CN103408753B - 温敏型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种温敏型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法。该多肽聚合物的结构式为：n=100~150。本发明首先通过液相合成法合成了烷氧醚类树枝化基元修饰的胶原蛋白三肽大单体，然后经缩聚反应得到相应聚合物。该类聚合物不仅具有良好的生物相容性，且在水溶液中呈现出优异的温敏行为，其中一种聚合物相变温度接近人体温度，从而在医药学领域尤其是控制药物释放有潜在的应用价值。

Description

温敏型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法，特别是一种温敏型胶原蛋白多肽聚合物及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白肽是在人体中富含的一种蛋白质多肽，广泛存在于皮肤、骨骼及细胞外基质中。胶原蛋白类多肽因其特殊的三级超螺旋结构（三条左手螺旋的分子链相互缠结形成右手螺旋的三级螺旋结构），引起人们的广泛研究。目前，人们发现的存在于脊椎动物中的胶原蛋白肽的种类有28种之多，但其序列重复单元主要由Pro-Hyp-Gly（脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸）组成，结构如下所示。

与传统聚合物相比，多肽类聚合物具有有序的二级结构，且其二级结构决定了它们在生物体的功能性。将多肽聚合物进行改性，实现其智能响应性将进一步有利于它们在生物材料领域的应用。智能多肽聚合物因其具有对外界刺激（pH、温度等）响应性的特征，在医药领域尤其是药物控制释放方面有很大的潜在应用价值。温度敏感型多肽聚合物就是其中重要的一类，它在较低温度下有良好的水溶性，当温度升高到其最低临界溶液温度(LCST）以上时，即T>LCST时，发生脱水聚集的相转变过程，再次将温度降低到T<LCST时，又可以回复到良好的水溶性状态。目前为止，基于多肽这类生物大分子的温敏聚合物的研究报道还不多见，最著名的温敏多肽是弹性蛋白多肽聚合物(ELPs)。本课题组报道了一类由烷氧醚构筑的树枝化聚合物(Macromolecules2008,41,3659–3667;Chem.Commun.2008,5523-5525)，该类聚合物不仅表现出十分优异的温敏行为（相变迅速且升温降温过程滞后效应小），且可以通过改变树枝化基元的端基30-65°C范围内调节聚合物的相变温度。最近，李志波等人报道了一类温敏谷氨酸多肽聚合物(Biomacromolecules,2011,12,2859-2863),它们的侧基因连接有短链烷氧醚而表现出温敏特征。鉴于目前所报道的温敏多肽聚合物类型较少，而且往往它们的相变过程较慢，相变温度范围较宽。进一步开发新型的温敏多肽类聚合物是十分有必要和有意义的。

多肽合成的研究已经走过了一百多年的光辉历程。自1902年E.Fischer^[47]创立了蛋白质的多肽结构学说，人们便开始关注多肽的合成。目前关于多肽化学合成的方法主要有液相合成法和固相合成法两种。在溶液中进行的多肽合成称为液相合成法，其中包括氨基酸缩合法和酸酐开环聚合法。在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，如一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用。其主要缺点：合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相多肽合成方法（SPPS）是在不溶的高分子树脂表面进行的反应。它的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。其缺点主要表现在合成过程中，肽键生成不完整，受多肽长度的影响，只适合于合成50个氨基酸以内的多肽而且成本相对较高。如何通过更有效的方法合成出高分子量的多肽聚合物也是多肽合成研究的一大热点。

发明内容

本发明的目的之一在于通过有效的合成手段，制备一种温度敏感型的胶原蛋白肽类聚合物，该聚合物能在接近人体温度范围内，实现随温度变化脱水聚集和再吸水溶解的相变过程，且相变过程迅速，并且具有良好的生物相容性，从而在医药学领域尤其是控制药物释放有潜在的应用价值。

本发明的目的之二在于提供该聚合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一类温敏型胶原蛋白多肽聚合物，其特征在于该多肽聚合物的结构式为

n=100~200。

一种制备上述的温敏型胶原蛋白多肽聚合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将羟脯氨酸和N,N-二异丙基乙胺DiEA溶于水中,在惰性气氛和冰盐浴下，缓慢滴加脯氨酸活性酯的N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液；在室温下搅拌至反应完全；经分离提纯得无色油状的化合物A；其中羟脯氨酸、N,N-二异丙基乙胺DiEA、脯氨酸活性酯的摩尔比为：1:（1.2~1.5）:（1.1~1.2）；所述化合物A的结构式为：；

b.将步骤a所得化合物A溶于干燥DMF中，然后在冰浴和惰性气氛下，加入NaH，室温下逐滴滴加核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的DMF溶液；滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌反应20～30小时，而后滴加甲醇终止反应；去除溶剂，残留物溶于二氯甲烷DCM中，经10wt%KHSO₄水溶液和饱和食盐水洗涤，经分离纯化得化合物B；其中化合物A、NaH（氢化钠）和核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的摩尔比为：1:（5~6）:（1.1~1.2）；所述的核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的结构式为：

所述的化合物B的结构式为：

c.将五氯酚和步骤b所得化合物B按(1.2~1.5)：1的摩尔比溶于干燥的DCM中，在冰盐浴和惰性气体保护下，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl，室温下继续搅拌至反应完全；反应液先后用饱和NaHCO₃和食盐水洗涤，经分离提纯后得到二肽活性酯；在冰盐浴和惰性气氛下，将该二肽活性酯用DCM溶解后滴加到溶有甘氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺DiEA的DCM溶液中，滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌反应3～5小时，经分离提纯后得到化合物C；其中所述的EDC·HCl与化合物B的摩尔比为1:（1.2~1.5）；所述的二肽活性酯、甘氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺DiEA的摩尔比为：1:（1.1~1.2）：（1.2~1.5）；化合物C的结构式为：

d.将步骤c所得化合物C溶于MeOH和H₂O按3:1的体积比配成的混合溶剂中，冰水浴下加入一水氢氧化锂，搅拌1.5~3.0小时后升至室温，再反应3.5~5小时，去除溶剂，残留物溶于DCM后，调节pH至5~6，用饱和食盐水洗涤，经分离提纯后得到的三肽羧酸；其中化合物C与一水氢氧化锂的摩尔比为：1:（2~3）；三肽羧酸的结构式为：

；

d.再将步骤c所得三肽羧酸与五氯酚按1:（1.2~1.5）的摩尔比溶于干燥DCM中，冰盐浴惰性气体保护下，加入EDC·HCl，室温下继续搅拌至反应完全，去除溶剂，残留物溶于DCM后，调节pH至5~6，用饱和食盐水洗涤，分离提纯后得到化合物D；其中三肽羧酸与EDC·HCl的摩尔比为：1:（1.2~1.5）；其中，化合物D的结构式为：

e.将步骤d所得化合物D溶于H₂O中，在5^oC下缓慢滴加HCl的水溶液，搅拌至反应完全，去除溶剂即得大单体E；其中化合物D与HCl的摩尔比为：1:（50~60）；大单体E的结构式为：

f.将步骤e所得大单体E溶于二甲亚砜DMSO中，大单体E溶于二甲亚砜的质量体积比为：配制成浓度为0.1g：0.10~0.15mL，加入N,N-二异丙基乙胺DiEA，在惰性气氛下搅拌3~5天，其中大单体E与N,N-二异丙基乙胺DiEA的摩尔比为：1:（3~5）；用乙醚沉析出后再经分离纯化得到目标聚合物，即温敏型胶原蛋白多肽聚合物。

本发明将在胶原蛋白肽侧基引入烷氧醚树枝化基元，成功制备了树枝化烷氧醚类具有温敏智能行为的胶原蛋白多肽聚合物，该多肽聚合物的相变温度（LCST）接近人体温度，相变过程迅速，回复滞后小，它兼具有温度敏感智能特征和胶原蛋白肽良好的生物相容性，在药物控制释放、智能材料等领域极具应用前景，拓宽了这类功能多肽在生物材料领域的应用价值。

附图说明

图1.当X=Et，Y=2时的聚合物P1在重水中的核磁氢谱。由图可知，¹HNMR(D₂O):δ=0.99-1.19(m,9H,CH₃),1.80-2.34(m,6H,CH₂),3.36-3.79(m,38H,CH+CH₂),4.08-4.47(m,9H,CH+CH₂),6.64-6.71(br,1H,NH)。证明得到了目标产物。

图2.聚合物P1在0.25wt%水溶液中的浊度曲线。横坐标为温度，纵坐标为紫外光（500nm）透过率，通过跟踪P1水溶液的透过率随温度改变（先升高，后降低，变温速率为0.2°C/min）的变化情况，得到如图所示浊度曲线。加热过程中，曲线上透过率减小到初始值一半时的温度为该P1水溶液的相变温度（LCST），发现其相变温度为38.5°C。并且，该P1水溶液相变过程迅速（<4°C），回复滞后小（<3°C）。

具体实施方式

以X=Et，Y=2为例，本发明的优选实施例详述如下：

实施例1

当结构式中X=Et，Y=2时，本实施例采用以下方法制备了该系列聚合物中的聚合物P1：

化合物A的合成：将羟脯氨酸(1.2当量)和DiEA(3当量)溶于水(1体积)中,冰盐浴-15^oC、N₂保护下缓慢滴加溶有脯氨酸活性酯(1当量)的DMF(2体积)溶液。滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌4h至反应完全。蒸干溶剂后残留物用DCM溶解，先后用KHSO₄(10%)水溶液和饱和食盐水洗涤反应液，DCM萃取分液后，用MgSO₄干燥有机相并过滤。再用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为DCM/MeOH(20:1,v/v)，蒸干溶剂，即得无色油状的化合物A。

化合物B的合成：将化合物A(1.5当量)溶于干燥DMF(2体积)溶液中，然后在0^oC冰浴、N₂保护下加入NaH(7.5当量)。回复至室温下搅拌15min后，逐滴滴加溶有端基为乙基、核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元(1.3当量)（合成方法参考文献Macromolecules2008,41,3659–3667;Chem.Commun.2008,5523-5525）的干燥DMF(1体积)溶液。滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌24h，而后滴加甲醇终止反应。将溶剂蒸出后残留物溶于DCM中，先后用KHSO₄(10%)水溶液和饱和食盐水洗涤，分离提纯步骤同化合物A。

化合物C的合成：将五氯酚(1.1当量)和化合物B(1当量)溶于干燥的DCM中，置于-15^oC冰盐浴和N₂气保护下，加入EDC·HCl(1.1当量)，回复至室温后继续搅拌5h至反应完全。停止反应后反应液先后用饱和NaHCO₃和食盐水洗涤，DCM萃取分液后用MgSO₄干燥有机相，过滤。蒸干溶剂后得到二肽活性酯，再用DCM溶解后滴加到甘氨酸甲酯盐酸盐(1.1当量),DiEA(5当量)的DCM溶液中，滴加过程保持溶液在-10^oC冰盐浴以及N₂气保护下。滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌4h，分离提纯步骤同化合物A。

化合物D的合成：将化合物C(1当量)溶于MeOH/H₂O(3:1)的混合溶剂中，0^oC冰浴下加入一水氢氧化锂(2当量)，搅拌2h后回复至室温，再反应4h后在室温下蒸干溶剂。残留物溶于DCM后，用10%KHSO₄水溶液调节pH至5~6，用饱和食盐水洗涤有机相后，萃取，MgSO₄干燥，过滤，蒸干后得到的三肽羧酸(1当量)与五氯酚（1.1当量）溶于干燥DCM中，置于-15^oC冰盐浴和N₂气保护下，加入EDC·HCl(1.2当量)，回复至室温后继续搅拌5h至反应完全，分离提纯步骤同化合物A。

大单体E的合成：将化合物D(1当量)溶于H₂O中，在5^oC下缓慢滴加HCl(50当量)的水溶液，搅拌4h至反应完全，在室温下蒸去溶剂即得大单体E。

聚合物P1的合成：大单体E（1当量）溶于DMSO中，加入DiEA（3当量）后在N₂保护下搅拌4天，在乙醚中沉析出后再通过硅胶柱提纯，得到目标聚合物P1，产率12%。

本发明改性胶原蛋白肽的温度敏感行为按如下方法进行测试：

1）将按实施例1所述方法改性后的胶原蛋白肽（38mg）于常温下溶于水（10mL）中，表观观察溶液为无色透明状，说明其有良好的水溶性，加热至40°C，观察溶液变混浊，说明在该温度下胶原蛋白肽脱水聚集，表观上表现出其温度敏感性。

2）采用具有温控装置的紫外/可见光谱仪对改性胶原蛋白肽水溶液(0.25wt%)的相变过程进行跟踪，温度范围设置为30~45°C，测试过程为先加热，后冷却，最终分别得到加热和冷却过程的浊度曲线，如图2所示，证明了聚合物的温敏行为过程。

实施例2

当结构式中X≠Et或Y≠2时，此类聚合物的合成方法参照实施例1。

按照上述方法合成了X=Et，Y=2时的聚合物P1经过核磁氢谱、GPC、紫外光谱的手段进行表征。

（1）¹HNMR（BrukerAV500500M核磁共振氢谱仪）

此聚合物在D₂O中的核磁氢谱如附图1所示。由图可知，¹HNMR(D₂O):δ=0.99-1.19(m,9H,CH₃),1.80-2.34(m,6H,CH₂),3.36-3.79(m,38H,CH+CH₂),4.08-4.47(m,9H,CH+CH₂),6.64-6.71(br,1H,NH)。证明得到了目标产物。

（2）GPC（WaterGPCe2695，美国Waters公司，Waters2414示差检测器）

此聚合物的GPC数据为:M_n=6.9×10⁴，M_w=1.4×10⁵，聚合度DP_n=158，多分散性PDI=2.0；表明采用此方法可以得到较高分子量多肽聚合物，证明了此方法的可行性。

（3）浊度测试（Lambda35紫外/可见分光光度计）

采用紫外光谱仪测试该胶原蛋白肽0.25wt%的水溶液在不同温度下的透光率，所得浊度测试曲线如附图2所示。由图可知，该胶原蛋白肽的相变过程迅速（<4°C），回复滞后小（<3°C），相变温度（LCST）为38.5°C。

Claims (1)

1.一类温敏型胶原蛋白多肽聚合物的制备方法，该多肽聚合物的结构式为

n=100~200，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将羟脯氨酸和N,N-二异丙基乙胺DiEA溶于水中,在惰性气氛和冰盐浴下，缓慢滴加脯氨酸活性酯的N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液；在室温下搅拌至反应完全；经分离提纯得无色油状的化合物A；其中羟脯氨酸、N,N-二异丙基乙胺DiEA、脯氨酸活性酯的摩尔比为：1:（1.2~1.5）:（1.1~1.2）；所述化合物A的结构式为：

；

b.将步骤a所得化合物A溶于干燥DMF中，然后在冰浴和惰性气氛下，加入NaH，室温下逐滴滴加核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的DMF溶液；滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌反应20～30小时，而后滴加甲醇终止反应；去除溶剂，残留物溶于二氯甲烷DCM中，经10wt%KHSO₄水溶液和饱和食盐水洗涤，经分离纯化得化合物B；其中化合物A、NaH（氢化钠）和核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的摩尔比为：1:（5~6）:（1.1~1.2）；所述的核心为苄氯的一代烷氧醚树枝化基元的结构式为：

所述的化合物B的结构式为：

c.将五氯酚和步骤b所得化合物B按(1.2~1.5)：1的摩尔比溶于干燥的DCM中，在冰盐浴和惰性气体保护下，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl，室温下继续搅拌至反应完全；反应液先后用饱和NaHCO₃和食盐水洗涤，经分离提纯后得到二肽活性酯；在冰盐浴和惰性气氛下，将该二肽活性酯用DCM溶解后滴加到溶有甘氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺DiEA的DCM溶液中，滴加完毕后再将反应液在室温下搅拌反应3～5小时，经分离提纯后得到化合物C；其中所述的EDC·HCl与化合物B的摩尔比为1:（1.2~1.5）；所述的二肽活性酯、甘氨酸甲酯盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺DiEA的摩尔比为：1:（1.1~1.2）：（1.2~1.5）；化合物C的结构式为：

d.将步骤c所得化合物C溶于MeOH和H₂O按3:1的体积比配成的混合溶剂中，冰水浴下加入一水氢氧化锂，搅拌1.5~3.0小时后升至室温，再反应3.5~5小时，去除溶剂，残留物溶于DCM后，调节pH至5~6，用饱和食盐水洗涤，经分离提纯后得到的三肽羧酸；其中化合物C与一水氢氧化锂的摩尔比为：1:（2~3）；三肽羧酸的结构式为：

；

d.再将步骤c所得三肽羧酸与五氯酚按1:（1.2~1.5）的摩尔比溶于干燥DCM中，冰盐浴惰性气体保护下，加入EDC·HCl，室温下继续搅拌至反应完全，去除溶剂，残留物溶于DCM后，调节pH至5~6，用饱和食盐水洗涤，分离提纯后得到化合物D；其中三肽羧酸与EDC·HCl的摩尔比为：1:（1.2~1.5）；其中，化合物D的结构式为：

e.将步骤d所得化合物D溶于H₂O中，在5^oC下缓慢滴加HCl的水溶液，搅拌至反应完全，去除溶剂即得大单体E；其中化合物D与HCl的摩尔比为：1:（50~60）；大单体E的结构式为：

f.将步骤e所得大单体E溶于二甲亚砜DMSO中，大单体E溶于二甲亚砜的质量体积比为：配制成浓度为0.1g：0.10~0.15mL，加入N,N-二异丙基乙胺DiEA，在惰性气氛下搅拌3~5天，其中大单体E与N,N-二异丙基乙胺DiEA的摩尔比为：1:（3~5）；用乙醚沉析出后再经分离纯化得到目标聚合物，即温敏型胶原蛋白多肽聚合物。