JP2004508301A

JP2004508301A - 材料物質の調合物並びに相応の利用方法

Info

Publication number: JP2004508301A
Application number: JP2002518995A
Authority: JP
Inventors: ハウプトマイエル・ベルンハルト; リューデル・オーラフ; フローレ・ピーター・ハルメン; マヒューレッツ・ヘルベルグ・ルツ
Original assignee: ローマン・アニマル・ヘルス・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2001-08-13
Publication date: 2004-03-18
Also published as: EP1179349B8; ATE320267T1; EP1179349A1; EP1179349B1; WO2002013856A3; DE50012404D1; WO2002013856A2

Abstract

本発明の材料物質調合物は、シリンジへの吸い上げに適した安定した水／油乳剤であって、
−　分散した水性相と、
−　液体脂肪および／または液体油および／または液体ワックスに基づく連続的な油相であって、この油相に前記の分散した水性相を含んでいるものと、
−　乳化剤と、
−　安定剤としての、疎水性化した、おおいに分散させた二酸化珪素及び／またはレシチンとから、構成される。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は材料物質の調合物、ならびに、これの、ワクチンのアジュバントもしくはワクチンとしての相応の利用方法に関する。
【０００２】
ドイツ連邦共和国における該当する医薬製造法によれば、ワクチンとは、「抗原を含み、且つ、予防接種による特定の駆逐・反発性の予防物質の発生の為に人体もしくは動物に適用される事を目的とした手段」である。
【０００３】
ワクチンは、抗体として、とくに、生きている、もしくは、不活性な、もしくは、死んだ微生物（バクテリアや、ウィールス）や、それらの代謝物（微生物毒素・トキソイド）などを含み、抗体の能動的な形成の為に働く。この能動免疫とは異なり、受動免疫の場合は、細菌感染後に別の生体によって形成される抗体を含んだ抗血清の注入が起きる。
【０００４】
殆どの不活性ワクチンは「パレンテラリア（ギリシャ語：ｐａｒａ＝下に、ｅｎｔｅｒａ＝腸）」に分類される。胃腸の経路をバイパスして人体に入る、対称的に活動する物質がパレンテラリアと呼ばれている。狭義では、パレンテラリアは、注射と注入だけを意味する。（ｓ．ｃ．＝皮下の、ｉ．ｖ．＝静脈（内）の、ｉ．ｍ．＝筋（肉）内の注射）。
【０００５】
（補助すると言う意味のラテン語ａｄｊｕｖａｒｅを語源とする）アジュバントは、ワクチンの効果を高める材料物質についての用語である。免疫化学プロセスにおいて、例えば水酸化アルミニウム、燐酸カルシウムゲル、フロイントアジュバントなどのアジュバントは抗原を伴って、抗体の発生を強化する。
【０００６】
フロイントアジュバントにおいて、この効果は（活性成分が乳剤の水溶性内相に局在するので）就中、水／油相の位置に基づく。これにより、活性成分の解放が遅延される。Ｗ／Ｏ型乳剤は、「油中水型乳剤」であり、すなわち、細かな水滴（内相＝不連続相）を、油（外相＝連続相）へ乳化させる。
【０００７】
抗原は通常、水性相に含まれる。水性相や油性相にくわえて、最近のＷ／Ｏ型アジュバントは更に、シェルフ安定性の改善のための一種乃至数種の乳化剤と補助物質とを含む。
【０００８】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、結核死菌を含むクリーム状のＷ／Ｏ型−パラフィンオイル−脂肪乳濁液である。優れた活性を示すが、但し、特に、大きな動物についてはしばしば、おおきな潰瘍性の膨張を生じさせる。一方、不完全フロイントアジュバントには結核菌を含まない。
【０００９】
獣医学の予防ワクチンの場合、不平、苦情が全く存在しないことを前提条件としており、フロイントアジュバントは、前述したような対立する反応の結果として、規則的に承認されるチャンスは無い。この製剤の場合、極めて低いシェルフ安定性も不都合である。
【００１０】
獣医学の薬品の場合、ターゲットとなるそれぞれ異なる動物の種と、抗原ごとに別々のアジュバントが採用される。ピー・ピー・パストレット／ジェー・ブランコー／ピー・バニエール／シー・フェアシュエーレン共著「獣医学ワクチン学」エルゼビエールサイエンス１９９７年版にいくつかの例が見られる。
【００１１】
この現状から出発して、本発明の目的は、ワクチン用のアジュバントとして、もしくは、ワクチンとしての使用に特に適した材料物質の新規の調合物を提供することである。
【００１２】
前記の目的は、特許請求の範囲の請求項１の態様を備えた材料物質調合物により達成できる。この材料物質調合物の利用方法の一つは、請求項２２に、そして、別の利用方法は請求項２５に示している。本発明の有益な実施例は、特許請求の範囲の各従属項の主題である。
【００１３】
本発明の材料物質調合物は、シリンジへの吸い上げに適した安定した水／油乳剤であって、
−　分散した水性相と、
−　液体脂肪および／または液体油および／または液体ワックスに基づく連続的な油相であって、この油相に前記の分散した水性相を含んでいるものと、
−　乳化剤と、
−　安定剤としての、疎水性化した、おおいに分散させた二酸化珪素及び／またはレシチンとから、
構成される。
【００１４】
本発明の材料物質調合物は、安定しており、シリンジへの吸い上げに適し、非経口の適用に適しており、市販のアジュバント同様に適合性があり、且つ、不完全フロイント同様に活性を有する。
【００１５】
疎水性化した大いに分散させた二酸化珪素が、調製の直ぐ後に確立されるチキソトロープ効果によって乳濁液を安定させる。この機械的に応力除去された乳濁液の粘度は、或る時間遅れて増加する。この状態は、（少し振るだけで乳濁液は流動状態へ変えられるので）反転させることができる。そして乳濁液をシリンジへ容易に吸い上げる事が出来て、非経口的に投与できる。従って、この乳濁液はアジュバントとしての利用に特に適するものとなる。更に注目すべき点は、この乳濁液の極めて良好な温度安定性である。これはおそらく、二酸化珪素粒子の強化枠構造安定性により、温度上昇によって高まった滴の凝集傾向が二酸化珪素粒子により補償されることによるものである。この安定な材料物質調合物において、水の粒子は比較的大きな平均滴直径（好ましくは５〜３０μｍのレンジ）を有していて良く、これにより、採用すべき乳化剤の量が減り、調製手順が簡素化され（混合技術が容易になる）、そして、低い粘度が達成される。乳濁液１００ｍｌに対して、この材料物質調合物は、好ましくは、最大１．５ｇの二酸化珪素を含む。疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素の利用は、更に、アジュバントとして用いる場合、活性に関しても、有益な効果を有している。
【００１６】
二酸化珪素は現在まで非経口投与からは除外されてきた。その理由は、従来の研究において（組織過敏や、予防接種膿瘍などの）毒性の効果が報告されていたからである。驚くべき事に、疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素による本発明の材料物質調合物の場合、それにはあてはまらない。二酸化珪素を疎水性化しておおいに分散させることにおいて、所望の安定性の達成には疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素は極めて少ない使用量で十分であるという事は、耐性の点で有益である。更に、この材料物質調合物の調製のきわめて簡単な操作性もまた有益である。
【００１７】
驚くべき事に、安定剤としてレシチンを使用したことにより、所望の安定性を持ち、シリンジへの吸い上げに適した水／油‐乳濁液のかたちの材料物質調合物も達成される。現在まで、レシチンは乳化剤としては広く利用されているが、水／油‐乳濁液のかたちでのアジュバントの安定性のためには利用されていない。この乳濁液の安定性のためには、乳濁液の調製時、比較的短い平均滴直径（好ましくは５μｍもしくはそれ以下）によることが有利である。この短い平均滴直径は特に、インラインローター‐ステーター分散装置を用いることにより得られる。レシチンの使用により、非経口投与時の極めて良好な耐性を備えた材料物質調合物が得られる。
【００１８】
この材料物質調合物は、安定剤として、疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素のみ、もしくは、レシチンのみを含んでも良い。但し、原理的には、疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素とレシチンを組み合わせて含んで、この二種の安定剤の利点が互いに組み合わされるようにしても良い。更に、前述の安定剤のうち一方もしくは他方を用いる、もしくは、両安定剤を組み合わせて用いる場合は一種乃至数種の追加の安定剤を加えることも可能である。
【００１９】
油性相は、液体脂肪、液体油、液体ワックスの材料分類のうちから単一の材料物質に基づいてよい。また、材料分類のうちの一つからの、もしくは、複数の材料分類を組み合わせたうちからの、数種の材料物質から構成しても良い。更に、数種の材料分類に起因する材料物質を含んでも良い。
【００２０】
特に、アジュバント、もしくは、ワクチンとして使用するために、この液体調合物の水性相は、注入を目的とした水分と生体に適合させた生理学的無機塩添加剤とからなる、特に、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）からなる緩衝剤処理液に基づいてよい。
【００２１】
更なる実施例に拠れば、この材料物質調合物は、特に、ワクチンの貯蔵耐久性の長期化に関連して防腐剤を含む。好ましくは、防腐剤は（特に、水性相が抗原もしくは活性の因子を包含する役割を果たす場合）基本的に水性相に含まれる。
【００２２】
油性相は、特に、中性の油および／またはパラフィン油および／またはイソプロピルミリステートおよび／またはイソプロピルステアレートおよび／またはイソプロピルパルミテートおよび／またはエチルオレエートおよび／またはオクチルパルミテートおよび／またはオレイルオレエートおよび／またはヘキシルラウレエートに基づいてよい。上記の各材料物資の仕様については、特に、エー・ワーデ／ピー・ジェー・ウエラー共著「医薬品付形剤ハンドブック」ザ・ファーアスーチカルプレス・ロンドン社発行第２版（１９９４年）を参照する。中性油の仕様は同書２９９〜３０１頁の「中鎖トリグリセリド」の項に示され、イソプロピルミリステートは、２４３〜２４４頁に説明されている。材料物質調合物の試験はイソプロピルミリステートによって行った。前述したうち（これと同様の化学特性を持った）更に別の材料物質の使用により、比較可能な結果が得られることが見込まれる。本発明は、前述の各物質のうちのただ一つを含んだ材料物質調合物の全種類から成り、また、前述の各物質の任意の組み合わせを含んだ材料物質調合物から構成される。
【００２３】
乳化剤は、好ましくは、油性相に含まれる。乳化剤は一定の材料でも良いし、また、各種材料の混合物でも良い。乳化剤は特に、ポリグリセロールおよび／またはポリグリセリドで良い。好ましくは、ポリグリセリル‐２ジポリヒドロキシステアレートを、他の乳化剤との組み合わせの場合にも選択的に、乳化剤として用いる。
【００２４】
二酸化珪素は、好ましくは、油性相に含まれる。レシチンは好ましくは、油性相と水性相の間の境界層に付加される。大いに分散させる二酸化珪素は好ましくは、ナノメートルのレンジの、即ち、１〜数百ナノメートルのレンジの、平均粒子直径を有する。好ましくは、二酸化珪素は、１０〜２０ナノメートルの平均直径を有する。
【００２５】
有益な変形例によれば、二酸化珪素は、珪質面に、例えば、珪質面に濃縮させたシラノールとシロキサン基により、疎水性化させる。
【００２６】
特に有益であるのは、乳濁液約１００ｍｌあたりイソプロピルミリステート２５±５ｍｌ、ポリグリセリル‐２‐ジポリヒドロキシステアレート１．５±１．０ｍｌ、液体相７５±５ｍｌ、二酸化珪素１±０．５ｇ含んだ材料物質調合物である。例外的に有益であるのは、体積部分と質量部分がそれぞれ、上記のレンジの相応の平均値を取る材料物質調合物である。前述の態様を備えた材料物質調合物は、ワクチンの為のアジュバントとして用いた場合の相の位置、滴サイズ、粘度測定値、シリンジへの吸い上げ最適性、安定性、乳化破壊作用、耐性、活性について調査したところ、特に有益な結果を得た。
【００２７】
前述の材料物質調合物において、水性相の滴の平均滴直径は好ましくは５〜３０μｍのレンジに位置し、好ましくは約１５μｍである。
【００２８】
更に、特に有益であるのは、乳濁液約１００ｍｌあたりイソプロピルミリステート２５±５ｍｌ、ポリグリセリル‐２‐ジポリヒドロキシステアレート２．５±１．５ｍｌ、ホスホリピド２．５±１．５ｍｌ、液体相７５±５ｍｌ含んだ材料物質調合物である。例外的に有益であるのは、体積部分と質量部分がそれぞれ、上記のレンジの相応の平均値を取る材料物質調合物である。前述の態様を備えた材料物質調合物は、ワクチンの為のアジュバントとして用いた場合の相の位置、滴サイズ、粘度測定値、シリンジへの吸い上げ最適性、安定性、乳化破壊作用、耐性、活性について調査したところ、特に有益な結果を得た。
【００２９】
水性相の平均滴直径は好ましくは、前述の材料物質調合物において約０．５〜５μｍである。
【００３０】
この特許出願において、「平均滴直径」および「平均粒子直径」と呼んでいるのは、滴や粒子の形状が小球状で無い場合の、二つ乃至それ以上の異別の直径の算術平均の結果得られる直径である。滴の集合、粒子の集合それぞれについては、「ソーテル直径」を平均直径とする。形状が小球状とは異なる粒子の直径を考慮しなければならない限りにおいては、前記した原理に従って、各直径の平均を出す。
【００３１】
この材料物質調合物は好ましくは、０．５ｍｍもしくはそれ以上の直径のカニューレへの吸い上げに適している。
【００３２】
ワクチンとしての使用のために、水性相は、少なくとも一個の抗原を有する。そのように実施するに際し、抗原は好ましくは、水性相の体積部分の代用をする。この欠乏により、（少なくとも一つの抗原を用いる場合）前記した体積部分と質量部分が同等に有効である。
【００３３】
抗原としては、特に、バクテリア抗原、ウイルス性抗原、寄生虫性抗原、真菌性抗原、トキソイド、バクテリア分裂抗原、ウイルス性分裂抗原、寄生虫性分裂抗原、ＤＮＡストランド、ＤＮＡストランド分節、組換えプロテインが利用できる。
【００３４】
抗原は特に、家畜やヒトのためのワクチン抗原で良い。耐性及び活性の調査結果は、本発明材料物質調合物を複数の家畜並びにヒトの為のワクチンとして適用可能であることを予期させる。各種の家畜動物と、ヒトについて挙げた下記の各抗原は、例示だけを目的としている。
【００３５】
ブタ：　動物パスツレラ症病原菌、気管支敗血症菌、ブタ丹毒菌、大腸菌、ウエルシュ菌、アクチノバチルスうし肺疫菌、ヘモフィルスパラスイス、ストレプトコッカス・スイス、サルモネラ・セロバール、エルシニア全腸炎菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、ブタ生殖呼吸症候群ウイルス、インフルエンザウイルス、偽性狂犬病ウイルス、ブタシルコウイルス、ピコルナウイルス、ブタパーボウイルス（ＰＰＶ）、ブタ熱ウイルス
【００３６】
食用飼鳥類：　大腸菌、サルモネラ・セロバール、腸カンピロバクター、エルシニア・シュードツベルクローシス、動物パスツレラ症病原菌、ヘモフィルス・パラガリ・ナルーム、ボルデテラ・アビューム、マイコプラズマ・ガリセプチクム、ウエルシュ菌、ボツリヌス菌、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、エイメリア種、鳥類脳脊髄炎ウイルス、感染性滑液嚢炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、鳥類ポックスウイルス、関節炎／腱滑膜炎ウイルス、感染性貧血／ＣＡＡウイルス
【００３７】
ウシ：　ロタウイルス、ウシウイルス性下痢／粘膜病、パラインフルエンザ‐３‐ウイルス、ウシ熱ウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、家畜地方病性ウシ白血病ウイルス、ヘルペスウイルス（ＩＢＲ／ＩＰＶ）、サルモネラ・ダブリン、サルモネラ・セロバール、クラミジア・シターキ、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・ボビス、ストレプトコッカス・アガラクシア、黄色ぶどう球菌、化膿性コリネバクテリウム、大腸菌、動物パスツレラ症病原菌、ヘモフィルス・ソムナス、うし流産菌、カンピロバクター・フィータス、ウシモラクセラ、トリコフィトン・ベルコサム、足口病ウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ
【００３８】
ヒツジ／ヤギ：　パラミクソウイルス（小さな反芻動物の熱）、ひつじ肺腺腫症ウイルス（レトロウイルス）、マエディ‐ビスナウイルス、ヤギ感染性関節炎・脳炎ウイルス、ヤギポックスウイルス、ヒツジポックスウイルス、クラミジア・シターキ、マイコプラズマ・アガラクシア、サルモネラ・セロバール、大腸菌、マルタ熱菌、リステリア単核細胞遺伝子、動物パスツレラ症病原菌、パスツレラ・ヘモリチカ
【００３９】
ヒト：　気管支敗血症菌、大腸菌、パーボウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルス属、アデノウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、サルモネラ・セロバール、Ａ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、フレキスナー赤痢菌、野兎病菌、動物パスツレラ症病原菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純疱疹ウイルス、腸内ウイルスなど）
【００４０】
本発明の材料物質調合物は、好ましくは、（少なくともひとつの抗原を水性相に編入させて）ワクチンのアジュバントとして使用される。望ましい使用方法は、不活性な状態のワクチンのためのアジュバントとしての使用である。更には、家畜やヒトのためのワクチンのアジュバントとして用いられることも好ましい。非経口の投与が望ましい。
【００４１】
抗原から成る材料物質調合物が、好ましくは、ワクチンとして使用される。更に、不活性な状態のワクチンとして用いられることが望ましい。結局の所、家畜やヒトのワクチンとしての使用が特に望ましい。
【００４２】
本発明の実施の例を以後の各項目で詳細に説明する。
１．アジュバントに用いる成分の仕様
２．アジュバントの処方
３．アジュバント処方の調製
４．ねずみ、ニワトリ、ブタによる耐性試験
５．てんじくねずみ（ブタパーボウイルス‐ＰＰＶ）と、兎（ｒＳｔｘ−Ｉｌｅ−Ｂ−プロテイン）による活性試験
【００４３】
各実施例は添付の図面を参照する。各図は以下の通りである。
図１は、疎水性化した変異体Ｒ９７２、Ｒ９７４におけるエアロジル表面のシラノール基の概略図である。
図２は、エアロシル粒子どおしの相互作用の概略図である。
図３は、プラシーボのＷ／Ｏ型乳濁液Ｇ９８Ｖ０４−１０１の特性を表す光学顕微鏡写真である。
図４は、プラシーボのＷ／Ｏ型乳濁液Ｇ９９Ｖ０９−１２の特性を表す光学顕微鏡写真である。
図５は、攪拌機構造の上下方向の断面図である。
図６は、ＩＫＡ　ＵＴＬ２５型インライン式ウルトラ・タラックスの構造の縦断面図である。
図７は、実験終了時のマウスの平均体重を示す。
図８は、実験開始時、二回目のワクチン接種前、実験終了時のニワトリの平均体重を示す。
図９は、オピッツ病後の注射部位の評価を示す。
図１０は、各種ワクチン接種後におけるてんじくねずみのＰＶＰ抗体の滴定量を示す。
図１１は、ｒＨｉｓ‐ＳｔｘＢ２ｅおよびその他のアジュバント接種後におけるうさぎの抗‐Ｓｔｘ２ｅ抗体の滴定量を示す。
【００４４】
１．アジュバントとして使用される成分の特性
望ましい処方の成分について、本項で詳述する。製造者からの物質並びに安全性仕様書を引用する。
１．１　イソプロピルミリステート（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ（登録商標））

機能：　油分
製造者：　ゴールドシュミット・アーゲー（エッセン、Ｔｅｇｏｓｏｆｔ（登録商標））等
摘要公式：　Ｃ_１７Ｈ_３４Ｏ_２
分子構造：
【００４５】
分子量：　　２７０．５ｇ／ｍｏｌ
色：　　　　無色、透明
臭い：　　　無臭
【００４６】
鹸化価：　　２０２〜２１２ｍｇＫＯＨ／ｇ
酸価：　　　＜１ｍｇＫＯＨ／ｇ
水分：　　　＜０．１％
【００４７】
凝集の状態：　　液体
密度（２０°Ｃ）：　　０．８５〜０．８５５ｇ／ｍｌ
粘度（２０°Ｃ）：　　７〜９ｍＰａ・ｓ
沸点：　　１９２°Ｃ
屈折率（２０°Ｃ）：　１．４３４〜１．４３７
【００４８】
毒性：　　毒性の効果は全く検出されていない。
微生物カウント：　＜１０ＣＦＵ／ｍｌ
モノグラフ：　ＤＡＢ１０（ドイツ薬局方）、イギリス薬局方；
ＭＲＬ（平均残余レベル）状況：　添付書類ＩＩ。
【００４９】
１．２　ポリグリセリル‐ジポリヒドロキシステアレート（Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標）ＰＧＨＰ）
機能：　Ｗ／Ｏ型乳化剤
製造者：　コグニス・ドイチュラント　ゲーエムベーハー（旧ケアー・ケミカルズ社（１９９８年以前）、ヘンケル）等
分子量：　　３０００ｇ／ｍｏｌ
【００５０】
外観：　　　光沢あり、多少濁りあり、粘りあり。
臭い：　　　刺すように激しく、僅かに脂っけがある。
【００５１】
鹸化価：　　１７０〜１９０ｍｇＫＯＨ／ｇ
酸価：　　　＜０．１ｍｇＫＯＨ／ｇ
ＨＬＢ特数：　３〜５
【００５２】
密度（２０°Ｃ）：　　０．９５ｇ／ｍｌ
粘度（２０°Ｃ）：　　５５００〜６０００ｍＰａ・ｓ
沸点：　　＞１８０°Ｃ
【００５３】
毒性：　　毒性の効果は全く検出されていない。
【００５４】
微生物カウント：　＜１０ＣＦＵ／ｍｌ
モノグラフ：　現在、薬局方にはモノグラフが無い。尚、実際のところ、この乳化剤を構成する単独の成分（グリセリン、ステアリン酸、グリセロールエステル）についてはそれぞれ薬局方に論文提出されている。
ＭＲＬ状況：　主成分は中鎖グリセロールトリエステルであり、これらは、（体内に生じる）生理学的物質である；　ＭＲＬ状況：　添付書類ＩＩ。
【００５５】
１．３　疎水性化し大いに分散させた二酸化珪素（エアロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））Ｒ９７４）
機能：　安定剤
製造者：　デグーザ・ヒュルズ・アーゲー（エアロジル（登録商標）Ｒ９７４）など
構造式：　ＳｉＯ_２
主要粒子の構造：

【００５６】
分子量：　　６０．０８ｇ／ｍｏｌ
外観：　　　白い非晶質粉末程度の白色
臭い：　　　無臭
【００５７】
密度（２０°Ｃ）：　　２．２ｇ／ｍｌ
突き固め密度：　　５０ｇ／ｌ
特定面：　　　　　１５０〜１９０ｍ^２／ｇ
乾燥ロス：　　　　＜０．５％
炭素成分：　　　　０．７〜１．３％
ＳｉＯ_２成分（脚注２０）：　　＞９９．８％
平均直径主要粒子：　　１２ｎｍ
【００５８】
毒性：　ＬＤ_{５０、ｒａｔ}　＞　５０００ｍｇ／ｋｇ、異論の出ない粘膜耐性；
６ヶ月間にわたり毎日経口でエアロジル（登録商標）Ｒ９７４を５００ｍｇずつ投与したラットについて、組織学的にも、病理学的にも、何らの変化も観察されなかった。また、発癌性もしくは補発癌性の作用は観察されなかった。非晶質構造の結果、珪肺症は除外しなければならない。
微生物カウント：　この製品の構造、少ない水分、調製方法の結果として、エアロジル（登録商標）Ｒ９７４は、高い蓋然性をもって自己滅菌する。
モノグラフ：　大いに分散された二酸化珪素は、ＥＡＢ（欧州薬局方）に基づき薬品補助剤として経口及び局所の適用のために一般に公開されている。
【００５９】
付記：
エアロジル変異体はすべて、デグーザ社が開発した高温加水分解法により調製した合成の、大いに分散させた珪酸である。疎水性化したエアロジル変異体において、シナノール‐（Ｓｉ‐ＯＨ）と、シロキサン（Ｓｉ‐Ｏ‐Ｓｉ）基を珪素面に集中させる。（参考：図１、出典：デグーザ・アーゲー、「製薬学及び美容化粧法におけるエアロジル」、色素顔料論文第４９号（１９９２年発行））
【００６０】
枠構造の形成は、油中にエアロジルＲ９７４を採用する場合チキソトロープ効果発生を得られる原因となる。
【００６１】
集塊および枠構造の形成が、チキソトロピーにつながる。枠は、剪断力の強さにより反転して壊れる。（参照：図２、前記出典。）
脚注（２０）：　十分に焼成した物質に関する。
【００６２】
１．４　リン脂質（Ｓｔｅｒｎｐｕｒ（登録商標）ＰＭ）
機能：　安定剤
製造者：　スターン・レシチンアンドゾーヤ・ゲーエムベーハーアンドカンパニー．カーゲー、Ｓｔｅｒｎｐｕｒ（登録商標）ＰＭ
リン脂質の一般構造：
【００６３】

【００６４】
リン脂質の一般分子構造：

【００６５】
ホスファチジルコリンの特定分子構造：

【００６６】
根源：　植物（ダイズレシチン）
外観：　浅黄粉末
臭気：　（濃縮ダイズ油のように）刺激性、芳香性あり。種ごとに特定臭気あり。
【００６７】
鹸化価：　＜３ｍｇＫＯＨ／ｇ
酸価：　　＜３５ｍｇＫＯＨ／ｇ
リン脂質成分：　＞９６％
【００６８】
密度（２０°Ｃ）：　　１．０ｇ／ｍｌ
粘度（２０°Ｃ）：　　‐
沸点：　　４５〜５０°Ｃ
【００６９】
毒性：　　毒性の効果は全く検出されていない。ＡＤＩ値は述べられない。
微生物カウント：　標準製品　＜３０００ＣＦＵ／ｇ、医薬品グレード　＜１０００ＣＦＵ／ｇ
モノグラフ：　ＳｔｅｒｎｐｕｒＰＭは、レシチンに関するＥＥＣ規則９５／２ＥＧのＥ３２２の法規定に従っている。
【００７０】
付記：
用語レシチンは、所謂リン脂質の系統全体を含んでいるが、狭義では、ホファチジルコリンのみをレシチンと称している。リン脂質は、あらゆる動物細胞、植物細胞における細胞構成物として生じる。
【００７１】
一般的に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の含有量が多くなるほど、製品は高価になると言える。レシチンは卵黄に多く見られる。（レシチンという呼称も、ギリシャ語で卵黄を意味するｌｅｋｉｔｈｏｓからきている。）だが実際のところ、レシチンは主にダイズから回収されている。
【００７２】
１．５　ホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）
ホスフェート緩衝液は、注入を目的とした水分と、器官に適合させた生理学的無機塩添加物とから構成される。ホスフェート緩衝液の組成は下記の成分の組み合わせに基づく。
【００７３】
配合ホスフェート緩衝液（１００ｍｌあたり）：
塩化ナトリウム　０．８００ｇ
塩化カリウム　０．０２０ｇ
燐酸水素二ナトリウム×２Ｈ_２Ｏ　０．０１４ｇ
燐酸二水素カリウム　０．０１２ｇ
注入目的の水分（無菌）　１００ｍｌ
【００７４】
密度（２０°Ｃ）：　　１．００３ｇ／ｍｌ
粘度（２０°Ｃ）：　　１．００２ｍＰａ・ｓ
ｐＨ値（２０°Ｃ）：　７〜７．２
弾力性：　２８０〜３１０ｍＯｓｍ
【００７５】
付記：
この無機塩添加物は、第一義的に、ワクチンの水性相の等張化のために働く。
プラシーボ乳濁液の調製時、水性相には排他的にＰＢＳを含むが、一方、完全ワクチンの水性相は、ＰＢＳのほかに、抗原分画も含んでいる。抗原分画は、必要な活性物質濃度に調節される。
大抵の場合、アジュバントは各種の抗原との混合が可能である。
【００７６】
１．６　チオメルサル
機能：　防腐剤
構造式：　Ｃ_９Ｈ_９ＨｇＮａＯ_２Ｓ
分子量：　４０４．８１ｇ／ｍｏｌ
分子構造：

根源：　無機物
外観：　セーム革色、結晶質粉末
臭気：　特徴的臭気。種ごとに特定の臭気。
安全性規則：　吸引フードの下のみで処理。吸い込みを禁ずる。皮膚または粘膜に接触させることを禁ずる。
【００７７】
付記：
チオメルサルは乳化以前にＰＢＳ溶液に溶かす。前述の「医薬品付形剤ハンドブック」において、０．０１％のチオメルサル濃度が注入溶液（筋肉注射、静脈注射、皮下注射）の基準値として示唆されている。この水銀含有コンパウンドは１９３０年以後、医薬的応用の場面で防腐剤として用いられている。
【００７８】
２．アジュバント処方
２．１　処方Ｇ９８Ｖ０４−１０１の仕様
処方：　Ｇ９８Ｖ０４−１０１：
イソプロピルミリステート（ＴｅｇｏｓｏｆｔＭ（登録商標））：　２４．７７ｍｌ
ポリグリセリル‐２ジポリヒドロキシステアレート（Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標）ＰＧＨＰ）：　０．９３ｍｌ
燐酸緩衝液溶液（ＰＢＳ）：　７４．３０ｍｌ
疎水性化し大いに分散させた二酸価珪素（Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）Ｒ９７４）：　０．７４３ｇ
即ち、０．７４ｇのエアロジルＲ９７４を、乳濁液１００ｍｌへ加える。乳濁液の水性部は、ｕ７５％、油性部は、ｕ２５％である。
【００７９】
処方ｇ９８Ｖ０４‐１０１の基本態様は、
・受け入れ得る粘度を持った安定なＷ／Ｏ型乳濁液
・低い乳化破壊度合
・Ｗ／Ｏの相分配関係　ｕ７５／２５
・極めて大きな平均滴直径（ｄ_{ｐ、ｍａｘ}＞２０μｍ）
・流動学特性：　本質的粘性、チキソトロープ。
・ナノスケールの固体粒子（ナノ粒子）の使用が、アジュバントに対する別の有利な効果を備えて、Ｗ／Ｏシステムを安定させる役割を果たす。
・極めて温度安定な乳濁剤
・極めて簡素な調製手順
である。
【００８０】
このプラシーボ、乳濁液Ｇ９８Ｖ０４−１０１の最も明白な態様は、チキソトロープ効果であって、チキソトロープ効果はそれ自体、調製の直ぐ後に（即ち、乳濁液が「凝固」したようになる或る定常の時間の後に）確立する。この状態は反転可能であり、短く振るだけで、相互作用するナノ粒子の構成枠を破壊するには十分である。
【００８１】
チキソトロープ物質において、剪断応力の一時的な衝撃により粘度は低下する。幾分かの休止時間後、液体が再度形成され、原初の粘度に再び接近する。チキソトロピーは、たいていの場合、構造上の粘度とともにみられる。この流れの変則性の理由は、引力による分子枠の組立てである。
【００８２】
即ち、処方ｇ９８Ｖ０４‐１０１に関しては、時間に依拠して、乳化破壊作用の減速がおこり、最終的に明確なエアロジルＲ９７４濃度を発端とする凝固につながる。
【００８３】
極めて良好な温度安定性についての引用した態様に関しても、チキソトロピー効果により説明される。即ち、高い目の温度において、Ｗ／Ｏシステムの乳化破壊傾向が増大する。説明した枠構造による安定化も加速される。しばしば説明したナノ粒子の特性の結果として、前記の安定化は、部分的に、最速の非安定化反応より速くなる。おそらく、ナノ粒子の相互分子ファンデルワールス力が、重力よりいっそう速く効果を表し、就中、凝集を強化する。
【００８４】
更に、組織過敏状態や、日々の体重増加の減少などの受け入れがたい不利な反応を生じることなく、免疫反応の改善を達成するために、ターゲットとなる動物種における免疫系への刺激が望ましい。
【００８５】
大きな平均滴直径についての引用した態様は図３に示している。
この処方における典型的な滴サイズ分配が認識できる。試料面は、位相対照顕微鏡の偏光が作用しているので立体的にみえる。この顕微鏡による方法により、用いたスライドカバーガラスと、その結果生じる毛細管の力によって、大き目の滴が互いに押圧されて一体化し、一方、小さ目の滴は殆ど理想的な球状のままとなる。滴サイズの分配が、スライドカバーガラスを置くことにより干渉されるかぎり、このシステムエラーは、引き続く分配機能の評価において考慮される。
【００８６】
上記のプラシーボ‐処方に対照させて、ＰＢＳの限定した部分を、ＰＰＶ‐抗原（ＩＡＤ−ＰＰＶ１０１）を備えたワクチン変異体における抗原の、同等の体積部分と交替させる。
【００８７】
２．２　処方Ｇ９９Ｖ０９１２（リン脂質具備）の仕様
処方：　Ｇ９９Ｖ０９−１２：（１００ｍｌについて）
イソプロピルミリステート（ＴｅｇｏｓｏｆｔＭ（登録商標））：　２５．００ｍｌ
ポリグリセリル‐２ジポリヒドロキシステアレート（Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標）ＰＧＨＰ）：　２．５ｍｌ
リン脂質（ＳｔｅｒｎｐｕｒＰＭ（登録商標））：　２．５ｍｌ
燐酸緩衝液溶液（ＰＢＳ）：　７０．００ｍｌ
【００８８】
乳化剤の要件の実質的な増大は、内面の拡大の結果である。湿潤されるべき相境界層エリアは、処方Ｇ９８Ｖ０４−１０１に比べて、ちいさめの平均滴直径により、増加する。（図４参照。）完全にこの処方は、面活性物質の５％からなる。
【００８９】
処方ｇ９９Ｖ０９‐１２の基本態様は、
・幾分増加した粘度を持った安定なＷ／Ｏ型乳濁液
・極めて低い乳化破壊度合
・Ｗ／Ｏの相分配関係　＝７５／２５（＋５％の補助物質）
・小さな平均滴直径
・流動学特性：　本質的粘性。
・リン脂質の使用が、耐性を改善する。
・小さなチキソトロピー効果
・ローター・ステーター原理に従った調製方法
前述の処方と比較して、この補助物質エアロジルＲ９７４だけを、ＳｔｅｒｎｐｕｒＰＭに変更したとしても、基本的に修正されたアジュバントが、この処方により扱われる。そのアジュバントは別の医薬特性を示し、製造手順のプロセスエンジニアリングに一層高度な要件を付加する。
【００９０】
事実上、前記したワクチンＩＡＤ　ＰＰＶ−１０１へ適用された相違点と同様の相違点、即ち、「ＰＢＳの限定した部分を所望のワクチン量あたりの滴定量が達成されるよう濃縮した抗原に代えること」をワクチン変異体ＩＰＤ　ＰＰＶ‐１２へも適用する。
【００９１】
３．アジュバント処方の調製
３．１　処方Ｇ９８Ｖ０４−１０１
図５の攪拌機を用いる。２台の三枚羽根プロペラ式アジテータ（２、３）を攪拌機のアジテータ軸に取り付ける。
【００９２】
アジテータ軸の上下方向の傾斜角度と、炉型攪拌容器（４）の壁傾斜角度は図に示した。この場合の主要な寸法は、
Ｄ：　容器直径
Ｄ_１：　Ｚ_１での容器直径
Ｄ_２：　Ｚ_２での容器直径
ｄ_１：　プロペラ大の直径
ｄ_２：　プロペラ小の直径
Ｚ_０：　高さ、液位
Ｚ_１：　平均高さ、プロペラ大
Ｚ_２：　平均高さ、プロペラ小
【００９３】
下記の表に選択した寸法を示す。

【００９４】
乳濁液ｇ９８Ｖ０４‐１０１調製用原材料、原材料使用量、前記攪拌機によって行われる加工ステップについては、以下の調製方法の説明に示している。
【００９５】
Ｗ／Ｏ型乳濁液プラシーボＧ９８Ｖ０４−１０１
バッチサイズ：　１０４．７５ｇ＝１０７．４６ｍｌ
組成：　Ｈ１に基づく。

【００９６】
調製の説明：
部分バッチＩ
Ｄｅｈｙｍｕｌｓ　ＰＧＨＰは攪拌により、イソプロピルミリステート中に均質化する。混合は、０．２μｍフィルターにより無菌濾過する。
部分バッチＩＩ
チオメルサルを、予め滅菌したＰＳＢに溶かし、バッチ容器を回転させる。
運転中のブレード式攪拌機により部分バッチＩＩを部分バッチＩへ加える。引き続いて、乳濁液を更に３分間、ブレード式攪拌機を毎分６００回転させて、分散させる。
ワクチンのＩＰＫ（インプロセスコントロール）：　　相分配Ｗ／Ｏ　　乳濁液汚染性試験
パッケージング：
２本の５０ｍｌのクリアーなガラスバイアルに、無菌のＨＫ１（３８９１）を、ブロモブチルストッパー、無菌（３８７２）とアルミニウムキャップ（３８４７）とともにパッケージする。調製と投与の間の短時間の間に、暗所の室温での保管が最適である。貯蔵時間が延びる場合、貯蔵は５°Ｃで行うこと。
【００９７】
１本の５０ｍｌのクリアなガラスバイアルに入れた保管試料を冷却室で５°Ｃで保管する。
注：　調製は無菌の実験室で、熱風滅菌装置と、主要なパッキング材料によって、ＬＦ（ラミナーフロー）のもとで無菌状態で行った。
＊燐酸緩衝液（ＰＢＳ）：　ｐＨ７．１２；　弾性力　３００ｍＯｓｍｓ
メルック　　塩化ナトリウム　　　＃Ｋ９１０７３５０４８０６　０．８００ｇ
メルック　　塩化カリウム　　　　＃Ｋ２３９８２４３６７２４　０．０２０ｇ
メルック　　燐酸水素二ナトリウム２Ｈ２Ｏ
＃Ｋ２２１８４４９８０５３８　０．１１４ｇ
ＲｄｅＨ^３１　燐酸二水素カリウム　＃７３３２０　　　　　　　０．０１２ｇ
１２３５　　注入用水分　　　　　　‐　　　　　　　１００ｍｌまで追加。
＊＊０．０１％に相応。
（３１）リーデル・デ・ヘーン
【００９８】
処方Ｇ９９Ｖ０９−１２
小さ目の滴の発生のための実質的に高い剪断力が、この処方の調製時、作用するようになった。この目的の為に、追加のインラインロータステータ分散装置を処方調製のための機構に組み込む。この装置は、ＩＫＡ社製の分散装置ＩＫＡＵＴＬ２５型インライン式Ｔｕｒｒａｘである。図６に示している。製品の搬送は、符号５の中央部分で行われ、混合ヘッド６へ送られる。この装置にはモーター８で駆動されるローター７を含んでいる。製品はロータ７で加速され、ステータスリット９を通され手、外周の出口１０から撤収される。
【００９９】
この分散装置の技術データは以下の表のとおりである。
技術データ　ＩＫＡ　ＵＴＬ２５型インライン式ウルトラ・タラックス
インライン装置寸法：　　　１７ｍｍ
再循環ライン　　　　　　　ＤＮ１０
ローター　：　　　　　　　　　Ｇ２０、２基
ステーター：　　　　　　　　　Ｇ３０、３基
ドライブ：　　　　　　　　　　三相、交流モーター
定格電圧：　　　　　　　　　　２４０Ｖ±１０％
駆動ワット　　　　　　　　　　１９０Ｗ
回転速度　　　　　　　　　　　毎分８０００〜２４０００回転、無限調節可能
別途の装置：　　　　　　　　　装置清掃用バイパスライン
【０１００】
このインライン分散装置は図５のように、フィードラインを備えた攪拌容器４の炉型出口につなぐ。そして、混合ヘッド６外周の出口１０から、再循環ラインが攪拌容器４内へ伸びている。これにより、連続的な円形の流れが、攪拌容器４を介して混合ヘッド６の混合室を通過できる。但し、このインライン式ウルトラタラックスではポンピング特性が制限されているので、混合室を調節してほぼ攪拌容器４の製品液レベルにする必要がある。
【０１０１】
以下の調製についての説明において、乳濁液Ｇ９９Ｖ０９‐１２の調製に採用された原材料と、その量、並びに、前記の機構によって実施する調製ステップに関して詳細に引用している。
【０１０２】
Ｗ／Ｏ型乳濁液プラシーボＧ９９Ｖ０９−１２
バッチサイズ：　９６．３５ｇ＝１００．００ｍｌ
組成：　Ｈ２１２に基づく。

【０１０３】
調製の説明：
部分バッチＩ
Ｄｅｈｙｍｕｌｓ　ＰＧＨＰは２〜３分の攪拌により、イソプロピルミリステート中に均質化する。それから、スターンパーピーエム粉末を加え、過熱式磁石攪拌機による５０°Ｃでの永久攪拌の下で溶かす。溶液は、０．２μｍフィルターにより無菌濾過する。
【０１０４】
部分バッチＩＩ
チオメルサルを、予め滅菌したＰＳＢに溶かし、バッチ容器で回転させる。
運転中のブレード式攪拌機により部分バッチＩＩを部分バッチＩへ加える。引き続いて、乳濁液を更に３分間、ブレード式攪拌機を毎分６００回転させて、分散させる。きめ細かな分散が、ウルトラ・タラックスによる１８０００〜２４０００回転^{（＊３２）}で起きた。
ワクチンのＩＰＫ（インプロセスコントロール）：　　相分配Ｗ／Ｏ　　乳濁液汚染性試験
パッケージング：
２本の５０ｍｌのクリアーなガラスバイアルに、無菌のＨＫ１（３８９１）を、ブロモブチルストッパー、無菌（３８７２）とアルミニウムキャップ（３８４７）とともにパッケージする。調製と投与の間の短時間の間に、暗所の室温での保管が最適である。貯蔵時間が延びる場合、貯蔵は５°Ｃで行うこと。
【０１０５】
１本の５０ｍｌのクリアなガラスバイアルに入れた保管試料を冷却室で５°Ｃで保管する。
注：　調製は無菌の実験室で、熱風滅菌装置と、主要なパッキング材料によって、ＬＦ（ラミナーフロー）のもとで無菌状態で行った。
＊燐酸緩衝液（ＰＢＳ）：　ｐＨ７．１２；　弾性力　２９０ｍＯｓｍｓ
メルック　　塩化ナトリウム　　　＃Ｋ９１０７３５０４８０６　０．８００ｇ
メルック　　塩化カリウム　　　　＃Ｋ２３９８２４３６７２４　０．０２０ｇ
メルック　　燐酸水素二ナトリウム２Ｈ２Ｏ
＃Ｋ２２１８４４９８０５３８　０．１１４ｇ
ＲｄｅＨ３１　燐酸二水素カリウム　＃７３３２０　　　　　　　０．０１２ｇ
１２３５　　注入用水分　　　　　　‐　　　　　　　１００ｍｌまで追加。
＊＊０．０１％に相応。
（＊３２）１８ｍｍのローターの毎分約１４０００回転、乳濁液をよりきめ細かくしたければ２４０００回転による。
【０１０６】
４．１　マウスによる耐性試験
試験番号３００／９９
１．標題：　試験番号３００／９９
マウスによる新しいアジュバントについての耐性検定
２．試験の詳細
方法：　・ランダム試験
・臨床観察（ＨＡＨ）による実験マウスの耐性検出
材料：　・ワクチン製剤
動物：　・ＳＰＦマウス（チャールズ・リバー）
名称：　ＮＭＲＩ、メス
頭数：　４２
年齢：　１７〜２０ｇ
該当する細菌無菌：　ＳＰＦ証明書
予防接種量：　０．５ｍｌ／動物
適用：　皮下注射
観察時間：　接種後１０日間
評価分類：　・動物の健康、病気、死亡を毎日記録。
・観察期間の終わりに体重を記録。
【０１０７】
３．対照動物
ＰＢＳをマウス１０匹にすべて同じかたちで投与した。
【０１０８】
４．結果

【０１０９】
マウスの個々の体重は添付書類１に示した。
注入部位の評価は添付書類２に示した。
図７は、試験終了時の動物平均体重を示す。
５．望まれない逆効果
−　無し。
６．実験中に投与された薬剤
−　無し。
【０１１０】
７．結果に関する論考
各種ワクチン試料の皮下注射は、注射部位について外から目視可能な、もしくは、触知可能な変化につながらなかった。
【０１１１】
実験終了時の動物の解剖において、グループ１、２の動物の注射部位に、球形から長楕円形の、白色の、濁った含有物が確認された。これらのカプセルは開放可能で、ゲル状の液が詰まっており、それは、後の研究で、ワクチン残留物（Ｗ／Ｏ型乳濁液）であることが立証された。
【０１１２】
従って、遅延した抗原解放がグループ１で発生したことが想像される（グループ２は、プラシーボグループであった。）。
実験動物に系統的反応は観察されなかった。観察期間終了時に計測された体重は、グループ平均値の重大な差異を示さなかった。従って、新たに開発されたアジュバントは、皮下注射後の白色実験マウスにとって安全で、耐性があるものと評価される。
【０１１３】
添付書類１
マウスの最終体重

【０１１４】
添付書類２　　結果及び論考
表６：　実験番号３００／９９；　実験終了時の注射部位の評価

【０１１５】
図番号３３：

グループ１のマウスのワクチンカプセルを開放。（アジュバント：　エアロジルＲ９７４によるＷ／Ｏ型乳濁液）
試料体積は、０．６ｍｍのカニュレで、カプセル状のワクチン含有物から取った。
【０１１６】
図番号３４：

グループ３のマウスのワクチンカプセルを開放。（アジュバント：　水酸化ア
ルミニウムの懸濁液）
試料体積は、０．６ｍｍのカニュレで、カプセル状のワクチン含有物から取った。
図中上方右側の気泡ハ、スライドガラスカバーを置いた時だけ含まれた。
【０１１７】
４．２　ニワトリによる耐性試験
試験番号１４１／００，１４１−１／００
１．標題：　試験番号１４１／００、１４１−１／００
生後１０週のＳＰＦニワトリについて３プラシーボバッチの耐性試験
【０１１８】
２．試験の詳細
方法：　・ランダム試験
・臨床観察と、注入部位の病理学的−解剖学的評価によるＳＰＦニワトリの耐性検出
材料：　・プラシーボ製剤
・ワクチン「ＮＤＶａｃ　Ｐ．ｉ．」、バッチ番号：９０６５５００
動物：　・ＳＰＦニワトリ
種族：　ローマンホワイト
頭数：　３０
年齢：　１０週
該当する細菌無菌：　ＳＰＦ証明書
予防接種量：　１．適用：　０．５ｍｌ／動物（右胸筋）
２．適用：　１．５ｍｌ／動物（左胸筋）
適用：　筋肉注射
免疫：　１４日間隔で２回。
観察時間：　接種後１１日間
評価分類：　１．体重測定−　Ａ）第１回接種前
Ｂ）第２回接種前
Ｃ）試験終了時
２．日々の臨床対照（全般状況評価）
３．試験終了時に接種部位の局部対照（動物の解剖と、「オピッツ病」後の注射部位の評価
【０１１９】
３．対照動物
ＳＰＦニワトリ１０羽（注射無し）
【０１２０】
４．結果

【０１２１】
図８に、試験開始時、第２回接種前、試験終了時の平均動物体重を示す。
図９に、オピッツ病後の注入部位の評価を示す。
【０１２２】
５．望ましくない逆効果
−　無し。
６．実験中に投与された薬剤
−　無し。
【０１２３】
７．結果に関する論考
プラシーボ処方の適用は試験動物のいづれにも全般的な健康状態の悪化を生じなかった。また、どの動物にも注射部位における局部反応は観察されなかった。（第２回接種時及び実験終了時に目視判定と触診）
【０１２４】
体重が進展した場合でも、実験終了時（第２回接種後１４日め）にグループ間で重大な相違はみられなかった。
【０１２５】
実験終了時、注射部位の評価には差異があった。この場合、市販の比較ワクチンを接種したグループのニワトリは最も大きな局部組織変化を示した。最良の組織耐性は、プラシーボ処方Ｇ９８Ｖ０４‐１０１０（エアロジル加熱滅菌）を接種していたニワトリが示した。
【０１２６】
全体的評価は、処方Ｇ９８Ｖ０４‐１０１（エアロジル加熱滅菌）、Ｇ９８Ｖ０４‐１０１（エアロジル無菌濾過）、Ｇ９８Ｖ０９‐１２（リン脂質）が、生後１０週のＳＰＦニワトリへの二回の筋肉注射（０．５ｍｌ／ＩＤ、１．５ｍｌ／ＩＤ）の場合、安全で耐性ありという結果であった。
【０１２７】
添付書類１
サルモネラ菌の不活性接種（オピッツ博士）後の変化についての評価キー
程度０　　変化無し
程度１　　油分残余。−　過敏状態無し。
程度２　　単一の小さな肉芽腫　―　直径２センチ以下
程度３　　単一もしくは多数の肉芽腫、直径２センチ以上
程度４　　大きな肉芽腫、壊死をともなう広がった膨張部、直径４〜６センチ、
神経、血管、喉への加圧により、接種した個体の全般的健康状態を損なう。
【０１２８】
４．３　ブタによる耐性試験　実験番号：Ｗ／Ｏ−ａｄｊ０１／９９
１．標題
実験番号：Ｗ／Ｏ−ａｄｊ０１／９９
離乳後間もない子豚の新アジュバント耐性試験
２．実験方法
方法：　ランダム実験
実験期間：観察期間：　４週間
３．実験動物
種：　ブタ
タイプ：　離乳後間もない子豚
性別：　　メス／オス
実験開始時の年齢：　生後５週
実験開始時の免疫状態：　健康な動物、ＳＰＦ状態ではない。
管理状態：　グループ管理
出生／飼料／水分供給／食品添加剤
−出生：　ドイツ・ランドレース対ドイツ・ピエットライン
−食品：　ブタ離乳食
−水分供給：　飲料水
−食品添加物：　無し
【０１２９】
４．適用パラメータ
ワクチンバッチ：　Ａ）ＰＰＶ‐単一−抗原−バルク０２０６９９
（「ＩＡＤ　ＰＰＶ１０１」／９８Ｖ４−１０１／ＰＰＶ）
Ｂ）ＰＰＶ‐単一−ワクチン０１０５９９
活性成分濃度：　　Ａ）ＰＰＶ‐単一−抗原−バルク０２０６９９―
５１２０ＨＡ／ＩＤ
Ｂ）ＰＰＶ‐単一−ワクチン０１０５９９―
１０２４０ＨＡ／ＩＤ
アジュバント：　Ａ）ＰＰＶ＋Ｇ９８Ｖ０４‐１０１（Ｗ／Ｏ乳濁液＝
ＩＡＤ　ＰＰＶ　１０１）
Ｂ）ＰＰＶ＋水酸化アルミニウム
ワクチン量：　１ＩＤ／動物（１　ＩＤ＝２ｍｌ）
接種：　１４日間隔で２回。
適用モード：　筋肉注射
ワクチンの前処理：　−
動物の前処理：　−
接種動物数：　４頭
対照動物数（接種無し）：　−
【０１３０】
５．試験方法
５．１　注射部位の触診
５．２　直腸体温測定
−　注射前日
−　注射直後
−　注射後１日目、２日目
５．３　離乳後間もない子豚の全般的状態及び飼料摂取の判定
【０１３１】
６．実験の進展
６．１　接種の、望ましからざる逆効果
−　無し
６．２　他のファクターの影響
実験終了前に加えた実験動物の数：　無し
実験中の病気の発生：　無し
実験中他の薬剤により実験動物を処理：　していない
【０１３２】
７．結果
７．１　注射部位の触診

【０１３３】
０　　局部反応無し
１　　僅かに局部反応
２　　中間的な局部反応
３　　厳しい局部反応
【０１３４】
７．２　直腸体温の測定

【０１３５】
７．３　離乳後間もない子豚の全般的状態及び飼料摂取の判定

【０１３６】
０　　生理学的全般状態と飼料摂取
１　　全般状態と飼料摂取の僅かな悪化
２　　全般状態と飼料摂取の中間的な悪化
３　　全般状態と飼料摂取の激しい悪化
【０１３７】
９．論考
（新しいアジュバントを含んだ）ＩＡＤ−１０１と、（抗原は同じものを含み、アジュバントは水酸化アルミニウムである）ＶＭ０１０５９９とにより２回筋肉注射で免疫した離乳後間もない子豚は、適用後、接種もしくはワクチンに関連する何らの局部的もしくは臨床的兆候も示さなかった。
【０１３８】
注射部位では何ら、局部的反応は観察されなかった。
実験ワクチンＩＡＤ　ＰＰＶ−１０１で免疫した実験動物は、接種後、直腸体温の重大な上昇は示さなかった。比較ワクチンＶＭ０１０５９９によって免疫した実験動物の場合も同様であった。
【０１３９】
更に、実験動物すべてが、実験期間中、生理学的な全般状態と、飼料の摂取を示した。
全体的評価は、新しいアジュバントを含んだワクチンＩＡＤ　ＰＰＶ−１０１の２回の筋肉注射による適用（ＩＤ＝２ｍｌ）が、離乳後間もない子豚にとって安全であり、好ましからざる逆効果反応にはつながらないという結果になった。
【０１４０】
５．１　テンジクネズミによる活性試験
実験番号２９９／９９
１．標題：　実験番号２９９／９９
【０１４１】
テンジクネズミによる新しいアジュバントについての耐性及び活性調査
２．試験の詳細
方法：　・ランダム試験
・血清学的方法（ＨＡＨ）による実験動物の免疫達成の検出
材料：　・ワクチン製剤
動物：　・ＳＰＦてんじくねずみ（チャールズ・リバー）
名称：　ハートリー・ＭＳＷ、ＣＲＬ：（ＨＡ）ＢＲ、メス
頭数：　１２
年齢：　２５０〜３００ｇ
該当する細菌無菌：　ＳＰＦ証明書
予防接種量：　０．５ｍｌ／動物及び適用量
適用：　皮下注射
免疫：　１４日間隔で２回
観察期間：　接種後１１日間
評価分類：　・耐性（系統的、局部的）
・ＰＰＶ‐抗体滴定量（ＨＡＨ）
【０１４２】
３．対照動物
ＰＢＳをテンジクネズミ２匹ずつに投与した。
【０１４３】
４．結果

【０１４４】
平均グループ滴定量：　グループ１　１：２^９＊（＊一匹は、血清学上「非
レスポンダー」であった。）
グループ２　１：２^９，２
グループ３　１：２^８
グループ４　１：２^５
図１０は、各種ワクチンの抗体滴定量を示す。
【０１４５】
５．好ましからざる逆効果
−　グループ１、２、３の実験動物の注射部位に僅かに膨張部分。
６．実験中に投与された薬剤
−　無し。
【０１４６】
７．結果に関する論考
テンジクネズミに各種ワクチン試料を皮下注射で２回適用したことにより、対照動物と比べて、ＰＰＶ抗体滴定量の重大な増加が見られた。
ＨＡＨ結果で検査した血清データから、良好なＰＶＰ抗体滴定量が新しい説明したアジュバントを含んだワクチン製剤により、５１２０ＨＡＥ（実験グループ１、３）の抗原量と等しい抗原量で得られる傾向がある。但し、このグループには、そのＰＶＰ抗体滴定量が第２回接種以後１４日で対照動物のＰＶＰ抗体滴定量と同一であったことから、血清学上の「非レスポンダー」として評価される動物が存在した。
【０１４７】
５．２　兎による活性試験
実験番号　ｒＳｔｘ−Ｋａ０１／２０００
標題：　各種アジュバントと組み合わせたｒＳｔｘ‐ＩＩｅ‐プロテインの免疫潜在能力試験
【０１４８】
１．要約
この実験において１０匹の兎に皮下注射で３回接種を行った。ワクチン量は実験動物１匹当たり２ｍｌと適用量であり、５種のワクチン製剤を適用した。
ワクチンはそれぞれ、ｒＳｔｘ‐ＩＩ２プロテイン、並びにアジュバントとして、不完全フロイントアジュバント、市販の２種類のアジュバント、そして、新しく開発されたＬＡＨアジュバントを含んでいた。
血液試料を接種直前と、第３回接種から５週目に採取し、Ｅｌｉｓａ（酵素リンク免疫吸着剤検定）のｒＳｔｘ‐ＩＩ２プロテインに対する個々の抗体を検査した。
【０１４９】
フロイントアジュバントと、新しいＬＡＨアジュバントを含んだワクチン処方が、実験動物へ最高のｒＳｔｘ‐ＩＩ２プロテイン抗体滴定量を誘発した。
【０１５０】
２．略語リスト
ＡＢ　　　　　ａｎｔｉｂｏｄｙ　　　　　抗体
ｒＳｔｘ−Ｉｉｅ−Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｓｈｉｇａ−ｔｏｘｉｎ−ＩＩｅｄｅｍａ−Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ
組換えシガトキシンＩＩ浮腫Ｂサブユニット
ｓ．ｃ　　　　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　　皮下の
【０１５１】
３．材料及び方法
３．１　動物
種：　兎、ニュージランドホワイト種
動物分類：　アダルト
性別：　　　めす
実験開始時の年齢：　　１６００〜２０００ｇ
実験開始時の動物の免疫状況：　Ｓｔｘ‐ＩＩｅ‐ＡＢ‐負
動物の識別：　耳マーク
【０１５２】
３．２　ワクチンバッチの説明

【０１５３】
３．３　方法
３．３．１　動物管理
３．３．１．１　管理条件：　寝床つき管理ケージ
３．３．１．２　食物：　乾燥飼料（アルトロミン）
３．３．１．３　食品添加物：　無し
３．３．１．４　水分供給：　飲料水（（乳首つき飲用ビンによる）
３．３．２　ワクチン投与
３．３．２．１　ワクチン接種
３．３．２．１．１　量：　兎一匹につき２ｍｌ及び接種量
３．３．２．１．２　接種日付：　第１回接種　　０２．１０．２０００
第２回接種　　０３．０８．２０００
第３回接種　　０３．２９．２０００
３．３．２．１．３　適用モード：　非経口
３．３．２．１．４　適用タイプ：　皮下注射
３．３．２．１．５　ワクチンの前処理：　使用前に振る。
３．３．２．１．６　動物の前処理：　無し
３．３．２．１．７　接種済み動物及び対照動物の数：　８＋２対照動物
（プラシーボ）
３．３．２．１．８　観察期間：　８４日間
【０１５４】
表１：　動物グループのまとめ

【０１５５】
３．３．３　実験方法
３．３．３．１　日々訪問
全般状況及び飼料摂取の判定
３．３．３．２　血清学的検査
血液採取日付
１．試料無し　‐　第１回接種以前
２．第１試料　‐　第２回接種以前
３．第２試料　‐　第３回接種以前
４．第３試料　‐　第３回接種以後５週め
血液試料を、Ｅｌｉｓａにより動物に誘発したＳｔｘ‐Ｉｉｅ‐Ｂ抗体滴定量について検定した。
【０１５６】
４．実験の進展
４．１　実験終了前に取り出した動物数　‐　無し
４．２　実験中の病気の発生：　無し
４．３　他の薬剤による動物の処理：　無し
【０１５７】
５．結果
結果は添付書類１と、図１１に示した。
【０１５８】
６．この結果により、ワクチン接種量あたりの等しい抗原含有量により、用いたアジュバントに応じて、各別のＳｔｘ‐Ｉｉｅ‐ＡＢ‐滴定量が誘発されたことが示されている。
最高のＳｔｘ‐ＩＩｅ‐Ｂ‐抗体滴定量は、完全フロイントアジュバントもしくは新しいＬＡＨアジュバントを含んだワクチンを接種された兎で発生した。
しかし、公知の逆効果が理由となって、完全フロイントアジュバントは、予防免疫接種のため農業家畜動物に用いられるワクチン用アジュバントとして利用できない。
新たに開発されたＬＡＨアジュバントは、立証された活性を理由として、農業家畜動物の為のワクチン用の潜在的アジュバントとして見なされ得る。
【０１５９】
７．添付書類
７．１　添付書類１　‐　Ｅｌｉｓａ検定結果。
添付書類１：　組換えＳｔｘ２ｅワクチン：　最適アジュバントの判定
実験計画
１．ｒＨｉｓ−ＳｔｘＢ２ｅ及び各種アジュバントによる兎の予防接種
２．血液採取
３．ルーター氏からバウエルンフェイント博士へ２０００年４月１１日船積み。
４．ｒＨｉｓ−ＳｔｘＢ２ｅ−ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ番号Ｓｔｘ−１９〜２１、２６）による抗Ｓｔｘ２ｅ−ＩｇＧ検定
【０１６０】

【図面の簡単な説明】
【図１】
疎水性化した変異体Ｒ９７２、Ｒ９７４におけるエアロジル表面のシラノール基の概略図である。
【図２】
エアロシル粒子どおしの相互作用の概略図である。
【図３】
プラシーボのＷ／Ｏ型乳濁液Ｇ９８Ｖ０４−１０１の特性を表す光学顕微鏡写真である。
【図４】
プラシーボのＷ／Ｏ型乳濁液Ｇ９９Ｖ０９−１２の特性を表す光学顕微鏡写真である。
【図５】
攪拌機構造の上下方向の断面図である。
【図６】
ＩＫＡ　ＵＴＬ２５型インライン式ウルトラ・タラックスの構造の縦断面図である。
【図７】
実験終了時のマウスの平均体重を示す。
【図８】
実験開始時、二回目のワクチン接種前、実験終了時のニワトリの平均体重を示す。
【図９】
オピッツ病後の注射部位の評価を示す。
【図１０】
各種ワクチン接種後におけるてんじくねずみのＰＶＰ抗体の滴定量を示す。
【図１１】
ｒＨｉｓ‐ＳｔｘＢ２ｅおよびその他のアジュバント接種後におけるうさぎの抗‐Ｓｔｘ２ｅ抗体の滴定量を示す。

Claims

シリンジへの吸い上げに適した安定した油中水型乳剤の形態の材料物質調合物であって、
分散した水性相と、
液体脂肪および／または液体油および／または液体ワックスに基づく連続的な油性相であって、分散した水性相を含むものと、
乳化剤と、
疎水性化し、大いに分散させた二酸化珪素と、オプションとして安定剤としてのレシチンとを備えたもの。
シリンジへの吸い上げに適した安定した油中水型乳剤の形態の材料物質調合物であって、
５μＭか、それ以下の平均滴直径を持つ分散した水性相と、
液体脂肪および／または液体油および／または液体ワックスに基づく連続的な油性相であって、分散した水性相を含むものと、
乳化剤と、
安定剤としてのレシチンとを備えたもの。
クレーム１または２の材料物質調合物であって、前記水性相が緩衝液にもとづいているもの。
クレーム１〜３のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、防腐剤を含むもの。
クレーム４の材料物質調合物であって、防腐剤が基本的に水性相に備わるもの。
クレーム１〜５のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、油性相が、中性油及び／またはパラフィンオイルおよび／またはイソプロピルミリステートおよび／またはイソプロピルステアレートおよび／またはイソプロピルパルミテートおよび／またはエチルオレエートおよび／またはオクチルパルミテートおよび／またはオレイルオレエートおよび／またはヘキシルラウリエートに基づくもの。
クレーム１〜６のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、乳化剤が基本的に油性相に備わるもの。
クレーム１〜７のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、乳化剤がポリグリセロールおよび／またはポリグリセライドであるもの。
クレーム１〜８のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、乳化剤が、ポリグリセリル−２ジポリヒドロキシステアレートであるもの。
クレーム１〜９のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、二酸化珪素および／またはレシチンが基本的に油性相に備えられているもの。
クレーム１〜１０のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、二酸化珪素が、ナノメートルのレンジの平均粒子直径を有しているもの。
クレーム１１の材料物質調合物であって、ニ酸化珪素ガ１０〜２０ナノメートルの平均粒子直径を有しているもの。
クレーム１〜１２のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、二酸化珪素が、珪素面において疎水性化されているもの。
クレーム１〜１３のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、乳濁液１００ｍｌあたり、イソプロピルミリステート２５±５ｍｌ、ポリグリセリル−２ジポリヒドロキシステアレート１．５±１．０ｍｌ、液体相７５±５ｍｌ、二酸化珪素１±０．５ｇ含有しているもの。
クレーム１４の材料物質調合物であって、水性相の滴の平均滴直径が、約５〜３０μｍであるもの。
クレーム１〜１０のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、乳濁液１００ｍｌあたり、イソプロピルミリステート２５±５ｍｌ、ポリグリセリル−２−ジポリヒドロキシステアレート２．５±１．５ｍｌ、リン脂質２．５±１．５ｍｌ、液体相７５±５ｍｌ、二酸化珪素１±０．５ｇ含有しているもの。
クレーム１６の材料物質調合物であって、水性相の平均滴直径が、約０．５〜５μｍであるもの。
クレーム１〜１７のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、０．５ｍｍか、もしくは、それ以上の直径を有するカニューレを備えたシリンジへの吸い上げに適しているもの。
クレーム１〜１８のうちひとつに記載の材料物質調合物であって、水性相が少なくともひとつの抗原を備えているもの。
クレーム１９の材料物質調合物であって、前記少なくともひとつの抗原が水性相の体積分画に代わるものであるもの。
クレーム１９または２０の材料物質調合物であって、前記抗原が、細菌性、ウイルス性、もしくは、寄生虫性の抗原、真菌性抗原、トキソイド、細菌性、ウイルス性、もしくは寄生虫性の分裂抗原、ＤＮＡ染色分体、ＤＮＡ染色分体セグメント、もしくは、組換えプロテインであるもの。
クレーム１９〜２１のひとつに記載の材料物質調合物であって、前記抗原として、家畜やヒトのためのワクチン抗原を備えているもの。
クレーム１〜１８のひとつに記載の材料物質調合物の使用方法であって、アジュバントを備えたワクチンを製造する為のアジュバントとしての使用。
クレーム２３の使用方法であって、前記材料物質調合物が、不活性ワクチンを製造する為のアジュバントとして使用されるもの。
クレーム２３または２４の使用方法であって、前記材料物質調合物が、家畜またはヒトのためのワクチンを製造する為のアジュバントとして使用されるもの。
クレーム１９〜２２のうちひとつに記載の材料物質調合物の使用方法であって、ワクチンを製造する為に使用されるもの。
クレーム２６の使用方法であって、前記材料物質調合物が、不活性なワクチンを製造する為に使用されるもの。
クレーム２６または２７の使用方法であって、前記材料物質調合物が、家畜またはヒトのためのワクチンを製造する為に使用されるもの。