CN106187981B - 一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用。本发明全氟烷基酸探针为式Ⅰ所示的化合物:R1‑L‑(CF2)n‑R2式Ⅰ式Ⅰ中,R1为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团;n为4~20之间的整数;L为连接R1和(CF2)n的化学结构;R2为羧基或磺酸基。本发明全氟烷基酸探针与待测样品结合的检测方法,包括如下步骤:将所述全氟烷基酸探针的溶液与待测样品的溶液混合孵育,然后检测经所述孵育后上述体系的荧光偏振信号;通过所述体系的荧光偏振信号较所述全氟烷基酸探针的溶液的荧光偏振信号提高,即可得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品结合。本发明荧光标记的全氟烷基酸探针与检测待测样品的结合检测方法简单有效,能建立定性定量的研究蛋白与探针结合能力的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用,属于生物分析领域。
背景技术
全氟烷基酸(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)是一类由完全氟化的烷基链和末端的极 性酸性官能团组成的化合物。由于PFAAs的C-F共价键具有极高化学键能,因此这类化合物普遍具有非常高的稳定性,能够经受强的热处理、光照、化学处理、生物代谢 作用而不降解。PFAAs特别的化学结构使其具有非常特殊的化学性质:既具有疏水性 也具有疏油性。因此,PFAAs被广泛的应用在多个工业和消费产品领域:如纺织、造 纸、不粘涂料和灭火泡沫等。目前PFAAs包含约20种化合物,具有不同碳链长度(长 度为4碳至18碳)和不同极性官能团(如磺酸盐、羧酸盐等)。由于PFAAs化合物的大 量使用,以及其高稳定性和易于在环境中、生物体内富集的特点,PFAAs已经成为一 种全球性的新型持久性有机污染物。
动物实验表明PFAAs具有多种毒性作用,包括肝毒性、内分泌干扰作用、胚胎毒性、生殖毒性、神经毒性和潜在的致癌性等。但是其毒理机制目前还不清楚,原因之 一是PFAAs在生物体内作用的靶蛋白还不明确。筛选PFAAs潜在的生物靶蛋白对于 深入研究其毒理机制具有重要意义。在前期,已经有研究人员建立了一些用于探索 PFAAs在生物体内可能的靶蛋白的方法。Wolf等(Wolf et al.,Toxicological Sciences,2008,1:162-171)通过荧光素酶表达体系证明PFAAs能够与过氧化物酶体增殖 受体(PPARs)作用。Kjeldsen等(Kjeldsen et al.,Environ Sci Pollut Res.,2013,20:8031-8044) 也通过荧光素酶表达体系证明PFAAs能够作用于雌激素受体(ER)。以上荧光素酶表 达体系的方法需要在细胞中转染相应的核受体调控的荧光素酶报告质粒,操作复杂, 对操作人员技术要求高。而且该方法仅限于研究PFAAs与核受体类蛋白的相互作用, 不能用于研究酶、转运蛋白等其他类型的蛋白。Chen等(Chen et al.,Arch Toxicol., 2009,83:255-261)通过测定人血清白蛋白(HSA)内源性荧光信号的变化,证实PFAAs 能够与HSA结合。该方法操作简便,但是只能局限于研究具有内源性荧光信号的蛋白。 而且对于一些蛋白,PFAAs与其结合并不会导致其内源荧光信号变化,容易造成假阴 性结果。Benninghoff等(Benninghoff et al.,Toxicological Sciences,2011,1:42-58)通过放 射性标记的雌激素探针竞争法,研究PFAAs与ER的相互作用。Ren等(Ren et al.,Arch Toxicol.,2015,89:233-242)通过荧光素标记的甲状腺激素探针竞争法,研究PFAAs与 甲状腺激素受体(TR)的结合作用。以上放射性探针和荧光探针的方法需要针对目标 蛋白设计合成特异性的探针,方法具有很大的局限性。对于一些不能得到特异性探针 的蛋白,就无法采用探针竞争法研究PFAAs与其相互作用。除此之外,上述各种实验 方法只能针对性的研究PFAAs与某一种蛋白的相互作用,缺乏系统性。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用,本发明荧光标记的全氟烷基酸探针与检测待测样品的结合检测方法简单有效,能建立定性定量的研究 蛋白与探针结合能力的方法,本发明荧光标记的全氟烷基酸探针能有效的用于筛选 PFAAs潜在的生物靶蛋白。
本发明提供的全氟烷基酸探针为式Ⅰ所示的化合物:
R1-L-(CF2)n-R2
式Ⅰ
式Ⅰ中,R1为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团;n为4~20之间的整数; L为连接R1和(CF2)n的化学结构;R2为羧基或磺酸基。
上述的全氟烷基酸探针中,R1可为5(6)-羧基荧光素基团、CY3基团或CY5基团, 其结构式分别如下式Ⅲ、式Ⅳ和式Ⅴ所示;
L为-NH-(CH2)m-NH-,其中m为4~6之间的整数。
上述的全氟烷基酸探针中,当式Ⅰ所示的化合物中,R1为5(6)-羧基荧光素基团, n为8,m为4,R2为羧酸基;所述全氟烷基酸探针为式Ⅱ所示的化合物:
本发明所述全氟烷基酸探针,一部分化学结构为全氟烷基酸基团,该部分用于结合潜在的生物靶蛋白;另一部分化学结构为荧光信号分子,当所述全氟烷基酸探针与 靶蛋白结合后,其荧光信号分子的信号会发生改变,由此可判断探针与蛋白的结合。
本发明所述全氟烷基酸探针的制备方法包括如下步骤:全氟二酸的一端酸性基团进行氨基衍生化,之后对衍生的氨基进行荧光基团衍生化,即得到所述全氟烷基酸探 针。
本发明所述全氟烷基酸探针为式Ⅱ所示的化合物时,其制备方法包括如下步骤:
1、化合物1的制备
(1)在氩气保护的条件下制备反应体系1,由10g十六氟癸二酸和50mL二氯亚 砜组成;
(2)在氩气保护的条件下,向反应体系1滴加1mL二甲基甲酰胺,得到反应体 系2;
(3)将反应体系2在室温条件下回流4小时;
(4)完成步骤(3)后,将过量的有机溶剂旋干,得到化合物1的粗产物(结构 式如图1中的(2)所示),可直接投到下一步反应;
2、化合物2的制备
(1)制备反应体系3,由30mL无水二氧六环和11g化合物1粗产物组成;
(2)在氩气保护的条件下,将反应体系3用油浴加热到50℃,搅拌条件下将苄 醇的二氧六环溶液(1.5g苄醇溶解于15mL二氧六环)在一小时内缓慢滴加进去,制 备反应体系4;
(3)完成步骤(2)后,将反应体系4的反应温度升到100℃,氩气保护下反应 20小时;
(4)反应结束后,将体系降到室温,减压蒸馏去除溶剂,得到化合物2的粗产物 (结构如图1中的(4)所示),可直接投到下一步反应;
3、化合物3的制备
(1)取一个250mL的三口圆底烧瓶,制备反应体系5,由150mL无水四氢呋喃 和12g化合物2粗产物组成。
(2)在氩气保护的条件下,将反应体系5采用冰浴降温至0℃,搅拌条件下依次 将N-叔丁氧羰基-丁二胺的四氢呋喃溶液(2.5gN-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺溶解于30mL 四氢呋喃)和三乙胺的四氢呋喃溶液(3.8g三乙胺溶解于30mL四氢呋喃)在半小时 内缓慢滴加进去,制备反应体系6,搅拌反应2小时,在操作过程中保证体系温度不 超过5℃;
(3)将反应体系6升温至室温后继续反应3小时;
(4)完成步骤(3)后,首先通过减压蒸馏除去溶剂,然后将残留物上样至硅胶 层析柱,再用5个柱体积的洗脱液1冲洗所述硅胶层析柱并收集柱层析后溶液,柱层 析后溶液经浓缩、干燥即为化合物3(结构式如图1中的(6)所示);
洗脱液1:由石油醚和乙酸乙酯按照5:1的体积比混合得到;
4、化合物4的制备
(1)制备反应体系7,由2mL三氟乙酸、0.45g化合物3和10mL二氯甲烷组成;
(2)将反应体系7在室温条件下搅拌3小时;
(3)完成步骤(2)后,减压蒸馏去除溶剂,得到化合物4(结构式如图1中的 (7)所示),可直接投到下一步反应;
5、化合物5的制备
(1)制备反应体系8,由10mL二甲基亚酰胺、5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.3g 化合物4和0.1g 5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(结构式如图1中的(8)所示)和46mgN, N-二异丙基乙胺组成;
(2)将反应体系8在50℃条件下搅拌3小时,然后加入10mL蒸馏水,得到反 应体系9;
(3)向反应体系9中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g离心10min, 静置分层,分别收集上层有机相和下层液相;
(4)向步骤(3)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g 离心10min,静置分层,分别收集上层有机相和下层液相;
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g 离心10min,静置分层,分别收集上层有机相;
(6)将步骤(3)收集的上层有机相、步骤(4)收集的上层有机相和步骤(5) 收集的上层有机相合并浓缩干燥,即为化合物5(结构式如图1中的(9)所示);
6、化合物6的制备
(1)制备反应体系10,由1mL氢氧化锂水溶液(浓度为0.36mmol/L)、5mL甲 醇、5mL四氢呋喃和0.2g化合物5组成;
(2)将反应体系10在室温(25℃)条件下搅拌5小时后进行浓缩干燥,然后加 入10mL蒸馏水,采用稀盐酸调节pH值至4.0,即为粗样品;
(7)取粗样品,进行制备液相进行分离纯化,即得到所述全氟烷基酸探针为式Ⅱ所示的化合物,又称化合物6(结构式如图1中的(10)所示)。
本发明还提供了所述全氟烷基酸探针与待测样品结合的检测方法,包括如下步骤: 将所述全氟烷基酸探针的溶液与待测样品的溶液混合孵育,然后检测经所述孵育后上述体系的荧光偏振信号;通过所述体系的荧光偏振信号较所述全氟烷基酸探针的溶液 的荧光偏振信号提高,即可得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品结合。
上述的检测方法中,所述方法中还包括将所述待测样品的溶液浓度为横坐标,所述体系的荧光偏振信号为纵坐标作图,得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品的结 合曲线,计算得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品的结合常数的步骤。
本发明中,具体采用Graphpad Prism软件对所述结合曲线进行非线性拟合。
上述的检测方法中,所述待测样品为蛋白质。
上述的检测方法中,所述蛋白质具体可为TR、ER、PPARs和HSA中的至少一种。
本发明所述全氟烷基酸探针以游离状态存在时,其荧光偏振信号较低,当所述全氟烷基酸探针与蛋白结合后,其荧光偏振信号会显著提高;通过荧光偏振信号的提高 即可判断蛋白是否与所述全氟烷基酸探针结合。
上述的检测方法中,在混合后的溶液中,所述全氟烷基酸探针的溶液浓度可为 20~150nmol/L;具体可为50nmol/L、30~100nmol/L或30~120nmol/L;
所述待测样品的溶液的浓度可为0~20000nmol/L;具体可为0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、2000nmol/L、5000nmol/L、10000nmol/L 或20000nmol/L。
上述的检测方法中,所述孵育的温度为室温;
所述孵育的时间可为3~30min,具体可为5min、3~5min、5~30min或3~20min。
本发明中,所述室温指的是本领域人员公知的10~30℃。
上述的检测方法中,采用荧光光谱仪检测所述荧光偏振信号;
所述荧光光谱仪的检测的激发波长可为400~700nm,具体可为485nm,检测波长为420~770nm,具体可为520nm。
本发明所述全氟烷基酸探针应用于筛选全氟烷基酸的生物靶蛋白中;所述生物靶蛋白具体可为TR、ER、PPARs和HSA中的至少一种。
本发明具有以下优点:
本发明提供的全氟烷基酸探针通过与待测样品结合能力检测,能有效的用于筛选PFAAs潜在的生物靶蛋白;全氟烷基酸探针能够模拟PFAAs与蛋白的作用模式;全氟 烷基酸探针能系统有效的筛选多种待测样品,无需针对某一样品专门建立方法;全氟 烷基酸探针的检测为荧光检测,方法简单,且稳定性好、无危害性;采用荧光光谱仪 检测特异荧光探针与待测样品的结合,操作简单。可见,本发明提供的方法在筛选 PFAAs潜在的靶蛋白方面重要应用价值。
附图说明
图1为制备荧光探针FITC-PFNA的化学反应流程图。
图2为HPLC的检测结果。
图3为MS的检测结果。
图4为氢核磁的检测结果。
图5为氟核磁的检测结果。
图6为检测荧光探针FITC-PFNA与人血清白蛋白HSA的结合常数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中硅胶层析柱为Merck公司产品,230~400目,产品型号为MerckKieselgel 60;人血清白蛋白(HSA)为Sigma公司产品;荧光光谱仪为美国Horiba公 司产品。
实施例1、荧光标记的全氟烷基酸探针的制备
制备探针荧光标记的全氟烷基酸探针(式Ⅱ所示化合物)的化学反应流程如图1所示。按照如下步骤制备荧光标记的全氟烷基酸探针:
1、化合物1的制备
(1)取一个100mL的三口圆底烧瓶,在氩气保护的条件下制备反应体系1,由 10g十六氟癸二酸和50mL二氯亚砜组成。
(2)在氩气保护的条件下,向反应体系1滴加1mL二甲基甲酰胺,得到反应体 系2。
(3)将反应体系2在室温25℃条件下回流4小时。
(4)完成步骤(3)后,将过量的有机溶剂旋干,得到化合物1的粗产物(结构 式如图1中的(2)所示),可直接投到下一步反应。
2、化合物2的制备
(1)取一个100mL的三口圆底烧瓶,制备反应体系3,由30mL无水二氧六环和 11g化合物1粗产物组成。
(2)在氩气保护的条件下,将反应体系3用油浴加热到50℃,搅拌条件下将苄 醇的二氧六环溶液(1.5g苄醇溶解于15mL二氧六环)在一小时内缓慢滴加进去,制 备反应体系4。
(3)完成步骤(2)后,将反应体系4的反应温度升到100℃,氩气保护下反应 20小时。
(4)反应结束后,将体系降到室温,减压蒸馏去除溶剂,得到化合物2的粗产物 (结构如图1中的(4)所示),可直接投到下一步反应。
3、化合物3的制备
(1)取一个250mL的三口圆底烧瓶,制备反应体系5,由150mL无水四氢呋喃 和12克化合物2粗产物组成。
(2)在氩气保护的条件下,将反应体系5采用冰浴降温至0℃,搅拌条件下依次 将N-叔丁氧羰基-丁二胺的四氢呋喃溶液(2.5gN-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺溶解于30mL 四氢呋喃)和三乙胺的四氢呋喃溶液(3.8g三乙胺溶解于30mL四氢呋喃)在半小时 内缓慢滴加进去,制备反应体系6,搅拌反应2小时。在操作过程中保证体系温度不 超过5℃。
(3)将反应体系6升温至室温后继续反应3小时。
(4)完成步骤(3)后,首先通过减压蒸馏除去溶剂,然后将残留物上样至硅胶 层析柱,再用5个柱体积的洗脱液1冲洗所述硅胶层析柱并收集柱层析后溶液,柱层 析后溶液经浓缩、干燥即为化合物3(结构式如图1中的(6)所示)。
洗脱液1:由石油醚和乙酸乙酯按照5:1的体积比混合得到。
4、化合物4的制备
(1)制备反应体系7,由2mL三氟乙酸、0.45g化合物3和10mL二氯甲烷组成。
(2)将反应体系7在室温条件下搅拌3小时。
(3)完成步骤(2)后,减压蒸馏去除溶剂,得到化合物4(结构式如图1中的 (7)所示),可直接投到下一步反应。
5、化合物5的制备
(1)制备反应体系8,由10mL二甲基亚酰胺、5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.3g 化合物4和0.1g 5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(结构式如图1中的(8)所示)和46mgN, N-二异丙基乙胺组成。
(2)将反应体系8在50℃条件下搅拌3小时,然后加入10mL蒸馏水,得到反 应体系9。
(3)向反应体系9中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g离心10min, 静置分层,分别收集上层有机相和下层液相。
(4)向步骤(3)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g 离心10min,静置分层,分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯,涡旋1min,然后8000g 离心10min,静置分层,分别收集上层有机相。
(6)将步骤(3)收集的上层有机相、步骤(4)收集的上层有机相和步骤(5) 收集的上层有机相合并浓缩干燥,即为化合物5(结构式如图1中的(9)所示)。
6、化合物6的制备
(1)制备反应体系10,由1mL氢氧化锂水溶液(浓度为0.36mmol/L)、5mL甲 醇、5mL四氢呋喃和0.2g化合物5组成。
(2)将反应体系10在室温(25℃)条件下搅拌5小时后进行浓缩干燥,然后加 入10mL蒸馏水,采用稀盐酸调节pH值至4.0,即为粗样品。
(7)取粗样品,进行制备液相进行分离纯化,得到化合物6(结构式如图1中的 (10)所示),并对所得产物分别进行HPLC检测,MS检测,氢核磁检测和氟核磁检 测。
结构确证如下:使用配有Waters XBridgeTMC18反相柱(2.1mm×50mm,Waters 公司产品)的高效液相色谱仪(Agilent Technologies产品,型号为HP-1100)进行检 测。流动相由甲醇(A)和水(B)组成,流速为0.8mL/min,使用以下洗脱条件:在 0~7min内,流动相中甲醇的体积百分含量由10%匀速增至100%,水的体积百分含量 由90%匀速降至0%,进行线性梯度洗脱。检测波长为254nm。HPLC的检测结果如图 2所示。对采用低分辨液相-质谱(Agilent Technologies)进行分析。采用正电荷模式 电喷射离子化对样品进行分析。MS的检测结果如图3所示。氢核磁的检测结果如图4 所示。氟核磁的检测结果如图5所示。
上述结果表明,从粗样品中纯化得到化合物6(图1中的(10)),其结构式如式 Ⅱ所示,
化合物6即为本发明制备的荧光标记的全氟烷基酸探针(又称荧光探针 FITC-PFNA)。
实施例2、荧光光谱仪检测荧光探针FITC-PFNA与HSA的结合常数
取EP管,每管加入100μL pH7.4、50mmol/L的PBS缓冲液,本发明实施例1制 备的荧光探针FITC-PFNA,和不同浓度的HSA蛋白得到检测体系。检测体系中,荧 光探针FITC-PFNA的浓度为50nmol/L,HSA的浓度为0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、 100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、2000nmol/L、5000nmol/L、10000nmol/L或 20000nmol/L(每个检测样品设置3个复孔)。检测体系室温孵育5min后采用荧光光谱 仪对溶液的荧光偏振信号进行检测。荧光光谱仪的检测参数条件为,485nm激发波长, 520nm检测波长,采用荧光偏振的检测模式进行检测。荧光偏振检测荧光当荧光探针 以游离状态存在时,其荧光偏振信号较低,当探针与蛋白结合后,其荧光偏振信号会 显著提高。通过荧光偏振信号的提高即可判断蛋白是否与荧光探针结合。
结果如图6所示,由图6可知,当检测体系中只有荧光探针FITC-PFNA时,其荧 光偏振信号约为30mP。随着检测体系中HSA蛋白浓度的提高,其荧光偏振信号逐渐 上升,在5000nmol/L时达到360mP。将荧光偏振信号值对HSA蛋白浓度作图,得到 结合曲线。
图6中采用GraphPad软件对结合曲线进行非线性结合曲线拟合,即得到荧光探针FITC-PFNA与HSA的结合常数为800nmol/L。
Claims (7)
1.一种全氟烷基酸探针为式Ⅱ所示的化合物:
2.一种权利要求1所述全氟烷基酸探针与待测样品结合的检测方法,包括如下步骤:将权利要求1所述全氟烷基酸探针的溶液与待测样品的溶液混合孵育,然后检测经所述孵育后上述体系的荧光偏振信号;通过所述体系的荧光偏振信号较所述全氟烷基酸探针的溶液的荧光偏振信号提高,即可得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品结合;
所述待测样品为TR、ER、PPARs和HSA中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述方法中还包括将所述待测样品的溶液浓度为横坐标,所述体系的荧光偏振信号为纵坐标作图,得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品的结合曲线,计算得到所述全氟烷基酸探针与所述待测样品的结合常数的步骤。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法,其特征在于:在混合后的溶液中,所述全氟烷基酸探针的溶液浓度为20~150nmol/L;
所述待测样品的溶液的浓度为0~20000nmol/L。
5.根据权利要求2或3所述的检测方法,其特征在于:所述孵育的温度为室温;
所述孵育的时间为3~30min。
6.根据权利要求2或3所述的检测方法,其特征在于:采用荧光光谱仪检测所述荧光偏振信号;
所述荧光光谱仪的检测的激发波长为400~700nm,检测波长为420~770nm。
7.权利要求1所述全氟烷基酸探针在筛选全氟烷基酸的生物靶蛋白中的应用;
所述生物靶蛋白为TR、ER、PPARs和HSA中的至少一种。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004003510A2 (en) * | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Guava Technologies, Inc. | Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods |
US20090326186A1 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-31 | Transitions Optical, Inc. | Mesogen containing compounds |
CN102276713A (zh) * | 2010-06-10 | 2011-12-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 全氟辛酸人工完全抗原的制备方法 |
CN102276711A (zh) * | 2010-06-10 | 2011-12-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 全氟辛磺酸人工完全抗原的制备方法 |
CN103764169A (zh) * | 2011-03-31 | 2014-04-30 | 康斯坦策·沙费尔 | 用于非病毒转移核酸的全氟化化合物 |
WO2016089152A1 (ko) * | 2014-12-04 | 2016-06-09 | 주식회사 엘지화학 | 할로겐화 화합물, 이를 포함하는 중합체 및 이를 포함하는 고분자 전해질막 |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004003510A2 (en) * | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Guava Technologies, Inc. | Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods |
US20090326186A1 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-31 | Transitions Optical, Inc. | Mesogen containing compounds |
CN102276713A (zh) * | 2010-06-10 | 2011-12-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 全氟辛酸人工完全抗原的制备方法 |
CN102276711A (zh) * | 2010-06-10 | 2011-12-14 | 中国科学院生态环境研究中心 | 全氟辛磺酸人工完全抗原的制备方法 |
CN103764169A (zh) * | 2011-03-31 | 2014-04-30 | 康斯坦策·沙费尔 | 用于非病毒转移核酸的全氟化化合物 |
WO2016089152A1 (ko) * | 2014-12-04 | 2016-06-09 | 주식회사 엘지화학 | 할로겐화 화합물, 이를 포함하는 중합체 및 이를 포함하는 고분자 전해질막 |
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Acylations of pentafluorosulfanylamine, SF5NH2. Part II. Reactions of N-pentafluorosulfanylcarbamylfluoride, SF5NHC(O)F, and N-pentafluoro- sulfanylperfluorosuccinmide, SF5NC(O)CF2CF2C(O);Joseph S Thrasher et al;《Journal of fluorine chemistry》;19840430;第24卷(第4期);第431-442页,第439页第2段 * |
The Synthesis, Characterization and Structural Analysis of a Co(III) Complex of 1,10-Phenanthroline and Perfluorosebacic Acid, [Co(HL)(phen)2(H2O)]L•H2O;Ibrahim Kani et al;《Zeitschrift fuer Naturforschung, B: Chemical Sciences》;20140602;第61卷(第10期);第1198-1204页,Fig 1 * |
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