KR101877096B1 - 생물학적 항원 및 아크릴산 중합체를 포함하는 수성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 항원 및 아크릴산 중합체를 함유하며, 0.9% (w/v) 수중 염화나트륨 용액의 오스몰농도보다 더 높은 오스몰농도를 제공하도록 전해질을 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돼지 시르코 바이러스 2 (PCV2) 및 임의로 미코플라스마 효뉴모니아에에 대한 원샷 백신에서 사용하기 위한, 그리고 수성 조성물이 대상 동물에게 투여되는 경우 수성 조성물에 존재하는 생물학적 항원에 의해 유도되는 발열을 감소시키기 위하여 수성 조성물에서 사용하기 위한 아크릴산 중합체에 관한 것이다.

Description

생물학적 항원 및 아크릴산 중합체를 포함하는 수성 조성물 {AN AQUEOUS COMPOSITION COMPRISING A BIOLOGICAL ANTIGEN AND AN ACRYLIC ACID POLYMER}

본 발명은 생물학적 항원 및 아크릴산 중합체를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돼지 시르코(circo) 바이러스 2 (PCV2) 및 미코플라스마 효뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae)에 대한 원샷(one shot) 백신에서 사용하기 위한, 그리고 수성 조성물이 대상 동물에게 투여되는 경우 수성 조성물 중에 존재하는 생물학적 항원에 의해 유도되는 발열을 감소시키기 위하여 수성 조성물에서 사용하기 위한 아크릴산 중합체에 관한 것이다.

예를 들면 WO 2010/025469호에, 생물학적 항원 및 아크릴산 중합체 (생물학적 항원은, 예를 들면 박테리아, 바이러스, 동물, 원생생물, 진균 등과 같은 살아있는 생물체, 통상적으로 살아있거나 사멸된 미생물, 또는 생물학적 분자, 바람직하게는 살아있는 생물체로부터 유래하는 ("~로부터 유래하는"이라는 용어는 생물학적 분자 자체 또는 그의 전구체가 생물체에 의해 생성되는 것을 포함함) 단백질 또는 다당류로부터 유래하는 항원임)를 포함하는 수성 조성물 (즉 수소 결합의 형성을 가능케 하는 물 또는 또 다른 친수성 액체를 기재로 하는 조성물)을 제공하는 것에 대해 공지되어 있다. 이 선행 기술 참고문헌에서의 아크릴산 중합체는 아주반트, 즉 면역학적 사건의 연속단계에서 특정 과정을 촉진하거나 증폭함으로써 궁극적으로 더 우수한 면역학적 반응을 이끌어 내기 위하여 조성물에 포함되는 비-특이적 면역자극제로서 사용된다. 아크릴산 중합체는 오래전부터 살아있거나 사멸된 미생물, 이러한 생물체의 하위단위, 또는 재조합으로 제조된 하위단위, 예컨대 단백질, 다당류 및 기타 유형의 분자와 같은 다양한 유형의 항원들에 대한 면역학적 반응을 향상시킬 수 있는 안전하고 적절한 아주반트로 인식되어 왔다. 예를 들면, US 3,178,350호가 이미 아주반트로서의 아크릴산 중합체의 용도에 대해 기술하고 있다. 이러한 아주반트는 카르보폴(Carbopol)™이라는 상표로 구입가능하다.

아크릴산 중합체의 주목할만한 특성은 그것이 본질적으로 해당 조성물 중에 연결된 중합체 사슬을 제공하기 때문에, 수성 조성물의 점도를 상당히 증가시킨다는 것이다. 다시 말하자면, 중합체 사슬의 산 잔기가 수소-결합에 의해 상호작용할 수 있다. 수소 결합이 공유 결합에 비해 상당히 덜 강하기는 하지만, 중합체 사슬들 사이의 이와 같은 상호작용은 수용액의 점도에 상당한 영향을 줄 수 있다. 중합체 사슬 길이 및 측쇄/기의 유형에 거의 관계가 없는 아크릴산 중합체의 이와 같은 고유 특성은, 예를 들면 아크릴산 중합체가 증점제로서 사용되는 크림 또는 로션에서 광범위하게 사용되고 있다. 연결된 중합체들이 조성물 전체에 걸쳐 (특정 중합체 농도 초과, 통상적으로는 0.2 내지 0.5% w/w 초과에서) 중합체 사슬의 진성 네트워크를 형성하고 네트워크의 간극이 연속 상으로 채워지는 경우, 조성물은 겔로 지칭된다. 수성 조성물의 국소 적용 (예컨대 핸드 크림, 선탠 로션)에 있어서, 이는 조성물의 바람직한 상태이다. 생물학적 항원을 함유하며 통상적으로 주사에 의해 투여되는 조성물의 경우, 점도의 증가는 중요한 단점이다. 조성물의 점도가 약 5-70 mPas (항원을 포함하는 수성 조성물에서 통상적임)로부터 약 200 mPas로 상승하는 경우라 할지라도, 주사 (수동)에 의해 대상 동물 (본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 동물이라는 용어에는 인간이 포함됨)에게 조성물을 적용할 때에는 그것이 매우 중요할 수 있다. 조성물의 겔화는 보통 어떠한 시점에도 회피되는데: 겔화된 조성물은 용이하게 주사될 수 없기 때문이다. 따라서, 실제 생물학적 항원을 포함하는 조성물의 경우, 통상적으로 0.1 내지 최대 0.2% (중량 대비 중량; w/w)의 아크릴산 중합체가 적용된다. 사실상 현행 기술 백신에 관한 것인 WO 2010/025469호에서는, 0.1% w/w의 아크릴산 중합체가 적용된다. 아크릴산 중합체를 포함하는 시중에서 구입가능한 백신의 예는 0.2% (w/w)의 카르보폴™ 941을 함유하는 수박신(Suvaxyn)™ M.Hyo-파라수이스(Parasuis) (화이자 애니멀 헬스(Pfizer Animal Health) 사로부터 구입가능)이다.

당업계에서 (US 3,920,811호), 실제적인 방식으로 상업적으로 이용될 수 있음과 동시에 바람직한 아주반트 특성을 유지할 수 있을 정도까지 조성물의 점도를 낮추기 위하여, 주사가능한 조성물에 생리학적으로 허용가능한 전해질 (즉 용해 또는 용융되었을 때 이온화하여 전기 전도성인 매질을 생성하는 화합물, 예컨대 '811 특허의 컬럼 4, 28-42 줄에 언급되어 있는 전해질들)을 첨가하는 것에 대해 기술된 바가 있다. 그러나, '811 특허에 분명히 나타나 있는 바와 같이 (컬럼 7, 3-6 줄), 전해질 농도는 아주반트 용액과 생물학적 항원의 혼합물의 최종 주사가능 용액에서 등장성을 생성시킬만큼 높을 수 있다. 사실, 실제 주사가능한 조성물은 통상적으로 약 2분의 1 등장성이다. 그 이유는 일반적으로 고장성 용액이 주사시 조직 손상을 제공할 수 있다고 알려져 있기 때문이다. 조성물이 약간만 고장성이어서 궁극적인 손상이 무시할 수 있을만한 경우라 할지라도, 주사의 결과는 동물이 주사 부위에 매우 불편한 느낌을 가질 수 있으며, 그것이 예를 들면 스트레스, 가려움, 따가움(biting) 등으로 이어질 수 있다는 것이다. 따라서, 동물 투여용 조성물에 대하여 일반적으로 요구되는 안전성 표준에 부합하기 위하여, 생물학적 항원 및 아크릴산 중합체를 포함하는 시중에서 구입가능한 각 조성물은 정상적인 체액 (예컨대 혈청)과 등장성 이하이며, 즉 0.9% (w/v) 수중 염화나트륨 용액의 오스몰농도 (약 300 mOsm/l)를 가진다.

본 발명의 개요

본 발명의 목적은 더 광범위한 적용성을 가진다는 명제에 따르는 새로운 조성물을 제공하는 것이다.

놀랍게도, 아크릴산 중합체를 포함하는 조성물에서, 고장성 용액을 제공하는 양의 전해질 사용은 여전히 일반적으로 허용되는 안전성 표준에 부합하는 조성물로 이어진다는 것이 발견되었다. 분명히, 상당히 고장성인 경우에도 조성물이 안전하다는 확실한 기술적 이유는 없지만, 아크릴산 중합체의 존재는 동물 조직에서의 조성물의 주사시에도 과량의 전해질의 존재가 문제를 일으키지 않는 조성물을 제공한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 연결된 중합체 사슬의 네트워크 형태인 중합체의 존재가 주변 조직을 손상시키지 않으면서도 과량의 전해질의 조절되지만 빠른 희석이 이루어지는 조성물을 구성할 수 있는 것으로 여겨진다. 이는 사실상 특허가 공개된 이후 지금까지 통상적으로 승인된 교시였던 '811 특허의 교시를 부정하는 것이다. 과량의 전해질이 사용될 수 있다는 이와 같은 발견의 한 가지 주요 장점은 아크릴산 중합체를 포함하는 조성물의 점도가 추가적으로 감소됨으로써 조성물의 더 용이한 실제 이용을 가능케 할 수 있다는 것이다. 또한, 본 발명은 여전히 매우 낮은 점도를 유지하면서도, 심지어는 0.5% w/w를 초과하는 훨씬 더 많은 양의 아크릴산 중합체의 사용을 가능케 한다. 그와 같은 양의 중합체의 사용은 생물학적 항원용 (초)저속-방출 제제로의 관문을 개방한다. 동물 조직에의 투여시 전해질이 조성물로부터 빠르게 희석된다는 뚜렷한 특징으로 인하여, 조성물의 점도는 투여 후 바로 상당히 증가하게 됨으로써, 심지어는 투여 부위에서 겔화된 조성물을 형성할 수도 있다. 본질적으로, 그와 같은 겔로부터는, 그대로의 수성 (저점도) 조성물로부터의 방출과 비교하였을 때, 겔 특성으로 인하여 생물학적 항원이 더 느리게 방출되게 된다. 일반적으로, 점도가 더 높을수록, 더 느린 항원의 방출이 예상될 수 있다.

특히, 생물학적 항원을 포함하는 수성 조성물 중 아크릴산 중합체는, 조성물이 대상 동물에게 투여되었을 때 해당 생물학적 항원에 의해 유도되는 발열을 감소시키는 데에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 주사 후 처음 24시간 이내의 2℃의 온도 상승이면 일반적으로 허용되어 안전한 것으로 간주되고 있기는 하지만, 1℃ 미만의 온도 상승이 일반적으로는 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물에서는, 1℃ 미만, 또는 심지어는 0.5℃ 미만의 온도 상승이 수득될 수 있다. 그 이유는 아직 불분명하지만, 고장성의 저점도 용액이 거의 투여 직후에 더 높은 점도에 도달함으로써, 어느 정도 저속-방출인 제제로 전환되게 된다는 사실과 연계될 수 있다. 저속 방출은 덜 강렬하지만 더 연장되는 면역학적 반응으로 이어질 수 있다. 일부는 적어도 약간의 역가 감소 역시 관찰될 것으로 예상하기도 하였지만, 매우 놀랍게도, 발열이 상당히 감소된 경우에도 여전히 높은 역가가 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 이는 예를 들면 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이), 살모넬라(Salmonella) 속, 시겔라(Shigella) 속 및 기타 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도모나스(Pseudomonas), 모락셀라(Moraxella), 헬리코박터(Helicobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 초산균, 레지오넬라(Legionella) 및 알파-프로테오박테리아, 예컨대 월바키아(Wolbachia), 시아노박테리아, 스피로헤타, 녹색 유황 및 녹색 비-유황 박테리아, 네이세리아 고노로에아에( Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 해모필루스(Haemophilus) 속, 예컨대 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 및 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii)와 같은 그람-음성 박테리아를 함유하는 많은 백신에 존재하는 바와 같은 지질다당류 (LPS) 함유 항원과 같이 통상적으로 발열을 유도하는 항원을 기재로 하는 더 안전한 백신을 수득하기 위한 관문을 개방한다.

상기 이외에, 돼지 시르코 바이러스 2 (PCV2) 항원, 및 임의로 미코플라스마 효뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) 항원 및 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 항원을 함유하는 조성물에서 1회의 단일 투여 후 돼지 시르코 바이러스 2, 및 미코플라스마 효뉴모니아에 및 라우소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염에 대하여 적절한 면역 반응을 제공하는 백신을 제공하는 데에 본 발명이 유리하게 사용될 수 있다는 것도 발견되었다.

본 발명은 상기에서 언급된 수성 조성물을 포함하는 주사가능한 조성물 (특히 200 mPa.s 미만, 바람직하게는 100 mPa.s 미만의 점도를 가지는 조성물)에 관한 것이기도 하다는 것에 주목한다.

본 발명의 실시양태

한 실시양태에서, 조성물의 오스몰농도는 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액의 오스몰농도보다 30% 이상 더 높다 (즉 약 400 mOsmol/l 이상). 이만큼 높은 오스몰농도도 투여 부위에서의 부정적인 부작용 없이 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 이는 아크릴산 중합체의 사용에 있어서의 자유를 크게 향상시킨다. 이제는, 해당 점도를 유지하면서도 통상적으로 적용될 때의 0.2%를 상당히 초과하는 양도 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물의 오스몰농도는 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액의 오스몰농도보다 50% 이상 더 높다 (즉 약 450 mOsmol/l 이상). 이만큼 높은 오스몰농도도 투여 부위에서의 부정적인 부작용 없이 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 이는 아크릴산 중합체의 사용에 있어서의 자유를 크게 향상시킨다. 이제는, 해당 점도를 유지하면서도 통상적으로 적용될 때의 0.2%를 상당히 초과하는 양도 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 조성물은 0.2% (w/w) 초과의 아크릴산 중합체, 또는 심지어는 0.5% (w/w) 초과의 아크릴산 중합체를 포함한다. 이러한 아크릴산 중합체의 양으로 인하여, 조성물은 점성의 겔 형태일 수 있다. 겔화된 조성물에 과량의 전해질을 첨가하는 것에 의해, 점성은 10-70 mPa.s 사이의 통상적인 값으로 감소될 수 있다. 이에 따라, 조성물은 표준 수동 주사기를 사용하여 적용하기가 용이하게 되며, 주사 후에는 과량의 전해질의 희석에 의해 매우 점성인 겔로 복귀하게 된다. 그와 같은 아크릴산 중합체 겔은 생성되는 발열을 감소시키면서도, 통상적으로 발열을 유도하는 항원에 대한 높은 항체 역가를 수득하는 데에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 0.8% 내지 1.6% (w/w)의 아크릴산 중합체를 포함하는 조성물이 특히 바람직하다. 이와 같은 실시양태에서, 과량의 전해질은 바람직하게는 통상적으로 정상 조직액의 오스몰농도 (0.9% 염화나트륨 용액)를 2-3배 초과함으로써 약 600-900 mOsmol/l를 초과하는 오스몰농도를 제공한다. 이와 같은 방식으로, 투여 전의 점도는 주사를 가능케 하기에 충분하게 낮게 유지될 수 있다. 주사 후에는, 전해질이 희석되게 되며, 조성물이 겔로 전환되게 된다.

한 실시양태에서, 아크릴산 중합체는 바람직하게는 가교-결합제로서 폴리알케닐에테르, 폴리알콜 및/또는 디비닐글리콜을 사용하여 가교 결합된 중합체이다. 중합체를 가교-결합시키는 것은 조성물에서의 중합체 사슬의 네트워크 형성을, 예컨대 온도 및 pH에 덜 의존하게 만드는데, 단지 네트워크 형성의 일부분이 본질적으로 공유 가교-결합의 형태로 존재하기 때문이다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 다중하전된 양이온 (즉 1+보다 더 높은 전하, 통상적으로는 2+ 또는 3+를 가지는 양이온)을 포함하는 전해질을 포함한다. 다중하전된 양이온을 사용하는 경우, 단일하전된 (1+) 양이온을 사용하는 경우와 오스몰농도가 동일한 경우에도 점도가 더 효과적으로 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 실시양태에서, 양이온은 0.05 M 이하, 바람직하게는 약 0.03 M 이하의 농도로 존재한다. 사용될 수 있는 양이온의 양은 아크릴산 중합체 용액 중 카르복실레이트 기의 양에 따라 달라진다. 너무 많은 양이온은 침전을 유도하게 된다. 이러한 양 이하의 다중하전 양이온을 사용하는 경우, 조성물의 투여시 안전성은 유지하면서도 점도가 매우 효과적으로 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

한 실시양태에서, 생물학적 항원은 투여시 0.5℃ 초과, 또한 특히 1.0℃ 초과, 1.5℃ 초과, 또는 심지어는 2.0℃ 초과의 발열을 유도하는 항원이다. 실제로, 많은 항원들이 투여시 약간의 발열을 유도한다. 유도될 수 있는 최대 발열은 종종 규제 당국에 의해 설정된다. 그와 같은 최대치에 부합하기 위하여, 일부 경우에서는 최적 농도 이하로 항원의 양을 낮춤으로써 비-최적 면역학적 반응이 수득되는 것을 허용할 필요가 있다. 백신이 보호를 제공해야 하는 실제 질환을 예방함에 있어서, 이는 불리한 상황이다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 조성물을 사용함으로써, 면역학적 반응은 유지하면서도 항원에 의해 유도되는 발열이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 항원의 저속-방출은 이와 같은 효과의 유일한 이유는 될 수 없는데, 저속 방출로 인하여 발열이 감소되는 경우에는 면역학적 반응 역시 덜 강하게 되는 것으로 예상될 것이기 때문이다. 그러나, 본 출원인은 본 발명을 사용함으로써, 적절한 면역학적 반응을 유지하면서도 발열이 감소될 수 있다는 것을 발견하였다.

한 실시양태에서, 항원은 그람-음성 박테리아 항원 및 시르코 바이러스 항원으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 실시양태에서, 항원은 악티노바실루스 플류로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae) 항원, 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis) 항원 및 돼지 시르코 바이러스 2 (PCV2) 항원으로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 항원은 특히 투여시 발열을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명을 사용함으로써, 적절한 수준에서 조성물의 면역학적 효능을 유지하면서도 발열이 상당히 감소될 수 있다.

지금부터, 하기의 실시예를 사용하여 본 발명이 추가 설명될 것이다.

실시예 1은 점도에 대한 아크릴산 중합체의 효과를 나타내며,

실시예 2는 본 발명에 따른 조성물의 물리적 특성, 및 그의 안전성에 관한 것이고,

실시예 3은 본 발명에 따른 조성물의 구성에 대해 기술하며,

실시예 4는 본 발명에 따른 조성물을 사용한 백신접종 실험을 나타내고,

실시예 5는 본 발명에 따른 조성물을 사용한 제2의 백신접종 실험을 나타내며,

실시예 6은 본 발명에 따른 조성물을 사용한 제3의 백신접종 실험을 나타내고,

실시예 7은 본 발명에 따른 다른 조성물, 및 해당 조성물의 제제화 방법에 대해 기술한다.

실시예 1

조성물의 점도에 대한 중합체의 효과를 평가하기 위하여, 가교-결합된 아크릴산 중합체를 사용하여 다양한 수성의 등장성 제제들을 제조하였다. 제제들은 항원 (통상적으로 점도를 증가시키게 됨)은 포함하지 않는다. 또한, 과량의 이중으로 하전된 전해질 첨가의 효과를 평가하였다.

모든 제제는 가교-결합된 아크릴산 중합체 카르보폴 974P (오하이오 클리블랜드 소재 BF굿리치 스페셜티 케미칼즈(BFGoodrich Specialty Chemicals) 사로부터 구입가능)를 포함하였다. 다양한 양의 중합체 (0.1 내지 1.6% w/w)를 0.9% w/v 염화나트륨 용액의 수용액에 용해시켰다. 브룩필드(Brookfield) 실험실용 점도계를 사용하여 제제들의 점도를 측정하였다. 결과는 하기와 같다:

본 발명의 수성 조성물이 통상적으로 유-중-수 에멀젼, 수-중-유 에멀젼 또는 수-중-유-중-수 에멀젼으로 이어지는 오일-상과의 에멀젼을 제조하는 데에 사용될 수 있음에 주목한다. 따라서, 그와 같은 에멀젼은 본 발명에 따른 수성 조성물을 포함한다. 물론, 에멀젼의 제제화는 점도에 영향을 주게 되는데, 보통 상당한 증가로 이어진다. 예를 들면, 오일 (예컨대 10% w/v)이 약 3 mPas의 점도를 가지는 수용액 중에서 에멀젼화될 경우, 점도는 약 25 mPa.s 또는 더 초과로 증가할 수 있다.

다음 실험에서는, 0.8%의 카르보폴 제제를 사용하여, 과량의 전해질을 사용하는 것에 의한 점도상의 효과를 평가하였다. 점도에 대한 효과를 보여주기 위하여, 이와 같은 제제에, 다양한 양의 염화나트륨 및 염화칼슘를 첨가하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

이해될 수 있는 바와 같이, 과량의 전해질의 첨가는 아크릴산 중합체 함유 조성물의 점도를 상당히 감소시킨다. 주사시, 이와 같은 과량은 조성물로부터 주변 조직으로 희석됨으로써 조성물의 점도를 심지어는 겔이 되도록 증가시키게 된다는 것이 발견되었다 (실시예 2 참조). 그와 같은 겔은 주사 부위에 남아 그 성분의 저속 확산 및 분해를 기다리게 된다.

실시예 2

본 실시예는 본 발명에 따른 조성물의 물리적 특성, 특히 그의 주사 후 겔-형성 및 그의 분산된 내용물의 방출, 그리고 동물 조직에의 주사시 그의 안전성에 대한 것이다.

본 실험에서는, 4 마리의 돼지를 사용하였다. 각 돼지는 근육내 주사에 의해 1.6%의 카르보폴 974P, 2.5%의 염화나트륨 및 0.48%의 염화칼슘 (925 mOsmol/l의 대략적인 오스몰농도를 가짐)를 함유하는 조성물 1 ml를 투여받았다. 진단 목적으로, 제제는 0.075%의 착색제 페이턴트 블루(patent blue)를 추가 포함하였다. 제제의 주사 2시간 후 돼지 번호 1을 안락사시키고, 즉시 근육 조직을 개방하여 투여 부위를 조사하였다. 젤리 블루(jelly blue) 물질을 함유하는 투명한 점이 눈에 보였다. 한 스푼을 채취하고, 상기 점을 겔로서 제거할 수 있었다. 겔은 유동하지 않았다. 동일한 조성물 투여 24시간 후 돼지 번호 2를 안락사시키고, 역시 그의 근육 조직을 개방하여 투여 부위를 조사하였다. 투여 부위에는 투명한 무색의 겔이 점을 형성할 수 있었는데, 이는 돼지 신체로의 페이턴트 블루의 확산의 표시이다. 돼지 번호 3은 48시간 후에, 돼지 번호 4는 1주 후에 안락사시켰다. 이들 돼지로부터는 겔을 분리할 수 없었다. 청색의 색상은 완전히 사라졌다.

이러한 결과는 주사 후 2일까지 겔이 존재한다는 것을 나타낸다. 소형 분자는 1일 이내에 겔로부터 확산된다. 이와 같은 특별한 제제 중에서 단백질과 같은 대형 분자의 방출은 약 2일 동안 저속화되는 것으로 예상된다.

상이한 시점에, 국소 반응 (즉 정상 조직에서 굴곡을 포함하는 점)도 점수화하였다. 결과로써, 굴곡을 가지는 점의 크기를 하기 표 3에 목록화하였다. 2시간 후의 굴곡이 주로 젤리-점 자체로 제한된다는 것에 주목한다. 24시간 후에는, 약간 더 큰 조직 부피 (5 cm³)의 일부 굴곡이 관찰되었으나, 안전한 (허용가능한) 수준이었다. 1주 후에는, 굴곡을 가지는 나머지 점이 사실상 사라졌다. 살아있는 돼지는 (스트레스, 가려움, 발적, 따가움 등과 같은) 어떠한 국소 반응의 신호도 나타내지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 오스몰농도가 0.9% 염화나트륨 용액 오스몰농도의 약 3배라는 사실에도 불구하고, 조성물은 안전한 것으로 간주될 수 있다고 결론지을 수 있다.

실시예 3

상이한 생물학적 항원, 그리고 상이한 유형 및 양의 아크릴산 중합체를 포함하는 다양한 조성물들을 제조하였다. 주사 후 높은 점도를 보장하도록, 각 경우에서의 아크릴산 중합체의 양은 0.8% w/w 이상이었다. 각 조성물의 일반적인 구성을 하기 표 4에 나타내었다. 표시된 점도는 주사 전의 점도임에 주목한다. 주사 후, 전해질은 제제로부터 빠르게 희석되게 되며, 그에 의해 제제는 매우 점성이 되게 됨으로써 주사 부위에 안정한 겔로 남아 있을 수 있다.

일반적으로, 0.8%의 아크릴산 중합체를 함유하는 0.8 유형, 및 1.6%의 아크릴산 중합체를 함유하는 1.6 유형의 2종 유형 아크릴산 중합체 포함 제제를 제조하였다. 표준 피하 주사기를 사용한 조성물의 주사를 가능케 하기에 충분하게 낮은 조성물 점도를 유지하기 위하여, 표 4에서 상기에 나타낸 바와 같이 전해질을 첨가하였다. 2종의 상이한 유형의 가교-결합된 아크릴산 중합체, 즉 카르보폴 974P 및 카르보폴 971P (모두 BF굿리치 사로부터 입수가능)를 사용하였다. 박테리아인 악티노바실루스 플류로뉴모니아에, 해모필리스 파라수이스, 미코플라스마 효뉴모니아에 및 돼지 시르코 바이러스 2 (PCV2)로부터 유래하는 다양한 유형의 항원들을 사용하였다. 이들 항원을 사용하여, 하기의 조성물들을 제조하였다:

1. Mhyo / PCV2 조성물

제1 조성물 ("A"로 표시)은 0.8%의 농도로 아크릴산 중합체 카르보폴 974P를 포함하였다. 이 조성물에서는, 미코플라스마 효뉴모니아에 항원 (네덜란드 복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스(Intervet Schering-Plough Animal Health) 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 Mhyo에 존재하는 것과 동일한 항원, 동일 농도) 및 PCV 항원 (복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 PCV에 존재하는 것과 동일한 항원, 동일 농도)을 불활성화하였다. 제2 조성물 ("B"로 표시)은 0.8%의 농도로 아크릴산 중합체 카르보폴 971P를 포함하였다. 이 조성물에서는, 미코플라스마 효뉴모니아에 항원 (복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 Mhyo에 존재하는 것과 동일한 항원, 동일 농도) 및 PCV 항원 (복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 PCV에 존재하는 것과 동일한 항원, 동일 농도)을 불활성화하였다.

제1 참조 조성물로는, 미국 뉴저지 서미트 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 M+Pac에서 사용될 때와 동일한 항원을 동일 농도로 포함하나 아주반트 에멀젼 에무나데(Emunade) 중에 제제화되는, "C"로 표시되는 조성물을 제조하였다. 단순히 PBS 용액으로 구성되는 엄격 대조 제제 "D"를 제조하였다.

2. APP 조성물

제1 조성물 ("E"로 표시)은 0.8%의 농도로 아크릴산 중합체 카르보폴 974P를 포함하였다. 이 조성물은 네덜란드 복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 APP에 존재하는 것과 동일한 악티노바실루스 효뉴모니아에 항원 (즉 APXI, APXII, APXIII 및 OMP)을 동일한 양으로 포함하였다.

참조 조성물로는, 시중에서 구입가능한 백신 포르실리스 APP ("F"로 표시)를 사용하였다.

3. 해모필루스 파라수이스 조성물

제1 조성물 ("G"로 표시)은 0.8%의 농도로 아크릴산 중합체 카르보폴 974P를 포함하였다. 이 조성물은 네덜란드 복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 글래써(Glaesser)에 존재하는 것과 동일한 해모필루스 파라수이스 항원 (즉 해모필루스 파라수이스 박테리아의 불활성화된 세포)을 동일한 양으로 포함하였다.

참조 조성물로는, 시중에서 구입가능한 백신 포르실리스 글래써 ("H"로 표시)를 사용하였다.

먼저 필요한 양의 약 70%의 물에서 전해질의 용액을 제조함으로써, 조성물 A, B, E 및 G를 제조하였다. 그 후 아크릴산 중합체를 첨가하고, 중합체가 완전히 수화될 때까지 혼합하였다. 다음에, 4 M NaOH 용액의 액적을 사용하여, 용액의 pH를 7.2로 설정하였다. 이 생성물을 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. 다음에, 생성물을 교반하면서 대략 20℃로 냉각한 후, pH를 점검하여 필요할 경우 조정하였다. 다음에, 교반하면서 항원을 첨가한 후, 다시 pH를 점검하여 필요할 경우 조정하였다. 나머지 양의 물을 첨가하였다. 용기를 충진하기 전에 생성물을 밤새 교반하고, 충진 후에는 질소 기체 분위기에서 2-8℃로 저장하였다.

실시예 4

백신접종 실험에서는, 각각 10 마리 새끼돼지의 4개 군을 사용하였다. 조성물 A, B, C 및 D를 3주령에 2 ml의 투여량으로 근육내 투여하였다. 백신접종 직전 (t = 0시간) 및 백신접종 4시간 후 (예상 최대 온도 상승)에 직장 온도를 측정하였다.

하기의 결과를 수득하였다. 어떠한 군에서도 임상적인 질환 신호는 보이지 않았는데, 이는 모든 조성물이 안전한 것으로 간주될 수 있음을 의미한다. 측정된 평균 온도를 하기 표 5에 나타내었다.

볼 수 있는 바와 같이, 사용된 항원들은 백신접종된 동물에서 상당한 온도 상승을 발생시킬 수 있다 (조성물 C의 결과 참조). 그러나, 본 발명에 따라 제제화될 경우, 온도 상승은 더 낮을 수 있으며, 심지어는 완전히 억제될 수 있다.

온도 상승 다음으로, 조성물 투여 6주 후에, 항원에 대한 항체 역가를 측정하였다. 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

Mhyo-부분이 시중에서 구입가능한 싱글샷(single shot) 백신 M+Pac과 동일하기 때문에, 조성물 C는 Mhyo에 대한 보호를 제공하는 백신이라는 것에 주목한다. 따라서, 조성물 A 및 B 역시 병원성 미코플라스마 효뉴모니아에에 대한 보호를 제공할 것으로 예상된다. PCV2와 관련하여서는, 투여 약 6주 후 역가가 9를 초과하는 경우에 시중에서 구입가능한 백신 포르실리스 PCV가 보호를 발생시키는 것으로 알려져 있다 (EP 2 291 195호 실시예 3의 결과 참조).

실시예 5

5½-6주령인 20 마리의 돼지를 사용하였다. 그들을 각각 10 마리 돼지의 2개 처리군에 무작위로 할당하였다. 돼지들은 6 및 10주령에 각각 조성물 E 및 F를 투여받았다. 양 백신접종 후, 전신성 반응, 특히 직장 온도 및 임상 신호, 그리고 국소 반응에 대하여 동물들을 관찰하였다. 백신에 대한 혈청학적 반응의 측정을 위하여, 6, 10, 13 및 23주령에 혈액 샘플채취를 수행하였다. 23주령에, 동물들을 주사 부위의 국소 반응에 대하여 검시 조사하였다.

후자와 관련하여, 도살시 주사 부위에서 허용불가능한 국소 반응은 관찰되지 않았다. 평균 온도 상승은 조성물 투여 4, 6 및 8시간 후에 설정하였다. 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

볼 수 있는 바와 같이, 사용된 항원들은 백신접종된 동물에서 상당한 온도 상승을 발생시킬 수 있다 (조성물 F의 추가 결과 참조). 그러나, 본 발명에 따라 제제화될 경우, 온도 상승은 더 낮을 수 있으며, 심지어는 완전히 억제될 수 있다 (특히 추가 백신접종 후 t = 8시간에서의 결과 참조).

온도 상승 다음으로, 조성물 투여 13주 후에, 항원에 대한 항체 역가를 측정하였다. 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

본 발명에 따른 조성물 (조성물 E)이 심지어는 시중에서 구입가능하며 보통 효과적인 것으로 간주되는 백신 포르실리스 APP (조성물 F)보다 더 높은 역가를 유도한다는 사실로 볼 때, 신규 조성물은 병원성 악티노바실루스 플류로뉴모니아에 박테리아에 의한 감염에 대하여 동물을 보호하는 데에 효과적인 백신인 것으로 보인다.

실시예 6

백신접종 실험에서, 6 마리 새끼돼지의 2개 군을 사용하였다. 1주령 (초회) 및 4주령 (추가)에 2 ml의 투여량으로 조성물 G 및 H를 근육내 투여하였다. 백신접종 직전 (t = 0시간) 및 백신접종 6시간 후 (예상 최대 온도 상승)에 직장 온도를 측정하였다.

어떠한 군에서도 임상적인 질환 신호는 나타나지 않았는데, 이는 모든 조성물이 안전한 것으로 간주될 수 있음을 의미한다. 평균 온도 상승 (t = 6 대 t = 0시간)을 하기 표 9에 나타내었다.

볼 수 있는 바와 같이, 사용된 항원들은 백신접종된 동물에서 상당한 온도 상승을 발생시킬 수 있다 (특히 조성물 H의 추가 결과 참조). 그러나, 본 발명에 따라 제제화될 경우, 온도 상승은 상당히 더 낮을 수 있다.

온도 상승 다음으로, 조성물 투여 6주 후에, 항원에 대한 항체 역가를 측정하였다. 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

본 발명에 따른 조성물 (조성물 G)이 시중에서 구입가능하며 보통 효과적인 것으로 간주되는 백신 포르실리스 글래써 (조성물 H)와 동일한 역가를 유도한다는 사실로 볼 때, 신규 조성물은 병원성 해모필루스 파라수이스 박테리아에 의한 감염에 대하여 동물을 보호하는 데에 효과적인 백신인 것으로 보인다.

실시예 7

본 실시예는 본 발명에 따른 다른 조성물, 및 해당 조성물의 제제화 방법에 대해 기술한다. 해당 조성물에 대해서는 하기 표 11에 나타내었다. 표는 조성물 1000 ml 당 단위를 나타낸다. 언급되는 항원과 관련하여, Mhyo 항원은 동일한 투여량 당 농도 (1 U/투여량)의, 네덜란드 복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 Mhyo에 존재하는 것과 동일한 항원이다. PCV 항원은 동일한 투여량 당 농도 (5E3 U/투여량)의, 복스미어 소재 인터베트 쉐링-플로우 애니멀 헬스 사로부터 구입가능한 시중 구입가능 백신 포르실리스 PCV에 존재하는 것과 동일한 항원이다. 라우소니아 항원은 사멸된 전체 세포의 수이다. 생성되는 백신은 돼지 시르코 바이러스 유형 2, 미코플라스마 효뉴모니아에 및 라우소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염에 대하여 돼지를 보호하도록 투여량 당 1 ml의 원-샷 백신으로서 사용하기 위한 것이다. 백신은 3일령 이상의 돼지에서 사용하기에 적합하다. 특히 제제 A, B 및 C의 경우, 부위 반응은 발생하지 않는 것으로 여겨진다.

표 11에 언급되어 있는 바와 같은 제제 A 내지 D를 구성하기 위한 적합한 절차는 하기와 같다:

1. 용기에 WFI를 첨가한다.

2. 염화나트륨 및 염화칼슘의 용액을 제조한다.

3. 카르보폴을 첨가한다. 균질한 현탁액이 수득될 때까지 내용물을 혼합한다.

4. 수산화나트륨 펠렛을 사용하여 용액의 pH를 7 부근 (6.9-7.1)으로 조정하고, 필요할 경우 염산 (4 M)을 사용하여 재-조정한다.

5. 121℃에서 20분 동안 생성물을 오토클레이빙한다.

6. 생성물을 20℃ (15-25)로 냉각한다.

7. pH를 점검하고 필요할 경우 조정한다.

8. 교반하면서 항원을 첨가한다.

9. pH를 점검하고 필요할 경우 조정한다.

10. 나머지 양의 주사용수를 첨가한다.

11. 2-8℃에서 생성물을 저장한다.

Claims (20)

1. 생물학적 항원 및 카르보폴을 함유하며, 0.9% (w/v) 수중 염화나트륨 용액의 오스몰농도보다 30% 이상 더 높은 오스몰농도를 제공하도록 전해질을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 조성물의 오스몰농도가 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액의 오스몰농도보다 50% 이상 더 높은 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 0.2% (w/w) 초과의 카르보폴을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, 0.5% (w/w) 초과의 카르보폴을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 0.8% 내지 1.6% (w/w)의 카르보폴을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카르보폴이 가교 결합된 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 카르보폴이 폴리알케닐에테르, 폴리알콜 및 디비닐글리콜 중 1종 이상을 사용하여 가교 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중하전된 양이온을 포함하는 전해질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제8항에 있어서, 양이온이 0.05 M 이하의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 양이온이 0.03 M 이하의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 항원이 투여시 발열을 유도하는 항원인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 항원이 그람-음성 박테리아 항원 및 시르코(circo) 바이러스 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제11항에 있어서, 항원이 악티노바실루스 플류로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae) 항원, 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis) 항원 및 돼지 시르코 바이러스 2 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1회의 단일 투여 후 돼지 시르코 바이러스 2에 의한 감염에 대하여 적절한 면역 반응을 제공하는 백신으로서 사용하기 위한, 돼지 시르코 바이러스 2 항원을 함유하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, 1회의 단일 투여 후 돼지 시르코 바이러스 2에 의한 감염에 대한 적절한 면역 반응에 더하여, 미코플라스마 효뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 중 하나 또는 둘다에 의한 감염에 대하여 적절한 면역 반응을 제공하는 백신으로서 사용하기 위한, 미코플라스마 효뉴모니아에 항원 및 라우소니아 인트라셀룰라리스 항원 중 하나 또는 둘다를 추가로 함유하는 조성물.
16. 제1항 또는 제2항에 따른 수성 조성물을 포함하는 주사가능한 조성물.
17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상 동물에게 투여되는 경우 수성 조성물에 존재하는 생물학적 항원에 의해 유도되는 대상 동물에서의 발열을 감소시키기 위한 수성 조성물.
18. 제17항에 있어서, 조성물이 0.2% (w/w) 초과의 카르보폴을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
19. 제18항에 있어서, 조성물이 0.5% (w/w) 초과의 카르보폴을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
20. 카르보폴을 포함하는 제1항 또는 제2항에 따른 수성 조성물을 사용하여, 인간을 제외한 대상 동물에서 제1항 또는 제2항에 따른 수성 조성물에 존재하는 생물학적 항원에 의하여 유도되는 발열을 감소시키는 방법.