核碱基键合位点的情况下引入取代基。已知各种2′-取代的尿苷，其通过2′醚或酯、2′硫醚或酯、2′酰胺或2′氨基甲酸酯或者甚至通过2-C产生连接；参见图解8。

图解8：适于在2′位全氟化的2-取代尿苷实例

为了在2′位合成具有全氟化烯烃的尿苷，研究出新的合成法。例如，经醚官能团和酯官能团直接连接至2′-OH基团；参见图解9。

图解9：经醚官能团和酯官能团直接连接至2′OH基团

还可以使用短的间隔区经醚官能团或酯官能团而连接至2′-OH基团；参见图解10。

图解10：使用短的间隔区经醚官能团或酯官能团而连接至2′-OH基团

另一种可能是经间隔区和预定断裂点连接全氟化烷基；参见图解11。

图解11：经间隔区和预定断裂点而与全氟化烷基连接

在图解9至11中所示的所有反应，3′和5′-OH基团都被保护。甲硅烷基保护基团适用于这一目的。然而，必须指出的是，在某些情况下要建立2′-和3′-取代的尿苷之间的平衡(酰基迁移作用)。出于这个原因，疏水性基团向尿苷2′位的连接通过醚官能团或通过氨基官能团(2′-氨基-2′-脱氧尿苷)完成。

经2′醚官能团的全氟化：

通过2′-OH基团通过醚官能团随后引入全氟化疏水性基团。对于这一点，在第一步中，在3′和5′使用四异丙基-二向色性-乙硅烷(tetraisopropyl-dichor-dissilane)保护OH基，然后在下一步中在2′位用1-碘全氟辛烷或1-碘-全氟化-十一烷使OH基醚化并且去保护。依据反应过程，通过制备型色谱来纯化反应的中间体和最终产物。该反应在排除水分并且在惰性气体(氩气)的条件下进行。所用的溶剂也必须在使用前干燥。

具体而言，一开始用官能化的全氟化烃(C₈F₁₇Br或C₈F₁₇J)和尿苷，尿苷上的3′-OH和5′-OH基团首先被提供有保护基团(3′,5′-二醚丁基硅氧烷)。与官能化全氟化烃的反应的反应在尿苷的2′-OH基团上发生。为此目的，C₈F₁₇Br(或C₈F₁₇J))通过威廉姆逊醚合成而键合至尿苷的2′-OH基团，由此获得尿苷-2′O-C₈F₁₇(带有3′，5′-二醚丁基硅氧烷)。与官能化全氟化烃的反应在尿苷的2′-OH基团上发生。为此目的，进行根据1991年Monokanen等和1993年Monokanen等的反应，从而获得尿苷-2′O-C₈F₁₇(带有3′，5′-二醚丁基硅氧烷)。最后，分离保护基团；参见图解12。

图解12

样品实施方式3：经2′-氨基-2′-脱氧尿苷的2′-氨基官能团而全氟化

第二条合成路径起始于2′-氨基-2′-脱氧尿苷，其为市售。使用全氟化羧酸将其转化成酰胺。这里，在排除水分的情况下使用惰性气体。使用制备型柱色谱法纯化最终产物。尿苷5′位的伯OH基团由DMT保护。为了核酸成分其它位置的类似反应，可以添加或省略适当的保护基团；参见图解13。

图解13

样品实施方式4：具有生物素形式的识别序列的全氟化核苷的合成

合成的起始点为氨基醇的2′-修饰的尿苷核苷。使用C₈H₁₇OH使氨基醇在其氨基官能团被全氟化。通过使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基乙胺(DIPEA)，在没有攻击醇羟基的情况下实现化学选择性酰胺结构。然后，用生物素酯化剩余的伯羟基官能团。

样品实施方式5：荧光染料的全氟化核苷的合成

用反应性氨基官能团合成荧光素组分，从而经酰胺键实现连接。由4-硝基邻苯二甲酸和间苯二酚制备5-硝基荧光素。通过缩合反应获得6-和5-硝基荧光素的混合物，通过分步结晶分离6-硝基荧光素。在后续合成中，硝基官能团还原为氨基官能团。化合物中的羧基转换为甲酯：将得到的化合物用琥珀酸酐进行酰化，得到相应的酰胺。

使用全氟化核苷酸的羟基官能团将游离的羰基酯化。

样品实施方式6：用识别序列和荧光染料合成全氟化核苷

样品实施方式7：全氟化寡核苷酸和核酸的合成

氩气气氛下，在烘过的50ml Schlenk试管中，将0.90mmol2′-全氟化尿苷溶解在20ml干燥的二氯甲烷中。在加入1.00mmol CyTIPP和2.30ml0.45M四唑溶液(在乙腈中)至该溶液后，在室温下搅拌反应混合物2小时，并通过DC监测该反应进程。在旋转蒸发器上浓缩该混合物并且进行柱层析法纯化后，得到3′-亚磷酰胺-2′-全氟-尿苷。这些核苷酸为亚磷酰胺方法的起始点，在该方法中单体的核苷酸被耦合在一起。在这个过程中，单体的核苷酸组分作为3′-亚磷酰胺被一起连接至固相。序列构造出现在3′至5′末端，具有在标准合成中经3′琥珀酸酯连接至适当固相的“前导核苷”。作为3′亚磷酰胺被引入的该核苷承受5′羟基的酸不稳定性保护基团和位于碱基的环外氨基官能团的碱不稳定性保护基团。该合成循环不断重复，包括以下反应：亚磷酰胺通过加入弱酸例如4,5-二氰基咪唑或1-H四唑而被活化，并与固定化的核苷的5′-羟基耦合。未转化的OH基被乙酸酐酰化，从而阻止进一步的转化。含水的碘溶液发生氧化，产生磷酸三酯。用二氯乙酸溶液去除该酸不稳定性三苯甲基保护基团。完成以上的程序后，通过在55℃氨性水溶液处理而使寡核苷酸和核碱基的保护基团断裂。

在世界上许多公司的现有技术中，已经提供制备低聚物和核酸的亚磷酰胺方法或者其它化学方法，并且核苷酸序列可达到的长度已经达到人工基因的大小。

样品实施方式8：全氟化寡核苷酸和核酸的替代合成法

整个低聚物和核酸的全氟化还可以例如通过使用氟酸的酸催化的方法来实现，或者全氟化核苷酸的聚合可通过使用聚合酶(聚合酶链反应)实现。

样品实施方式9：修饰的核酸组分的全氟化

核酸可被衍生化以稳定或消除电荷，例如通过硫代磷酸酯、电中性的甲基磷酸酯衍生物、电中性的二甲砜衍生物或核糖在2′碳原子的衍生物。就像常规的核酸组分那样，全氟化的可能性在于修饰的糖-磷酸酯骨架和碱基。全氟化路径请参阅全氟核苷、核苷酸和全氟化寡核苷酸的合成。

样品实施方式10：以丙氨酰核氨酸形式的全氟化肽核酸单体的合成

肽核酸单体为核苷酸类似物，其核糖-磷酸二酯骨架被基于N-(2-氨基乙基)甘氨酸亚单元或其它肽单元的非手性肽骨架取代。在此，全氟化的碱基经羧基亚甲基单元连接至骨架。当核碱基NH₂基团的全氟化显示没有影响向低聚物的结合时，在该肽单元的氨基末端和羧基末端的全氟化具有使合成停止的影响。丙氨酰核氨酸的合成起始于A／-Boc-L-丝氨酸，并且A／Boc-L-丝氨酸已被转化为A／Boc-L-丝氨酸内酯。Boc-丝氨酸内酯借助亲核环开环而发生反应，亲核环开环是通过苄氧基羰基-保护的胞嘧啶和鸟嘌呤前体2-氨基-6-氯嘌呤而成为Boc-L-AlaG-OH或Boc-D-AlaG-OH和Boc-AlaCZ-OH或其对映体。胞嘧啶的环外氨基官能团上的保护基苄氧羰基对后续的肽固相合成来说是必需的。因环外氨基显示出非常小的亲核性，鸟嘌呤不需要任何保护。

A／-Boc-L-天冬氨酸苄酯或Boc-D-天冬氨酸苄酯用作合成高丙氨酰核氨酸的起始化合物。用BH3-THF使侧链降级为醇并通过Appel反应溴化为N-Boo-D-γ-溴-高丙氨酰苄酯或N-Boc-D-Y-溴-高丙氨酰苄酯。

在K₂CO₃下，进行使用苄氧基羰基保护的胞嘧啶和2-氨基-6-氯嘌呤对溴化物的亲核取代。在接下来的步骤中，水解TFA／H₂O同时去除Boc保护基团。随后步骤为使用PdO-H₂O进行氢解。随后使用Boc酸酐保护而成为Boc-L-HalG-OH或Boc-D-HalG-OH。

使用K₂CO₃／丙酮和官能化的全氟化碳分子通过成廉姆逊醚合成法超过48小时而完成单体的全氟化。核碱基和肽组分上的全部可及的NH₂和OH基团均被全氟化。使用C₈F₁₇J的实例在此作为全氟化的一个实例。

另一种可能性是在全氟化发生之前掩蔽肽片段的OH基。在这种情况下，只有核碱基的NH₂基团被全氟化。为了实现这一目标，必须用二叔丁基甲硅烷基双三氟甲磺酸酯保护羟基。全氟化后，为了可用于肽合成，这些OH基必须再次被去保护。使用这些单体，有可能实现低聚物的合成，其中全氟化的单体已经被结合。然而，由于需要额外的反应步骤，先合成然后再氟化低聚物显得更容易。

为了举例列出其它全氟化：

样品实施方式11：全氟化肽核酸低聚体和肽核酸的合成

在肽核酸的情形下，整个核糖-磷酸二酯骨架被基于N-(2-氨基乙基)甘氨酸亚单元或其它肽单元的非手性肽骨架取代。这里，全氟化碱基通过羧基亚甲基单元连接至骨架。接着，核碱基连接至肽单元。然后在固相合成中将该单体连接至低聚体。已经证明仅在低聚体合成后进行全氟化步骤更加容易。全氟化步骤遵循单体全氟化的反应步骤。

丙氨酰核氨酸的合成起始于N-Boc-L-丝氨酸和A／Boc-D-丝氨酸，它们已转化为N-Boc-L-丝氨酸内酯或N-Boc-D-丝氨酸内酯。Boc-丝氨酸内酯借助借助亲核环开环而发生反应，亲核环开环是通过苄氧基羰基-保护的胞嘧啶和鸟嘌呤前体2-氨基-6-氯嘌呤而成为Boc-L-AlaG-OH或Boc-D-AlaG-OH和Boc-AlaCZ-OH或其对映体。胞嘧啶的环外氨基官能团上的保护基苄氧基羰基对后续的肽固相合成来说是必需的。因环外氨基显示出非常小的亲核性，鸟嘌呤不需要任何保护。

A／-Boc-L-天冬氨酸苄酯或Boc-D-天冬氨酸苄酯用作合成高丙氨酰核氨酸的起始化合物。用BH3-THF使侧链降级为醇并通过Appel反应溴化为N-Boc-L-γ-溴-高丙氨酰苄酯或N-Boc-D-γ-溴-高丙氨酰苄酯。

在K₂CO₃下，进行使用苄氧羰基保护的胞嘧啶和2-氨基-6-氯嘌呤对溴化物的亲核取代。在接下来的步骤中，水解TFA／H₂O同时去除Boc保护基团。随后步骤为使用PdO-H₂O进行氢解。随后使用Boc酸酐保护而成为Boc-L-HalG-OH或Boc-D-HalG-OH。

由于获得胞嘧啶碱基的苄氧基羰基保护基团为需要的结果，因此这里不允许发生苄基的氢解裂解。因而，使用NaOH／二噁烷/H₂O进行碱性皂化反应。

与肽合成类似地实施肽核酸的合成。在固态体系下进行该合成。可以使用Boc合成方法或Fmoc合成方法进行合成。在这里，选择Boc合成方法：

使用HBTU(N-(1-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲基-六氟磷酸酯)和HOBt(1-羟基苯并三唑)作为氨基酸的耦合剂。该高丙氨酰核氨酸由HATU和HOAt活化。使用由Boc-L-Lys(2-Cl-Z)-OH覆盖的MBHA-PS树脂作为固体。依据氨基酸，耦合进行35分钟至两小时之间。选择侧链的保护基团，这样它们可以在树脂被酸性裂解的同时被去除。对赖氨酸来说，侧链用(2-Cl-Z)进行保护，谷氨酸用(OBn)进行保护，酪氨酸用(2-Br-Z)基团进行保护。

-1.去保护：在TFA中的5％间甲酚(1x5min，1x10min)；2.洗涤：DCM／NMP(5x)+嘧啶；

-1.耦合：5.0当量的Boc-Hal-OH或5.0当量的Boc-AS-OH，4.5当量的HATU或HBTU，5.0当量的HOAt或HOBt，12当量的DIPEA，NMP；2.洗涤：DCM／NMP(5x)，在NMP中的10％哌啶(3x)，DCM／NMP(5x)；

-1.加帽：Ac20／DIPEA／NMP(1：1：8)，(2x5min)；2.洗涤：DCM／NMP(5x)，在NMP中的10％哌啶(3x)，DCM／NMP(5x)；裂解：TFA／TFMSA／间甲酚(8：1：1)

RmR′=核碱基

使用此方法制备与氨基酸结合的15-mer肽。

随后，借助K₂CO₃／丙酮和官能化的全氟化碳分子进行威廉姆逊醚合成48小时。全氟化到达所有可及的NH₂和OH基，其反应的发生类似于单个核碱基和肽核酸单体(如上所述)的全氟化。通过改变反应时间(2h至72h)，能够减少或增加全氟化的程度。

样品实施方式12：预定断裂点的选择

在此使用以下预定断裂点：fPFC／mRNA复合物通过胞吞作用被吸收，并被包裹在溶酶体中。在此过程中，在细胞外空间发生7.4至7.2的pH显著变化至溶酶体中的4.0，这是由ATP依赖性质子泵引起的(Serresi等人，2009)。这种4.0的低pH值是预定断裂点选择的关键。对于fPFC体系，有一系列值得考虑的酸不稳定性的预定断裂点值得考虑(Warnecke，2008，Wamecke2010)。然而，在低pH值下2′位的糖苷键水解；参见图解14。

图解14

由于全氟化烃掩蔽来自水解酶的分子，发生化学水解，以防止有害的OH基团连接至全氟化烃链上。因此断裂的全氟化烃链保持惰性，不与细胞分子结合。然而，在细胞质中断裂的预定断裂点也是有用的(约pH值=7)。

样品实施方式13：全氟化寡核苷酸和核酸的替代合成方案

例如通过使用氟酸的酸催化方法或者使用聚合酶的全氟化核酸聚合方法(聚合酶链反应)，可能实现整个低聚体和核苷酸的全氟化。

样品实施方式14：乳液的制备

A)为了设置一定的粒径，有必要使用表面活性剂。在此使用普朗尼克F-68(Pluronic F-68)。将5mg普朗尼克F-68溶解在10ml蒸馏水中。在其中加入0.5ml官能化的全氟化碳/mRNA溶液(1.0g/1.0微升)。然后进行3个周期的超声处理，强度为60。随后将获得的乳液离心(1200转/5分钟)，以使非常大的颗粒沉淀。在上述相同的上清液中发现粒径为50-100纳米的颗粒。使用这些颗粒。

B)溶剂乳液：将0.5ml官能化的全氟化碳/mRNA溶液(1.0g/1.0微升)添加至2ml四氢呋喃中，并在其中溶解。然后使用蒸馏水使其变为10ml。随后将获得的乳液离心(1200转／5分钟)，以使非常大的颗粒沉积。在上述相同的上清液中发现粒径为50-100纳米的颗粒。使用这些颗粒。

C)将0.5ml全氟化碳/mRNA溶液(1.0g/1.0微升)添加至10ml蒸馏水中。然后进行3个周期的超声处理，强度为60。随后将获得的乳液离心(1200转/5分钟)，以使非常大的颗粒沉积。在上述相同的上清液中发现粒径为50-100纳米的颗粒。使用这些颗粒。

样品实施方式15：用于治疗获得性遗传病的具有治疗序列的人工mRNA的制备

按上述方法制备人工全氟化mRNA。该体系的预定断裂点为糖苷键。此外，人工mRNA的GC含量在保持相同的编码信息的同时增加，这增加了寿命(抗RNA酶)。

人工mRNA和官能化全氟化碳的复合物同时具有亲水和疏水的特性，不需要额外的表面活性剂；在样品实施方式8的C)所述的条件下完成乳液的制备。在缓冲液中建立的乳液通过设备处理成气溶胶，将该气溶胶作为吸入雾剂而给药，并经肺进入机体血液。在复合物在血液中循环，并通过胞吞作用／胞饮作用非特异性吸收。预定断裂点的断裂通过化学水解发生于细胞的核内体和溶酶体。释放的mRNA和释放的全氟代碳分子通过核内体或溶酶体而被释放至细胞质中。在细胞质中进行mRNA的翻译和治疗性蛋白质的形成。输送体系(全氟化碳分子)为惰性，不与细胞分子反应。由于其蒸气压和其它物理性质，该运输体系经肺和肾功能被排出。

样品实施方式16：在癌症治疗中治疗性siRNA的释放：

如上所述像制备乳液那样制备siRNA并将转铁蛋白连接至该体系。该乳液通过静脉给药。利用配体转铁蛋白，该颗粒在肿瘤细胞尤其强烈地吸收，这使得可以在特定的靶细胞中进行siRNA治疗。预定断裂点通过化学水解在核内体或溶酶体中被破坏。siRNA和全氟化碳分子被释放到细胞质中。该全氟化碳分子经肺和肾功能被排出。

样品实施方式17：抗HPV16型治疗性疫苗

siRNA关闭HVP16型的特定基因表达，并如上所述制备其乳液。将该乳液在缓冲液中处理成酊剂，其应用于粘膜。该复合物渗透入组织并通过细胞的胞吞作用/胞饮作用吸收。siRNA的作用路径以及全氟化碳分子的去除路径如上所述。

样品实施方式18：全氟核酸吸收入细胞内的检测

为了跟随全氟化核酸进入细胞的路径，使用以下具有罗丹明连接的结构：

首先将化合物溶解在四氢呋喃(THF)中，随后将该溶液滴定至异丙醇中。获得的颗粒的平均尺寸为50nm。

HEK293细胞系用作细胞培养。在细胞放大后一天进行转染。作为对照，用等同罗丹明浓度的纯罗丹明颗粒进行转染，以测试全氟化的核酸。在转染之后，具有全氟化核酸的细胞的细胞培养物立刻表现澄清并保持不变。具有罗丹明的培养基出现轻微浑浊且微红。对此一个可能的解释是因为罗丹明键合至全氟化核酸中的PFC颗粒上，并且作为小颗粒沉到底部，而染料完全溶解在纯罗丹明的培养基中。

转染20分钟后，在使用全氟化核酸的细胞的细胞表面上可观察到均匀的着色。在使用纯罗丹明的细胞中，在此时没有看到清晰的着色。

转染后24小时，与20分钟标记相比，全氟化核酸细胞的着色发生了变化：不再能观察到细胞表面上一致均匀的着色。观察到颗粒状着色，其囊泡颜色强度变深，然而中间的空间几乎没有表现出任何着色。

在使用共聚焦显微镜的图像进行调查的这个过程中(参见图1)，很明显，全氟化核酸被运输至核内体和溶酶体中。在细胞质中到处都检测到被全氟化核酸填充的核内体和溶酶体。在核中没有发现该颗粒(需要核定位序列或细胞分裂)。此外，观察到从核内体/溶酶体释放的一定量颗粒已位于细胞质中，这在囊泡外的扩散着色中是明显的。

与此相反，在使用纯罗丹明的转染中，虽然在24小时后也观察到着色，但在细胞表面上与在细胞质和颗粒相比，基本上更弱和扩散。

还使用了FACS(荧光激活细胞分选)研究转染细胞(参见图2)。该FACS研究是使用纯罗丹明(对照)和全氟化核酸在转染的细胞上进行，并确认了共聚焦显微镜的结果。全氟化核酸确实被细胞吸收，包裹在核内体和溶酶体中，并由其释放至细胞质中。

由于全氟化核酸向细胞中的吸收的有效性水平高，因此这种方法构成病毒介导的基因转移、以及将核酸和其类似物(修饰的核酸，肽核酸)转移入细胞内的其它方法的一个真正替代方案。

Claims (18)

1.通式(I)

A-B-C(F，G′)-D-E-F-G-A′              (I)

或通式(Ⅱ)

A-B-C(F′，G′)-D-B-E-F-G-A′               (Ⅱ)

的化合物：

其中

-A为至少一个选自全氟化碳(PFC)、全氟化硅化合物和／或其它全氟化化合物的组中的分子，

-B为至少一个物理、化学或酶可断裂键形式的预定断裂点，

-C不存在或为至少一个连接分子，

-D不存在或为至少一个间隔分子，

-E为至少一个选自包括下列的组中的分子：核碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、修饰的核碱基、修饰的核苷、修饰的核苷酸、修饰的寡核苷酸、修饰的核酸、肽核酸单体、肽核酸低聚物以及肽核酸或其它核酸类似物，

-F,F′不存在或为至少一个配体或为识别序列，

-GG′不存在或为至少一个标记分子，

-A′不存在或为A的含义，其中以下化合物除外

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，A为至少一个选自包括下列的全氟化碳(PFC)的组中的分子：直链或支链的无环或环状、多环或杂环的脂肪族烷烃、烯烃、炔烃、芳香化合物或这些化合物的组合，其中全部H原子被F原子取代，并且任选地还含有作为一个或多个官能团或杂原子特别是Br、I、Cl、H、Si、N、O、S、P的形式的、至少一个非氟化或部分氟化的取代基，或与一个或多个其它的官能团连接的这些取代基。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，A选自包括下列的全氟化碳（PFC)的组：C₁-C₂₀₀、优选C₁-C₁₀₀、特别优选C₁-C₅₀、非常优选C₁-C₃₀、最优选C₁-C₂₀的直链、支链、环状、多环或杂环的烷烃、烯烃或炔烃，C₆-C₅₀、优选C₆-C₃₀、特别优选C₁-C₂₀的芳香或杂芳香环体系。

4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，A为至少一个选自包括下列的全氟化碳(PFC)的组的分子：直链或支链的无环或环状、多环或杂环的脂肪族硅烷，其中全部H原子被F原子取代，并且任选地还含有带有一个或多个官能团或杂原子特别是Br、I、Cl、H、Al、N、O、S、P的、非氟化或部分氟化的取代基，或与一个或多个其它的官能团连接的这些取状基。

5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，A含有两个或更多个选自全氟化碳(PFC)、全氟化硅化合物和其它全氟化化合物的组中的分子。

6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，至少一个预定断裂点B具体为酸不稳定性基团的形式，特别是糖苷键、二硫键、酯基、醚基、肽键、亚胺键、腙键、酰基腙键、缩酮键、缩醛键、顺-乙腈键、三苯甲基键、β-D-葡糖神经酰胺和／或二硫苏糖醇的形式，或为缩醛磷脂全氟化物、乙烯基醚基团或原酸酯的形式。

7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，至少一个连接分子C选自包括下列的组：直链或支链的无环或环状、多环或杂环的脂肪族烷烃、烯烃、炔烃、芳香化合物或者这些化合物与官能团的组合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，至少一个间隔分子D选自包括具有一个或多个官能团的直链或支链脂肪族的组，还可以使用间隔分子D作为连接分于C。

9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，分子E选自下列的组：核碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶；修饰的核碱基诸如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、齐多夫定类、叠氮胸苷类、司他夫定、扎西他滨、二腺苷、碘苷、氟尿苷和利巴韦林、叠氮胸苷、齐多夫定、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤和其“镜像异构体”。

10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，分子E选自下列的组：核苷，包括腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷；或修饰的核苷诸如2-硫代胞苷、N4-乙酰胞苷、2′-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、5-(羧基羟基甲基)-尿苷、5-羧甲基氨甲基-尿苷、5-甲基氨甲基-尿苷、5-甲氧基-羰基甲基-尿苷、5-甲氧基尿苷、2′-O-甲基尿苷、核糖胸核苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、2′-O-甲基腺苷、肌苷、1-甲基肌苷、1-甲基鸟苷、N2-2-甲基鸟苷、N2-2,2-二甲基鸟苷、7+-甲基鸟苷、2′-O-甲基鸟苷、辫苷、β-D-半乳糖基辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、古嘌苷、2′-O-核糖基磷酸腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、赖西丁、烟酸、核黄素和泛酸、NADPH、NADH、FAD、辅酶A以及琥珀酰辅酶A、嘌呤霉素、阿昔洛韦、更昔洛韦和其“镜像异构体”。

11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，分子E选自下列的组：核苷酸，包含AMP、GMP、m5UMP、UMP、CMP、dAMP、dGMP、dTMP、dUMP、dCMP、cAMP、cGMP、c-二-GMP、cADPR、ADP、GDP、m5UDP、UDP、CDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCTP、ATP、GTP、m5UTP、UTP、CTP、dATP、dGTP、dTTP、dUTP、dCTP，或源自上述组分的修饰的核苷酸，在糖-磷酸酯结构带有修饰的核苷酸，两性离子的寡核苷酸和磷酸酯被取代为甲基磷酸酯或二甲砜基团的核苷酸。

12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，分子E选自单链或双链寡核苷酸和核酸的组，这些物质具有多达大于1,000,000bp的2个碱基对的长度，以下的长度范围每个都为优选：10至50bp、15至25bp、25至200bp、25至100bp、200至300bp、200至500bp、500至1500bp、800至1300bp、1500至20,000bp、1500至5000bp、3000至8000bp、20,000至1,000,000bp或20,000至50,000。

13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，至少一个配体F，F′选自包括下列的组：转铁蛋白、叶酸、半乳糖、乳糖、甘露糖、表皮生长因子、RGD肽、生物素和使该化合物能够特异性进入细胞的其他物质或细胞核定位序列。

14.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于，至少一个标记分子G，G′选自包括下列的组：荧光染料，诸如Dil、DilC、DiO、荧光黄类、罗丹明类、噁嗪类、碱性品红类、派若宁类、吖啶类、金胺类、碱性副品红类、GFP、RFP、DAPI，过氧化物酶染料诸如ABTS，以及使分子遵循新陈代谢的其他物质。

15.根据前述权利要求中任一项所述的化合物在将至少一个分子E非病毒转移至至少一个真核生物、特别是动物或人类的细胞中的用途。

16.一种药物组合物，其含有至少一种如权利要求1至14中任一项所述的化合物和至少一种表面活性物质。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，该组合物以分散液、混悬液、乳液或溶液的形式存在，特别是具有2nm和200μm之间、优选20nm至400nm之间、特别优选50nm的平均粒径。

18.根据权利要求16或17所述的药物组合物在将至少一个分子E非病毒转移至至少一个真核生物、特别是动物或人类的细胞中的用途。

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