CN103650916A

CN103650916A - 一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法

Info

Publication number: CN103650916A
Application number: CN201310676580.1A
Authority: CN
Inventors: 赵宗杰; 李光飞; 谢海涛; 周荣灵
Original assignee: SHENZHEN RENTAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN RENTAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103650916B

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法。该方法基于液体深层发酵技术，通过特有的发酵培养基和发酵温度控制，使牛樟芝于前期发酵过程中累积菌丝体，于后期不利生长环境胁迫下快速的转变为大量的无性孢子。该温度诱导胁迫方法大大缩短了孢子培养的周期，从而克服了目前液体发酵制备牛樟芝无性孢子周期长的问题。

Description

一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及基于液体深层发酵和温度诱导胁迫快速制备牛樟芝无性孢子的方法。

背景技术

牛樟芝是台湾地区名贵的药用真菌，牛樟芝外型呈板状或钟状，表面呈鲑红色，用于养生保健，效果远优于灵芝，只生长在高海拔的常绿阔叶大乔木的牛樟树上。牛樟芝富含类三萜化合物、超氧化物歧化脢、腺苷、多糖体、β-D-葡聚糖、维生素、免疫球蛋白等，常用于抗癌、抗痒、抗过敏及抗疲劳。在传统疗法，牛樟芝被誉为是一种“抗癌圣药”。

目前牛樟芝人工培植的主要方法有液体发酵法、固体培养法和椴木栽培法。牛樟芝在椴木等固体培养时可以产生有性生殖的担孢子，但牛樟芝产担孢子所需时间较长，且不宜收集。牛樟芝菌丝体在液体培养过程中可以产生无性的节孢子或厚垣孢子，牛樟芝孢子可以提取牛樟芝孢子油或用以菌种长期保藏，快速获得大量牛樟芝孢子，具备较大的实用价值，而液体发酵快速产无性孢子是大量获得牛樟芝孢子的最佳方式。现有液体发酵产牛樟芝方法多为恒温培养，培养周期较长，通常需要长达300个小时以上。如名称为“一种基于无性孢子的牛樟芝快速液态发酵工艺”的发明专利公开了一种液体发酵获得牛樟芝无性孢子的工艺，该技术牛樟芝无性孢子的培养时间需要长达380个小时，培养周期长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法，以解决现有技术中牛樟芝孢子培养周期长的问题。本发明采用特定的产孢子培养基配方，通过控制不同阶段的牛樟芝培养温度，使牛樟芝菌丝体于不利生长环境胁迫下快速的转变为大量的无性孢子。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法，包括以下步骤：步骤一，取牛樟芝菌丝体或孢子接种到琼脂平板培养基I培养；步骤二，将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，接入液体培养基II，分阶段变温培养，得牛樟芝无性孢子。

作为本发明的进一步改进，所述分阶段变温培养为：第一阶段，在25-28℃下培养60-72小时；第二阶段，将第一阶段所得培养物在12-17℃下继续培养6-8小时；第三阶段，将第二阶段所得培养物置于24-35℃下，静置6-8小时。

作为本发明的进一步改进，所述步骤二中液体培养基II中各组分的重量百分比为：1-2%玉米淀粉、2-4%麸皮、0.1-1%麦芽浸膏、0.1-1%蛋白胨、0.05-0.2%葡萄糖，余量为水。

作为本发明的进一步改进，所述步骤一中琼脂平板培养基I中各物质的重量百分比为：2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

作为本发明的进一步改进，所述步骤一中所述琼脂平板培养基I放置于25-28℃培养60-72h。

本发明的有益结果在于：（1）采取温度胁迫诱生孢子的技术，显著缩短培养周期，能够在较短的时间内获取大量牛樟芝无性孢子；（2）采用的特殊产孢子培养基既保证了菌丝体在温度诱生孢子前大量繁殖，又能够启动牛樟芝利用复杂碳源的酶系，传递培养基中简单碳源耗尽的信号，为无性孢子生产提供了基础条件。

附图说明

图1是实施例1发酵液牛樟芝无性孢子400倍光学显微镜观察图；

图2是实施例1发酵液牛樟芝无性孢子5000倍扫描电镜观察图。

具体实施方式

本发明采用特定的产孢子发酵培养基配方，通过控制不同阶段的培养温度，人为创造不利环境，使牛樟芝累积的菌丝体于不利生长环境胁迫下快速的转变为大量的无性孢子。

本发明的具体实施方法为：

S1：挑取牛樟芝菌丝体或孢子（保藏号为ATCC200183）接种到琼脂平板培养基中心位置，放置于28℃培养60h。

琼脂平板培养基成分为2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

S2：将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml产孢子培养基的1000ml锥形瓶中，并于培养瓶中放置直径约3-5mm的玻璃小球10-20个。

产孢子培养基成分为1-2%玉米淀粉、2-4%麸皮、0.1-1%麦芽浸膏、0.1-1%蛋白胨、0.05-0.2%葡萄糖，余量为水。

S3：将所述接种有牛樟芝菌丝体的锥形瓶放置于恒温震荡摇床上，分阶段培养：第一阶段：25-28℃，200rpm培养60-72小时；

第二阶段：将震荡摇床温度调节到12-17℃，继续培养6-8个小时；

第三阶段：将培养物置于24-35℃下，静置培养6-8小时。

S4：取培养物显微镜检查无性孢子生成状态。

下面结合具体参数作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不局限于此。本发明所使用牛樟芝菌种、仪器、试剂等，均可从商业途经获得。

实施例1

S1：挑取牛樟芝菌丝体或孢子接种到琼脂平板培养基中心位置，放置于28℃培养60h。琼脂平板培养基成分为2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

S2：将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml产孢子培养基的1000ml锥形瓶中，并于培养瓶中放置直径约3-5mm的玻璃小球10个。产孢子培养基成分为1%玉米淀粉、2.2%麸皮、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量为水。

S3：将所述接种有牛樟芝菌丝体的锥形瓶放置于恒温震荡摇床上，分阶段培养：第一阶段：28℃，200rpm培养72小时；

第二阶段：将震荡摇床温度调节到12℃，继续培养6个小时；

第三阶段：将培养物置于35℃下，静置培养6小时。

S4：取培养物显微镜检查无性孢子生成状态。

实施例2

S1：挑取牛樟芝菌丝体或孢子（保藏号为CCTCC M2013359）接种到琼脂平板培养基中心位置，放置于25℃培养72h。琼脂平板培养基成分为2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

S2：将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有100ml产孢子培养基的500ml锥形瓶中，并于培养瓶中放置直径约3-5mm的玻璃小球15个。产孢子培养基成分为1%玉米淀粉、2.2%麸皮、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量为水。

S3：将所述接种有牛樟芝菌丝体的锥形瓶放置于恒温震荡摇床上，分阶段培养：第一阶段：25℃，180rpm培养60小时；

第二阶段：将震荡摇床温度调节到17℃，继续培养8个小时；

第三阶段：将培养物置于24℃下，静置培养8小时。

S4：取培养物显微镜检查无性孢子生成状态。

实施例3

S1：挑取牛樟芝菌丝体或孢子（保藏号为BCRC37849）接种到琼脂平板培养基中心位置，放置于26℃培养70h。琼脂平板培养基成分为2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

S2：将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml产孢子培养基的1000ml锥形瓶中，并于培养瓶中放置直径约3-5mm的玻璃小球20个。产孢子培养基成分为1%玉米淀粉、2.2%麸皮、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量为水。

S3：将所述接种有牛樟芝菌丝体的锥形瓶放置于恒温震荡摇床上，分阶段培养：第一阶段：26℃，190rpm培养68小时；

第二阶段：将震荡摇床温度调节到15℃，继续培养7个小时；

第三阶段：将培养物置于32℃下，静置培养7小时。

S4：取培养物显微镜检查无性孢子生成状态。

对比例1

S1：挑取牛樟芝菌丝体或孢子（保藏号为CCTCC M2013359）接种到琼脂平板培养基中心位置，放置于28℃培养60h。琼脂平板培养基成分为2%玉米淀粉、2%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

S2：将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml产孢子培养基的1000ml锥形瓶中，并于培养瓶中放置直径约3-5mm的玻璃小球7-20个。产孢子培养基成分为1%玉米淀粉、2.2%麸皮、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量为水。

S3：将所述接种有牛樟芝菌丝体的锥形瓶放置于恒温震荡摇床上，26℃，190rpm培养180小时。取培养物于显微镜下检测菌丝体生长状态及有无无性孢子生成。

S4：将培养物置于32℃下，静置20小时。取培养物显微镜检查无性孢子生成状态。

取实施例1、2、3和对比例1培养液统计孢子数目，如下表1所示，实施例1、2、3中所示变温培养较对比例1恒温培养产孢子所需时间周期短，且本发明快速制备牛樟芝孢子的发酵方法适用于不同来源的菌种。

表1牛樟芝不同培养条件下无性孢子产生情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速制备牛樟芝无性孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，取牛樟芝的菌丝体或孢子接种到琼脂平板培养基I培养；

步骤二，将所述琼脂平板上长有菌丝体的部分切下，接入液体培养基II，分阶段变温培养，得牛樟芝无性孢子。

2.根据权利要求1所述制备牛樟芝无性孢子的方法，其特征在于，步骤二中所述分阶段变温培养为：

第一阶段，在25-28℃下培养60-72小时；

第二阶段，将第一阶段所得培养物在12-17℃下继续培养6-8小时；

第三阶段，将第二阶段所得培养物置于24-35℃下，静置6-8小时。

3.根据权利要求1或2所述制备牛樟芝无性孢子的方法，其特征在于，步骤二中液体培养基II中各组分的重量百分比为：1-2%玉米淀粉、2-4%麸皮、0.1-1%麦芽浸膏、0.1-1%蛋白胨、0.05-0.2%葡萄糖，余量为水。

4.根据权利要求3所述制备牛樟芝无性孢子的方法，其特征在于，步骤一中琼脂平板培养基I中各物质的重量百分比为：2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

5.根据权利要求1或2所述制备牛樟芝无性孢子的方法，其特征在于，步骤一中琼脂平板培养基I中各组分的重量百分比为：2%玉米淀粉、1%麦芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟树精油和1.5%琼脂粉，余量为水。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述琼脂平板培养基I放置于25-28℃培养60-72h。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一中所述琼脂平板培养基I放置于25-28℃培养60-72h。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤一中所述琼脂平板培养基I放置于25-28℃培养60-72h。