MX2013015330A - Una composicion acuosa que comprende un antigeno biologico y un polimero de acido acrilico. - Google Patents

Abstract

La presente invención concierne a una composición acuosa que contiene un antígeno biológico y un polímero de ácido acrílico, en donde la composición comprende un electrolito para proveer una osmolaridad mayor que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) en agua; la invención también al polímero de ácido acrílico para usarse en una vacuna de inyección contra el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y, opcionalmente Mycoplasma hyopneumoniae y en una composición acuosa para reducir la fiebre inducida por antígenos biológicos presentes en una composición acuosa cuando la composición se administra a un sujeto animal.

Description

UNA COMPOSICIÓN ACUOSA QUE COMPRENDE UN ANTÍGENO BIOLÓGICO Y UN POLÍMERO DE ÁCIDO ACRÍLICO CAMPO TÉCNICO La presente invención concierne a una composición acuosa que comprende un antígeno biológico y un polímero de ácido acrílico. La invención también al polímero de ácido acrílico para usarse en una vacuna de inyección contra el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae y en una composición acuosa para reducir la fiebre inducida por antígenos biológicos presentes en una composición acuosa cuando la composición se administra a un sujeto animal.

TÉCNICA ANTECEDENTE Por ejemplo, a partir del documento WO 2010/025469 se sabe que proveer una composición acuosa (es decir, una composición a base de agua o de otro líquido hidrófilo que permite la formación de enlaces de hidrógeno) que comprende un antígeno biológico y un polímero de ácido acrílico (un antígeno biológico que es un antígeno derivado de un organismo vivo, tal como por ejemplo, una bacteria, un virus, un animal, un protista, un hongo, etc., normalmente un microorganismo vivo o muerto o una molécula biológica, de preferencia una proteína o un polisacárido, derivado de un organismo viviente; el termino "derivado de" significa que la molécula biológica misma o un precursor de la misma es producida por el organismo). El polímero de ácido acrílico en esta referencia de la técnica antecedente se usa como un adyuvante, es decir, un agente inmunoestimulate no específico incluido en la composición para favorecer o ampliar un procedimiento particular en la cascada de eventos inmunológicos, que conllevan a una mejor respuesta inmunológica. Desde hace mucho tiempo, los polímeros de ácido acrílico han sido reconocidos como adyuvantes seguros y adecuados, capaces de mejorar la respuesta inmunológica para varios tipo se antígenos, tales como migroorganismos vivos o muertos, subunidades de estos organismos o subunidades producidas de manera recombinante, tales como proteínas, polisacáridos y otros tipos de moléculas. Por ejemplo, la publicación US 3,178,350 ya describe el uso de un polímero de ácido acrílico como un adyuvante. Estos adyuvantes se encuentran disponibles bajo la marca comercial Carbopol™.

Una propiedad notable de polímeros de ácido acrílico es que aumentan significativamente la viscosidad de una composición acuosa ya que proveen de manera inherente cadenas de polímero enlazadas en tales composiciones. Los residuos de ácido de las cadenas de polímero pueden, principalmente, interactuar mediante enlazamiento de hidrógeno. Aunque los enlaces de hidrógeno son significativamente menos fuertes que los enlaces covalentes, esta interacción entre las cadenas de polímeros puede tener una influencia significante sobre la viscosidad de la solución acuosa. Esta propiedad inherente de polímeros de ácido acrílico, cuya propiedad difícilmente depende de la longitud de cadena del polímero y de tipo de cadenas laterales/grupos, se usa ampliamente en, por ejemplo, cremas o lociones en las que los polímeros de ácido acrílico se usan como agentes espesantes. Cuando los polímeros enlazados forman una verdadera red de cadenas de polímero a través de la composición (superior a cierta concentración de polímero, normalmente superior a 0.2 a 0.5% p/p), y los intersticios de la red se llenan con la fase continua, la composición se llama gel. Para aplicaciones tópicas de composiciones acuosas (tal como cremas para las manos y lociones de bronceado) este es un estado preferido de la composición. Para composiciones que contienen antígenos biológicas, cuyas composiciones normalmente se administran vía inyección, el aumento de viscosidad es una desventaja importante. Incluso cuando la viscosidad de la composición aumenta de aproximadamente 5-7 mPa (la cual es normal para una composición acuosa que comprende antígenos) a aproximadamente 200 mPa, es muy notable al aplicar la composición mediante inyección (a mano) a un sujeto animal (el termino animal en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, incluye un ser humano). La gelificación de las composiciones se evita comúnmente todas las veces, las composiciones gelificadas no se pueden inyectar fácilmente. Por lo tanto, en la práctica, para composiciones que comprenden antígenos biológicos normalmente de 0.1 a un máximo de 0.2% (peso sobre peso, p/p) se aplica un polímero de ácido acrílico. De hecho, en WO 2010/025469 la cual concierte a las vacunas del estado de la técnica, se aplica 0.1% p/p del polímero de ácido acrílico. Un ejemplo de una vacuna comercialmente disponible que comprende un polímero de ácido acrílico es Suvaxyn™ M.Hyo - Parasuis (disponible en Pfizer Animal Health), la cual contiene 0.2% (p/p) Carbopol™ 941.

En la técnica (US 3,920,811) se ha descrito añadir un electrolito fisiológicamente aceptable (es decir, un compuesto que se ioniza cuando se disuelve o se funde para producir un medio eléctricamente conductor), tal como los electrolitos mencionados en la columna 4, líneas 28-42 de la patente '811, a una composición inyectable para disminuir la viscosidad de la composición hasta el punto en el que se puede utilizar comercialmente de manera práctica, mientras que al mismo tiempo se retienen las propiedades adyuvantes favorables. Sin embargo, como se indica evidentemente en la patente '811 (columna 7, líneas 3-6), la concentración de electrolito puede ser tan alta que produce isotonicidad en la solución inyectable final de la mezcla de la solución adyuvante y del antígeno biológico. En particular, las composiciones inyectables actuales son normalmente alrededor de una mitad isotónica. La razón de esto es que por las soluciones hipertónicas generalmente conocidas pueden ocasionar daño de tejido al ser inyectadas. Incluso cuando la composición solamente es ligeramente hipertónica y por esto, se puede evitar el daño definitivo, el resultado de la inyección es que el animal puede tener una sensación de incomodidad en el sitio de la inyección, lo cual puede dar pie a, por ejemplo, estrés, comezón, punción, etc. Por lo tanto, para cumplir con los estándares de seguridad generalmente requeridos para composiciones para administración a animales, cada composición comercialmente disponible comprende antígenos biológicos y un polímero de ácido acrílico es por mucho isotónica con fluido corporal normal (por ejemplo, suero), es decir, que tiene una osmolaridad de una solución de cloruro de sodio de 0.9% (p/v) en agua (aproximadamente 300 mOsm/l).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la invención es proveer nuevas composiciones de acuerdo con el preámbulo que tienen una aplicabilidad más amplia.

Inesperadamente se ha descubierto que en una composición que comprende un polímero de ácido acrílico, el uso de una cantidad de electrolito que provee una solución hipertónica aún da lugar a una composición que cumple con los estándares de seguridad generalmente aceptados. Aparentemente, sin tener una razón técnica clara para que la composición sea segura incluso cuando es significativamente hipertónica, la presencia del polímero de ácido acrílico provee una composición en donde la presencia de un exceso de electrolito no induce ningún problema, incluso cuando se inyecta la composición en tejido animal. Sin estar limitada a la teoría, se cree que la presencia del polímero en forma de una red de cadenas de polímero enlazadas puede constituir una composición en donde una dilución controlada pero rápida del exceso de electrolito se lleva a acabo sin dañar el tejido circundante. De hecho, esto contradice la enseñanza de la patente '811 que ha sido la enseñanza comúnmente aceptada desde que se publicó la patente. Una de las mayores ventajas del presente descubrimiento de que se pueda usar un exceso de electrolito, es que puede disminuir más la viscosidad de la composición que comprende el polímero de ácido acrílico, lo que permite un uso práctico más fácil de la composición. También, la presente invención permite el uso de cantidades mucho mayores de un polímero de ácido acrílico, incluso mayores a 0.5% p/p y, al mismo tiempo, mantener una viscosidad muy baja. El uso de tales cantidades de polímero da pie a formulaciones de liberación (muy) lenta para los antígenos biológicos. Debido a la aparente característica de que el electrolito se diluye rápido de la composición después de su administración al tejido animal, la viscosidad de la composición aumentará de manera significativa inmediatamente después de la administración, e incluso forma una composición gelificada en el lugar de la administración. Inherentemente, los antígenos biológicos se liberarán más despacio de tal gel en comparación con la liberación de una composición acuosa (viscosidad baja) como tal, dependiendo, entre otras cosas en las propiedades del gel. En general, mientras mayor sea la viscosidad, se espera que la liberación de antígenos sea más lenta.

En particular, se ha descubierto que un polímero de ácido acrílico en una composición acuosa que comprende antígenos biológicas se puede usar para reducir la fiebre inducida por estos antígenos biológicos cuando la composición se administra a un sujeto animal. Aunque una elevación de temperatura de 2°C dentro de las primeras 24 horas después de la inyección es generalmente aceptada y considerada segura, una elevación de temperatura por debajo de 1°C es generalmente favorable. Con las composiciones de acuerdo con la presente invención se puede obtener una elevación de temperatura menor a 1°C o incluso menor a 0.5°C. La razón de esto continúa siendo incierta pero se puede ligar al hecho de que la solución de baja viscosidad hipertónica alcanzará casi inmediatamente después de la administración una mayor viscosidad y por esto se vuelve una formulación de liberación mas o menos lenta. La liberación lenta puede dar como resultado una respuesta inmunológica que sea menos intensa pero más prolongada. Aunque se espera observar por lo menos una disminución también del título, fue muy sorprendente que se pueden obtener títulos aún altos, incluso cuando fiebre disminuya significativamente. Esto da pie a obtener vacunas más seguras basadas en antígenos que normalmente inducen fiebre, tales como por ejemplo, lipopolixacárido (LPS) que contiene antígenos como los presentes en varias vacunas que contienen bacterias gram negativas, tales como por ejemplo Escherichia coli (£. coli), Salmonella spp, Shigella spp y otra Enterobacteriaceas, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bacteria de ácido acético, Legionella y alpha-proteobacteria como Wolbachia, cianobacteria, spirochaetes, bacteria verdes sulfurosas y verdes no sulfurosas, Neissería gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus spp tales como Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori, y Acinetobacter baumannii.

A diferencia de lo anterior, también se ha descubierto que la presente invención se puede usar ventajosamente en una composición que contiene circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae y antígeno de Lawsonia intracellularis para proveer una vacuna que después de una sola administración proporcione una respuesta inmune adecuada contra una infección con circovirus porcino de tipo dos y Mycoplasma hypneumoniae y Lawsonia intracellularis.

Cabe destacar que la presente invención también concierne a una composición inyectable (en particular, una composición que tiene una viscosidad menor a 200 mPa, de preferencias menor a 100 mPa) que comprende la composición referida anteriormente referida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la osmolaridad de la composición es por lo menos 30% más alta que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) (es decir, aproximadamente 400 mOsmol/l o más alta). Se ha descubierto que incluso una osmolaridad tan alta como esta, se puede usar sin efectos secundarios negativos en el sitio de administración. Esto mejora grandemente la libertad en el uso del polímero de ácido acrílico. Incluso las cantidades significativamente sobre 0.2% de las comúnmente aplicadas se pueden usar ahora al mismo tiempo que se mantiene una viscosidad muy baja.

En una modalidad, la osmolaridad de la composición es por lo menos 50% más alta que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) (es decir, aproximadamente 450 mOsmol/l o más alta). Se ha descubierto que incluso una osmolaridad tan alta como esta, se puede usar sin efectos secundarios negativos en el sitio de administración. Esto mejora grandemente la libertad en el uso del polímero de ácido acrílico. Incluso las cantidades significativamente sobre 0.2% de las comúnmente aplicadas se pueden usar ahora al mismo tiempo que se mantiene una viscosidad muy baja.

En una modalidad preferida, la composición comprende más de 0.2% (p/p) del polímero de ácido acrílico, o incluso más de 0.5% (p/p) del polímero de ácido acrílico. Con estas cantidades de polímero de ácido acrílico, la composición puede estar en la forma de un gel viscoso. Al agregar el exceso de electrolito a la composición gelificada, la viscosidad puede disminuir a valores convencionales de entre 10-70 mPa. De esta manera, la composición será fácil de aplicar al usar una jeringa de mano estándar, y después de la inyección, mediante dilución del exceso de electrolito, se revertirá a un gel altamente viscoso. Se ha descubierto que tal gel de polímero de ácido acrílico es particularmente conveniente para obtener altos títulos de anticuerpo contra antígenos que normalmente inducen fiebre, y al mismo tiempo disminuir la fiebre resultante. Una composición que comprende entre 0.8% y 1.6% (p/p) del polímero de ácido acrílico es particularmente preferida.

De preferencia, en esta modalidad, el exceso de electrolito provee una osmolaridad de normalmente más de 2-3 veces la osmolaridad de fluido de tejido normal (solución de cloruro de sodio a 0.9%), por lo tanto, más de aproximadamente 600-900 mOsmol/l. De esta manera, la viscosidad antes de la administración se puede mantener o suficientemente baja como para permitir la inyección. Después de la inyección, el electrolito se diluirá y la composición se convertirá en un gel.

En una modalidad, el polímero de ácido acrílico es un polímero reticulado, de preferencia que usa un polialqueniléter, un polialcohol y/o un divinilglicol como un reticulante. Reticular el polímero hace la formación de red de las cadenas del polímero en la composición, dependiendo menos de, por ejemplo, la temperatura y el pH, simplemente porque parte de la formación de red está inherentemente presente en la forma de enlaces cruzados covalentes.

En otra modalidad, la composición comprende un electrolito que comprende un catión multicargado (que es un catión que tiene una carga más alta que 1+, normalmente 2+ o 3+). Se ha descubierto que al usar un catión multicargado, la viscosidad puede ser disminuida de manera más eficaz, incluso cuando la osmolaridad es la misma que cuando se usa un catión monocargado (1+). En una modalidad preferida, el catión está presente en una concentración de hasta 0.05M, de preferencia hasta aproximadamente 0.03M. La cantidad de catión que se puede usar depende de la cantidad de grupos carboxilados en la solución de polímero de ácido acrílico. Demasiado catión inducirá la precipitación. Se ha descubierto que cuando se usan estas cantidades de catión multicargado, la viscosidad puede ser disminuida de manera muy efectiva y al mismo retener la seguridad tras la administración de la composición.

En una modalidad, el antígeno biológico es un antígeno que tras la administración induce fiebre, es decir, más de 0.5°C, más particularmente más de 1.0°C, más de 1.5°C o incluso más de 2.0°C. En la práctica, muchos antígenos tras su administración inducen un poco de fiebre. La fiebre máxima que se puede inducir es, a menudo, establecida por autoridades regulatorias. Para cumplir con tal máximo, en algunos casos es necesario disminuir la cantidad de antígeno a un nivel sub-óptimo, por lo que se acepta que se obtiene una respuesta inmunológica no óptima. Para prevenir la enfermedad actual la que la vacuna debe proveer protección, esta es una situación de desventaja. Sorprendentemente se ha descubierto que al usar la composición de acuerdo con la invención, la fiebre inducida por los antígenos se puede reducir y al mismo tiempo conservar la respuesta inmunológica. La lenta liberación de antígenos no puede ser la única razón de este efecto, ya que una persona esperaría que si se reduce la fiebre debido a una lenta liberación, la respuesta inmunológica también sería menos potente. Sin embargo, el solicitante descubrió que al usar la presente invención, se puede reducir la fiebre y al mismo tiempo mantener una respuesta inmunológica adecuada.

En una modalidad, el antígeno se selecciona de un grupo que consiste en antígeno de bacteria gram negativa y un antígeno de circovirus.

En una modalidad preferida, el antígeno se selecciona de un grupo que consiste en antígeno de Actinobacillus pleuropneumoniae, antígeno de Haemophilus parasuis y antígeno de cirvovirus porcino de tipo 2 (PCV2). Estos antígenos son particularmente conocidos por inducir la fiebre tras su administración. Al usar la presente invención, la fiebre se puede reducir de manera significativa y, al mismo tiempo, mantener la potencia inmunológica de la composición en un nivel adecuado.

A continuación se describirá más la invención mediante el uso de los siguientes ejemplos.

El ejemplo 1 muestra el efecto de un polímero de ácido acrílico sobre la viscosidad.

El ejemplo 2 concierne a las propiedades físicas de una composición de acuerdo con la invención y a su seguridad.

El ejemplo 3 describe la constitución de composiciones de acuerdo con la invención.

El ejemplo 4 muestra un experimento de vacunación con una composición de acuerdo con la invención.

El ejemplo 5 muestra un segundo experimento de vacunación con una composición de acuerdo con la invención.

El ejemplo 6 muestra un tercer experimento de vacunación con una composición de acuerdo con la invención.

El ejemplo 7 describe más composiciones de acuerdo con la invención y un método para formular estas composiciones.

EJEMPLO 1 Se han hecho varias formulaciones isotónicas acuosas mediante el uso de un polímero de ácido acrílico reticulado para evaluar el efecto del polímero sobre la viscosidad de la composición. Las formulaciones no comprenden antígenos (lo que normalmente aumentarían la viscosidad). También, se ha evaluado el efecto de añadir una cantidad en exceso de un electrolito doblemente cargado.

Todas las formulaciones comprendieron el polímero de ácido acrílico reticulado Carbapol 974P (disponible en BF Goodrich Specialty Chemicals, Cleveland, Ohio). Se disolvieron varias cantidades del polímero (0.1 a 1.6% p/p) en una solución acuosa de cloruro de sodio a 0.9% p/v. Las viscosidades de las formulaciones se midieron con un viscómetro de laboratorio Brookfield. Los resultados fueron los siguientes: CUADRO 1 Viscosidad de varias soluciones isotónicas de polímero de ácido acrílico Cabe destacar que la composición acuosa de la presente invención se puede usar para hacer una emulsión con una fase oleosa, normalmente para llegar a una emulsión de agua en aceite, una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite en agua. Así, tal emulsión comprende una composición acuosa de acuerdo con la presente invención. Por supuesto, formular una emulsión causará un impacto sobre la viscosidad, que normalmente da lugar a un aumento significativo. Por ejemplo, cuando un aceite (por ejemplo, 10% p/v) se emulsiona en una solución acuosa que tiene una viscosidad de aproximadamente 3 mPa, la viscosidad puede aumentar a aproximadamente 25 mPa o incluso más.

En el siguiente experimento, el efecto sobre la viscosidad al usar un exceso de electrolito se evaluó al usar una formulación de Carbopol a 0.8%. A esta formulación se le agregaron varias cantidades de cloruro de sodio y cloruro de calcio para mostrar el efecto sobre la viscosidad. Estos resultados se ilustran en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Viscosidad de varias soluciones de polímero de ácido acrílico Como se puede entender, la adición de una cantidad en exceso de electrolito reduce significativamente la viscosidad de la composición que contiene polímero de ácido acrílico. Se descubrió (véase el Ejemplo 2) que tras la inyección, este exceso se diluirá de la composición al tejido circundante, por lo que aumenta la viscosidad de la composición para convertirse incluso en gel. Tal gel permanecerá en el sitio de inyección para esperar una difusión y degradación lentas de sus constituyentes.

EJEMPLO 2 Este ejemplo concierne a las propiedades físicas de una composición de acuerdo con la invención, en particular a su formación en gel después de la inyección y a su liberación del contenido disperso y a su seguridad durante la inyección en tejido animal.

En este experimento se usaron cuadro cerdos. Cada cerdo recibió 1ml de una composición que contenía Carbopol 974P a 1.6%, cloruro de sodio a 2.5% y cloruro de calcio a 0.48% (con una osmolaridad aproximada de 925 mOsmol/l) mediante inyección intramuscular. Por propósitos de diagnóstico, la formulación comprendió además 0.075% del colorante azul de patente. Al cerdo 1 se le practicó la eutanasia 2 horas después de la inyección de la formulación y se abrió inmediatamente el tejido muscular para examinar el sitio de administración. Fue visible un punto transparente que contenía una sustancia azul gelatinosa. Se tomó una cuchara y el punto se pudo remover como un gel. El no era fluido. Al cerdo 2 se le practicó la eutanasia 24 horas después de la administración de la misma formulación y también se abrió su tejido muscular para examinar el sitio de administración. En el sitio de administración se pudo apreciar un gel transparente incoloro, lo cual es un indicio de difusión del azul de patente en el cuerpo del cerdo. Al cerdo 3 se le practicó la eutanasia 48 horas después y el cerdo 4 después de una semana. De ninguno de estos cerdos se pudo aislar un gel. El color azul desapareció por completo.

Estos resultados indican que el gel está presente hasta 2 días después de la inyección. Las moléculas pequeñas se diseminan del gel dentro de 1 día. Se espera que la liberación de grandes moléculas como las proteínas se ralentice durante aproximadamente 2 días, en particular esta formulación.

Las reacciones locales (es decir, puntos que comprenden desviaciones en el tejido normal) también se calificaron en diferentes puntos de tiempo. Los resultados, tamaños de puntos con desviaciones, se mencionan a continuación en el Cuadro 3. Se debe tomar en cuenta que las desviaciones después de 2 horas se limitan principalmente al mismo punto gelatinoso. Después de 24 horas se observaron algunas desviaciones en un volumen de tejido ligeramente mayor (5 cm3), pero en un nivel seguro (aceptable). Después de 1 semana, el punto remanente con desviaciones había prácticamente desaparecido. Los cerdos vivos no mostraron ninguna señal de reacciones locales (como estrés, comezón, enrojecimiento, punción, etc.). Con base en estos resultados, se puede concluir que la composición, a pesar del hecho de que la osmolaridad es de aproximadamente tres veces la osmolandad de una solución de cloruro de sodio a 0.9%, se puede considerar segura.

CUADRO 3 Tamaño de la reacción local después de la invección IM EJEMPLO 3 Se produjeron varias composiciones que comprendían diferentes antígenos biológicos y diferentes tipos y cantidades de polímeros de ácido acrílico. La cantidad de polímero de ácido acrílico en cada caso fue de por lo menos 0.8% p/p para asegurar una alta viscosidad después de la inyección. La constitución general de cada composición se indica en el cuadro 4. Se debe considerar que la viscosidad indicada es la viscosidad antes de la inyección. Después de la inyección, el electrolito se diluirá rápido de la formulación, con lo cual, la formulación se volverá altamente viscosa y permanecerá como un gel estable en el sitio de la administración.

CUADRO 4 Constitución general de composiciones que contienen antígenos biológicos por 1000 gramos de composición En general, se hicieron dos tipos de formulaciones que comprenden polímero de ácido acrílico, el tipo 0.8 que contiene polímero de ácido acrílico a 0.8% y el tipo 1.6 que contiene polímero de ácido acrílico a 1.6%. Para mantener la viscosidad de las composiciones lo suficientemente baja para permitir inyectar la composición con una jeringa hipodérmica estándar, se agregó el electrolito como se indica en el cuadro 4 anterior. Se usaron dos tipos diferentes de polímeros de ácido acrílico reticulados, viz. Carbopol 974P y Carbopol 971 P (ambos se pueden obtener en BF Goodrich). Se usaron varios tipo de antígenos derivados de las bacterias ActinobacHIus pleuropneumoniae, Haemophilis parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae y circovirus porcino de tipo 2 (PCV2). Con estos antígenos se hicieron las siguientes composiciones: Composición 1 Mhvo/PCV2 La primera composición (designada "A") comprendió el Carbopol 974P de polímero de ácido acrílico en una concentración de 0.8%. En esta composición se usaron antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada (los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis Mhyo comercialmente disponible, disponible de Interver Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, Países Bajos, en la misma concentración) y antígenos de PCV (los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis PCV comercialmente disponible, disponible de Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, en la misma concentración).

La segunda composición (denotada "B") comprendió el Carbopol 917P de polímero de ácido acrílico en una concentración de 0.8%. En esta composición se usaron antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada (los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis Mhyo comercialmente disponible, disponible de Interver Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, en la misma concentración) y antígenos de PCV (los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis PCV comercialmente disponible, disponible de Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, en la misma concentración).

Como una primera composición de referencia, se elaboró una composición denotada "C" que comprendió los mismos antígenos en la misma concentración pero formulada en la emulsión de adyuvante Emunade, como se usa en la vacuna M+Pac comercialmente disponible, disponible de Interver Schering-Plough Animal Health, Summit, NJ, E.U.A.) Se elaboró una formulación "D" de control estricto que consistió simplemente en la solución PBS.

Composición 2 APP Una primera composición (designada "E") comprendió el Carbopol 974P de polímero de ácido acrílico en una concentración de 0.8 %. Esta composición comprendió los mismos antígenos de Actinobacillus hyopneumoniae (viz. APXI, APX II, APXIll y OMP), en la misma cantidad, que los presentes en la vacuna Porcilis APP comercialmente disponible, disponible de InterveT Schering-Ploguh Animal Health, Boxmeer, Países Bajos.

Como una composición de referencia, se usó la vacuna Porcilis APP comercialmente disponible (denotada "F").

Composición 3 Haemophilus parasuis Una primera composición (designada "G") comprendió el Carbopol 974P de polímero de ácido acrílico en una concentración de 0.8%.

Esta composición comprendió los mismos antígenos de Haemophilus parasuis (viz. células inactivas de la bacteria Haemophilus parasuis), en la misma cantidad, que las presentes en la vacuna Porcilis Glásser comercialmente disponible, disponible en Intervet Shering-Plough Animal Health, Boxmeer, Países Bajos.

Como una composición de referencia, se usó la vacuna Porcilis Glásser comercialmente disponible (denotada "H").

Las composiciones A, B, E y G se elaboraron al elaborar primero una solución de los electrolitos en aproximadamente 70% de la cantidad requerida de agua. Después de eso, se agregó y mezcló el polímero de ácido acrílico hasta que el polímero estuvo completamente hidratado. Después, el pH de la solución se fijó a 7.2 usando gotas de una solución de NaOH de 4M. Este producto se sometió al autoclave durante 20 minutos a 121°C. Después, el producto se enfrió a aproximadamente 20°C mientras se agitaba, después de lo cual, se revisó el pH y se ajustó, en caso de ser necesario. Después se agregaron los antígenos durante agitación, después de lo cual, se volvió a revisar el pH y se ajustó, en caso de ser necesario. Se agregó la cantidad remanente de agua. El producto se agitó toda la noche antes de llenar los contenedores, y después del llenado, se almacenó en una atmósfera de nitrógeno a 2-8°C.

EJEMPLO 4 En el experimento de vacunación se usaron cuatro grupos de 10 lechones. Las composiciones A,B,C y D se administraron intramuscularmente como una dosis de 2 mi a las tres semanas de edad. Se midieron las temperaturas rectales justo antes de la vacunación (t=0h) y 4 horas después de la vacunación (elevación máxima de temperatura esperada).

Se obtuvieron siguientes resultados: No se observaron signos clínicos de enfermedad en ninguno de los grupos, lo que significa que todas las composiciones se pueden considerar seguras. Las temperaturas promedio medidas se ilustran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Temperatura promedio después de una sola administración de vacunas hvo/PCV Como se puede observar, los antígenos utilizados pueden ocasionar una elevación a temperatura significativa en animales vacunados (véanse los resultados con la composición C) Sin embargo, cuando está formulada de acuerdo con la invención, la elevación de temperatura puede ser inferior e incluso se puede suprimir por completo.

Junto con la elevación de temperatura, se midieron los títulos de anticuerpo contra antígenos, 6 semanas después de administrar la composición. Los resultados se encuentran indicados en el cuadro 6.

CUADRO 6 Títulos promedio a las 6 semanas después de una sola administración de vacunas Mhyp/PCV Se debe considerar que la composición C es una vacuna que confiere protección contra Mhyo ya que la parte Mhyo es la misma que en la vacuna M+Pac de una sola inyección comercialmente disponible. Por lo tanto, se espera que las composiciones A y B también confieran protección contra el Mycoplasma hyopneumoniae patogénico. Con respecto a PCV2, se sabe que la vacuna comercialmente disponible Porcilis PCV da lugar a protección cuando el título se encuentra sobre 9 a seis semanas después de su administración (véase, entre otros, EP 2 291 195, resultados del ejemplo 3).

EJEMPLO 5 Se usaron 20 cerdos de edad de 51/2 - 6 semanas. Fueron aleatoriamente asignados a dos grupos de tratamiento de diez cerdos cada uno. Los cerdos recibieron las composiciones E y F, respectivamente, a las 6 y 10 semanas de edad. Los animales se mantuvieron bajo observación en caso de que presentaran reacciones sistémicas, en particular, temperatura rectal y signos clínicos y reacciones locales después de ambas vacunas. Se tomaron muestras de sangre a las 6, 10, 13 y 23 semanas de edad para determinar las respuestas serológicas a las vacunas. A la edad de 23 semanas, se realizó una investigación post-mortem en los animales para reacciones locales de los sitios de inyección.

Respecto a esto último, en la matanza no se observaron reacciones locales no aceptables en los sitios de inyección. La elevación de temperatura se estableció a las 4, 6 y 8 horas después de la administración de las composiciones. Estos resultados se ilustran en el cuadro 7.

CUADRO 7 Elevación promedio de temperatura después de administrar las vacunas APP Como se puede observar, los antígenos utilizados pueden ocasionar una elevación a temperatura significativa en animales vacunados (véanse los resultados del refuerzo con la composición F) Sin embargo, cuando está formulada de acuerdo con la invención, la elevación de temperatura puede ser inferior e incluso se puede suprimir por completo (en particular, véanse los resultados a t=8 h después de la vacuna de refuerzo).

Junto con la elevación de temperatura, se midieron los títulos de anticuerpo contra antígenos, 13 semanas después de administrar la composición. Los resultados se encuentran indicados en el cuadro 8.

CUADRO 8 Títulos promedio a las 13 semanas después de administrar las vacunas APP Debido al hecho de que la composición de acuerdo con la invención (composición E) incluso induce títulos más altos que la vacuna Porcilis APP (composición F) comercial y comúnmente disponible, muestra que la nueva composición es una vacuna efectiva para proteger animales contra una infección con bacteria de Actinobacillus pleuropneumoniae patogénica.

EJEMPLO 6 En el experimento de vacunación se usaron dos grupos de 6 lechones. Las composiciones G y H se administraron intramuscularmente como una dosis de 2 mi a una edad de una (primaria) y de cuatro (refuerzo) semanas Se midieron las temperaturas rectales justo antes de la vacunación (t=Oh) y 6 horas después de la vacunación (elevación máxima de temperatura esperada).

No se observaron signos clínicos de enfermedad en ninguno de los grupos, lo que significa que todas las composiciones se pueden considerar seguras. La elevación promedio de temperatura (t=6 contra t=0 h) se muestra en el cuadro 9.

CUADRO 9 Elevación de temperatura promedio después de administrar vacunas de H. parasuis Como se puede observar, los antígenos utilizados pueden ocasionar una elevación a temperatura significativa en animales vacunados (véase en particular el resultado del refuerzo con la composición H). Sin embargo, cuando está formulada de acuerdo con la invención, la elevación de temperatura puede ser inferior e incluso puede ser significativamente inferior.

Junto con la elevación de temperatura, se midieron los títulos de anticuerpo contra antígenos, 6 semanas después de administrar la composición. Los resultados se encuentran indicados en el cuadro 10.

CUADRO 10 Títulos promedio a las 6 semanas después de administrar las vacunas de H. parasuis Debido al hecho de que la composición de acuerdo con la invención (composición G) induce el mismo título que la vacuna Porcilis Glásser (composición H) comercial y comúnmente disponible considerada efectiva, muestra que la nueva composición es una vacuna efectiva para proteger animales contra una infección con bacteria de Haemophilus parasuis patogénica.

EJEMPLO 7 Este ejemplo describe más composiciones de acuerdo con la invención y un método para formular estas composiciones. Estas composiciones de mencionan en el cuadro 11. El cuadro indica unidades por 1000 mi de composición.

Con respecto a los antígenos mencionados, los antígenos de Mhyo son los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis Mhyo comercialmente disponible, disponible en Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, Países Bajos, en la misma concentración por dosis (1 U/dosis). Los antígenos de PCV son los mismos antígenos que los presentes en la vacuna Porcilis PCV comercialmente disponible, disponible en Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, en la misma concentración por dosis (5E3 U/dosis). Los antígenos de Lawsonia son los números de células totalmente muertas. La vacuna resultante es para usarse como una vacuna de una sola inyección, 1 mi por dosis, para proteger a los cerdos contra una infección con circovirus porcino de tipo 2, Mycoplasma hyopneumoniae y Lawsonia intracellularis. La vacuna es adecuada para usarse en cerdos de una edad de tres días y mayores. Se cree que no ocurren reacciones en el sitio, en particular para las formulaciones A, B y C.

CUADRO 11 Composiciones que comprenden antígenos de PCV. Mhyo y Lawsonia.

Un procedimiento conveniente para constituir las formulaciones A a D como se menciona en el cuadro 11 se realiza de la siguiente manera: 1. Agregar WFI al recipiente. 2. Elaborar una solución de cloruro de sodio y cloruro de calcio. 3. Agregar el carbopol. Mezclar el contenido hasta obtener una suspensión homogénea. 4. Ajustar el pH de la solución a alrededor de 7 (6.9-7.1) con sedimentos de hidróxido de sodio y, en caso de ser necesario, volver a ajustar con ácido clorhídrico (4M). 5. Someter al autoclave el producto durante 20 min. a 121 °C. 6. Enfriar el producto a 20°C (15-25). 7. Revisar el pH y ajustar en caso de ser necesario. 8. Agregar los antígenos mientras se agita. 9. Revisar el pH y ajustar en caso de ser necesario. 10. Agregar la cantidad remanente de agua para inyección. 11. Almacenar el producto a 2-8°C

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición acuosa que contiene un antígeno biológico y un polímero de ácido acrílico, caracterizada porque la composición comprende un electrolito para proveer una osmolaridad mayor que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v) en agua.

2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la osmolaridad de la composición es por lo menos 30% más alta que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v).

3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque la osmolaridad de la composición es por lo menos 50% más alta que la osmolaridad de una solución de cloruro de sodio a 0.9% (p/v).

4. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende más de 0.2% (p/p) del polímero de ácido acrílico.

5.- La composición de conformidad la reivindicación 4, caracterizada además porque la composición comprende más de 0.5% (p/p) del polímero de ácido acrílico.

6.- La composición de conformidad la reivindicación 5, caracterizada además porque la composición comprende entre 0.8% y 1.6% (p/p) del polímero de ácido acrílico.

7. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el polímero de ácido acrílico es un polímero reticulado.

8. - La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el polímero de ácido acrílico es reticulado que usa un polialqueniléter, polialcohol y/o divinilglicol.

9. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende un electrolito que comprende un catión multicargado.

10. - Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el catión está presente en una concentración de hasta 0.05 M, preferiblemente hasta 0.03 M.

11.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el antígeno biológico es un antígeno que induce fiebre después de la administración.

12. - La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el antígeno se selecciona de un grupo que consiste en un antígeno de bacteria gram negativa y un antígeno de circovirus.

13. - La composición de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizada además porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de Actinobacillus pleuropneumoniae, antígeno de Haemophilus parasuis y antígeno de circovirus porcino de tipo 2.

14.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque contiene antígeno de circovirus de tipo 2, antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae y, opcionalmente, antígeno de Lawsonia intracellularis para usarse como una vacuna de después de una sola administración provee una respuesta inmune adecuada contra una infección contra circovirus porcino de tipo 2 y, opcionalmente Mycoplasma hypneumoniae y Lawsonia intracellularis.

15.- Una composición inyectable que comprende la composición acuosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

16. - Un polímero de ácido acrílico para usarse en una composición acuosa para reducir la fiebre inducida por los antígenos biológicos presentes en la composición acuosa cuando la composición es administrable a un sujeto animal.

17. - El polímero de ácido acrílico de conformidad con la reivindicación 16, en donde la composición comprende más de 0.2% (p/p), preferiblemente más de 0.5% (p/p) del polímero de ácido acrílico.

18. - El polímero de ácido acrílico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, en donde la solución acuosa es hipertónica.

19. - El uso de un polímero de ácido acrílico para fabricar una composición acuosa que comprende el polímero, para reducir la fiebre en un sujeto animal inducida por un antígeno biológico presente en la composición acuosa.

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde la composición comprende más de 0.2% (p/p), de preferencia más de 0.5% (p/p) del polímero de ácido acrílico.

21.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, en donde la solución acuosa es hipertónica.