CN106397577A - 双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温度、pH值双重刺激响应的胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法。该聚合物是以胶原蛋白多肽为主链，该胶原蛋白多肽侧链上的氨基通过动态键联反应接枝烷氧醚树枝化基元侧链，从而得到具有温度、pH值双重刺激响应性胶原蛋白多肽聚合物；所述的胶原蛋白多肽的结构式为：其侧链动态键联反应方程式为：所述的胶原蛋白肽与烷氧醚树枝化基元G1的摩尔比为：1:(0.6～2)；本发明为设计制备具有其他响应行为的胶原蛋白多肽聚合物提供了新的思路，胶原蛋白本身作为一种人体组织中重要的结构蛋白，我们将其双重刺激响应智能化后，使之具有更为广阔的生物材料应用前景，在生物骨骼、人造血管等仿生材料领域具有潜在的应用价值。

Description

双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法，特别是一种双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白肽(collagen)是在哺乳动物体内大量存在的一种蛋白质多肽，其种类共有28种之多，它主要分布于皮肤、筋腱、血管、内脏和骨骼中，在这些组织中，胶原蛋白主要提供了结构稳定性，并参与许多代谢过程。在空间结构上，其显示出特殊的三股螺旋缠绕的结构，被称为胶原蛋白三螺旋结构。该三螺旋结构是由三条多肽链相互缠结紧密组装的右手超螺旋结构，而每一条多肽链又是左手螺旋的、延伸的聚脯氨酸第二型(polyprolinetypeII,PPII)螺旋结构。最典型的重复序列单元是由Pro-Hyp-Gly(脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸)组成，其结构如下所示。
与其它聚合物相比，多肽类聚合物具有有序的二级结构，其在生物体内的功能性也都与其二级结构紧密相关，目前对胶原蛋白肽的研究主要集中于合成胶原蛋白多肽及其构象的稳定性方面，对其智能行为的研究还不多见。所以将多肽类聚合物进行化学改性，赋予其刺激响应性，可以丰富其在作为生物材料、药物负载等领域的应用。诱导智能多肽聚合物改变的外部因素是多方面的，例如pH值，温度，金属离子，光或辐射，离子浓度等，pH敏感型多肽聚合物就是其中一类，可以通过改变溶液的pH值，来控制多肽聚合物的空间构象。2008年，Chmielewski等人利用多肽固相合成手段，设计合成了含有羧酸盐组分的具有pH刺激响应行为的胶原蛋白多肽聚合物(J.Chmielewski,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,8429-8432)，当环境pH值为中性时，由于羧酸根之间的静电排斥作用，不利于胶原蛋白肽三螺旋结构的稳定性；而当改变pH值处于酸性环境下后，羧酸根质子化，消弱静电排斥作用，有利于三螺旋结构的稳定。2006年，Moroder等人设计合成胶原蛋白肽具有光响应性的偶氮苯单元的胶原蛋白肽(L.Moroder,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,7015-7018.)，赋予胶原蛋白光敏性，通过改变光照条件来控制偶氮苯单元的顺反构型，从而影响胶原蛋白肽的有序构象。
综上，已有的对于胶原蛋白肽的研究，都还集中于单一的刺激因素，具有双重刺激响应性的胶原蛋白肽还没有报道。
发明内容
为了扩大只具有单一刺激响应行为的胶原蛋白多肽聚合物的应用范围，拓展其在新型生物材料、医学及药物缓释等方面的应用，本发明通过有效的合成方法，制备一种具有pH和温度双重响应型胶原蛋白肽聚合物，我们可以通过改变该聚合物所处的pH值环境，来改变动态键联的成键率，来实现其pH响应性；通过改变温度，来实现其随温度变化脱水聚集和再吸水溶解的相变过程，来实现其温度响应性。该类具有双重响应特性的胶原蛋白多肽聚合物，在药物的控制释放领域具有潜在的应用价值。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物，其特征在于该聚合物是以胶原蛋白多肽为主链，该胶原蛋白多肽侧链上的氨基通过动态键联反应接枝烷氧醚树枝化基元侧链，从而得到双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物，
其结构式为：
n＝60～80；
所述的胶原蛋白多肽的结构式为：
所述烷氧醚树枝化基元侧链G1的结构式为：
上述的动态键联反应为：肟键、烯胺键或酰腙键。
一种制备上述的双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.在冰浴和惰性气氛下，将N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸和NaH按1:(1.5～2.5)的摩尔比溶于四氢呋喃中，搅拌反应15～30分钟后，然后回复至室温，逐滴滴加自制的TsOH保护的2-叠氮基乙醇(制备方法参考文献：M Wang，etal.,J.Org.Chem.,2010,75,8604–8614.)的THF溶液；滴加完毕后，搅拌反应20～24小时，而后滴加甲醇终止反应；将溶剂通过旋转蒸发仪蒸出，残留物溶于二氯甲烷DCM，先经10wt％KHSO4水溶液洗涤，再用饱和食盐水洗涤，DCM萃取分液后，干燥，有机相并过滤；再经分离提纯即得化合物A；所述的N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸与2-叠氮基乙醇：1：(1.5～2)；
b.在冰盐浴和惰性气体保护下，将步骤a所得化合物A和1-羟基苯并三唑按1：(1.1～1.2)的摩尔比溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，然后搅拌10～15分钟，再加入溶有甘氨酸甲酯盐酸盐HCl-Gly-OMe与N,N-二异丙基乙胺DiEA的DCM溶液，然后继续搅拌5～7分钟，最后缓慢滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl的DCM溶液；在冰浴下搅拌4～6小时后，室温继续搅拌6～8小时至反应完全；蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用10wt％KHSO4水溶液和饱和食盐水洗涤，萃取分液后，干燥有机相并过滤；再经分离提纯得淡黄色油状的化合物B；所述的化合物A、甘氨酸甲酯盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的摩尔比为：1：(1.5～2)：(2.5～3)：(1.2～1.5)；
c.将步骤b所得化合物B溶于二氯甲烷DCM中，在冰浴下缓慢滴加三氟乙酸TFA的DCM溶液，搅拌至反应完全，加入甲醇蒸干溶剂得到化合物C；所述的化合物B与三氟乙酸的摩尔比为：1：(6～10)；
d.在惰性气氛和冰盐浴下，将步骤c所得化合物C和N，N-二异丙基乙胺DiEA按1：(1.2～1.5)的摩尔比溶于二氯甲烷DCM溶液中，再缓慢滴加溶有脯氨酸活性酯的DCM 溶液；在室温下搅拌至反应完全；蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用10wt％KHSO4水溶液和饱和食盐水洗涤DCM相，萃取分液后，干燥有机相并过滤；再经分离提纯即得淡黄色结晶化合物D；所述的化合物C和脯氨酸活性酯的摩尔比为：1：(1.5～2)；
e.将步骤d所得化合物D溶于甲醇和水以3:1的体积比的混合溶剂中，冰浴下加入一水合氢氧化锂，搅拌0.5～1h后，在室温下，再反应2～3h，在室温下蒸干溶剂，残留物溶于乙酸乙酯后，用10wt％KHSO4水溶液调节pH至5～6，用饱和食盐水洗涤有机相后，萃取，干燥，过滤，再经分离提纯，即得淡黄色结晶化合物E；所述的化合物D和一水合氢氧化锂的摩尔比为：1：(2～2.5)；
f.将步骤e所得化合物E与五氯苯酚按1：(1～1.2)的摩尔比溶于DMF中，在冰盐浴和惰性气体保护下，加入溶有(1.2～1.5)倍量的EDC·HCl的DMF，室温下继续搅拌至反应完全，蒸干溶剂，分离提纯，即得淡黄色结晶化合物F；
g.将步骤f所得化合物F溶于乙酸乙酯EA中，在冰浴下缓慢滴加2mol/L(8～10)倍量的氯化氢的乙酸乙酯溶液HCl/EA溶液，搅拌反应完全，室温下蒸出溶剂后即得大单体G；
h.在惰性气体保护下，将步骤g所得大单体G溶于DMF中，加入N,N-二异丙基乙胺DiEA后，搅拌反应至粘度不再增加后，再加入三苯基膦PPh3的DMF溶液，在48～50℃，反应24～30小时后，用乙醚沉淀得到目标聚合物P。
i.将步骤h所得聚合物P在酸性水溶液中溶解，加入(0.6～2)倍量的烷氧醚树枝化基元G1，然后将其pH值用1mol/L的NaOH水溶液调至10.5～12.1，常温下搅拌10～15分钟即得双重刺激响应型胶原蛋白肽。
本发明通过液相合成法合成了侧链带有叠氮基团的胶原蛋白三肽大单体，然后通过活性酯缩合聚合反应得到侧链带有叠氮基团的胶原蛋白肽聚合物，然后把聚合物侧链上叠氮基团还原得到端基为氨基基团的上述聚合物。该类聚合物在水溶液中可通过溶液pH值的改变来调控胶原蛋白肽特有的三股螺旋构象的稳定性；侧链的氨基基团可以通过亚胺键动态键联接枝烷氧醚树枝化基元侧链，赋予其温度敏感性；从而得到具有pH与温度双重刺激响应行为的胶原蛋白肽聚合物。这一发明为我们设计制备其他具有多重响应行为的胶原蛋白肽材料提供了新的思路，胶原蛋白本身作为一种人体组织中重要的结构蛋白，其本身所具有的生物相容性使其在生物骨骼、人造血管等仿生材料领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明中的大单体合成路线以及目标聚合物的聚合方法。
图2为本发明大单体化合物G的核磁氢谱表征(重水25℃，500MHz)。由图可知，1HNMR(D2O):δ＝1.89-2.63(m,6H,CH2),3.14-3.58(m,4H,CH2),3.58-3.84(m,4H,CH2), 3.85-4.09(m,2H,CH2),4.28-4.43(m,1H,CH),4.54-4.63(m,1H,CH),4.64-4.70(m,1H,CH)。证明得到了大单体化合物G。
图3为本发明的目标聚合物P的核磁氢谱表征(重水25℃，500MHz)。由图可知，1HNMR(D2O):δ＝1.69-2.42(m,6H,CH2),2.96-3.08(m,2H,CH2),3.29-3.50(m,2H,CH2),3.51-3.67(m,2H,CH2),3.68-4.15(m,4H,CH2),4.15-4.27(m,1H,CH),4.27-4.43(m,1H,CH),4.43-4.59(m,1H,CH)。证明得到了聚合物P。
图4为一系列加入不同比例烷氧醚侧链的动态键联接枝的胶原蛋白聚合物在水溶液中的浊度曲线。
图5为胶原蛋白肽聚合物P与接枝了烷氧醚侧链的双响应型聚合物在不同pH值水溶液中的圆二色光谱图，由该图可知，目标聚合物能够通过pH的改变来控制其三螺旋结构的形成。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明阐述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例一：本发明的双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物P的合成方法
1、参见图1，本发明的胶原蛋白多肽大单体化合物G的制备方法为：
化合物A的合成：将N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸(1当量,11.59g)溶于干燥THF(50mL)中，然后在冰浴和氮气保护下，加入NaH(2.5当量,3.02g)，冰浴下搅拌半小时，然后回复至室温，逐滴滴加自制的TsOH保护的2-叠氮基乙醇(1.8当量,21.7g)的THF(100mL)溶液；滴加完毕后再将反应体系放置于室温下搅拌反应24小时，而后滴加甲醇终止反应；将溶剂通过旋转蒸发仪蒸出，残留物溶于二氯甲烷DCM，先经KHSO4(10％)水溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤一次，DCM萃取分液后，用MgSO4干燥有机相并过滤。再用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为Hex/EA(5：1，v/v)，蒸干溶剂，即得化合物淡黄色油状化合物A。
化合物B的合成：将化合物A(1当量,0.67g)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(1.1当量,0.332g)、溶于干燥N，N-二甲基甲酰胺DMF(4mL)中，然后在冰盐浴和氮气保护下搅拌10分钟，再将溶有甘氨酸甲酯盐酸盐HCl-Gly-OMe(2当量,0.56g)与N,N-二异丙基乙胺DiEA(3当量,0.86g)的DCM(4mL)溶液，然后在冰盐浴和氮气气氛下继续搅拌5分钟，最后缓慢滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl(1.5当量，0.63g)的DCM(4mL)溶液；在冰盐浴中搅拌4小时后去除冰盐浴，回复至室温继续搅拌8小时至反应完全。蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用KHSO4(10％)水溶液和饱和食盐水洗涤DCM相，萃取分液 后，用MgSO4干燥有机相并过滤。再用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为Hex/EA(5:1,v/v)，；经分离提纯得淡黄色油状的化合物B。
化合物C的合成：将化合物B(1当量,0.55g)溶于二氯甲烷DCM(4mL)中，在冰浴下缓慢滴加三氟乙酸TFA(6当量,1.007g)的DCM(4mL)溶液，搅拌4小时反应完全，加入甲醇蒸干溶剂得到化合物C。
化合物D的合成：将化合物C(1当量,0.68g)和N,N-二异丙基乙胺DiEA(1.5当量,0.35g)溶于二氯甲烷DCM(8mL)溶液中,在惰性气氛和冰盐浴下，缓慢滴加溶有脯氨酸活性酯(1.2当量,0.82g)的DCM溶液(3mL)；在室温下搅拌8小时反应完全；蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用KHSO4(10％)水溶液和饱和食盐水洗涤DCM相，萃取分液后，用MgSO4干燥有机相并过滤。再用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为DCM/MeOH(20:1,v/v)，蒸干溶剂，即得淡黄色结晶化合物D。
化合物E的合成：将化合物D(1当量,0.76g)溶于MeOH/H2O(3:1)的混合溶剂中，0℃冰浴下加入一水合氢氧化锂(2当量,0.14g)，搅拌1h后回复至室温，再反应3h后，在室温下蒸干溶剂。残留物溶于EA后，用10％KHSO4水溶液调节pH至5～6，用饱和食盐水洗涤有机相后，萃取，MgSO4干燥，过滤，再用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为DCM/MeOH(5:1,v/v)，蒸干溶剂，即得淡黄色结晶化合物E。
化合物F的合成：化合物E(1当量,0.47g)与五氯苯酚(1.1当量,0.31g)溶于干燥DMF(4mL)中，置于-15℃冰盐浴和N2气保护下，加入4mL溶有EDC·HCl(1.2当量,0.24g)的DMF，回复至室温后继续搅拌24小时后至反应完全，蒸干溶剂，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为DCM/MeOH(40:1,v/v)，蒸干溶剂，即得淡黄色结晶化合物F。
大单体G的合成：将所得化合物F(1当量,0.51g)溶于乙酸乙酯EA(1mL)中，在冰浴下缓慢滴加2M的氯化氢的乙酸乙酯溶液HCl/EA(10当量,3.6mL)溶液，搅拌4小时至反应完全，室温下蒸出溶剂后即得大单体G。
2、“一锅法”制备胶原蛋白多肽聚合物P：
本发明采用“一锅法”实现了大单体的缩聚及侧链叠氮基团的还原，得到目标产物P。
聚合物P的合成：大单体G(1当量,0.213g)溶于DMF(0.25mL)中，加入DiEA(2当量,86mg)后在N2保护下搅拌4天，待粘度不再增加后，补加少许DMF(0.1mL)溶剂，并加入三苯基膦PPh3(2.5当量,220mg)，油浴加热至50℃，反应24小时后，用乙醚沉淀析出两次后得到目标聚合物，冻干机抽干溶剂得到淡黄色粉末状目标聚合物，由附图2可知： 1H NMR(D2O)：δ＝1.69-2.42(m,6H,CH2),2.96-3.08(m,2H,CH2),3.29-3.50(m,2H,CH2),3.51-3.67(m,2H,CH2),3.68-4.15(m,4H,CH2),4.15-4.27(m,1H,CH),4.27-4.43(m,1H,CH), 4.43-4.59(m,1H,CH).证明得到了目标聚合物P：P-PO(NH2)G
实施例二：本发明中胶原蛋白肽聚合物刺激响应行为的表征
1、本发明双重刺激响应型胶原蛋白肽聚合物的pH敏感行为按照如下方法进行测试：
通过圆二色光谱对聚合物P-PO(NH2)G的二级结构进行了表征，如附图5所示，常温下，在pH为12.2的碱性水溶液中，其CD信号谱图在225nm处显示出一个正的吸收峰，胶原蛋白肽主链表现为规整的三股螺旋构象；同样温度下，在pH为3.1的酸性水溶液中，其在225nm出的正吸收峰消失，表示其三股螺旋构象遭到破坏。我们也可以先在酸性水溶液中溶解聚合物，然后再通过加入碱液(NaOH等)使其pH到碱性范围，可以通过其科顿信号来判断其主链构象由无规线团到有序的三股螺旋的转变。
在酸性条件下加入了烷氧醚侧链后，其在225nm处仍为负的吸收峰，表明此时处于无规构象；而将其pH值调节至碱性，其在225nm处出现了一个正的吸收峰，说明其构象由无规转为了胶原蛋白肽的三螺旋构象。
2、本发明双响应型胶原蛋白肽的温度敏感行为按照如下方法进行测试：
采用具有温控装置的紫外-可见光谱仪对改性胶原蛋白肽水溶液的相变过程进行跟踪，温度范围设置为30～80℃，测试过程为先加热，后冷却，测试了一系列加入不同比例烷氧醚侧链的样品。最终分别得到加热和冷却过程的浊度曲线，如图4所示，证明了聚合物的温敏行为过程。

Claims (3)

1.一种双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物，其特征在于该聚合物是以胶原蛋白多肽为主链，该胶原蛋白多肽侧链上的氨基通过动态键联反应接枝烷氧醚树枝化基元侧链，从而得到双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物，
其结构式为：n＝60～80；
所述的胶原蛋白多肽的结构式为：
其烷氧醚树枝化基元侧链G1的结构式为：
2.根据权利要求1所述的双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物，其特征在于所述的动态键联反应为：肟键、烯胺键或酰腙键。
3.一种制备根据权利要求1或2所述的双重刺激响应型胶原蛋白多肽聚合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 在冰浴和惰性气氛下，将N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸和NaH 按 1:（1.5~2.5）的摩尔比溶于四氢呋喃中，搅拌反应15~30分钟后，然后回复至室温，逐滴滴加自制的TsOH保护的2-叠氮基乙醇的THF溶液；滴加完毕后，搅拌反应20~24小时，而后滴加甲醇终止反应；将溶剂通过旋转蒸发仪蒸出，残留物溶于二氯甲烷DCM，先经10wt%KHSO4水溶液洗涤，再用饱和食盐水洗涤，DCM萃取分液后，干燥，有机相并过滤；再经分离提纯即得化合物A；所述的N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸与2-叠氮基乙醇：1：（1.5~2）；
b. 在冰盐浴和惰性气体保护下，将步骤a所得化合物A和1-羟基苯并三唑按1：（1.1~1.2）的摩尔比溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，然后搅拌10~15分钟，再加入溶有甘氨酸甲酯盐酸盐HCl-Gly-OMe与N,N-二异丙基乙胺DiEA的DCM溶液，然后继续搅拌5~7分钟，最后缓慢滴加1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl的DCM溶液；在冰浴下搅拌4~6小时后，室温继续搅拌6~8小时至反应完全；蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用10wt%KHSO4水溶液和饱和食盐水洗涤，萃取分液后，干燥有机相并过滤；再经分离提纯得淡黄色油状的化合物B；所述的化合物A、甘氨酸甲酯盐酸盐、N,N-二异丙基乙胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐的摩尔比为：1：（1.5~2）：（2.5~3）：（1.2~1.5）；
c. 将步骤b所得化合物B溶于二氯甲烷DCM中，在冰浴下缓慢滴加三氟乙酸TFA的DCM溶液，搅拌至反应完全，加入甲醇蒸干溶剂得到化合物C；所述的化合物B与三氟乙酸的摩尔比为： 1：（6~10）；
d. 在惰性气氛和冰盐浴下，将步骤c所得化合物C和N，N-二异丙基乙胺DiEA按 1：（1.2~1.5）的摩尔比溶于二氯甲烷DCM溶液中，再缓慢滴加溶有脯氨酸活性酯的DCM溶液；在室温下搅拌至反应完全；蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用10wt%KHSO4水溶液和饱和食盐水洗涤DCM相，萃取分液后，干燥有机相并过滤；再经分离提纯即得淡黄色结晶化合物D；所述的化合物C和脯氨酸活性酯的摩尔比为：1：（1.5~2）；
e. 将步骤d所得化合物D溶于甲醇和水以3 :1的体积比的混合溶剂中，冰浴下加入一水合氢氧化锂，搅拌0.5~1 h后，在室温下，再反应2~3 h，在室温下蒸干溶剂，残留物溶于乙酸乙酯后，用10 wt%KHSO4水溶液调节pH至5～6，用饱和食盐水洗涤有机相后，萃取，干燥，过滤，再经分离提纯，即得淡黄色结晶化合物E；所述的化合物D和一水合氢氧化锂的摩尔比为：1：（2~2.5）；
f. 将步骤e所得化合物E与五氯苯酚按1：（1~1.2）的摩尔比溶于DMF中，在冰盐浴和惰性气体保护下，加入溶有（1.2~1.5）倍量的EDC·HCl 的DMF，室温下继续搅拌至反应完全，蒸干溶剂，分离提纯，即得淡黄色结晶化合物F；
g. 将步骤f所得化合物F溶于乙酸乙酯EA中，在冰浴下缓慢滴加2 mol/L (8~10)倍量的氯化氢的乙酸乙酯溶液HCl/EA溶液，搅拌反应完全，室温下蒸出溶剂后即得大单体G；
h. 在惰性气体保护下，将步骤g所得大单体G溶于DMF中，加入N,N-二异丙基乙胺DiEA后，搅拌反应至粘度不再增加后，再加入三苯基膦PPh3的DMF溶液，在48~50 ℃，反应24~30小时后，用乙醚沉淀得到目标聚合物P；
i. 将步骤h所得聚合物P在酸性水溶液中溶解，加入（0.6~2）倍量的烷氧醚树枝化基元G1，然后将其pH值用1 mol/L的NaOH水溶液调至10.5~12.1，常温下搅拌10~15分钟即得双重刺激响应型胶原蛋白肽。
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