CN103728283A - 一种纳米级生物复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术，具体涉及一种纳米级生物复合物及其应用。纳米级生物复合物为0.02微克/毫升—10微克/毫升纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液和0.001毫克/毫升—10毫克/毫升重组别藻蓝蛋白溶液共混于PBS溶液。所述纳米级生物复合物作为生物传感器。本发明复合物具有高特异性，纳米级，高敏感性同时应用广泛。

Description

一种纳米级生物复合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及一种纳米级生物复合物及其应用。

背景技术

葡萄糖，作为主要碳源和能源，在我们日常生活相关的各个方面起到了重要的作用。缺乏葡萄糖会抑制细胞的生长和分裂，或限制食品工业生物过程中产品的产量。但是，过多的葡萄糖也可以通过糖酵解途径诱发乳酸的形成。因此，监测和控制血糖水平，不仅对健康的细胞的生长十分必要，也可作为糖尿病的临床指标，同时对于监控工业中生物过程的最大产量有着十分显着的作用。一直以来寻找“理想”的葡萄糖传感器，是许多研究者的一个长期目标，现今已经开发了大量的葡萄糖传感器。然而，这些葡萄糖传感系统有一些内在的不足，如：传感器的制作再现性低，生物相容性较低，贮存稳定性较弱以及传感器信号的不可逆。因此，可靠的葡萄糖传感器特别是能被植入体内，长时间监测葡萄糖的生理水平的传感器仍然是非常必要的。

带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白结合一个色基，由来自于Synechocystis sp.PCC6803基因组α亚基基因通过在N末端依次添加组氨酸标签和麦芽糖结合蛋白标签，并在大肠杆菌宿主中表达。融合的His6-标签提供了一种简便的方法，易于大规模的从细胞裂解物中纯化重组的别藻蓝蛋白。同时也顺利完成了大规模发酵生产重组别藻蓝蛋白。

最近，石墨烯作为一种新型的荧光淬灭基团以及碳纳米管的替代品，获得了越来越多的研究。壳聚糖修饰的石墨烯片材的表面上含有大量的羧基，羟基，和环氧基团，使材料具有更好的水溶性，也使其更易于与其它分子形成共价键。带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签并结合一个色基的重组别藻蓝蛋白α亚基可以与壳聚糖修饰的石墨烯通过麦芽糖结合蛋白标签相结合。这种结合在体外可以引起重组别藻蓝蛋白α亚基的荧光淬灭。然而在葡萄糖存在的条件下，通过竞争性结合，在葡萄糖与麦芽糖结合蛋白标签更强的结合亲和力作用下，对壳聚糖修饰的石墨烯进行替换使荧光信号得以恢复。

发明内容

本发明目的在于提供一种纳米级生物复合物及其应用。

为实现上述目的本发明采用技术方案为：

一种纳米级生物复合物，纳米级生物复合物为0.02微克/毫升—10微克/毫升的纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液和0.001毫克/毫升—10毫克/毫升的带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白溶液共混于PBS溶液。

所述纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液为

将片状石墨加入到纯硫酸、过硫酸钾和五氧化二磷混合液于60-100℃温育3-10小时得预氧化石墨；

于0-4℃下将上述预氧化石墨加入纯硫酸中，并在10-25℃恒温下边搅拌边逐渐加入高锰酸钾，加入后在15-45℃搅拌1-5小时，而后加入蒸馏水用以终止反应，反应终止后加入过氧化氢，待反应液变为亮黄色进行离心，而后经HCl溶液洗涤沉淀，离心所得沉淀经蒸馏水洗涤并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变为中性；

将上述洗涤至中性混浊液经超声处理并离心，上清液再经超声处理即得纳米级（20-20000纳米粒径）氧化石墨的片层，所得片层经Tris-HCl缓冲液溶解并加入1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）于室温下搅拌混匀加入低分子量（分子量为9×10³-7×10⁵）壳聚糖，即得到纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液。

所述重组别藻蓝蛋白溶液为带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白α亚基溶液。

纳米级生物复合物的应用，所述纳米级生物复合物作为生物传感器。所述纳米级生物复合物作为检测单糖的生物传感器。所述纳米级生物复合物作为检测葡萄糖的生物传感器。所述生物传感器可用于血液中生化指标或食品药品中的葡萄糖含量的检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.采用本发明纳米级生物复合物作为传感器进行血糖浓度监测。其制作再现性高，生物相容性较高，贮存稳定性较强并且传感器信号具有可逆性。本发明纳米级生物复合物是可靠的葡萄糖传感器，特别是能被植入体内长期监测葡萄糖的生理水平。

2.本发明纳米级生物复合物中带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白α亚基结合一个色基，具有生物相容性，无毒，长期稳定和640nm近红外荧光发射等特性。纳米级生物复合物含有组织吸收极低的发色团，进而将发射光通过两厘米厚的组织传播，更加便于检测其荧光信号，配合高度敏感的检测技术，可以提供更深入的实时组织的监测。

3.本发明纳米级生物复合物是将氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物与重组别藻蓝蛋白α亚基的结合，在体外可以引起重组别藻蓝蛋白α亚基的荧光淬灭。然而在葡萄糖存在的条件下，通过竞争性结合，在葡萄糖与麦芽糖结合蛋白标签更强的结合亲和力作用下，对壳聚糖修饰的石墨烯进行替换使荧光信号得以恢复。

4.本发明纳米级生物复合物中得重组别藻蓝蛋白三聚体利用大肠杆菌生产重组荧光探针蛋白，规模化发酵生产，易于培养，生长快，可以大大缩短生产周期，易于纯化，生产过程可以节约能源并且生产效率高。得到的重组蛋白含有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签标记，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。同时麦芽糖结合蛋白标签标记便于与葡萄糖底物的特异性结合。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纳米级生物复合物作为葡萄糖检测的新型纳米级生物传感器工作原理示意图；

图2为本发明实施例提供的氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物示意图；

图3为本发明实施例提供的重组别藻蓝蛋白表达载体pHPC和pHMPC的示意图；

图4为本发明实施例提供的氧化石墨烯（GO）纳米材料，低分子量壳聚糖（CS）以及它们共价结合形成的氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的紫外吸收光谱图；

图5为本发明实施例提供的添加了氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物后的重组别藻蓝蛋白荧光光谱以及不同添加量影响效果图；

图6为本发明实施例提供的添加了葡萄糖后的重组别藻蓝蛋白荧光光谱以及不同添加量影响效果图。

具体实施方式

下面通过实施实例具体说明本发明：

纳米级生物复合物具体为，氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物，氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物与带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白共混于PBS溶液。

将上述纳米级生物复合物于葡萄糖存在下，葡萄糖同带有麦芽糖结合蛋白标签标记的重组别藻蓝蛋白竞争性结合；通过竞争性结合，使淬灭的荧光信号得以恢复，使在低浓度水平下检测不同浓度的葡萄糖。

实施实例1：

纳米级生物复合物的合成：

1）氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成：

将2g片状石墨与1.5毫升纯硫酸、0.8克过硫酸钾和0.5克五氧化二磷混合，混合后于80℃温育6小时，即得预氧化石墨。

将预氧化石墨粉末用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜。取1g预氧化的石墨粉末放置在0℃的29毫升的纯硫酸中。而后保持温度20℃以下，边搅拌边逐渐加入3克高锰酸钾，然后将混合物在35℃以下搅拌2小时，搅拌后加入46毫升蒸馏水，并继续搅拌15min。最后加入140毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入2毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。

将上述变为亮黄色的混合物离心，并用250毫升10％HC l溶液洗涤沉淀，以除去残留的金属离子，然后用蒸馏水洗涤沉淀，并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次离心直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变为中性。

将上述产物，即洗涤至中性的混浊液用400W的超声波探头处理30分钟，随后13000转离心30分钟，上清液中即为剥离的氧化石墨的片层。不断重复超声波处理，离心，收集上清液，加入新的蒸馏水，再超声波处理，离心，收集上清液，过程，直至沉淀消失。最终得到700毫升的上清液，随后用超声波以500W功率处理100分钟使获得的纳米级氧化石墨的片层能稳定地分散在水中，并且数月不会沉淀。

最后将3毫克1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）加入到12毫升含3毫克上述所得纳米级氧化石墨的pH值为7.4的0.01M浓度Tris-HCl缓冲液中，并将该混合物在室温下搅拌1小时，然后将1mg的低分子量（9×10³）壳聚糖的加入到上述溶液中，反应过夜。最后，利用半透膜透析去除多余的小分子EDC和低分子量壳聚糖获得最终的结合物并利用紫外分光光谱仪进行检测（参见图2，图3）。

2）带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白（参见图4）以Liu,S.,H.Chen,et al.(2009).″Highly soluble and stablerecombinant holo-phycocyanin alpha subunit expressed in Escherichiacoli.″Biochemical Engineering Journal48(1):58-64.文献中记载，首先从美国国立生物信息中心（National Center for BiotechnologyInforma tion,NCBI）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用文献报道的引物利用PCR获取Synechocystissp.PCC6803的pcyA、hox1、cpcE和cpcF基因的全长序列，其次将全长别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因pcyA、藻胆素生物合成酶基因hox1、色基裂合酶基因cpcE和cpcF克隆到壮观霉素抗性的表达载体pCDFDeut-1中构建成表达载体pHPC；再然后利用PCR从pMAL-p2X载体获取麦芽糖结合蛋白标签（MBP）序列，并将此序列连接到pHPC质粒的多克隆位点处的BamHI酶切位点处构建成表达载体pHMPC。将表达载体pHMPC，转化大肠杆菌，利用壮观霉素抗性筛选出表达上述基因的工程菌，即为带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白。

将上述构建所得工程菌在5L发酵罐中表达融合藻蓝蛋白的程序如下:取保存的菌种100μl无菌接种于5ml液体LB培养基，37℃震荡培养12小时，然后转接于含200ml液体LB培养基的三角瓶，37℃震荡培养4小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行，体积比为2%的接种量，诱导前培养温度设为37℃，转速随发酵时间由300-500rpm递增，pH均自动控制；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，原培养基中的碳源接近耗尽时，以0.08g/L·min^-1的速率进行葡萄糖补料。发酵开始约7h时，先将罐内温度缓慢降至28℃，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养10h以上。

别藻蓝蛋白的分离纯化：将上述发酵液离心（5000rpm，10min）得到已表达目的蛋白的菌体，按照每升结合缓冲液（20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH7.4）加入湿菌体80g的比例将菌体重悬，超声破碎细菌20分钟，12000rpm，4℃条件下离心，收集上清液，上样于Ni²⁺亲和色谱柱，用5倍柱体积的缓冲液（20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，50mmol/L咪唑，pH7.4）冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0.5mol/L氯化钠，400mmol/L咪唑，pH7.0)洗脱，洗脱液经millipore蛋白浓缩柱脱盐浓缩后即得到脱盐蛋白。通过Superdex200凝胶色谱柱，用50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）洗脱，洗脱速度为10ml/h，收集检出最大峰值时的流出液，为目的蛋白，即纯化后即纯化后带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白α亚基荧光蛋白，其蛋白单体质量为40kDa大小。

3）将上述0.27毫克/毫升氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液加入到3微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，用pH值7.4的0.01M PBS溶液稀释20倍，即得到纳米级生物复合物。

将所得纳米级生物复合物中加入不同浓度的葡萄糖，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。以实现对样品中葡萄糖含量的检测（参见图5，图6）。

实施实例2

氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成

1）将3g片状石墨将与2.0毫升纯硫酸，0.8克过硫酸钾，和0.8克五氧化二磷，然后80度温育7小时预氧化石墨。然后将产物用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜2g预氧化的石墨粉末放置在0度的30毫升的纯硫酸中。保持温度20度以下，边搅拌边逐渐加入5克高锰酸钾，然后将混合物在35度以下搅拌3小时，随后加入60毫升蒸馏水，并继续搅拌25min。随后加入200毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入5毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。将混合物离心，并用300毫升10％HCl溶液洗涤，以除去残留的金属离子。然后用蒸馏水洗涤沉淀，并多次离心直至溶液变成中性。将上步反应的混浊液用400W的超声波探头处理40分钟，以使氧化石墨的片层剥离；随后13000转离心30分钟，上清液中即为剥离的片层。不断重复超声波处理，离心，收集上清液，加入新的蒸馏水，再超声波处理，离心，收集上清液，过程，直至沉淀消失。，最终得到1000毫升的上清液，随后用超声波以500W功率处理100分钟使获得的纳米级氧化石墨的片层能稳定地分散在水中，并且数月不会沉淀。

2）将5毫克1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）加入到20毫升含5毫克纳米级氧化石墨的pH值为7.4的0.01M浓度Tris-HCl缓冲液中，并将该混合物在室温下搅拌1.5小时，然后将1mg的低分子量壳聚糖（8×10⁴）的加入到上述溶液中，反应过夜。最后，利用半透膜透析去除多余的小分子EDC和低分子量壳聚糖获得最终的结合物并利用紫外分光光谱仪进行检测。

新型的氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物；在葡萄糖存在的条件下，通过竞争性结合，使淬灭的荧光信号得以恢复，以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例3：

与实施例1不同之处在于：

将8g片状石墨与8毫升纯硫酸8克过硫酸钾和5克五氧化二磷混合，混合后于80℃温育10小时，即得预氧化石墨。将预氧化石墨粉末用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜。取1g预氧化的石墨粉末放置在0℃的90毫升的纯硫酸中。而后保持温度20℃以下，边搅拌边逐渐加入30克高锰酸钾，然后将混合物在35℃以下搅拌5小时，搅拌后加入460毫升蒸馏水，并继续搅拌15min。最后加入400毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入20毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。将上述变为亮黄色的混合物离心，并用50毫升10％HCl溶液洗涤沉淀，以除去残留的金属离子，然后用蒸馏水洗涤沉淀，并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次离心直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变成中性，获得最终的结合物。

将所得纳米级生物复合物加入到3微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，添加不同浓度的葡萄糖，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例4：

与实施例1不同之处在于：

预氧化石墨粉末用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜。取7g预氧化的石墨粉末放置在0℃的69毫升的纯硫酸中。而后保持温度20℃以下，边搅拌边逐渐加入3克高锰酸钾，然后将混合物在35℃以下搅拌6小时，搅拌后加入96毫升蒸馏水，并继续搅拌45min。最后加入140毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入12毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。将上述变为亮黄色的混合物离心，并用50毫升10％HCl溶液洗涤沉淀，以除去残留的金属离子，然后用蒸馏水洗涤沉淀，并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次离心直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变成中性。将上述混浊液用400W的超声波探头处理60分钟，随后13000转离心30分钟，上清液中即为剥离的氧化石墨的片层。不断重复超声波处理，离心，收集上清液，加入新的蒸馏水，再超声波处理，离心，收集上清液，过程，直至沉淀消失。最终得到1700毫升的上清液，随后用超声波以500W功率处理100分钟使获得的纳米级氧化石墨的片层能稳定地分散在水中，并且数月不会沉淀。

将所得纳米级生物复合物加入到3微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，添加不同浓度的葡萄糖，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例5：

与实施例1不同之处在于：

预氧化石墨粉末用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜。取50g预氧化的石墨粉末放置在0℃的69毫升的纯硫酸中。而后保持温度20℃以下，边搅拌边逐渐加入3克高锰酸钾，然后将混合物在35℃以下搅拌11小时，搅拌后加入96毫升蒸馏水，并继续搅拌45min。最后加入500毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入12毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。将上述变为亮黄色的混合物离心，并用500毫升10％HCl溶液洗涤沉淀，以除去残留的金属离子，然后用蒸馏水洗涤沉淀，并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次离心直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变成中性。将上述混浊液用400W的超声波探头处理90分钟，随后13000转离心50分钟，上清液中即为剥离的氧化石墨的片层。不断重复超声波处理，离心，收集上清液，加入新的蒸馏水，再超声波处理，离心，收集上清液，过程，直至沉淀消失。最终得到900毫升的上清液，随后用超声波以500W功率处理120分钟使获得的纳米级氧化石墨的片层能稳定地分散在水中，并且数月不会沉淀。

将所得纳米级生物复合物加入到13微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，添加不同浓度的小鼠血液，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例6

与实施例2不同之处在于：

氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成

1）将7g片状石墨将与12毫升纯硫酸，9克过硫酸钾，和5克五氧化二磷，然后80度温育2小时预氧化石墨。然后将产物用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜5g预氧化的石墨粉末放置在0度的30毫升的纯硫酸中。保持温度20度以下，边搅拌边逐渐加入9克高锰酸钾，然后将混合物在35度以下搅拌3小时，随后加入60毫升蒸馏水，并继续搅拌25min。随后加入800毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入45毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。

2）将25毫克1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）加入到200毫升含15毫克纳米级氧化石墨的pH值为8.4的0.01M浓度Tris-HCl缓冲液中，并将该混合物在室温下搅拌0.5小时，然后将3mg的低分子量壳聚糖（8×10⁵）的加入到上述溶液中，反应过夜。最后，利用半透膜透析去除多余的小分子EDC和低分子量壳聚糖获得最终的结合物并利用紫外分光光谱仪进行检测。

新型的氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物加入到13微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，添加不同浓度的小鼠血液，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。通过竞争性结合，使淬灭的荧光信号得以恢复，以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例7

与实施例2不同之处在于：

氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成

1）将17g片状石墨将与20毫升纯硫酸，91克过硫酸钾，和53克五氧化二磷，然后80度温育4小时预氧化石墨。然后将产物用蒸馏水洗涤至中性，过滤后在空气中干燥并于室温下过夜27g预氧化的石墨粉末放置在0度的300毫升的纯硫酸中。保持温度20度以下，边搅拌边逐渐加入9克高锰酸钾，然后将混合物在50度以下搅拌13小时，随后加入600毫升蒸馏水，并继续搅拌250min。随后加入1800毫升蒸馏水用以终止反应，接着加入145毫升30％的过氧化氢使该混合物的颜色变为亮黄色。

2）将215毫克1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）加入到200毫升含105毫克纳米级氧化石墨的pH值为8.4的0.01M浓度Tris-HCl缓冲液中，并将该混合物在室温下搅拌8.5小时，然后将5mg的低分子量壳聚糖（3×10⁵）的加入到上述溶液中，反应过夜。新型的氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物加入到130微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，添加不同浓度的小鼠血液，温育35分钟后测量荧光发射光谱值。通过竞争性结合，使淬灭的荧光信号得以恢复，以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例8

与实施例2不同之处在于：

氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物的合成，将65毫克1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）加入到200毫升含50毫克纳米级氧化石墨的pH值为6.4的0.01M浓度Tris-HCl缓冲液中，并将该混合物在室温下搅拌5.5小时，然后将10mg的低分子量壳聚糖（5×10⁴）的加入到上述溶液中，反应过夜。最后，利用半透膜透析去除多余的小分子EDC和低分子量壳聚糖获得最终的结合物并利用紫外分光光谱仪进行检测。

新型的氧化石墨烯（GO）纳米材料和低分子量壳聚糖（CS）的共价结合形成氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物；在葡萄糖存在的条件下，通过竞争性结合，使淬灭的荧光信号得以恢复，以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

实施例9

与实施例1不同之处在于：

带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白

利用表达带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白的工程菌在5L发酵罐中表达融合藻蓝蛋白的程序如下:取保存的菌种400μl无菌接种于5ml液体LB培养基，37℃震荡培养29小时，然后转接于含2000ml液体LB培养基的三角瓶，37℃震荡培养14小时。

别藻蓝蛋白的分离纯化：将上述发酵液离心（7000rpm，10min）得到已表达目的蛋白的菌体，按照每升结合缓冲液（200mmol/L磷酸钠，0.35mol/L氯化钠，200mmol/L咪唑，pH7.4）加入湿菌体80g的比例将菌体重悬，超声破碎细菌200分钟，12000rpm，4℃条件下离心，收集上清液，上样于Ni²⁺亲和色谱柱，用5倍柱体积的缓冲液（200mmol/L磷酸钠，4.5mol/L氯化钠，500mmol/L咪唑，pH8.4）冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液(200mmol/L磷酸钠，6.5mol/L氯化钠，1400mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱，洗脱液经millipore蛋白浓缩柱脱盐浓缩后即得到脱盐蛋白。通过Superdex200凝胶色谱柱，用50mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）洗脱，洗脱速度为10ml/h，收集检出峰值时的流出液，为目的蛋白，即纯化后即纯化后带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白α亚基荧光蛋白。

将上述0.27毫克/毫升氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液加入到3微克/毫升的重组别藻蓝蛋白溶液中，用pH值7.4的0.01M PBS溶液稀释20倍，即得到纳米级生物复合物。

将所得纳米级生物复合物中加入不同浓度的葡萄糖，温育15分钟后测量荧光发射光谱值。以实现对样品中葡萄糖含量的检测。

上述所得纳米级生物复合物进而可以用于其它单糖的检测，作为不同单糖的生物传感器。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种纳米级生物复合物，其特征在于：纳米级生物复合物为0.02微克/毫升—10微克/毫升的纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液和0.001毫克/毫升—10毫克/毫升的带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白溶液共混于PBS溶液。

2.按权利要求1所述的纳米级生物复合物，其特征在于：

所述纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液为

将片状石墨加入到纯硫酸、过硫酸钾和五氧化二磷混合液于60-100℃温育3-10小时得预氧化石墨；

于0-4℃下将上述预氧化石墨加入纯硫酸中，并在10-25℃恒温下边搅拌边逐渐加入高锰酸钾，加入后在15-45℃搅拌1-5小时，而后加入蒸馏水用以终止反应，反应终止后加入过氧化氢，待反应液变为亮黄色进行离心，而后经HCl溶液洗涤沉淀，离心所得沉淀经蒸馏水洗涤并离心，沉淀再用蒸馏洗涤，重复多次直至洗涤沉淀的蒸馏水的pH值变成中性；

将上述洗涤至中性混浊液经超声处理并离心，上清液再经超声处理即得纳米级氧化石墨的片层，所得片层经Tris-HCl缓冲液溶解并加入1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）于室温下搅拌混匀加入低分子量壳聚糖，即得到纳米级氧化石墨烯-低分子量壳聚糖复合物溶液。

3.按权利要求1所述的纳米级生物复合物，其特征在于：所述重组别藻蓝蛋白溶液为带有麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签的重组别藻蓝蛋白α亚基溶液。

4.一种权利要求1所述的纳米级生物复合物的应用，其特征在于：所述纳米级生物复合物作为生物传感器。

5.按权利要求4所述的纳米级生物复合物的应用，其特征在于：所述纳米级生物复合物作为检测单糖的生物传感器。

6.按权利要求5所述的纳米级生物复合物的应用，其特征在于：所述纳米级生物复合物作为检测葡萄糖的生物传感器。

7.按权利要求6所述的纳米级生物复合物的应用，其特征在于：所述生物传感器可作为用以血液中生化指标或食品药品中的葡萄糖含量的检测。

Images