CN105675570A - 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针 - Google Patents

一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针 Download PDF

Info

Publication number
CN105675570A
CN105675570A CN201610121989.0A CN201610121989A CN105675570A CN 105675570 A CN105675570 A CN 105675570A CN 201610121989 A CN201610121989 A CN 201610121989A CN 105675570 A CN105675570 A CN 105675570A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpr40
protein
sequence
fluorogenic probe
specific fluorogenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610121989.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105675570B (zh
Inventor
任肖敏
曹林英
杨郁
郭良宏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Original Assignee
Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS filed Critical Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority to CN201610121989.0A priority Critical patent/CN105675570B/zh
Publication of CN105675570A publication Critical patent/CN105675570A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105675570B publication Critical patent/CN105675570B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D307/80—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其特异荧光探针。所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。实验证明，本发明提供的检测待测样品与GPR40结合能力的方法可检测待测样品与GPR40结合能力。利用本发明提供的方法检测待测样品与GPR40结合能力具有结合位点明确、特异性好、操作简单、所述特异荧光探针稳定性好且无危害性等优点。本发明提供的方法在检测待测样品与GPR40结合能力方面重要应用价值。

Description

一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其专用特异荧光探针
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种检测待测样品与GPR40结合能力的方法及其专用特异荧光探针。
背景技术
G蛋白偶联受体40(Gprotein-coupledreceptor40，GPR40)，又称为游离脂肪酸受体1(Freefattyacidreceptor1，FFAR1)，是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体。研究发现，GPR40在调节胰岛素分泌中发挥重要作用，如在胰岛β细胞中，GPR40可被游离脂肪酸激活，促使细胞内钙离子浓度升高，进而促进胰岛素释放。因此，以GPR40作为治疗糖尿病的药物靶标分子是当前国内外研究的热点，已有大量的研究工作致力于筛选能够作用于GPR40的药物，但是能够用于定量检测化合物与GPR40直接结合能力的方法则比较少。
Duncan等通过检测GPR40调控的细胞内钙离子浓度上升研究化合物与GPR40的结合作用，但是该方法只能间接的反应化合物能够作用于GPR40，并不能给出化合物与GPR40的直接结合能力，且在实验操作过程中，存在很多因素都会导致细胞的钙离子浓度变化。简单的通过钙离子浓度的变化反应化合物与受体的作用可能会造成假阳性的结果。此外，对于某些GPR40的抑制剂，其能够与受体结合，但并不会导致细胞内钙离子变化。因此，通过钙离子浓度的变化研究某些具有抑制作用的化合物与GPR40受体的作用时，可能会造成假阴性的结果。Lin等通过对GPR40已知的配体AMG837和AM1638进行放射性标记，得到了放射性探针[3H]AMG837和放射性探针[3H]AM1638。Hauge等通过对GPR40的配体L358进行放射性标记得到了[3H]L358。放射性标记探针方法的优点是灵敏度很高，但是放射性探针危害较大，操作复杂，对操作人员技术要求高，难以推广使用。Hara等证明一种荧光分子标记的脂肪酸(C1-BODIPY-C12)可以作为检测化合物与GPR40结合能力的荧光探针。荧光探针相对放射性探针没有危害性，但该方法也需要将GPR40蛋白从细胞膜上分离提取，容易造成受体蛋白失活，同时需要采用免疫反应将GPR40固定到磁珠上，操作比较复杂。上述研究人员开发的放射性探针和荧光探针虽然能够与GPR40结合，但是在GPR40上的结合位点是未知的，因此，研究化合物与GPR40结合作用时，其在GPR40上的结合位点也是不明确的，难以对化合物的作用效果和作用机理进行深入研究。可见，设计针对GPR40的特异性探针，建立定性定量的检测化合物与GPR40结合能力的方法，对有效的筛选和研究化合物与GPR40的结合与效应具有重要意义。
Srivastava等(Srivastavaetal.Nature，2014，513:124-139)通过蛋白晶体结构得到GPR40与TAK-875形成复合物的晶体结构，这是目前唯一解析的GPR40与配体的复合物晶体结构。晶体结构的结果明确的给出TAK-875在GPR40的特异性结合口袋位置。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测待测样品与GPR40结合能力。
为解决上述问题，本发明首先提供了特异荧光探针在检测待测样品与GPR40结合能力中的应用；所述GPR40为G蛋白偶联受体40；所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
上述应用中，所述GPR40可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
上述应用中，所述特异荧光探针具体可为式(Ⅰ)所示的化合物；
上述应用中，所述待测样品可为化合物。
为解决上述问题，本发明还提供了一种获得待测样品与GPR40结合能力的方法。
本发明所提供的获得待测样品与GPR40结合能力的方法，包括如下步骤：检测待测样品与特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力，从而获得所述待测样品与所述GPR40的结合能力；所述GPR40为G蛋白偶联受体40；所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
上述方法中，所述GPR40可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，所述特异荧光探针具体可为式(Ⅰ)所示的化合物；
上述方法中，所述待测样品可为化合物。
上述方法中，所述“检测待测样品与所述特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力”是通过将待测样品、所述特异荧光探针和表达所述GPR40的细胞共孵育并采用流式细胞仪进行检测实现的。
上述方法中，所述“表达所述GPR40的细胞”可为瞬时表达所述GPR40的哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞具体为HEK293细胞。所述“表达所述GPR40的哺乳动物细胞”具体可通过将表达所述GPR40的质粒转染HEK293细胞实现。
所述共孵育的条件具体可为：室温孵育2min。
所述共孵育的初始时刻：所述特异荧光探针的浓度可为80～120nmol/L(如100nmol/L)；所述待测样品的初始浓度可为0～1000nmol/L(如0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L或1000nmol/L)；所述“表达所述GPR40的细胞”的浓度可为5×106～6×106个/mL。
所述“采用流式细胞仪进行检测”的具体方法如下：对完成共孵育的细胞的FITC通路的荧光信号进行流式检测，将得到的荧光检测平均值进行直方图统计分析。所述方法中，具体来说，每一个样品都收集至少10000个细胞采用高流速测样模式进行检测。当所述“表达所述GPR40的细胞”为瞬时表达所述GPR40的哺乳动物细胞时，由于是瞬时转染，仅有一部分细胞会表达GPR40，因此进行流式分析时，直方图会出现两个细胞峰，荧光强度较大的峰为阳性表达GPR40细胞结合所述特异荧光探针产生的峰(结合峰)，以此峰所占的比例表示所述特异荧光探针与GPR40的结合量。
所述方法中，可将结合峰比例对所述待测样品的浓度作图，得到竞争曲线。
所述方法中，可采用Origin软件对所述竞争曲线进行Sigmoidal拟合，即得到待测样品的半抑制浓度，然后按照下述公式计算得到待测样品与GPR40的结合常数：
结合常数＝半抑制浓度×A/B；
其中A为所述特异荧光探针与GPR40结合常数，B为所述特异荧光探针的浓度。
所述特异荧光探针与GPR40结合常数具体可为100nmol/L。
待测样品与GPR40的结合常数越大，则待测样品与GPR40的结合能力越强。
所述“表达所述GPR40的质粒”可为上海吉凯基因化学技术有限公司生产的产品目录号为POSE141087382的质粒。
特异荧光探针在制备检测待测样品与GPR40结合能力的产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述GPR40为G蛋白偶联受体40；所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
上述应用中，所述GPR40可为如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
上述任一所述应用中，所述特异荧光探针具体可为式(Ⅰ)所示的化合物；
本发明还保护式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
式(Ⅱ)所示的化合物具体可为式(Ⅰ)所示的化合物；
实验证明，本发明提供的检测待测样品与GPR40结合能力的方法可有效检测待测样品与GPR40的结合能力。利用本发明提供的方法检测待测样品与GPR40结合能力具有如下优点：(1)特异荧光探针与GPR40的结合位点明确；(2)特异荧光探针与GPR40结合特异性非常好；(3)特异荧光探针的检测为荧光检测，特异荧光探针的制备方法简单，且稳定性好、无危害性；(4)采用流式细胞仪检测特异荧光探针与细胞表达的GPR40结合，操作简单。可见，本发明提供的方法在检测待测样品与GPR40结合能力方面重要应用价值。
附图说明
图1为制备荧光探针F-TAK-875A的化学反应流程图。
图2为HPLC的检测结果。
图3为MS的检测结果。
图4为检测荧光探针F-TAK-875A与GPR40的结合常数。
图5为利用荧光探针F-TAK-875A检测TAK-875与GPR40的结合能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
硅胶层析柱为Merck公司产品，230～400目，产品型号为MerckKieselgel60。TAK-875为Selleckchem公司产品。流式细胞仪为美国ACEABiosciences公司产品。表达GPR40的质粒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，产品目录号为POSE141087382；其中GPR40的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
含酚红的DMEM培养基、无酚红的DMEM培养基和LipofectamineTM2000试剂盒均为LifeTechnologies公司产品。
HEK293细胞购自AmericanTypeCultureCollection。
实施例1、荧光探针F-TAK-875A的制备
制备荧光探针F-TAK-875A的化学反应流程图见图1。按照如下步骤制备荧光探针F-TAK-875A：
1、化合物1的制备
(1)取两口圆底烧瓶，首先加入4-溴-3，5-二甲酚(见图1中的⑴)6g、3-甲酰基苯硼酸(见图1中的⑵)5g、1MNa2CO3水溶液80mL、乙醇40mL和甲苯80mL，然后加入四(三苯基膦)钯1.8g，在氩气的保护下室温搅拌过夜。
(2)完成步骤(1)后，首先通过减压蒸馏除去溶剂，然后将残留物上样至硅胶层析柱，再用5个柱体积的洗脱液1冲洗所述硅胶层析柱并收集过柱后溶液，过柱后溶液经浓缩、干燥即为化合物1(见图1中的⑶)。化合物1为淡黄色固体。
洗脱液1：由石油醚和乙酸乙酯按照10:1的体积比混合得到。
2、化合物2的制备
(1)制备反应体系1，由50mL二甲基甲酰胺、5g化合物1、7.5gN-叔丁氧羰基-溴乙胺(图1中的⑷)和9.1gK2CO3组成。
(2)将反应体系1置于85℃条件下，搅拌过夜，然后冷却至室温。
(3)完成步骤(2)后，加入100mL蒸馏水，得到反应体系2。
(4)向反应体系2中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(6)向步骤(5)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，收集上层有机相。
(7)将步骤(4)收集的上层有机相、步骤(5)收集的上层有机相和步骤(6)收集的上层有机相混合并浓缩干燥，然后上样至硅胶层析柱，再用5个柱体积的洗脱液2冲洗所述硅胶层析柱并收集过柱后溶液，过柱后溶液经浓缩、干燥即为化合物2(图1中的⑸)。化合物2为淡黄色固体。
洗脱液2：由石油醚和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合得到。
3、化合物3的制备
(1)制备反应体系3，由5mL甲醇、50mL四氢呋喃和4g化合物2组成。
(2)取反应体系3置于冰浴上，加入0.63g硼氢化钠(分3次加入，每次间隔5min)，然后在冰浴中搅拌3小时。
(3)完成步骤(2)后，加入100mL蒸馏水，得到反应体系4。
(4)向反应体系4中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置后分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(6)向步骤(5)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(7)将步骤(4)收集的上层有机相、步骤(5)收集的上层有机相和步骤(6)收集的上层有机相混合并浓缩干燥，然后上样至硅胶层析柱，再用5个柱体积的洗脱液3冲洗所述硅胶层析柱并收集过柱后溶液，过柱后溶液经浓缩、干燥即为化合物3(图1中的⑹)。化合物3为白色固体。
洗脱液3：由二氯甲烷和甲醇按照50:1的体积比混合得到。
4、化合物4的制备
(1)制备反应体系5，由15mL甲苯、0.68g偶氮二甲酰二哌啶、1.1g三丁基膦、1g化合物3和0.67g2，3-二氢-6-羟基-3-香豆酮乙酸甲酯(图1中的⑺)组成。
(2)将反应体系5置于室温条件下，在氮气的保护下搅拌6小时。
(3)完成步骤(2)后，加入100mL蒸馏水，得到反应体系6。
(4)向反应体系6中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(6)向步骤(5)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(7)将步骤(4)收集的上层有机相、步骤(5)收集的上层有机相和步骤(6)收集的上层有机相混合并浓缩干燥，然后上样至硅胶层析柱，再用5个柱体积的洗脱液4冲洗所述硅胶层析柱并收集过柱后溶液，过柱后溶液经浓缩、干燥即为化合物4(图1中的⑻)。化合物4为淡黄色固体。
洗脱液4：由石油醚和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合得到。
5、化合物5的制备
(1)制备反应体系7，由3mL三氟乙酸、10mL二氯甲烷和0.45g化合物4组成。
(2)将反应体系7在室温条件下搅拌3小时，然后通过减压蒸馏除去溶剂，向残留物中加入10mL蒸馏水，调pH值至12.0，得到反应体系8。
(3)向反应体系8中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(4)向步骤(3)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入50mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(6)将步骤(3)收集的上层有机相、步骤(4)收集的上层有机相和步骤(5)收集的上层有机相混合并浓缩干燥，然后上样至硅胶层析柱，再用5个柱体积的洗脱液5冲洗所述硅胶层析柱并收集过柱后溶液，过柱后溶液经浓缩、干燥即为化合物5(图1中的⑼)。化合物5为白色固体。
洗脱液5：由二氯甲烷和甲醇按照30:1的体积比混合得到。
6、化合物6的制备
(1)制备反应体系9，由5mLN，N-二甲基甲酰胺、0.1g化合物5和0.1g5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(图1中的⑽)组成。
(2)将反应体系9在室温条件下搅拌过夜，然后加入10mL蒸馏水，得到反应体系10。
(3)向反应体系10中加入20mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(4)向步骤(3)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入20mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相。
(6)将步骤(3)收集的上层有机相、步骤(4)收集的上层有机相和步骤(5)收集的上层有机相合并浓缩干燥，即为化合物6(图1中的⑾)。
7、化合物7的制备
(1)制备反应体系11，由2mL氢氧化锂水溶液(浓度为0.36mmol/L)、3mL甲醇、3mL四氢呋喃和0.15g化合物6组成。
(2)将反应体系11在室温条件下搅拌5小时后进行浓缩干燥，然后加入10mL蒸馏水，调节pH值至4.0，得到反应体系12。
(3)向反应体系12中加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(4)向步骤(3)收集的下层液相中加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相和下层液相。
(5)向步骤(4)收集的下层液相中加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后8000g离心10min，静置分层，分别收集上层有机相。
(6)将步骤(3)收集的上层有机相、步骤(4)收集的上层有机相和步骤(5)收集的上层有机相混合并浓缩干燥，即为粗样品。
(7)取粗样品，进行HPLC-MS。
使用配有WatersXBridgeTMC18反相柱(2.1mm×50mm，Waters公司产品)的高效液相色谱仪(AgilentTechnologies产品，型号为HP-1100)进行检测。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8mL/min，使用以下洗脱条件：在0～7min内，流动相中甲醇的体积百分含量由10％匀速增至100％，水的体积百分含量由90％匀速降至0％，进行线性梯度洗脱。检测波长为254nm。HPLC的检测结果见图2。采用低分辨液相-质谱(AgilentTechnologies)进行分析。采用正电荷模式电喷射离子化对样品进行分析。MS的检测结果见图3。
结果表明，从粗样品中纯化得到化合物7(图1中的⑿)，其结构式如式(Ⅰ)所示，
化合物7即为制备的荧光探针F-TAK-875A。
实施例2、应用荧光探针F-TAK-875A检测TAK-875与GPR40的结合能力
1、HEK293细胞瞬时转染表达GPR40
参考LipofectamineTM2000试剂盒的操作步骤对HEK293细胞进行瞬时转染。具体步骤如下：
(1)将HEK293细胞接种于含10％胎牛血清、1％青霉素和1％链霉素的含酚红的DMEM培养基，在37℃、5％CO2环境中培养。
(2)取直径为10cm的细胞培养皿，接种步骤(1)得到的体系(含5×106个HEK293细胞)，在37℃、5％CO2环境中培养12h，使HEK293细胞贴壁。
(3)取表达GPR40的质粒8μg，用0.5mL含酚红的DMEM培养基稀释，得到质粒溶液。
(4)取20μL脂质体2000(LipofectamineTM2000试剂盒中的组件)，用0.5mLDMEM稀释，得到转染溶液。
(5)将质粒溶液和转染溶液混合，室温孵育20分钟后，加入完成步骤(2)的培养皿中，孵育48h后，然后收集细胞并进行胰酶消化。
(6)取步骤(5)得到的细胞，加入5mL无酚红的DMEM培养基，充分洗涤后，离心收集细胞。
(7)取步骤(6)收集的细胞，加入5mL无酚红的DMEM培养基，充分洗涤后，离心收集细胞，然后悬浮于5mL无酚红的DMEM培养基，得到细胞液。将所述细胞液置于冰上，在两个小时内进行后续实验。
2、流式细胞术检测荧光探针F-TAK-875A与GPR40的结合常数
取EP管，每管加入50μL步骤1制备的细胞液、450μLpH7.4、50mmol/L的PBS缓冲液和实施例1制备的荧光探针F-TAK-875A，得到检测体系。检测体系中，荧光探针F-TAK-875A的浓度为0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L或1000nmol/L(每个荧光探针F-TAK-875A浓度设置3个复孔)。检测体系室温孵育2min后采用流式细胞仪对细胞的FITC通路的荧光信号进行流式检测，将得到的荧光检测平均值进行直方图统计分析。每一个样品都收集至少10000个细胞采用高流速测样模式进行检测。
结果表明，由于HEK293细胞是瞬时转染，仅有一部分细胞会表达GPR40，因此进行流式分析时，直方图会出现两个细胞峰。荧光强度较大的峰为阳性表达GPR40细胞结合荧光探针F-TAK-875A产生的峰，以此峰所占的比例表示荧光探针F-TAK-875A与GPR40的结合量。随着荧光探针F-TAK-875A浓度的提高，更多的细胞结合了荧光探针F-TAK-875A，因此结合峰的比例会随之增加。将结合峰比例对荧光探针F-TAK-875A浓度作图，得到结合曲线。
采用GraphPad软件对结合曲线进行非线性结合曲线拟合，即得到荧光探针F-TAK-875A与GPR40的结合常数为100nmol/L(图4)。
3、流式细胞术检测TAK-875与GPR40结合能力
取EP管，每管加入TAK-875、50μL步骤1制备的细胞液、450μLpH7.4、50mmol/L的PBS缓冲液和实施例1制备的荧光探针F-TAK-875A，得到检测体系。检测体系中，荧光探针F-TAK-875A的浓度为100nmol/L，TAK-875的浓度为0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L或1000nmol/L(每个TAK-875浓度设置3个复孔)。检测体系室温孵育2min后采用流式细胞仪对细胞的FITC通路的荧光信号进行流式检测，将得到的荧光检测平均值进行直方图统计分析。每一个样品都收集至少10000个细胞采用高流速测样模式进行检测。
结果表明，由于HEK293细胞是瞬时转染，仅有一部分细胞会表达GPR40，因此进行流式分析时，直方图会出现两个细胞峰。荧光强度较大的峰为阳性表达GPR40细胞结合探针产生的峰，以此峰所占的比例表示荧光探针F-TAK-875A与GPR40的结合量。随着TAK-875的加入，荧光探针F-TAK-875A从细胞中被竞争到溶液中，因此结合峰的比例会随之减少。将结合峰比例对TAK-875浓度作图，得到竞争曲线(图5)。
采用Origin软件对竞争曲线进行Sigmoidal拟合，即得到TAK-875的半抑制浓度，然后按照下述公式计算得到TAK-875与GPR40的结合常数：
结合常数＝半抑制浓度×A/B；
其中A为荧光探针F-TAK-875A与GPR40结合常数，B为荧光探针F-TAK-875A的浓度。
结果表明，荧光探针F-TAK-875A浓度为100nmol/L时，半抑制浓度为3nmol/L。TAK-875与GPR40的结合常数为3nmol/L。
化合物与GPR40的结合常数越大，则化合物与GPR40的结合能力越强。

Claims (10)

1.特异荧光探针在检测待测样品与GPR40结合能力中的应用；
所述GPR40为G蛋白偶联受体40；
所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述特异荧光探针为式(Ⅰ)所示的化合物；
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述GPR40为如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
4.一种获得待测样品与GPR40结合能力的方法，包括如下步骤：检测待测样品与特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力，从而获得所述待测样品与所述GPR40的结合能力；
所述GPR40为G蛋白偶联受体40；
所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述特异荧光探针为式(Ⅰ)所示的化合物；
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述GPR40为如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：
a1)氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质；
a2)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
7.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述“检测待测样品与所述特异荧光探针竞争性结合GPR40的能力”是通过将待测样品、所述特异荧光探针和表达所述GPR40的细胞共孵育并采用流式细胞仪进行检测实现的。
8.特异荧光探针在制备检测待测样品与GPR40结合能力的产品中的应用；
所述GPR40为G蛋白偶联受体40；
所述特异荧光探针为式(Ⅱ)所示的化合物；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述特异荧光探针为式(Ⅰ)所示的化合物；
10.一种化合物，如式(Ⅱ)所示；
R为产生荧光检测信号的无机基团或有机基团。
CN201610121989.0A 2016-03-03 2016-03-03 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针 Expired - Fee Related CN105675570B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610121989.0A CN105675570B (zh) 2016-03-03 2016-03-03 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610121989.0A CN105675570B (zh) 2016-03-03 2016-03-03 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105675570A true CN105675570A (zh) 2016-06-15
CN105675570B CN105675570B (zh) 2018-11-13

Family

ID=56306647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610121989.0A Expired - Fee Related CN105675570B (zh) 2016-03-03 2016-03-03 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105675570B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106187981A (zh) * 2016-07-11 2016-12-07 中国科学院生态环境研究中心 一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用
CN106701061A (zh) * 2016-11-15 2017-05-24 山东大学 一种gpr120小分子荧光探针及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341346A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用
CN104946249A (zh) * 2015-07-10 2015-09-30 太原理工大学 一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341346A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于白蛋白假酯酶水解反应的特异性荧光探针及应用
CN104946249A (zh) * 2015-07-10 2015-09-30 太原理工大学 一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOBUYUKI NEGORO 等: "《Discovery of TAK-875: A Potent, Selective, and Orally Bioavailable GPR40 Agonist》", 《ACS MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 *
杨录等: "《靶向雌激素受体荧光探针及其生物应用》", 《中国科学:化学》 *
陈磊等: "《特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术》", 《生命科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106187981A (zh) * 2016-07-11 2016-12-07 中国科学院生态环境研究中心 一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用
CN106187981B (zh) * 2016-07-11 2018-04-03 中国科学院生态环境研究中心 一种荧光标记的全氟烷基酸探针及其应用
CN106701061A (zh) * 2016-11-15 2017-05-24 山东大学 一种gpr120小分子荧光探针及其应用
CN106701061B (zh) * 2016-11-15 2019-01-29 山东大学 一种gpr120小分子荧光探针及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105675570B (zh) 2018-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Keppler et al. Labeling of fusion proteins of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro
CN107383037B (zh) 一种长波长型h2s荧光探针及其合成方法和应用
CN109735328A (zh) 一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用
CN103940867B (zh) 一种用于检测17β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法
JP6281727B2 (ja) アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび定量方法
CN112250678B (zh) 一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用
CN110231490A (zh) 一种探针及其应用
CN102207495A (zh) 一种高效液相色谱法对土壤中草甘膦含量的测定方法
CN112779001A (zh) 一种近红外粘度荧光探针的制备及其应用
CN105131035B (zh) 氨基官能团化合物及糖链标记带正电荷质谱衍生化试剂
CN105675570A (zh) 一种检测待测样品与gpr40结合能力的方法及其专用特异荧光探针
CN106841128B (zh) 一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用
CN100501370C (zh) 一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法
CN112876499A (zh) 用于检测羧酸酯酶1的新型bodipy荧光探针及其制备方法与应用
CN102757391B (zh) 一种苯巴比妥衍生物及其制备方法和应用
CN114105823A (zh) 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN107382900B (zh) 一种pH荧光探针的制备方法及其应用
CN104262373A (zh) 一种靶向检测并抑制癌细胞的荧光探针、制备方法及应用
CN101776691A (zh) 一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法
CN106674048B (zh) 一种cn-检测试剂及其合成方法和应用
CN115322203B (zh) 一种活细胞内质网自噬成像分析化合物及其制备方法
CN103105384A (zh) 一种时间分辨荧光法综合检测乳腺癌试剂盒及其应用
CN106405067B (zh) 一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法
CN102702074B (zh) 一种以咔唑为荧光团的磺酰氯类化合物的制备方法
CN109160916A (zh) 一种快速识别苯硫酚的荧光探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20181113

Termination date: 20210303