CN103608041A - 包含生物性抗原和丙烯酸聚合物的水性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有生物性抗原和丙烯酸聚合物的水性组合物，其中所述组合物包含电解质以提供比0.9%(w/v)氯化钠水溶液的摩尔渗透压浓度更高的摩尔渗透压浓度。本发明也涉及丙烯酸聚合物，其用在针对猪圆环病毒2(PCV2)和任选的猪肺炎支原体的单次注射疫苗中，以及用在水性组合物中，以用于在将所述组合物施用给受试动物时减轻由存在于所述水性组合物中的生物性抗原诱导的发热。

Description

包含生物性抗原和丙烯酸聚合物的水性组合物
本发明涉及包含生物性抗原和丙烯酸聚合物的水性组合物。本发明也涉及丙烯酸聚合物，其用在针对猪圆环病毒2 (PCV2)和猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)的单次注射疫苗中，以及用在水性组合物中，以用于在将所述组合物施用给受试动物时减轻由存在于所述水性组合物中的生物性抗原诱导的发热。
背景技术
从例如WO 2010/025469已知提供水性组合物(即基于水或另一种允许氢键形成的亲水液体的组合物)，其包含生物性抗原和丙烯酸聚合物(生物性抗原是源自活生物体(例如细菌、病毒、动物、原生生物、真菌等，通常是活的或杀死的微生物)的抗原，或源自活生物体的生物分子，优选蛋白或多糖；术语“源自”包括，所述生物分子本身或其前体由生物体产生)。在该现有技术参考文献中的丙烯酸聚合物被用作佐剂，即包括在组合物中的非特异性的免疫刺激剂，以有利于或放大免疫事件级联中的特定过程，最终导致更好的免疫应答。丙烯酸聚合物长期以来被视作安全的且适当的佐剂，其能够改善对不同类型抗原的免疫应答，所述抗原例如活的或杀死的微生物、这些生物体的亚单位或重组生产的亚单位，诸如蛋白、多糖和其它类型的分子。例如，US 3,178,350已经描述了丙烯酸聚合物作为佐剂的用途。这些佐剂可在商标Carbopol?下得到。
丙烯酸聚合物的显著性质是，它们显著地增加水性组合物的粘度，因为它们固有地在这样的组合物中提供连接的聚合物链。即聚合物链的酸残基可以通过氢键合而相互作用。尽管氢键的强度显著低于共价键，但聚合物链之间的这种相互作用可对水溶液的粘度具有显著影响。丙烯酸聚合物的这种固有性质(该性质几乎不依赖于聚合物链长度和侧链/基团的类型)被广泛地用于例如乳膏剂或洗剂中，其中将丙烯酸聚合物用作增稠剂。当连接的聚合物形成遍布于组合物的真实聚合物链网络(高于特定聚合物浓度，通常高于0.2-0.5% w/w)并且网络的间隙被连续相填充时，该组合物被称作凝胶。对于水性组合物(诸如护手膏、防晒霜)的表面施用而言，这是组合物的优选状态。对于含有生物性抗原的组合物(所述组合物通常通过注射来施用)而言，粘度的增加是重要的缺点。即使当组合物的粘度从约5-70 mPas (这对于包含抗原的水性组合物而言是典型的)升高至约200 mPas时，这在通过注射(手工地)将所述组合物施用给受试动物(在本说明书和所附权利要求书中，术语动物包括人类)时是非常显著的。通常总是避免组合物的胶凝：胶凝的组合物不能容易地注射。因此，在实践中，对于包含生物性抗原的组合物而言，通常应用0.1%至最大0.2% (重量/重量；w/w)的丙烯酸聚合物。实际上，在WO 2010/025469 (其涉及现有技术疫苗)中，应用0.1% w/w的丙烯酸聚合物。商购可得的包含丙烯酸聚合物的疫苗的例子是SuvaxynTM M.Hyo - Parasuis (可得自Pfizer Animal Health)，其含有0.2% (w/w) CarbopolTM 941。
在现有技术(US 3,920,811)中已经描述了向可注射组合物中加入生理上可接受的电解质(即在溶解或熔化时离子化以产生导电介质的化合物，诸如在US 3,920,811专利的第4栏第28-42行提及的电解质)，以便将所述组合物的粘度降低至可以在商业上以实用方式利用它们的程度，同时保留有利的佐剂性质。但是，如在US 3,920,811专利(第7栏，第3-6行)中明确指出的，电解质浓度可以高至这样的程度：其在佐剂溶液和生物抗原的混合物的最终可注射溶液中产生等渗性。具体地，实际的可注射组合物通常是约1/2等渗的。其原因是，普遍已知高渗溶液在注射后可造成组织损伤。即使当组合物仅仅是稍微高渗的且因而最终的损伤可能是可忽略的时候，注射的结果是，动物可能在注射部位处具有非常不适的感觉，这可能例如导致应激、瘙痒、刺痛等。因此，为了符合针对用于施用给动物的组合物普遍要求的安全性标准，每种商购可得的包含生物性抗原和丙烯酸聚合物的组合物至多与正常体液(例如血清)等渗，即具有0.9% (w/v)氯化钠水溶液的摩尔渗透压浓度(osmolarity)(约300 mOsm/l)。
发明内容
本发明的目的是，提供根据前言部分的新组合物，其具有更宽的适用性。
已经令人惊讶地发现，在包含丙烯酸聚合物的组合物中，提供高渗溶液的量的电解质的应用仍产生符合普遍接受的安全性标准的组合物。显然，尽管没有所述组合物即使在明显高渗时仍然安全的明确技术原因，但是丙烯酸聚合物的存在提供了这样的组合物：其中过量的电解质的存在没有诱发问题，即使在将所述组合物注射进动物组织中以后。不受限于理论，认为呈连接的聚合物链网络形式的聚合物的存在可以构成这样的组合物：其中发生过量的电解质的受控但是快速的稀释，而不损害周围组织。这实际上与US 3,920,811专利的教导相矛盾，所述教导自从该专利公布以来已经成为被普遍接受的教导。可以使用过量电解质的本发明发现的主要优点之一是，可以进一步降低包含丙烯酸聚合物的组合物的粘度，由此允许更容易地实际使用所述组合物。并且，本发明允许使用远远更大量的丙烯酸聚合物，甚至高于0.5% w/w，同时仍然保持非常低的粘度。这样的量的聚合物的应用，打开了通向生物抗原的(非常)缓释制剂的大门。鉴于在施用进动物组织中以后电解质从所述组合物快速稀释的明显特征，组合物的粘度将在施用后立即显著增加，并且甚至可能在施用部位处形成胶凝的组合物。与从水性(低粘)组合物的同样释放相比，生物性抗原固有地从这样的凝胶更慢地释放，这尤其(i.a.)取决于凝胶性质。一般而言，粘度越高，预期抗原的释放越慢。
特别地，已经发现，在包含生物性抗原的水性组合物中的丙烯酸聚合物可以用于减轻当将组合物施用给受试动物时由这些生物性抗原诱导的发热。尽管在注射后的前24小时内2℃的温度升高是普遍接受的且被视作安全的，但是低于1℃的温度升高通常是有利的。利用根据本发明的组合物，可以得到低于1℃或甚至低于0.5℃的温度升高。其原因仍然不清楚，但是可能与下述事实有关：高渗低粘溶液将在施用后几乎立即达到更高的粘度并因而变成大致缓释制剂。缓释可以产生强度较低，但是更持久的免疫应答。尽管也预期见到滴度的至少一些下降，但非常令人惊讶地发现，仍然可以得到高的滴度，即使在显著减轻发热时。这打开了得到更安全的疫苗的大门，所述疫苗基于通常诱导发热的抗原，例如含有脂多糖(LPS)的抗原，其存在于许多含有革兰氏阴性细菌的疫苗中，所述革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)、沙门氏菌属种(Salmonella spp)、志贺氏菌属种(Shigellaspp)和其它肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、螺杆菌属(Helicobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、乙酸细菌、军团菌属(Legionella)和α-变形菌(alpha-proteobacteria)如沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、蓝细菌、螺旋体、绿色硫细菌和绿色非硫细菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、嗜血菌属种(Haemophilus spp)诸如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
除了以上内容外，还已经发现，本发明可以有利地用在这样的组合物中：其含有猪圆环病毒2 (PCV2)抗原和任选的猪肺炎支原体抗原和胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗原，其用于提供疫苗，所述疫苗在单次施用后提供针对猪圆环病毒2和猪肺炎支原体和胞内劳森氏菌的感染的适当免疫应答。
应当指出，本发明也涉及可注射组合物(尤其是具有小于200 mPa.s、优选小于100 mPa.s的粘度的组合物)，其包含本文前述提及的水性组合物。
本发明的实施方案
在一个实施方案中，所述组合物的摩尔渗透压浓度比0.9% (w/v)氯化钠溶液的摩尔渗透压浓度高至少30% (即约400 mOsmol/l或更高)。已经发现，可以使用甚至如此高的摩尔渗透压浓度，而在施用部位没有不利的副作用。这极大地增强丙烯酸聚合物的使用中的自由。现在甚至可以使用显著超过常用的0.2%的量，同时保持适当的粘度。
在一个实施方案中，所述组合物的摩尔渗透压浓度比0.9% (w/v)氯化钠溶液的摩尔渗透压浓度高至少50% (即约450 mOsmol/l或更高)。已经发现，可以使用甚至如此高的摩尔渗透压浓度，而在施用部位没有不利的副作用。这极大地增强丙烯酸聚合物的使用中的自由。现在甚至可以使用显著超过常用的0.2%的量，同时保持适当的粘度。
在一个优选的实施方案中，所述组合物包含超过0.2% (w/w)的丙烯酸聚合物或甚至超过0.5% (w/w)的丙烯酸聚合物。由于这些量的丙烯酸聚合物，所述组合物可以呈粘稠凝胶的形式。通过将过量的电解质加入胶凝的组合物中，粘度可以下降至10-70 mPa.s之间的典型值。所述组合物因而可以使用标准的手持式注射器容易地施用，并且在注射以后，通过过量的电解质的稀释，将恢复至非常粘稠的凝胶。已经发现，这样的丙烯酸聚合物凝胶特别适合用于得到针对通常诱导发热的抗原的高抗体滴度，同时减轻引起的发热。包含0.8%至1.6% (w/w)之间的丙烯酸聚合物的组合物是特别优选的。在该实施方案中，过量的电解质优选提供的摩尔渗透压浓度通常超过正常组织液(0.9%氯化钠溶液)的摩尔渗透压浓度的2-3倍，因而超过约600-900 mOsmol/l。以此方式，施用之前的粘度可以保持足够低以允许注射。注射后，所述电解质将稀释，并且所述组合物将变成凝胶。
在一个实施方案中，所述丙烯酸聚合物是交联的聚合物，优选地使用聚烯基醚、多元醇和/或二乙烯基乙二醇作为交联剂。使聚合物交联使得组合物中的聚合物链的网络形成更少地依赖于例如温度和pH，仅仅因为网络形成的一部分固有地以共价交联的形式存在。
在另一个实施方案中，所述组合物包含含有多电荷阳离子(即具有比1+更高电荷的阳离子，通常2+或3+)的电解质。已经发现，当使用多电荷阳离子时，可以更有效地降低粘度，即使当摩尔渗透压浓度与使用单电荷(1+)阳离子相同时。在一个优选的实施方案中，所述阳离子以多至0.05M、优选多至约0.03M的浓度存在。可以使用的阳离子的量取决于丙烯酸聚合物溶液中的羧酸根基团的量。过多的阳离子将诱导沉淀。已经发现，当使用多达这些量的多电荷阳离子时，可以非常有效地降低粘度，同时在组合物施用后保留安全性。
在一个实施方案中，所述生物性抗原是这样的抗原：其在施用后诱导发热，即超过0.5℃，进一步特别是超过1.0℃，超过1.5℃或甚至超过2.0℃。在实践中，许多抗原在施用后诱导一些发热。可以诱导的最大发热经常由管理机构设定。为了符合这样的最大值，在某些情况下，必须将抗原量降低至亚最佳水平，由此接受得到非最佳的免疫应答。对于所预防的实际疾病(疫苗将提供针对该疾病的保护)，这是不利的情形。已经令人惊讶地发现，通过使用根据本发明的组合物，可以减轻由抗原诱导的发热，同时保留免疫应答。抗原的缓释可以不是该效应的唯一原因，因为可预见到，如果由于缓释而减轻发热，那么免疫应答的强度也将降低。但是，申请人发现，通过使用本发明，可以在维持适当免疫应答的同时减轻发热。
在一个实施方案中，所述抗原选自革兰氏阴性细菌抗原和圆环病毒抗原。在具体实施方案中，所述抗原选自胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)抗原、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)抗原和猪圆环病毒2 (PCV2)抗原。特别已知这些抗原在施用后诱导发热。通过使用本发明，可以显著减轻发热，同时将组合物的免疫学效能保持在适当的水平。
现在将使用下述实施例进一步例证本发明。
实施例1显示了丙烯酸聚合物对粘度的影响。
实施例2涉及根据本发明的组合物的物理性质和它的安全性。
实施例3描述了根据本发明的组合物的组成。
实施例4显示了根据本发明的组合物的疫苗接种实验。
实施例5显示了根据本发明的组合物的第二个疫苗接种实验。
实施例6显示了根据本发明的组合物的第三个疫苗接种实验。
实施例7描述了根据本发明的进一步的组合物和配制这些组合物的方法。
实施例1
已经使用交联的丙烯酸聚合物制备了不同的水性等渗制剂，以评估所述聚合物对组合物的粘度的影响。所述制剂不包含抗原(其通常将增加粘度)。并且，已经评估了加入过量的带双电荷的电解质的影响。
所有制剂包含交联的丙烯酸聚合物Carbopol 974P (可得自BFGoodrich Specialty Chemicals, Cleveland, Ohio)。将不同量的聚合物(0.1-1.6% w/w)溶解在0.9% w/v氯化钠溶液的水性溶液中。用Brookfield实验室粘度计测量制剂的粘度。结果如下：
表1：不同的等渗丙烯酸聚合物溶液的粘度
Figure 7275DEST_PATH_IMAGE001
。
应当指出，本发明的水性组合物可以用于制备含有油相的乳剂，通常实现油包水乳剂、水包油乳剂或水包油包水乳剂。这样的乳剂因而包含根据本发明的水性组合物。配制乳剂当然将影响粘度，通常导致显著增加。例如，当将油(例如10% w/v)在具有约3 mPas粘度的水溶液中乳化时，粘度可能增加至约25 mPa.s或甚至更高。
在下一个实验中，使用0.8% Carbopol制剂，评估了使用过量的电解质对粘度的影响。向该制剂中加入不同量的氯化钠和氯化钙，以显示对粘度的影响。结果显示在表2中。
表2：不同的丙烯酸聚合物溶液的粘度
样品编号 NaCl w/v CaCl2·2H2O w/v 粘度mPa.s 摩尔渗透压浓度mOsmol/l
1 0.45% 0.16% 748 190
2 0.9% 0.16% 221 340
3 1.5% 0.16% 71 530
4 2.5% 0.16% 12 850
可以理解，过量的电解质的加入显著降低含有丙烯酸聚合物的组合物的粘度。发现(参见实施例2)在注射后，该过量将从组合物稀释进周围组织中，由此增加组合物的粘度，以甚至变成凝胶。这样的凝胶将保留在注射部位，以等待它的组分的缓慢扩散和降解。
实施例2
本实施例涉及根据本发明的组合物的物理性质，尤其是在注射后它的凝胶形成及其分散的内容物的释放，以及在注射进动物组织中以后它的安全性。
在该实验中使用4只猪。每只猪通过肌肉内注射接受1 ml含有1.6% Carbopol 974P、2.5%氯化钠和0.48%氯化钙(具有925 mOsmol/l的近似摩尔渗透压浓度)的组合物。为了诊断目的，所述制剂另外包含0.075%的着色剂专利蓝。在注射制剂后2小时，将第1号猪安乐死，并立即打开肌肉组织以检查施用部位。看到含有胶状蓝色物质的清晰斑块。取一把匙，并且，可以取出作为凝胶的所述斑块。所述凝胶不流动。在施用相同组合物以后24小时，将第2号猪安乐死，并且也打开它的肌肉组织，以检查施用部位。可以发现在施用部位处的清晰无色凝胶斑块，这指示专利蓝向猪体内的扩散。在48小时后，将第3号猪安乐死，并在1周后，将第4号猪安乐死。从这些猪都没能分离出凝胶。蓝色完全消失。
这些结果指示，凝胶在注射后存在至多2天。小分子在1天内从凝胶扩散。预期在该具体制剂中，大分子(如蛋白质)的释放减慢至约2天。
还在不同的时间点，对局部反应(即正常组织中包含偏移的斑块)评分。结果，在下面表3中列出了具有偏移的斑块的大小。应当指出，在2小时以后的偏移主要限于胶状斑块自身。24小时后，看到稍微更大的组织体积(5 cm3)中的一些偏移，但是在安全的(可接受的)水平。1周后，剩余的具有偏移的斑块实质上消失。活猪没有表现出局部反应的任何征象(如应激、瘙痒、发红、刺痛等)。基于这些结果，可以得出结论，尽管所述组合物的摩尔渗透压浓度事实上是0.9%氯化钠溶液的摩尔渗透压浓度的约3倍，但是可以认为所述组合物是安全的。
表3：肌肉内注射以后的局部反应的大小
。
实施例3
制备了包含不同生物性抗原以及不同类型和量的丙烯酸聚合物的不同组合物。在每种情况下，丙烯酸聚合物的量是至少0.8% w/w，以确保注射后的高粘度。在表4中指出了每种组合物的一般组成。应当指出，指示的粘度是注射前的粘度。注射后，电解质将从制剂快速稀释，由此制剂将变得高度粘稠，且可作为稳定的凝胶保留在施用部位处。
表4：含有生物性抗原的组合物的一般组成
Figure 641836DEST_PATH_IMAGE003
。
总体上，制备2种类型的包含丙烯酸聚合物的制剂：含有0.8%丙烯酸聚合物的0.8型，和含有1.6%丙烯酸聚合物的1.6型。为了保持组合物的粘度足够低以能够用标准皮下注射器注射组合物，加入上文表4中指出的电解质。使用2种不同类型的交联的丙烯酸聚合物，即Carbopol 974P和Carbopol 971P (二者均可得自BFGoodrich)。使用源自细菌胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血菌(Haemophilis parasuis)、猪肺炎支原体和猪圆环病毒2 (PCV2)的不同类型的抗原。利用这些抗原，制备下述组合物：
1 Mhyo/PCV2组合物
第一种组合物(称作“A”)包含浓度为0.8%的丙烯酸聚合物Carbopol 974P。在该组合物中，包含灭活的猪肺炎支原体抗原(与在商购可得的疫苗Porcilis Mhyo中存在的相同的抗原，浓度也相同，所述Porcilis Mhyo可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, 荷兰)和PCV抗原(与在商购可得的疫苗Porcilis PCV中存在的相同的抗原，浓度也相同，所述Porcilis PCV可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer)。
第二种组合物(称作“B”)包含浓度为0.8%的丙烯酸聚合物Carbopol 971P。在该组合物中，包含灭活的猪肺炎支原体抗原(与在商购可得的疫苗Porcilis Mhyo中存在的相同的抗原，浓度也相同，所述Porcilis Mhyo可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer)和PCV抗原(与在商购可得的疫苗Porcilis PCV中存在的相同的抗原，浓度也相同，所述Porcilis PCV可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer)。
作为第一种参照组合物，制备了称作“C”的组合物，其包含相同浓度的相同抗原，但是配制在佐剂乳剂Emunade中，所述Emunade用在商购可得的疫苗M+Pac中，所述M+Pac可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Summit, NJ, USA。制备了仅由PBS溶液组成的严格对照制剂“D”。
2 APP组合物
第一种组合物(称作“E”)包含浓度为0.8%的丙烯酸聚合物Carbopol 974P。该组合物包含相同量的与在商购可得的疫苗Porcilis APP中存在的相同的猪肺炎放线杆菌(Actinobacillus hyopneumoniae)抗原(即APXI、APX II、APXIII和OMP)，所述Porcilis APP可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer，荷兰。
作为参照组合物，使用商购可得的疫苗Porcilis APP (称作“F”)。
3 副猪嗜血菌组合物
第一种组合物(称作“G”)包含浓度为0.8%的丙烯酸聚合物Carbopol 974P。该组合物包含相同量的与在商购可得的疫苗Porcilis Gl?sser中存在的相同的副猪嗜血菌抗原(即灭活的副猪嗜血菌细菌的细胞)，所述Porcilis Gl?sser可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer，荷兰。
作为参照组合物，使用商购可得的疫苗Porcilis Gl?sser (称作“H”)。
如下制备组合物A、B、E和G：首先制备电解质在约70%的所需量的水中的溶液。此后，加入丙烯酸聚合物，并混合，直到聚合物完全水合。然后，使用滴加的4M NaOH溶液，将溶液的pH设定为7.2。将该产物在121℃高压灭菌20分钟。然后，将产物在搅拌下冷却至大约20℃，此后检查pH，并且在必要的情况下进行调节。然后，在搅拌下加入抗原，此后再次检查pH，并且在必要的情况下进行调节。加入余量的水。将产物搅拌过夜，然后填充容器，并在填充后，在氮气气氛下在2-8℃储存。
实施例4
在疫苗接种实验中，使用4组各10只的小猪。在3周龄时，肌肉内施用2 ml剂量的组合物A、B、C和D。在即将疫苗接种之前(t=0小时)和在疫苗接种后4小时(预期的最大温度升高)，测量直肠温度。
得到下述结果。在任何组中都没有观察到疾病的临床征象，这表明，所有组合物都可以视作安全的。测量的平均温度显示在表5中。
表5：单次施用Mhyp/PCV疫苗以后的平均温度
Figure 37045DEST_PATH_IMAGE004
。
可以看出，使用的抗原可以导致接种疫苗的动物的显著温度升高(参见使用组合物C的结果)。但是，当根据本发明配制时，温度升高可以更低，并且甚至完全被抑制。
相继于温度升高，在施用组合物以后6周，测量了针对抗原的抗体滴度。结果显示在表6中。
表6：在单次施用Mhyp/PCV疫苗以后6周时的平均滴度
。
注意到，组合物C是赋予针对Mhyo的保护的疫苗，因为Mhyo-部分(Mhyo-part)与商购可得的单次注射疫苗M+Pac相同。因而预期，组合物A和B也赋予针对致病性的猪肺炎支原体的保护。就PCV2而言，已知的是，在施用后约6周滴度高于9时，商购可得的疫苗Porcilis PCV产生保护作用(具体参见EP 2 291 195，实施例3的结果)。
实施例5
使用20只51/2 - 6周龄的猪。将它们随机分配成2个治疗组，每组各10只猪。所述猪分别在6和10周龄时接受组合物E和F。观察动物在两次疫苗接种以后的全身反应(尤其是直肠温度和临床征象)和局部反应。在6、10、13和23周龄，采取血样用于确定针对疫苗的血清学应答。在23周龄，针对注射部位的局部反应对动物进行死后研究。
关于后者，在屠宰时，在注射部位处未看到不可接受的局部反应。确定在施用组合物以后4、6和8小时，平均温度升高。结果显示在表7中。
表7：施用APP疫苗以后的平均温度升高
Figure 860830DEST_PATH_IMAGE006
。
可以看出，使用的抗原可造成接种疫苗的动物的显著温度升高(参见组合物F的强化结果)。但是，当根据本发明配制时，温度升高可以更低，并且甚至完全被抑制(具体参见强化疫苗接种以后t = 8小时的结果)。
相继于温度升高，在施用组合物以后13周，测量了针对抗原的抗体滴度。结果显示在表8中。
表8：施用APP疫苗以后13周时的平均滴度
Figure 65547DEST_PATH_IMAGE007
。
鉴于根据本发明的组合物(组合物E)甚至诱导比商购可得的且通常认为有效的疫苗Porcilis APP (组合物F)更高的滴度的事实，表明该新组合物是保护动物对抗致病性胸膜肺炎放线杆菌细菌的感染的有效的疫苗。
实施例6
在疫苗接种实验中，使用了6只小猪的两个组。在1周龄(激发)和4周龄(强化)时，肌肉内施用2 ml剂量的组合物G和H。在即将疫苗接种之前(t=0小时)和在疫苗接种后6小时(预期的最大温度升高)，测量直肠温度。
在任何组中都没有观察到疾病的临床征象，这表明，所有组合物都可以视作安全的。平均温度升高(t=6小时相对于t=0小时)显示在表9中。
表9：施用副猪嗜血菌疫苗以后的平均温度升高
Figure 264447DEST_PATH_IMAGE008
。
可以看出，使用的抗原可造成接种疫苗的动物的显著温度升高(具体参见使用组合物H的强化结果)。但是，当根据本发明配制时，温度升高可以显著更低。
相继于温度升高，在施用组合物以后6周，测量了针对抗原的抗体滴度。结果显示在表10中。
表10：施用副猪嗜血菌疫苗以后6周时的平均滴度
Figure 933325DEST_PATH_IMAGE009
。
鉴于根据本发明的组合物(组合物G)诱导与商购可得的且通常认为有效的疫苗Porcilis Gl?sser (组合物H)相同的滴度的事实，表明该新组合物是保护动物对抗致病性副猪嗜血菌细菌的感染的有效的疫苗。
实施例7
本实施例描述了根据本发明的进一步的组合物和配制这些组合物的方法。这些组合物显示在表11中。该表指示了每1000ml组合物的单位。
关于提及的抗原，Mhyo抗原是与在商购可得的疫苗Porcilis Mhyo (其可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, 荷兰)中存在的相同的抗原，具有相同的每剂浓度(1 U/剂)。PCV抗原是与在商购可得的疫苗Porcilis PCV (其可得自Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer)中存在的相同的抗原，具有相同的每剂浓度(5E3 U/剂)。劳森氏菌抗原是许多杀死的完整细胞。得到的疫苗被用作单次注射疫苗(1 ml/剂)，以保护猪对抗2型猪圆环病毒、猪肺炎支原体和胞内劳森氏菌的感染。所述疫苗适合用在3天龄和更大的猪中。认为没有发生位点反应，尤其是对于制剂A、B和C而言。
表11：包含PCV、Mhyo和劳森氏菌抗原的组合物
。
用于构成如表11中提及的制剂A-D的适合操作如下：
1. 将注射用水(WFI)加入到容器中。
2. 制备氯化钠和氯化钙的溶液。
3. 加入carbopol。混合内容物，直到得到均匀混悬液。
4. 用氢氧化钠小片将溶液的pH调至约7 (6.9-7.1)，并且在必要的情况下，用盐酸(4M)重调。
5. 将产物在121℃高压灭菌20 min。
6. 将产物冷却至20℃ (15-25)。
7. 检查pH，并且在必要的情况下进行调节。
8. 在搅拌下加入抗原。
9. 检查pH，并且在必要的情况下进行调节。
10. 加入余量的注射用水。
11. 在2-8℃储存产物。

Claims (19)

1.一种包含生物性抗原和丙烯酸聚合物的水性组合物，其特征在于，所述组合物包含电解质，以提供比0.9% (w/v)氯化钠水溶液的摩尔渗透压浓度更高的摩尔渗透压浓度。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的摩尔渗透压浓度比0.9% (w/v)氯化钠溶液的摩尔渗透压浓度高至少30%。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物的摩尔渗透压浓度比0.9% (w/v)氯化钠溶液的摩尔渗透压浓度高至少50%。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含超过0.2% (w/w)的丙烯酸聚合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含超过0.5% (w/w)的丙烯酸聚合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含0.8%至1.6% (w/w)之间的丙烯酸聚合物。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述丙烯酸聚合物是交联的聚合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述丙烯酸聚合物是使用聚烯基醚、多元醇和/或二乙烯基乙二醇交联的。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含含有多电荷阳离子的电解质。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，阳离子以多至0.05M，优选多至0.03M的浓度存在。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述生物性抗原是在施用后诱导发热的抗原。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述抗原选自革兰氏阴性细菌抗原和圆环病毒抗原。
13.根据权利要求910所述的组合物，其特征在于，所述抗原选自胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)抗原、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)抗原和猪圆环病毒2抗原。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，其含有猪圆环病毒2抗原、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原和任选的胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗原，其用作疫苗，所述疫苗在单次施用后提供针对猪圆环病毒2和任选的猪肺炎支原体和胞内劳森氏菌的感染的适当免疫应答。
15.一种可注射组合物，其包含根据前述权利要求中的任一项所述的水性组合物。
16.用于水性组合物中的丙烯酸聚合物，其用于减轻在将所述组合物施用给受试动物时由存在于所述水性组合物中的生物性抗原诱导的发热。
17.根据权利要求16所述的丙烯酸聚合物，其特征在于，所述组合物包含超过0.2% (w/w)，优选超过0.5% (w/w)的丙烯酸聚合物。
18.根据权利要求16或17中的任一项所述的丙烯酸聚合物，其特征在于，所述水溶液是高渗的。
19.丙烯酸聚合物用于制备包含所述聚合物的水性组合物的用途，其用于减轻由存在于所述水性组合物中的生物性抗原在受试动物中诱导的发热。
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