CN103642034A - 温度敏感型树枝化多肽聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种温度敏感型树枝化多肽聚合物及其制备方法。该聚合物以L-脯氨酸和4位叠氮化的L-脯氨酸组成的聚脯氨酸聚合物为主链，其侧链接枝有烷氧基醚类树枝化基元而构成的树枝化多肽聚合物，其中侧链与主链的摩尔比为：1：3。本发明首次利用活性酯的方法,并采用大单体的策略合成结构完美的高分子量的树枝化多肽聚合物，同时赋予该聚合物优异的温敏行为，并且通过改变树枝化基元的大小和对聚合物水溶液温度的调控，实现了对此类多肽聚合物主链构像转变行为的有效控制。

Description

温度敏感型树枝化多肽聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种树枝化多肽聚合物及其制备方法。特别是一种温度敏感型树枝化多肽聚合物及其制备方法。 

背景技术

树枝化聚合物是一类新型的非线形聚合物，它是由线形聚合物为主链，在侧链高密度地堆积树枝化基元而形成的柱状、大尺度聚合物。其最大特点是表面基团密度高、单分子尺寸在纳米级别、刚性相对较高且分子呈现柱形结构，因而可以实现对其单分子进行观测和操作。因其结构的特殊性使得这类聚合物可以应用于催化和药物载体、DNA包缠、以及单分子容器等方面。树枝化聚合的合成可以分为表面接枝路线和大单体路线。表面接枝路线是先合成带有反应官能团的聚合物主链，然后通过表面接枝的方法将树枝化基元通过化学键联或者超分子作用链接到聚合物主链的反应官能团上，此方法的优点在于可以很合成高分子量的聚合物主链，缺点显而易见，即无法保证所有反应官能团和树枝化基元完全反应，合成的聚合物会存在结构缺陷，而且由于得到的聚合物本身就具有多分散性的特点而无法分离纯化，而残留的官能团对聚合物的结构和性能都会造成很大影响。大单体路线是先合成带有聚合单元的树枝化基元，即所谓的“大单体”，然后通过聚合手段得到相应的聚合物，这种方法的优点是可以得到结构完美的树枝化聚合物，缺点在于聚合物的分子量由于树枝化基元的位阻效应存在，要比表面接枝路线得到的分子量小。 

烷氧基醚类树枝化聚合物具有很好的生物相容性及温度敏感性能，张阿方等人通过简单而有效地合成路径制备了一系列烷氧醚类树枝化聚合物（Li, W.; Zhang, A.; Schlüter, A. D. Chem. Commun.  2008, 5523; Li, W.; Zhang, A.; Feldman, K.; Walde, P.; Schlüter, A. D. Macromolecules 2008, 41, 3659; Li, W.; Zhang, A.; Schlüter, A. D. Macromolecules 2008, 41, 43），该类聚合物以聚甲基丙烯酸甲酯为主链，侧基为烷氧基醚类树枝化基元，聚合物在水及有机溶剂中具有很好的溶解性，通过改变树枝化基元代数和基元外围基团的亲疏水性，其最低临界聚集温度范围（LCAT）从30 ^oC到70 ^oC可调。 

脯氨酸是自然界二十种天然氨基酸中结构非常特别的一种氨基酸，其侧链R基为五元环结构，相比于其它常规氨基酸，这种特殊的结构导致了含脯氨酸类多肽在二级构象方面的一些特殊性。首先，环状结构使脯氨酸构象受限，刚性增强。其次，五元环上δ碳与相邻的脯氨酸残基存在位阻作用，此外，由于形成酰胺键氮上缺少氢原子，因此聚脯氨酸无法形成分子内和分子间氢键。相比于常规氨基酸多肽可以形成的丰富的二级结构，如a-helix, β-sheet等，聚脯氨酸则只能形成Polyproline I (PPI)和Polyproline II (PPII)两种有序的构象。其中PPI 为右手螺旋构象，每个螺旋有3.3个脯氨酸残基构成，所有的肽键为顺式（Cis）构型，酰胺键上的羰基与主轴几乎平行，且被疏水的五元环包覆，主链二面角分别为（φ, ψ, ω ) = (-83°, +158°, 0°)。PPII则为左手螺旋构象，每个螺旋有3个残基，且所有的多肽键为反式（trans）构像，酰胺键上的羰基与主轴垂直，PPII较PPI结构更为伸展，主链二面角分别为（φ, ψ, ω )=(-78°, +149°, 180°)。PPI构象在脂肪醇等有机溶剂中较稳定，而PPII构象在水，三氟乙醇等有机酸中能够稳定存在。PPI和PPII构像可以通过圆二色谱（Circular Dichroism Spectroscopy, CD）进行表征，其中对于PPI构像，在200 nm 附近有强的负吸收峰，而213~215 nm有较强的正的吸收峰，230~235 nm处有较弱的负吸收峰。对于PPII构像，在206~208 nm处存在强的负吸收峰，而在226~228 nm处有弱的吸收峰PPI和PPII之间可以通过改变溶剂组成转化，其转化过程本质上是多肽酰胺键的Cis到Trans转化。关于PPII构象之所以在水中稳定存在的原因，目前普遍认为是由于其主链酰胺键和周围的水分子形成大量氢键所致，以至于在90 ^oC和一定离子条件（pH, 盐）下依然相对稳定。PPII构象在自然界特别是生物体中广泛存在，具有PPII构象的多肽和蛋白质参与生物体生命活动的方方面面，如信号传递和细胞运动等。通过将烷氧醚基元链接到聚脯氨酸主链，可以赋予聚脯氨酸非常优异的温度敏感性能，并期望通过树枝化基元的产生的位阻效应或聚集时产生的疏水效应对脯氨酸构象转变进行调控。 

目前聚多肽的合成方法通常可以分为四种：1）氨基酸酸酐开环聚合，优点：聚合过程基本可控，可以得到设计分子量的聚多肽，制备嵌段多肽或者共聚多肽，缺点：酸酐的合成繁琐，提纯困难，且该方法无法合成具有序列氨基酸多肽的聚合物；2）采用缩合剂，如叠氮磷酸二苯酯（DPPA），EDC·HCl，DCC等多肽类缩合剂，缩合剂直接加入氨基酸盐溶液中，通过将氨基与羧基缩合酰胺化反应，形成相应多肽聚合物，缺点：无法得到高分子量聚合物，产率很低，并且无法合成序列多肽聚合物；3）固相合成法， 优点：可以合成序列氨基酸多肽，缺点：无法合成高分子量多肽聚合物，需要昂贵的固相合成仪配合；4）活性酯方法，优点：可以合成具有序列氨基酸多肽高分子量聚合物，且此序列多肽可以更好的功能化，该合成方法简便，成本低廉，缺点：通常不能用来合成嵌段多肽聚合物。活性酯方法制备多肽聚合物原理主要包括首先合成带有端氨基保护的序列氨基酸多肽活性酯（通常为Boc保护基团），通过将氨基脱保护同时保留羧基端活性酯，然后加入过量N，N-二异丙基乙胺（DIEA）或者三乙胺（TEA）将多肽端氨基游离后，游离的氨基将羧基端活性酯胺解，因此在溶液中不断发生酰胺偶联反应，形成肽键，其聚合机理为缩聚聚合。目前采用的活性酯有五氟苯酚活性酯，五氯苯酚活性酯，N-琥珀酰亚胺活性酯，对硝基苯酚活性酯等，其中五氯苯酚活性酯和对硝基苯酚活性酯被认为适宜合成高分子量的聚多肽。（Bloom, S. M.; Dasgupta, S. K.; Patel, R. P.; Blout, E. R. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 2035； Shibnev, V. A., Chuvaeva, T. P., Poroshin, K. T. Russ. Chem. Bull. 1970, 19, 111）迄今为止，还没有将大尺寸基元，如具有智能响应的树枝化基元链接到序列多肽形成“大单体”进而聚合得到高分子量多肽聚合物的报道，而与此结构类似的聚合物通常采用表面接枝的方法，往往由于树枝化基元空间位阻的原因，无法制备结构完美的树枝化多肽聚合物，聚合物的结构缺陷往往制约了聚合物在理论或者应用方面的研究。 

发明内容

本发明的目的在于一种温度敏感型树枝化多肽聚合物。 

本发明的目的之二在于提供该聚合物的制备方法，该方法首次将有大尺寸树枝化基元通过一价铜催化的偶极环加成反应引入到多肽片段上，然后此将此多肽通过活性酯的方法在溶液中逐步聚合，进而制备出具有温度敏感型的烷氧醚类树枝化多肽聚合物，通过改变树枝化基元尺寸或者温度的调控以实现聚多肽主链的构象转化。 

为达到以上目的，本发明合成主要分成四部分： 

（1）        采用溶液合成方法制备得到端氨基Boc保护的氨基酸三肽的五氯苯酚活性酯片段单元 (Boc-PPA-OPCP)。具体反应式为：

（2）        合成带有炔基的烷氧基醚树枝化基元。具体反应式为：

（3）        制备用于聚合的多肽树枝化基元大单体 (HCl.PPA(R)-OPCP, R = EtG1, EtG2, MtG1, MtG2)。具体反应式为：

（4）        聚合物的合成。具体反应式为：

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种温度敏感型树枝化多肽聚合物，其特征在于该聚合物以脯氨酸和4位叠氮的脯氨酸形成的聚脯氨酸聚合物为主链，其侧链接枝有烷氧基醚类树枝化基元而构成的树枝化多肽聚合物，其中侧链与主链的摩尔比为：1：（3~6)。

上述的树枝化多肽聚合物的化学结构式为：，y=1~4，n= 30~100 ；R为： 

或            

其中X为Me或Et。

一种制备上述的温度敏感型树枝化多肽聚合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为： 

a. 制备用于聚合的多肽序列Boc-PPA-OPCP

a-1. 制备带有叠氮官能团的HCl.AZP-OMe：将Boc-AZP-OMe溶解到2 mol/L的盐酸乙酸乙酯溶液中，其中Boc-AZP-OMe和盐酸的摩尔为1：（5.0~10.0），在室温下反应5~10小时后收集生成的沉淀物，并用乙酸乙酯溶液洗涤，真空干燥后得到目标产物HCl.AZP-OMe；

a-2. 制备三肽Boc-PPA-OMe：将　Boc-ProPro-OH、步骤a-1所得HCl.AZP-OMe、N, N-二异丙基乙胺(DiPEA) 和1-羟基苯并三唑 (HOBt)按1：(1.05~1.10)：(3~5)：（1.05~1.10）的摩尔比溶解于二氯甲烷中。降温至-10~15 ^oC，加入的缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC·HCl ，其中Boc-ProPro-OH与乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.1 ~ 1：1.15，过夜反应，经分离纯化Boc-PPA-OMe；

a-3 制备Boc-PPA-OH：将步骤a-2所得Boc-PPA-OMe溶解于甲醇与水按4:1的体积比的混合溶液中，再加入的一水氢氧化锂LiOH·H₂O，其中Boc-PPA-OMe与一水氢氧化锂摩尔比为1：（2.0~3.0），反应5~10小时，蒸去大部分溶剂，调节pH =2~3，并乙酸乙酯萃取，蒸干得到Boc-PPA-OH；

a-4 制备端氨基Boc保护的氨基酸三肽的五氯苯酚活性酯片段单元Boc-PPA-OPCP：将步骤a-3所得的带叠氮化脯氨酸残基的三肽羧酸Boc-PPA-OH溶解于二氯甲烷中，然后在冰浴下加入五氯苯酚和缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；反应1.5~2.5小时后，在于室温下反应2~12小时，经分离纯化后得到端氨基Boc保护的氨基酸三肽的五氯苯酚活性酯片段单元；其中带叠氮化脯氨酸残基的三肽羧酸、五氯苯酚和缩合剂的摩尔比为：1：（1.05～1.10）：（1.1～1.15）；

b. 合成带有炔基的烷氧基醚树枝化基元

b-1 合成带有羧基端的烷氧醚基树枝化基元：将带有苯甲酯基团的树枝化基元和的一水氢氧化锂按1：（2~3）的摩尔比溶解于甲醇和水按4:1的体积比的混合溶液中，于室温下反应6~12小时，蒸干溶剂后调节pH=2 ~ 3，并用二氯甲烷萃取，蒸干后得到油状带有羧基端的树枝化基元；

b-2 合成带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元：将步骤b-1所得带有羧基的烷氧醚基树枝化基元、丙炔醇、催化剂对甲基苯磺酸二甲氨基吡啶盐DPTS和缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC·HCl按1：（2~5）：（0.8~1.0）：（1.1~1.15）的摩尔比溶解于二氯甲烷中，过夜反应，经分离提纯得到目标产物带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元；

c. 制备用于聚合的多肽带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元大单体HCl.PPA(R)-OPCP：将步骤a所得Boc-PPA-OPCP和步骤b所得带有炔基的烷氧基醚树枝化基元溶解于水和叔丁醇按1：(0.3~1）的体积比配制成的混合溶剂中，依次加入抗坏血酸钠和五水硫酸铜，其中Boc-PPA-OPCP、带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元、抗坏血酸钠和五水硫酸铜的摩尔比为：1：（1.1~1.3）：（0.2~0.5）：（0.05~0.1）；在室温下搅拌反应2~12小时,得初产物经分离纯化后溶于质量百分比浓度为10%的盐酸溶液中并搅拌2~4小时，确保端氨基的叔丁氧羰基保护基团Boc基团被脱去，去除将溶剂即得到产物HCl.PPAZP(R)-OPCP； 

d. 聚合物的合成：在惰性气氛和室温下，将步骤c所得HCl.PPA(R)-OPCP和三乙胺(TEA或N, N-二异丙基乙胺DIPEA按1：（3~5）的摩尔比溶于DMSO溶剂中，搅拌反应5~8天后，加入二氯甲烷稀释，再经分离提纯后，冷冻干燥即得到温度敏感型树枝化多肽聚合物。

上述的Boc-AZP-OMe 的合成方法参见参考文献：　Zhang, A. F.; Schluter, A. D. Chem. Asian J. 2007, 2, 1540。 

上述的Boc-ProPro-OH的合成方法参见参考文献：Zhang, A. F.; Guo, Y. F. Chem. Eur. J. 2008, 14, 8939。 

上述的带有苯甲酯基团的树枝化基元EtG1-OMe（或者EtG2-OMe, MtG1-OMe, MtH2-OMe, 合成方法参见：Li, W.; Zhang, A.; Schluter, A. D. Chem. Commun. 2008, 5523。 

本发明所得聚合物结构及分子量大小分别由¹H NMR和凝胶渗透色谱（GPC）证明，其温度敏感性能则通过紫外-可见光分光光度计在固定波长不同温度下的透过率测试，多肽聚合物主链构象转变特性则通过圆二色谱（Circular Dichroism Spectroscopy, CD）分析。 

本发明所制备的聚合物，在结构上首次采用具有构象转变特征的聚脯氨酸为主连，利用高效一价铜催化的点击化学 (click reaction)方法，将具有潜在温度敏感性的烷氧醚树枝化基元高密度地排布在聚脯氨酸主链周围，使聚合物具有很好的温度响应性，并且通过改变树枝化基元的种类，可以改变聚合物的温敏性能和聚合物主链的构象转变行为。 

本发明的方法优势在于：1）采用活性酯的方法合成多肽聚合物主链，该方法的最大特点及能够用于制备具有序列多肽结构的聚合物，而普通氨基酸酸酐开环聚合只能制备单一氨基酸序列结构的多肽聚合物。2）采用点击化学的方法，提供了一种制备各种功能化多肽聚合物的有效方法，即只需制备带炔烃官能团的功能化基元，即可将其接到多肽主链上，用以完成多肽的功能化。3）采用大单体的方法，即首先合成带有功能化基元的多肽片段以形成大单体，再进行聚合，可以保证每个多肽片段上都具有功能化基团，进而达到具有完美结构的聚合物。 

附图说明

图1. 多肽聚合物的合成路线 

图2. 带有炔烃官能团的树枝化基元的合成路线

图3. 多肽聚合物[PPA(EtG1)]_n的¹H NMR谱图(DMSO, 500MHz)

图4. 多肽聚合物[PPA(EtG2)]_n的¹H NMR谱图(DMSO 500MHz)

图5. 多肽聚合物的GPC谱图 (DMF 流动相，45 ^oC)

图6. 多肽聚合物的在水溶液中溶液透光率随温度变化曲线

图7. 多肽聚合物在水溶液中不同温度下随时间变化的CD光谱图。

具体实施方式

实施例1： 

本发明涉及[PPA(R)]_n (R= EtG1)的制备合成。合成路线参考图1

1.1 HCl.AZP-OMe的合成

在室温条件下，将Boc-AZP-OMe（1.0 g, 3.70 mmol）溶解于10 mL的盐酸乙酸乙酯溶液（2 mol/L）中，反应5小时以后，蒸去溶剂，得到固体粉状固体（0.76 g，100%）。表征数据如下：¹H NMR (D₂O): δ = 2.42-2.45 (m, 1H; CH₂), 2.54-2.60 (m, 1H; CH₂), 3.46-3.50 (m, 2H; CH₂), 3.78 (s, 3H; OCH₃), 4.53-4.56 (m, 1H; CH), 4.59-4.61 (m, 1H; CH); 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calcd for C₆H₁₁N₄O₂, 171.08; Found: 171.0871..

1.2 Boc-PPA-OMe的合成　

将Boc-Pro-Pro-OH (3.32 g, 10.64 mmol)，HCl.AZP-OMe (2.0 g, 9.67 mmol) 和 N, N-二异丙基乙胺(DiPEA) (5.00 g, 38.7 mmol) 和1-羟基苯并三唑 (HOBt) (1.63 g, 12.08 mmol) 溶解在二氯甲烷中，降温至 -15 ^oC，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl) (2.40 g, 12.51 mmol)，过夜反应，并逐步至室温，分别用饱和NaHCO₃溶液和10% KHSO₄溶液清洗有机相，硫酸镁干燥并过滤，粗产物采用柱色谱纯化得到4.25 g, 94%), 表征数据如下：¹H NMR (CDCl₃) δ =1.39, 1.44 (2 s, 9H;  ^t Bu), 1.77-2.50 (m, 10H, CH₂), 3.32-3.79 (m, 8H; CH₂, OCH₃), 4.10-4.20 (m, 1H; CH₂), 4.24-4.32 (m, 1H; CH), 4.36-4.50 (m, 1H; CH), 4.59-4.69 (m, 2H; CH); 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calcd for C₂₁H₃₃N₆O₆, 465.24; Found: 465.2454.

1.3 Boc-PPA-OH的合成

将Boc-PPA-OMe　(3.90 g, 8.39 mmol) 溶解于甲醇和水的混合溶液中（20 mL/5 mL）加入一水合氢氧化锂（LiOH·H₂O） (1.05 g, 25.2 mmol)，反应过夜，蒸去溶剂后采用10% KHSO₄酸化后，加入乙酸乙酯萃取，并用柱色谱分离，得到白色固体（3.42 g, 90%）。 核磁表征如下：¹H NMR (CDCl₃) δ = 1.38, 1.43 (2 s, 9H;  ^t Bu), 1.77-2.50 (m, 10H; CH₂), 3.32-3.81 (m, 5H; CH₂), 4.07-4.17 (m, 1H; CH₂), 4.28-4.39 (m, 1H; CH), 4.46-4.49 (m, 1H; CH), 4.56-4.67 (m, 2H; CH); 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calcd for C₂₀H₃₁N₆O₆,451.22; Found: 451.2305.

1.4 Boc-PPA-OPCP的合成。

在冰水浴条件下，将Boc-Pro-Pro-AZP-OH (1.10 g, 2.44 mmol) 和五氯苯酚(0.70 g, 2.68 mmol)溶解在二氯甲烷中( 20 mL)，加入缩合剂EDC·HCl (1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 (0.60 g, 2.90 mmol)，恢复室温并继续反应12小时以后，浓缩并采用柱色谱分离产物（二氯甲烷/甲醇 = 20：1，体积比）得到白色固体(1.50 g, 88%)。表征数据如下：¹H NMR (CDCl₃) δ = 1.39, 1.44 (2 s, 9H;  ^t Bu), 1.78-2.30 (m, 8H; CH₂), 2.48-2.71 (m, 2H; CH₂), 3.34-3.81 (m, 5H; CH₂), 4.24-4.32 (m, 1H; CH₂), 4.35-4.44 (m, 1H; CH), 4.45-4.49 (m, 1H; CH), 4.58-4.68 (m, 1H; CH), 5.04-5.10 (m, 1H; CH); 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₂₆H₂₉C_l5N₆O₆Na, 721.80; Found:721.0448. 

1.5树枝化基元EtG1-OH的合成。

将EtG1-OMe　(5.0 g, 7.52 mmol) 溶解于甲醇和水的混合溶液中（60 mL/15 mL）加入一水合氢氧化锂（LiOH·H₂O） (1.26 g, 30.1 mmol)，反应过夜，蒸去溶剂后采用10% KHSO₄酸化后，加入二氯甲烷萃取，并用柱色谱分离，得到油状物（4.3 g, 89%）。核磁表征如下：¹H NMR (CD₂Cl₂): d = 1.13-1.16 (m, 9H; CH₃), 3.46-3.48 (m, 6H; CH₂), 3.53-3.68 (m, 24H; CH₂), 3.77 (t, 2H; CH₂), 3.85-3.87 (m, 4H, CH₂), 4.16-4.21 (m, 6H; CH₂), 7.32 (s, 2H; CH). ¹³C NMR (CD₂Cl₂): d = 15.04, 15.10, 61.71, 66.55, 68.99, 69.74, 69.96, 70.42, 70.62, 70.68, 70.75, 70.88, 72.60, 109.23, 124.59, 143.05, 152.47, 169.81. 　 

1.6 树枝化基元EtG1-Par的合成

在冰浴条件下，将羧酸基烷氧基醚树枝化基元EtG1-OH (2.5 g, 3.84 mmol)及丙炔醇(0.26 g, 4.61 mmol)和催化剂甲基苯磺酸二甲氨基吡啶盐 (DPTS) (1.1 g, 3.84 mmol) 溶解于二氯甲烷(20 mL),  加入缩合剂EDC·HCl (1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 (0.92 g, 4.82 mmol)，恢复室温并继续反应12小时以后，将溶液浓缩后采用柱色谱纯化（二氯甲烷/甲醇 = 20：1，体积比）得到无色液油状体(2.31 g, 88%)。表征数据如下：¹H NMR (CDCl₃): d = 1.14-1.18 (t, 9 H; CH₃), 2.48-2.50 (t, 1H; CH), 3.44-3.51 (m, 6H; CH₂), 3.52-3.70 (m, 24H; CH₂), 3.76 (t, 2H; CH₂), 3.81-3.92 (m, 4H; CH₂), 4.14-4.21 (m, 6H; CH₂), 4.84 (d, 2H; CH₂), 7.28 (s, 2H; CH)。高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₃₄H₅₆O₁₄Na,711.36; Found: 711.3558.

1.7 Boc-PPA(EtG1)-OPCP的合成

将Boc-PPA-OPCP (0.67 g, 0.96 mmol) 和树枝化基元EtG1-Par (0.6 g, 0.87 mmol) 溶解于8 mL H₂O和8 mL 叔丁醇中，依次加入抗坏血酸钠(68 mg, 0.35 mmol) 和五水硫酸铜 (22 mg, 0.088 mmol)，在室温下搅拌24小时后，旋蒸除去溶剂后加入20 mL 二氯甲烷和饱和食盐水，分液，其中二氯甲烷相用无水硫酸镁干燥过滤，蒸干滤液后得到粗产品采用柱色谱分离纯化得到无色油状物 (0.91 g, 70%)。表征数据如下：¹H NMR (300MHz, CDCl₃,): d = 1.16-1.21 (m, 9 H; CH₃), 1.38, 1.44 (2 s, 9H;  ^t Bu), 1.78-2.28 (m, 10H; CH₂), 2.89-3.19 (m, 2H, CH₂), 3.35-3.43 (m, 1H, CH₂), 3.47-3.73 (m, 31H; CH₂), 3.78 (t, 2H; CH₂), 3.84 (t, 4H; CH₂), 4.12-4.24 (m, 7H, CH₂), 4.37-4.50 (m, 1H; CH₂), 4.64-4.82 (m, 2H; CH), 5.04-5.11 (m, 1H; CH), 5.26-5.37 (m, 1H; CH), 5.42 (d, 2H; OCH₂), 7.27 (s, 2H; Ph), 7.78, 7.80 (2 s, 1H; CH). 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₆₀H₈₅Cl₅N₆O₂₀Na, 1407.42; Found: 1407.414.

1.8 HCl.PPA(EtG1)-OPCP 的合成。

将Boc-PPA(EtG1)-OPCP (1.35 g, 0.97 mmol) 在室温下溶解于 HCl (10%, 60 mL) 并且搅拌过夜，于室温下旋蒸除去溶剂后得到油状产物 (1.25 g, 97%)。核磁表征数据如下： ¹H NMR (D₂O, 300MHz): d = 1.14-1.20 (m, 9H; CH₃), 2.01-2.11 (m, 6H; CH₂), 2.57-2.65 (m, 2H; CH₂), 2.89-2.95 (m, 1H; CH₂), 3.29-3.35 (m, 1H; CH₂), 3.43-3.49 (m, 2H; CH₂), 3.51-3.74 (m, 32H; CH₂), 3.79-3.90 (m, 6H; CH₂), 3.94-4.29 (m, 6H; CH₂), 4.47-4.53 (m, 1H; CH₂), 4.67-4.72 (m, 1H; CH₂), 4.85-4.95 (m, 2H; CH), 5.11-2.5 (m, 2H; CH₂), 5.47-5.66 (m, 2H; CH₂), 6.95(s, 2H; CH), 8.15 (s, 1H; CH). 高分辨质谱HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calcd for C₅₅H₇₈Cl₅N₆O₁₈, 1285.37; Found: 1285.381. 

1.9 [PPA(EtG1)]_n 的合成。

将HCl.PPA(EtG1)-OPCP (0.39 g, 0.29 mmol) 溶解于DMSO (0.3 ml) 中, 滴入三乙胺 (90 mg, 0.89 mmol) 后在室温下搅拌9天，加入3 mL二氯甲烷稀释后通过柱色谱纯化（200~300目硅胶，淋洗剂：二氯甲烷），后在乙醚中沉淀2次后得到相应聚合物 (0.19 g, 65%)。核磁表征参看图3 

实例2：

本发明涉及[PPA(R)]_n (R= EtG2)的制备合成。合成路线参考图1

2.1 Boc-PPA(EtG2)-OPCP 的合成。

将Boc-PPA-OPCP (0.59 g, 0.85 mmol) 和树枝化基元EtG2 (1.65 g, 0.67 mmol) 溶解于15 mL H₂O和15 mL 叔丁醇中，依次加入抗坏血酸钠(61.0 mg, 0.31 mmol) 和五水硫酸铜CuSO₄·5H₂O (19.0 mg, 0.076 mmol)，在室温下搅拌24小时后，旋蒸除去溶剂后加入20 mL 二氯甲烷和饱和食盐水，分液，其中二氯甲烷相用无水硫酸镁干燥并过滤，蒸干滤液后得到的粗产品采用柱色谱分离纯化得到无色油状物 (1.55 g, 73%)。核磁表征数据如下：¹H NMR (300MHz, CDCl₃): d = 1.15-1.20 (m, 27H; CH₃), 1.36-1.42 (2 s, 9H;  ^t Bu), 1.78-2.23 (m, 10H; CH₂), 2.86-3.16 (m, 2H; CH₂), 3.24-3.42 (m, 1H; CH₂), 3.45-3.83 (m, 139H; CH₂), 4.07-4.22 (m, 25H; CH₂), 4.35-4.49 (m, 7H; CH₂), 4.62-4.79 (m, 2H; CH), 5.02-5.09 (m, 1H; CH₂), 5.24-5.34 (m, 1H; CH), 5.39 (d, 2H; OCH₂), 6.54 (s, 6H; CH), 7.27 (s, 2H; CH), 7.78, 7.80 (d, 1H; CH). 高分辨质谱HRMS (MALDI-TOF) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₁₄₇H₂₃₅Cl₅N₆O₅₆Na, 3178.42; Found: 3178.397. 

2.2 HCl.PPA(EtG2)-OPCP 的合成。

将Boc-PPA(EtG2)-OPCP (1.40 g, 0.44 mmol) 在室温下溶解于HCl (10%, 50 mL)中并搅拌过夜. 旋蒸除去溶剂得到油状产物 (1.31 g, 96%). 表征数据如下：¹H NMR (D₂O): d = 1.03-1.11 (m, 27H; CH₃), 2.01 (m, 6H; CH₂), 2.52 (m, 2H; CH₂), 2.84 (m, 1H, CH₂), 3.21 (m, 1H; CH₂), 3.38 (m, 2H; CH₂), 3.41-3.87 (m, 140H, CH₂); 4.05-4.13 (m, 24H; CH₂), 4.33-4.42 (m, 7H; CH2), 4.57-4.62 (m, 1H; CH₂), 4.82 (m, 2H; CH), 5.04-5.16 (m, 2H; CH), 5.38-5.56 (m, 2H; OCH₂), 6.56, 6.06 (2 s, 6H; CH), 6.96 (s, 2H; CH), 8.07 (s, 1H; CH). 高分辨质谱HRMS (MALDI-TOF) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₁₄₂H₂₂₇Cl₅N₆O₅₄Na, 3078.35; Found: 3178.360. 

2.3 [PPA(EtG2)]_n的合成。

将HCl.PPA(EtG2)-OPCP (0.58 g, 0.187 mmol) 溶解于DMSO (0.25 ml)中, 滴入三乙胺 (94 mg, 0.94 mmol)后在室温下搅拌7天，加入二氯甲烷稀释后通过柱色谱纯化（淋洗剂：二氯甲烷），后在乙醚中沉淀3次后得到相应聚合物 （0.44g, 84%）。核磁表征参看图4. 

3．温敏型树枝化聚合物的表征

3.1 聚合物的分子量表征

采用凝胶渗透色谱法（GPC）。由GPC测得[PPAZP(EtG1)]_n的数均分子量M_n=1.8×10⁴, PDI = 1.3, 而[PPA(EtG2)]_n的数均分子量为6.0×10⁴，PDI = 1.5。参看图5, 通过大单体聚合的方法，得到了不同代数的树枝化聚脯氨酸聚合物。

3.2 温度敏感性能表征 

聚合的温度敏感性测定可以通过紫外-可见光分光光度计在不同温度下500 nm 波长时的透过率测得，选取升温曲线在透过率为50%的时候的温度为最低临界聚集温度 (LCAT)。参看图5。聚合物的浓度为0.25%水溶液。由图6可以看到[PPA(EtG1)]_n和[PPA(EtG2)]_n均表现出了良好的温敏性能，相对EtG1类聚合物，EtG2类聚合物具有较窄的相变温度。两种聚合物的相变温度约为37 ^oC。

3.3 聚合物在水溶液中的二级结构表征 

聚合物的二级结构可以通过圆二色谱 (Circular Dichroism Spectroscopy, CD) 表征。参看图7。

通过CD对聚合物二级结构的表征发现：1）在20 ^oC条件下，随着时间的变化，[PPAZP(EtG1)]_n基本保持稳定的PPI构像（图7a），而[PPA(EtG2)]_n则发生了从PPI到PPII的构像转变（图7b）；2）当升高温度至50 ^oC，此温度远远高于这两种聚合物的最低临界聚集温度（LCAT）时，这两种聚合物均保持了稳定的PPI构像（图7c和7d）。 

即可以通过改变不同的树枝化基元代数（EtG1或者EtG2），聚合物可以在水溶液(LCAT以下)中分别以较稳定的PPI构象（当为一代树枝化基元时）和稳定的PPII构象（当为二代树枝化基元）存在。此外利用聚合物温度敏感特性，当升高温度至其LCAT之上以后，聚合物均保持稳定的PPI构象。 

Claims (3)

1.一种温度敏感型树枝化多肽聚合物，其特征在于该聚合物以脯氨酸和4位叠氮的脯氨酸形成的聚脯氨酸聚合物为主链，其侧链接枝有烷氧基醚类树枝化基元而构成的树枝化多肽聚合物，其中侧链与主链的摩尔比为：1：（3~6)。

2.根据权利要求1所述的温度敏感型树枝化多肽聚合物，其特征在于所述的树枝化多肽聚合物的化学结构式为：                                               

，y=1~4，n= 30~100 ；R为：

或

            

其中X为Me或Et。

3.一种制备根据权利要求1或2所述的温度敏感型树枝化多肽聚合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 制备用于聚合的多肽序列Boc-PPA-OPCP

a-1. 制备带有叠氮官能团的HCl.AZP-OMe：将Boc-AZP-OMe溶解到2 mol/L的盐酸乙酸乙酯溶液中，其中Boc-AZP-OMe和盐酸的摩尔为1：（5.0~10.0），在室温下反应5~10小时后收集生成的沉淀物，并用乙酸乙酯溶液洗涤，真空干燥后得到目标产物HCl.AZP-OMe；

a-2. 制备三肽Boc-PPA-OMe：将　Boc-ProPro-OH、步骤a-1所得HCl.AZP-OMe、N, N-二异丙基乙胺(DiPEA) 和1-羟基苯并三唑 (HOBt)按1：(1.05~1.10)：(3~5)：（1.05~1.10）的摩尔比溶解于二氯甲烷中。降温至-10~15 ^oC，加入的缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC·HCl ，其中Boc-ProPro-OH与乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.1 ~ 1：1.15，过夜反应，经分离纯化Boc-PPA-OMe；

a-3 制备Boc-PPA-OH：将步骤a-2所得Boc-PPA-OMe溶解于甲醇与水按4:1的体积比的混合溶液中，再加入的一水氢氧化锂LiOH·H₂O，其中Boc-PPA-OMe与一水氢氧化锂摩尔比为1：（2.0~3.0），反应5~10小时，蒸去大部分溶剂，调节pH =2~3，并乙酸乙酯萃取，蒸干得到Boc-PPA-OH；

a-4 制备端氨基Boc保护的氨基酸三肽的五氯苯酚活性酯片段单元Boc-PPA-OPCP：将步骤a-3所得的带叠氮化脯氨酸残基的三肽羧酸Boc-PPA-OH溶解于二氯甲烷中，然后在冰浴下加入五氯苯酚和缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；反应1.5~2.5小时后，在于室温下反应2~12小时，经分离纯化后得到端氨基Boc保护的氨基酸三肽的五氯苯酚活性酯片段单元；其中带叠氮化脯氨酸残基的三肽羧酸、五氯苯酚和缩合剂的摩尔比为：1：（1.05～1.10）：（1.1～1.15）；

b. 合成带有炔基的烷氧基醚树枝化基元

b-1 合成带有羧基端的烷氧醚基树枝化基元：将带有苯甲酯基团的树枝化基元和的一水氢氧化锂按1：（2~3）的摩尔比溶解于甲醇和水按4:1的体积比的混合溶液中，于室温下反应6~12小时，蒸干溶剂后调节pH=2 ~ 3，并用二氯甲烷萃取，蒸干后得到油状带有羧基端的树枝化基元；

b-2 合成带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元：将步骤b-1所得带有羧基的烷氧醚基树枝化基元、丙炔醇、催化剂对甲基苯磺酸二甲氨基吡啶盐DPTS和缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC·HCl按1：（2~5）：（0.8~1.0）：（1.1~1.15）的摩尔比溶解于二氯甲烷中，过夜反应，经分离提纯得到目标产物带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元；

c. 制备用于聚合的多肽带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元大单体HCl.PPA(R)-OPCP：将步骤a所得Boc-PPA-OPCP和步骤b所得带有炔基的烷氧基醚树枝化基元溶解于水和叔丁醇按1：(0.3~1）的体积比配制成的混合溶剂中，依次加入抗坏血酸钠和五水硫酸铜，其中Boc-PPA-OPCP、带有炔基端的烷氧醚基树枝化基元、抗坏血酸钠和五水硫酸铜的摩尔比为：1：（1.1~1.3）：（0.2~0.5）：（0.05~0.1）；在室温下搅拌反应2~12小时,得初产物经分离纯化后溶于质量百分比浓度为10%的盐酸溶液中并搅拌2~4小时，确保端氨基的叔丁氧羰基保护基团Boc基团被脱去，去除将溶剂即得到产物HCl.PPAZP(R)-OPCP； 

d. 聚合物的合成：在惰性气氛和室温下，将步骤c所得HCl.PPA(R)-OPCP和三乙胺(TEA或N, N-二异丙基乙胺DIPEA按1：（3~5）的摩尔比溶于DMSO溶剂中，搅拌反应5~8天后，加入二氯甲烷稀释，再经分离提纯后，冷冻干燥即得到温度敏感型树枝化多肽聚合物。

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