JPH09268130A - オイルアジュバントワクチンおよびその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物レクチンのような免疫刺激物質を処方中
に使用しなくても、高い抗体産生力を長期間維持するこ
とができ、生体に安全で、かつ製剤安定性にすぐれたオ
イルアジュバントワクチンを提供すること。 【解決手段】 Ａ）常温で液状を示す油相２０〜９０重
量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと
脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イ
オン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセ
ライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との
混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、およびＤ）生
物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜７５重
量％を含有する油中水型オイルアジュバントワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オイルアジュバン
トワクチンおよびその調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】オイルアジュバントワクチンは、古くか
ら効率よく免疫を強化するワクチンとしてよく知られて
いる。とくに、不活化した抗原を用いる場合には、非常
に有効な免疫増強効果を発揮することから、実験室レベ
ルでは依然として古典的なオイルアジュバントワクチン
であるFreundのアジュバントが利用されている。しか
し、Freundのアジュバントに代表される鉱物油を主成分
とするオイルアジュバントは、確かに高い免疫増強効果
が認められる反面、接種反応も著しく、接種部位周辺に
無菌化膿巣や肉芽腫の形成を引き起こし、外面的には浮
腫、腫脹、硬結、壊死が観察されることや残留性が懸念
されることなどから、ワクチンへの応用が大きく阻まれ
てきた。家畜における局所反応の残留は、その肉を消費
に適さないものにすることから、可能な限り軽減するこ
とが望まれる。それゆえ鉱物油を主成分とするオイルア
ジュバントを用いたワクチンは、接種部位などで制限を
受ける場合がある。

【０００３】ワクチンの有効性と持続性を高いレベルで
保持させることは、疾病の予防というワクチン本来の目
的を果たす上で不可欠な要素であるが、その対象が生体
であることを考慮すると、有効性や持続性だけでなく、
ワクチン自体の安全性がきわめて重要となってくる。

【０００４】そこで、これらの問題を解決することを目
的として、これまで多くの検討が行われてきている。た
とえば、特公平６−８１７３１号公報には、界面活性剤
として無水マンニトール・オレイン酸エステルを、油分
として流動パラフィンを用いた油中水滴型の油性アジュ
バントが示されている。ＷＯ９１／００１０７号（特表
平４−５０６５２１号）公報には、油分として植物油な
どの代謝可能な油と鉱物油などの代謝不可能な油を混合
して用いた低粘度の油中水型の油性アジュバントが示さ
れている。また、特開平６−１７２２１６号公報には、
油分に植物油を、界面活性剤としてソルビタン脂肪酸エ
ステルとポリオキシエチレングリコールソルビタンアル
キルエステルを用いたオイルアジュバントワクチンが示
されており、特公平６−３９３８６号公報には、生免疫
原材料と、鉱物油を使用した水中油型乳剤とを混合した
アジュバント生ワクチンが示されている。

【０００５】しかるに、上記の方法によるオイルアジュ
バントワクチンはいずれも、注射局所反応や生体内残留
性などの面に加え、ワクチンとしての製剤安定性の面で
も満足できるものではなかった。ワクチンは、接種対象
があくまでも生体であることから、有効でかつ可能な限
り安全なものが求められるのは当然のことであるが、医
薬品であることを考慮すると、できる限り安定なものが
求められる。

【０００６】しかし、オイルアジュバントワクチンの場
合は、エマルションのタイプや使用する油分および界面
活性剤の種類等によって、免疫増強作用だけでなく、製
剤としての安定性に大きな差が生じることが知られてお
り、とくに不活化ワクチンの場合、十分な感染防御力を
長期間、しかも再現性よく発現させるワクチンを調製す
ることが困難であった。また、従来の油中水型オイルア
ジュバントワクチンの短所である注射局所反応や生体内
残留性を改善させることを目的として、水中油中水型の
オイルアジュバントワクチンなどが提案されているが、
従来の手段では、製剤としての長期安定性の面で多くの
問題が残されており、実用化させることが困難であっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来、局所
反応や残留性、製剤安定性のために利用が制限されてい
たオイルアジュバントワクチンに関し、それらの問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、免疫
刺激物質を処方中に使用しなくても、高い抗体産生力を
長期間維持することができ、生体に安全で、かつ製剤安
定性にすぐれたオイルアジュバントワクチンを提供する
ことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため、鋭意検討した結果、常温で液状を示
す油分と、親油性である特定の非イオン系界面活性剤と
ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイ
ド付加物との混合物である乳化剤と、生物学的に許容さ
れる有効量の抗原成分を含有する水相とで構成される油
中水型オイルアジュバントワクチン、およびこの油中水
型エマルション（上記油中水型オイルアジュバント）で
構成される相と、特定の乳化剤を含む外水相からなる水
中油中水型オイルアジュバントワクチンが、生体に接種
した際の局所安全性にすぐれ、すぐれた抗体産生力を長
期間発揮するものであることを見出すと共に、この油中
水型オイルアジュバントワクチンを調製する際、まず常
温で液状を示す油分に、親油性である特定の非イオン系
界面活性剤と、ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエ
チレンオキサイド付加物と、さらに親油性である特定の
非イオン系界面活性剤とアミノ酸またはその塩および特
定の糖または糖アルコールを含有する水溶液との混合物
を加えたのち、抗原を含有する水相を加えて乳化する方
法をとることにより、非常に低粘度な領域においても高
い安定性を示し、かつ抗体産生力およびその維持能にす
ぐれた油中水型オイルアジュバントワクチンを調製でき
ること、また、この方法に従い油中水型オイルアジュバ
ントワクチンを調製した後、さらにこれを特定の乳化剤
を含む水相に添加し、乳化することにより、安全性並び
に安定性に優れ、かつ従来の同タイプのものに比べすぐ
れた抗体産生力を長期間発揮する水中油中水型オイルア
ジュバントワクチンを調製できることを見い出し、本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明の第一は、Ａ）常温で液
状を示す油相２０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基
を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、
４０℃で液状を示す非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒド
ロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２
０〜６０モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３
０重量％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗
原を含む水相５〜７５重量％を含有するオイルアジュバ
ントワクチンに関するものである。

【００１０】また本発明の第二は、Ａ）常温で液状を示
す油相３０〜９０重量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有す
る多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで、40℃で
液状を示す非イオン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂
肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６０
モル付加物との混合物である乳化剤０．５〜３０重量
％、およびＤ）生物学的に許容される有効量の抗原を含
む水相５〜６５重量％を含有する油中水型オイルアジュ
バント相、およびＦ）非イオン系界面活性剤を含み、か
つ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤０．２〜２０重
量％を含有する外水相からなる水中油中水型オイルアジ
ュバントワクチンに関するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のオイルアジュバントワク
チンを構成するＡ成分は、常温で液状を示す油分であ
る。この明細書において「常温」とは、１５〜２５℃の
範囲内の温度を意味する。常温で液状を呈する油分とし
ては、従来より一般的に食品や医薬品、化粧品などに用
いられているエステル系油性基剤、あるいは非エステル
系油性基剤のうち、常温で液状を示すものから種々選
択、使用することができる。常温で液状を示す非エステ
ル系油性基剤としては、軽質流動パラフィンやスクアレ
ン、スクアラン、ポリブテンなどが挙げられる。また、
常温で液状を示すエステル系油性基剤としては、カプリ
ル酸やカプリン酸などの中鎖の飽和脂肪酸や、オレイン
酸やリノール酸などの長鎖の不飽和脂肪酸とアルコール
から誘導される種々のエステル系誘導体の他、天然由来
の脂肪酸エステルであるピーナツ油、オリーブ油、ヒマ
ワリ油、サフラワー油、ホホバ油などの液状の植物油、
あるいは動物由来の液状油であるオレンジラフィー油な
どが挙げられ、これらのうちから、目的に応じて１種、
あるいは、２種以上の混合物として用いればよい。その
中でも、オレイン酸のエステル系誘導体や植物油といっ
た油は、酸化安定性が比較的高いことに加え、生体に対
する親和性が高く、局所刺激性や残留性を低減できると
いう長所を有しているため、油分としては、これらの代
謝性油のみから、１種、あるいは、２種以上の混合物を
選択、使用する方が好ましい。とくに好ましくは、シス
−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつ
シス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂
肪酸と、たとえば、グリセロール、ジグリセロール、プ
ロピレングリコール、エチルアルコール、デシルアルコ
ール、あるいはシス−Δ９−オクタデセノールを８５重
量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪族アルコ
ールを９０重量％以上含有するオレイルアルコールなど
とのエステル化物からなるエステル系油性基剤を用いる
のがよい。また、本発明においては、上記のエステル系
油性基剤とスクアレンとを混合して用いることもでき
る。

【００１２】本発明において、オイルアジュバントワク
チンを構成する乳化剤の一つであるＢ成分は、３個以上
の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エス
テルで、４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活
性剤である。上記の部分エステルは、多価アルコールの
種類によって異なるが、たとえば、水酸基が３個のグリ
セロールの場合、主にモノエステルとジエステルと少量
のトリエステルとの混合物であり、水酸基が４個のジグ
リセロールやソルビタンの場合、モノエステル、ジエス
テルと少量のトリエステルおよびテトラエステルとの混
合物である。これら部分エステルまたはそれらの混合物
のうち、４０℃で液状を示し、かつ親油性であるものが
選択、使用される。

【００１３】部分エステルを構成する３個以上の水酸基
を有する多価アルコールとしては、たとえば、グリセロ
ール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリ
セロール、ヘキサグリセロール、オクタグリセロール、
デカグリセロール、キシリトール、ソルビトール、マン
ニトール、ソルビタンなどが挙げられる。部分エステル
を構成する脂肪酸としては、たとえば、カプリル酸、カ
プリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸など、
上記の多価アルコールとの部分エステルが４０℃で液状
を呈するものである限り、公知の種々の脂肪酸を使用す
ることができる。これらの脂肪酸の中でも、とくにシス
−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつ
シス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂
肪酸が好ましい。

【００１４】Ｂ成分の部分エステルとして、とく特に好
適なものは、上記のシス−Δ９−オクタデセン酸を８５
重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９
０重量％以上含有する脂肪酸から誘導される、グリセロ
ールモノオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタ
ンジオレート、ジグリセロールモノオレート、ジグリセ
ロールジオレートなどである。これらの部分エステル
は、アシル基として高純度に精製されたオレイン酸が導
入されているため、乳化剤としての酸化安定性にすぐ
れ、また界面活性剤分子間の配向性が高まる結果、乳化
安定性などの機能性にすぐれるといった特徴があり、現
在、一般に市販されているオレイン酸誘導体と比べて、
最終的に調製されるオイルアジュバントワクチンの安定
性が改善されるとともに、生体に接種した際の安全性が
大きく向上するという効果を有している。

【００１５】本発明のオイルアジュバントワクチンを構
成するＣ成分であるヒドロキシ脂肪酸トリグリセライド
のエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物において、
ヒドロキシ脂肪酸のトリグリセライドとしては、ヒマシ
油や硬化ヒマシ油などがある。この場合、エチレンオキ
サイドの平均付加モル数が２０モル未満では、低粘度な
領域で安定なエマルションを形成させることができず、
結果として、良好なオイルアジュバントワクチンを調製
することができなくなる。また、エチレンオキサイドの
平均付加モル数が６０を越えると、エマルションが転相
しやすくなり、やはり、最終的に良好なオイルアジュバ
ントワクチンを調製することができなくなる。このトリ
グリセライドのエチレンオキサイド付加物の使用量は、
全処方中（油中水型オイルアジュバントワクチンの全体
量中）、０．５〜１０重量％程度とするのがよい。０．
５重量％未満では、ワクチンの乳化安定性が低下する恐
れがある。また、１０重量％を越えると、エマルション
が転相しやすくなり、やはりワクチンの安定性が低下す
る恐れがある。

【００１６】本発明で用いるＥ成分は、アミノ酸または
その塩と、分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非
還元性の糖または糖アルコールである。本発明において
は、オイルアジュバントワクチン中にアミノ酸またはそ
の塩と分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元
性の糖または糖アルコールを含有させることにより、ワ
クチンの乳化安定性をさらに高めることができる。アミ
ノ酸またはその塩としては、食品や日本薬局方医薬品あ
るいは日本薬局方外医薬品として一般的に用いられてい
るものの中から選択使用できる。アミノ酸には、グリシ
ン、アラニン、アルギニン塩酸塩、アスパラギン、アス
パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、
ロイシン、イソロイシン、プロリン、ハイドロキシプロ
リン、セリン、スレオニン、パリン、フェニルアラニン
などがあり、これらの中でも中性のアミノ酸が好まし
い。また、アミノ酸の塩には、ナトリウム塩やカリウム
塩などの１価の金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩
などの２価の金属塩がある。これらのアミノ酸またはそ
の塩のうち、とくにアスパラギン酸ナトリウム１水和
物、アスパラギン酸カリウム２水和物、グルタミン酸ナ
トリウム１水和物、グルタミン酸カリウム１水和物など
が好ましく用いられる。これらのアミノ酸は、通常Ｌ−
体であるが、その異性体であるＤ−体、またそれらの混
合物であるＤＬ−体であっても同様に使用できる。

【００１７】また、上記の非還元性の糖または糖アルコ
ールとしては、食品や日本薬局方医薬品あるいは日本薬
局方外医薬品として一般的に用いられているものの中か
ら選択使用でき、とくにトレハロース、キシリトール、
ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチト
ールなとが好ましく用いられる。本発明で用いられるア
ミノ酸またはその塩および分子内に少なくとも５個の水
酸基を有する非還元性の糖または糖アルコールの使用量
は、それぞれ全処方中（オイルアジュバントワクチンの
全体量中）、０．０１〜１０重量％とするのがよい。オ
イルアジュバントワクチンにおいて、Ａ成分の油分およ
びＤ成分の抗原を含有する水相の比率は、アジュバント
の用途目的あるいは選択する抗原種に応じて、適宜選択
される。とくに、本発明の油中水型オイルアジュバント
ワクチンは、特定の油分と特定の乳化剤が組み合わされ
ていることにより、高い安定性が維持されるので、これ
に応じて油分および抗原を含有する水相の比率も広い範
囲で選択することができる。一般的には、油分：水相が
重量比で９０：５から２０：７５、好ましくは、８０：
１５から３０：６５となるようにするのがよい。

【００１８】また、このアジュバントの調製に際し、前
記Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＣ成分のヒドロキシ
脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜６
０モル付加物との添加量は、両者を合わせて、全処方
中、０．５〜３０重量％、好ましくは３〜２０重量％の
割合とするのが望ましい。０．５重量％未満では安定な
乳化系を得ることができず、３０重量％を越えると、注
射局所での反応性が高まり、本発明の目的とする安全性
の高いオイルアジュバントワクチンが得られなくなる。

【００１９】本発明のオイルアジュバントワクチンの第
一は、上記の油分、乳化剤および抗原を含有する水相に
より構成される油中水型オイルアジュバントワクチンで
あり、このオイルアジュバントワクチンは、たとえばつ
ぎのような方法で調製することができる。まず、Ａ成分
の油分に、Ｂ成分の４０℃で液状を呈する非イオン系界
面活性剤と、Ｃ成分のヒドロキシ脂肪酸トリグリセライ
ドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物とを加え
て撹拌混合し、しかるのちにＤ成分の生物学的に許容さ
れる有効量の抗原を含有する水相を加えて撹拌混合して
乳化させるというものであり、この方法により、良好な
乳化状態を有する油中水型オイルアジュバントワクチン
を調製することができる。

【００２０】本発明ではその際、Ａ成分の常温で液状を
呈する油分に、Ｂ成分の３個以上の水酸基を有する多価
アルコールと脂肪酸との部分エステルで４０℃で液状を
示す親油性の非イオン系界面活性剤と、Ｃ成分のヒドロ
キシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０
〜６０モル付加物と、さらにＢ成分の非イオン系界面活
性剤とＥ成分の水溶液とを前者：後者が重量比で１：１
から１：２０となるように混合し、これを強固なゲル状
の組成物となるまで攪拌したものを加えて、混合、分散
させ、しかるのちにＤ成分の生物学的に許容される有効
量の抗原を含有する水相を加えて攪拌混合して乳化させ
ることにより、安全性が損なわれることなく、低粘度で
あって、しかも低温保存下においても非常に高い安定性
を有する油中水型オイルアジュバントワクチンを調製す
ることができる。その際、上記のＢ成分の３個以上の水
酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステル
で４０℃で液状を示す親油性の非イオン系界面活性剤と
Ｅ成分の水溶液からなる強固なゲル状の組成物を調製す
る時に、攪拌機によって高温になる場合には、常温以下
に保つために冷却しながら攪拌を行うようにすればよ
い。

【００２１】なお、Ｂ成分とＥ成分の水溶液との混合比
率は、Ｅ成分の水溶液中のアミノ酸またはその塩および
非還元性の糖または糖アルコールの種類とその濃度に応
じて、適宜最適な比率が選ばれる。たとえば、Ｅ成分の
水溶液がＬ−グルタミン酸ナトリウム１水和物５重量％
およびラクチトール５重量％の水溶液の場合、Ｂ成分：
Ｅ成分の水溶液の重量比が１：２〜１：１０の範囲とな
るようにするのがよい。また、Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム１水和物３０重量％およびラクチトール２０重量％
の水溶液の場合、Ｂ成分：Ｅ成分の水溶液の重量比が
１：２〜１：１５の範囲となるようにするのがよい。そ
の際、Ｅ成分の水溶液中の濃度は、使用するアミノ酸ま
たはその塩および非還元性の糖または糖アルコールの溶
解度の範囲内において、できるだけ高い方が望ましい。

【００２２】本発明におけるオイルアジュバントワクチ
ンの第二は、前記の油中水型のオイルアジュバントから
なる内相と、非イオン系界面活性剤から選択される少な
くとも一種を含み、かつ全体のＨＬＢ（親水親油バラン
ス）が１０以上である乳化剤を含有する外水相とで構成
される水中油中水型オイルアジュバントワクチンであ
る。なお、この明細書において「ＨＬＢ」（親水親油バ
ランス）は、W.C.Griffinによって提唱された式（W.C.G
riffin, J. Soc. Cosmetic Chemists, 1, 311(1949)参
照）に従って求めている。

【００２３】本発明の水中油中水型オイルアジュバント
ワクチンを構成する外水相に用いられる、全体のＨＬＢ
が１０以上の乳化剤は、全体のＨＬＢが１０以上であれ
ば、単品、もしくは二種以上の混合物から選択使用する
ことができる。単品でＨＬＢ１０以上の非イオン系界面
活性剤としては、一般に医薬品用途などで用いられてい
るものの中から選択すればよく、たとえば、ヒドロキシ
脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加物、
ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加
物、ポリオキシエチレンアルキル（アルケニル）エーテ
ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコー
ルなどから、ＨＬＢが１０以上となるものを選択して使
用すればよい。

【００２４】このうち、ＨＬＢが１０以上であるヒドロ
キシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド付加
物としては、上記のオイルアジュバントワクチンを構成
するものと同様のもの、つまり、ヒマシ油や硬化ヒマシ
油などからなるヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエ
チレンオキサイド付加物の中から、エチレンオキサイド
の平均付加モル数が２０以上のもの、好ましくは２０〜
６０モル付加物を用いることができる。この場合、エチ
レンオキサイドの平均付加モル数が２０未満では、内相
となる油中水型オイルアジュバントを外水相中に安定に
分散させることができず、結果として、良好な水中油中
水型オイルアジュバントワクチンを調製することができ
なくなる。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数
が６０を越えると、内相の油中水型オイルアジュバント
ワクチンが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好な
水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製するこ
とができなくなる。

【００２５】また、ＨＬＢが１０以上のソルビタン脂肪
酸エステルのエチレンオキサイド付加物としては、脂肪
酸部分が不飽和であるソルビタンオレイン酸エステルの
他、ソルビタンラウリン酸エステルやソルビタンカプリ
ル酸エステルなどの飽和脂肪酸からなるソルビタンエス
テルのエチレンオキサイド付加物の中から、エチレンオ
キサイドの平均付加モル数が１０以上のものが挙げられ
る。その中でも、とくにシス−Δ９−オクタデセン酸を
８５重量％以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸
を９０重量％以上含有する脂肪酸からなるソルビタンオ
レイン酸エステルのエチレンオキサイド付加物であるポ
リオキシエチレンソルビタンオレートのエチレンオキサ
イドの平均付加モル数が１０〜４０であるものを用いる
のが好ましい。この場合、エチレンオキサイドの平均付
加モル数が１０未満では、内相となる油中水型オイルア
ジュバントを外水相中に安定に分散させることができ
ず、結果として、良好な水中油中水型オイルアジュバン
トワクチンを調製することができなくなる。また、エチ
レンオキサイドの平均付加モル数が４０を越えると、内
相の油中水型オイルアジュバントが転相しやすくなり、
やはり、最終的に良好な水中油中水型オイルアジュバン
トワクチンを調製することができなくなる。

【００２６】ポリオキシエチレンアルキル（アルケニ
ル）エーテルとしては、たとえば、ポリオキシエチレン
ラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル
などの高級飽和アルコールのエチレンオキサイド付加物
やポリオキシエチレンオレイルエーテルなどの高級不飽
和アルコールのエチレンオキサイド付加物など、一般的
に知られているアルキル（アルケニル）エーテル系界面
活性剤が挙げられ、その中でも、上記のアルキル（アル
ケニル）基の炭素数が１２〜１８であり、エチレンオキ
サイドの平均付加モル数が１０以上のもの、好ましくは
１０〜４０のものを用いるのがよい。その中でも、とく
にシス−Δ９−オクタデセノールを８５重量％以上含有
し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪族アルコールを９０重
量％以上含有するオレイルアルコールのエチレンオキサ
イド１０〜４０モル付加物であるポリオキシエチレンオ
レイルエーテルを用いるのが好ましい。この場合、アル
キル（アルケニル）基の炭素数が１２未満では、内相の
油中水型オイルアジュバントが転相しやすくなり、結果
として、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチ
ンを調製することができなくなり、炭素数が１８を越え
ると、内相となる油中水型オイルアジュバントを外水相
中に安定に分散させることができず、やはり、最終的に
良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製
することができなくなる。さらに、エチレンオキサイド
の平均付加モル数が１０未満では、内相となる油中水型
オイルアジュバントワクチンを外水相中に安定に分散さ
せることができず、結果として、良好な水中油中水型オ
イルアジュバントワクチンを調製することができなくな
る。また、エチレンオキサイドの平均付加モル数が４０
を越えると、内相の油中水型オイルアジュバントワクチ
ンが転相しやすくなり、やはり、最終的に良好な水中油
中水型オイルアジュバントワクチンを調製することがで
きなくなる。

【００２７】ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
グリコールとしては、一般的に医薬品や化粧品に用いら
れているものの中から、ＨＬＢが１０以上であるものを
選択して使用することができる。その中でもエチレンオ
キサイドのモル数（平均重合度）が５０〜２００、プロ
ピレンオキサイドのモル数（平均重合度）が５〜８０で
あり、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドのモ
ル数（平均重合度）の比が２：１以上であるものを用い
るのが好ましい。この場合、エチレンオキサイドとプロ
ピレンオキサイドのモル数（平均重合度）の比が２：１
より低くなると、内相となる油中水型オイルアジュバン
トを外水相中に安定に分散させることができず、結果と
して、良好な水中油中水型オイルアジュバントワクチン
を調製することができなくなる恐れがある。

【００２８】本発明の水中油中水型オイルアジュバント
ワクチンを構成する外水相に用いる乳化剤は、上記のよ
うな単独でＨＬＢ１０以上を示すものの他、上記のよう
に、一種以上の高ＨＬＢの非イオン系界面活性剤と一種
以上の低ＨＬＢの非イオン系界面活性剤を混合して、全
体のＨＬＢを１０以上に調整したものでもよい。その際
に用いる低ＨＬＢの非イオン系界面活性剤としては、た
とえば、ソルビタンモノオレート、ソルビタンセスキオ
レート、グリセロールモノオレートなど、一般に医薬品
等に広く用いられるものの中から選択使用することがで
きる。高ＨＬＢの非イオン系界面活性剤と低ＨＬＢの非
イオン系界面活性剤を混合して用いる例としては、例え
ば、ＨＬＢ１５．０のポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレートと、ＨＬＢ３．７のソルビタンセスキオレー
トの場合であれば、それぞれを重量比２：１で混合する
ことにより、全体のＨＬＢが約１１．２である乳化剤を
得ることができる。

【００２９】本発明においては、外水相を構成する乳化
剤として、上記のような全体のＨＬＢが１０以上である
乳化剤と、グリセロリン脂質とを混合して使用すること
により、目的とする水中油中水型オイルアジュバントワ
クチンの安定性をさらに高めることができる。

【００３０】上記の全体のＨＬＢが１０以上である乳化
剤と混合して用いるグリセロリン脂質としては、大豆由
来のリン脂質（大豆レシチン、大豆水添レシチンなど）
や卵黄由来のリン脂質（卵黄リン脂質、卵黄水添リン脂
質など）など、天然由来のものの他、高度に精製された
種々の高純度リン脂質（ホスファチジルコリンやホスフ
ァチジルエタノールアミンなど）やリゾリン脂質などの
中から種々選択して使用することができ、これらは単独
で使用しても、２種以上を選択混合して使用してもよ
い。

【００３１】上記のＨＬＢ１０以上の非イオン系界面活
性剤とグリセロリン脂質を混合して用いる際、それらの
混合比は、非イオン系界面活性剤：グリセロリン脂質が
重量比で２０：１〜１：２となるようにすればよい。

【００３２】なお、本発明の水中油中水型オイルアジュ
バントワクチンを構成する外水相に用いる乳化剤の使用
量は、外水相中０．２〜２０重量％、とくに好ましくは
０．５〜１０重量％とするのがよい。この場合、０．２
重量％未満では良好な水中油中水型を維持することがで
きず、また、２０重量％を越えると、オイルアジュバン
トワクチンの粘度が高まり接種に適さなくなると共に、
生体に接種した際の安全性が低下する場合がある。ま
た、本発明の水中油中水型オイルアジュバントワクチン
において、内相を構成する油中水型オイルアジュバント
相と外水相の混合比は、目的に応じて、油中水型オイル
アジュバント相：外水相が重量比で２：１から１：１０
になるようにすればよい。

【００３３】このようにして調製される水中油中水型オ
イルアジュバントワクチンは、あらかじめ抗原を含有す
る水相を用いて、油中水型オイルアジュバントワクチン
を調製した後、これを内相として、特定の乳化剤を含む
水相に加えて乳化するという二段階乳化法により、内水
相中に抗原を効率よく内包することができる。本発明の
水中油中水型オイルアジュバントワクチンは、例えば、
以下の方法により調製することができる。その方法は、
あらかじめ抗原を含有した油中水型のオイルアジュバン
トワクチンを本発明にしたがって調製した後、これをさ
らに非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも一
種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤、
あるいは非イオン系界面活性剤から選択される少なくと
も一種を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化
剤と、グリセロリン脂質とを含有した水相に添加し、再
乳化するというものである。本発明においては、この二
段階乳化法をとることにより、水中油中水型としての安
定性にすぐれ、かつ安全性の高い水中油中水型オイルア
ジュバントワクチンを調製することができる。

【００３４】本発明ではその際、まず、常温で液状を呈
する油分に、Ｂ成分の３個以上の水酸基を有する多価ア
ルコールと脂肪酸との部分エステルで４０℃で液状を示
す親油性の非イオン系界面活性剤と、Ｃ成分のヒドロキ
シ脂肪酸トリグリセライドのエチレンオキサイド２０〜
６０モル付加物と、Ｂ成分の非イオン系界面活性剤とＥ
成分の水溶液とを前者：後者が重量比で１：１から１：
２０となるように混合し、これを強固なゲル状の組成物
となるまで攪拌したものを加えて、混合、分散させ、し
かるのちにＤ成分の生物学的に許容される有効量の抗原
を含有する水相を加えて攪拌混合して乳化させて、高い
安定性を示す油中水型のオイルアジュバントワクチンを
調製した後、これをさらにＦ成分の非イオン系界面活性
剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体のＨ
ＬＢが１０以上である乳化剤、あるいは非イオン系界面
活性剤から選択される少なくとも一種を含み、かつ全体
のＨＬＢが１０以上である乳化剤と、グリセロリン脂質
とを含有した水相に添加し、再乳化するという方法をと
ることにより、安全性が損なわれることなく、かつさら
に高い安定性を有する水中油中水型のオイルアジュバン
トワクチンを調製することができる。本発明の油中水型
オイルアジュバントワクチンの水相、水中油中水型オイ
ルアジュバントワクチンの内水相、または水中油中水型
オイルアジュバントワクチンの外水相に用いる水分は、
リン酸緩衝水溶液や生理食塩水、あるいはリン酸緩衝生
理食塩水など、ワクチン一般に用いられるものから選
択、使用することができる。

【００３５】なお、本発明において、水中油中水型オイ
ルアジュバントワクチンは、その調製条件などによっ
て、抗原が内相である油中水型エマルション中の内水相
のみに内包される場合と、その一部が外水相に漏出し
て、内水相と外水相の両水相に存在する場合があるが、
いずれの場合にも、本発明に係るオイルアジュバントワ
クチンの効果が損なわれるものではない。

【００３６】本発明において、オイルアジュバントワク
チンを構成する油相、内水相、および水中油中水型オイ
ルアジュバントワクチンを構成する外水相等には、それ
ぞれ医薬品として当然のことながら、緩衝化剤や安定化
剤、浸透圧調整成分など、アジュバント活性には直接関
与しない種々の成分を含有させることができる。また、
本発明におけるオイルアジュバントワクチンの調製に際
しては、ホモミキサーやホモジナイザー、ＣＬＥＡＲＭ
ＩＸ（エム・テクニック（株）製）などの一般的な乳化
装置の他、多孔質膜を利用した膜乳化装置など、一般的
に乳化が可能な手段であればどのような装置でも使用す
ることができる。

【００３７】本発明のオイルアジュバントワクチンを構
成する水相に含有させる抗原としては、一般的に用いら
れている不活化菌体や不活化ウイルス粒子の他、サブユ
ニットワクチンで用いられる、アタッチメントプロテイ
ンやエンベロープ抗原といった病原体の感染防御因子な
ど、数多くの種類や形態が挙げられるが、本発明に記載
のオイルアジュバントワクチンは、特定の油分と特定の
乳化剤の組み合わせにより、非常に安定な乳化状態が得
られるため、抗原の形態や大きさにかかわらず、生物学
的に許容される有効量であれば目的とするものを広く選
択することができる。さらに、本発明のオイルアジュバ
ントワクチンにおいては、エマルション内に抗生物質な
どのような抗原以外の薬効成分を配合することも当然可
能である。

【００３８】以上のように、本発明のオイルアジュバン
トワクチンは、配合する成分を種々選択することによ
り、さまざまなタイプの生体に投与可能な医薬用組成物
を形成することができる。たとえば、動物用ワクチンの
場合であれば、一般的に広く用いられている皮下注射や
筋肉内注射の他に、経口投与や直腸投与、鼻腔内投与な
どによる免疫賦活が考えられるが、その投与経路につい
ては目的に応じて種々選択すればよい。

【００３９】このように、本発明により調製されるオイ
ルアジュバントワクチンは、非常に安定でかつ良好なエ
マルションを形成するために、ワクチンとしての安定性
にすぐれるとともに、安全性も高いといった特徴を有し
ており、さまざまな生物に対して、有効性と安全性の両
面にすぐれた、有用なワクチンとして使用することがで
きる。

【００４０】次に、本発明を、実施例によりさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定さ
れるものではない。「部」は他に明記しない限り「重量
部」である。

【実施例】

［オイルアジュバントワクチンの調製］以下の各実施例
で使用したオイルアジュバントワクチンは、いずれも、
次に示す方法で調製した。なお、処方中に記載された成
分は、いずれも、加熱滅菌か、濾過滅菌のうち、各々に
適した方法により、滅菌処理済みのものを使用した。ま
た、撹拌、乳化などの各操作は、すべてクリーンベンチ
内で、無菌環境下にて行った。

【００４１】《実施例１：ワクチンａ》Ａ成分として、
エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＥＯ−９０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン
酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９
４重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセス
キオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ
−９９２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸
含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９
重量％］１．６部と、５０℃に加温したポリオキシエチ
レン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数
４０］０．４部とを加えて十分に撹拌した後、これに抗
原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）６部を撹拌
しながら徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ Ｃ
ＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用い
て、８，０００回転で１０分間撹拌混合して、油中水型
オイルアジュバントワクチンａを調製した。

【００４２】《実施例２：ワクチンｂ》Ａ成分として、
精製ヒマワリ油６部と、スクアレン６部とを用い、これ
らの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂
（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９０２」、アシル基
組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シ
ス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．６部と、
５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エ
チレンオキサイド平均付加モル数４０］０．４部を加え
て十分に撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相
（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実
施例１と同様の方法により撹拌混合して、油中水型オイ
ルアジュバントワクチンｂを調製した。

【００４３】《実施例３：ワクチンｃ》Ａ成分として、
オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタ
デセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含
量：９４重量％］１２部を用い、これらの油分に、ソル
ビタンセスキオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢ
ＬＥ ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シス−９−オク
タデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸
含量：９４重量％］０．８部と、グリセロールモノオレ
ート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９０
１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：
８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量
％］０．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン
硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４
０］０．５部を加えて十分に撹拌した後、これに撹拌し
ながら、抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）
８部を徐々に加え、以下実施例１と同様に撹拌混合し
て、油中水型オイルアジュバントワクチンｃを調製し
た。

【００４４】《実施例４：ワクチンＸ１》まずＢ成分と
して、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９０１」、アシル基組成：シ
ス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量：９４重量％］５部を用い、またＥ成
分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物３部お
よびマンニトール１部を精製水６部に溶解させた水溶液
を用い、このＢ成分とＥ成分の水溶液を、常温にて、Ｃ
ＬＥＡＲＭＩＸ ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック
（株）製］を用いて、１０，０００回転／分で１０分間
攪拌混合してゲル状物質を得た。次にＡ成分の油とし
て、オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢ
ＬＥ ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オ
クタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪
酸含量：９４重量％］６部を用い、スクアレン６部とを
用い、これらの油分に、Ｂ成分としてソルビタンセスキ
オレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−
９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含
量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重
量％］１．６部と、Ｃ成分として５０℃に加温したポリ
オキシエチレン硬化ヒマシ油〔エチレンオキサイド平均
付加モル数４０〕０．４部を加えて十分に攪拌し、これ
に前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させた
のち、攪拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理
食塩水からなる水相８部を徐々に加え、常温にて、ＣＬ
ＥＡＲＭＩＸ ＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テクニック
（株）製］を用いて、８，０００回転／分で１０分攪拌
混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンＸ１を
調製した。

【００４５】《実施例５：ワクチンＸ２》まずＢ成分と
して、ジグリセロールモノオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＰＧＯ−９０２１Ｌ」、アシル基組
成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス
−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部を用い、ま
たＥ成分として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物
４部およびラクチトール１部を精製水７部に溶解させた
水溶液を用い、このＢ成分およびＥ成分の水溶液を、実
施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状物質を得た。次に
油分として、精製ヒマワリ油６部と、エチルオレート
［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＥＯ−９０」、
アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：８８重
量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部
とを用い、この油分に、ソルビタンセスキオレート［日
本油脂（株）製「ノニオン ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシ
ル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量
％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６
部と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４部
を加えて十分に攪拌し、これに前記ゲル状物質１部を混
合して、油相中に分散させたのち、攪拌しながら、抗原
を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を
徐々に加え、以下実施例４と同様に攪拌混合して、油中
水型オイルアジュバントワクチンＸ２を調製した。

【００４６】《実施例６：ワクチンＸ３》まずＢ成分と
して、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９９１Ｐ」、アシル基組成：
シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シス−９
−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］４部と、グリセロー
ルジオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ Ｇ
Ｏ−９０２Ｐ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセ
ン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：
９４重量％］４部を、またＥ成分として、Ｌ−アスパラ
ギン酸ナトリウム１水和物４部およびトレハロース１部
を精製水11部に溶解させた水溶液を用い、このＢ成分お
よびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌混合して、ゲル状
物質を得た。次に油分として、デシルオレート［日本油
脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＤＯ−９９」、アシル基
組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、シ
ス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］８部と、スク
アレン４部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセス
キオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ
−９９２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸
含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９
重量％］０．８部と、グリセロールモノオレート［日本
油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ９９１」、アシル
基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、
シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］１．２部
と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油
〔エチレンオキサイド平均付加モル数４０〕０．４部を
加えて十分に攪拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合
して、油相中に分散させたのち、攪拌しながら、抗原を
含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相１０部を
徐々に加え、以下実施例４と同様に攪拌混合して、油中
水型オイルアジュバントワクチンＸ３を調製した。

【００４７】《実施例７：ワクチンｄ》Ａ成分として、
エチルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＥＯ−９９」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン
酸含量：９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９
９重量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセス
キオレート〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ
−９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸
含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４
重量％〕１．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチ
レン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数
４０］０．３部とを加えて十分に撹拌した後、これに抗
原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を撹拌
しながら徐々に加え、以下、実施例１と同様に撹拌混合
して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製し
た。次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンポリオ
キシプロピレングリコール［エチレンオキサイド平均重
合度１６０、プロピレンオキサイド平均重合度３０、Ｈ
ＬＢ＝１６．０］０．４部をリン酸緩衝生理食塩水１０
部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌しながら、
上記の油中水型オイルアジュバント１０部を徐々に加
え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ ＣＬＭ−０．８Ｓ
［エム・テクニック（株）製］を用いて、８，０００回
転で５分間撹拌混合して、水中油中水型オイルアジュバ
ントワクチンｄを調製した。

【００４８】《実施例８：ワクチンｅ》Ａ成分として、
精製ホホバ油６部と、スクアレン６部とを用い、これら
の油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）
製「ノニオン ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組成：シ
ス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、５０℃に
加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオ
キサイド平均付加モル数４０］０．４部を加えて十分に
撹拌した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸
緩衝生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と
同様の方法により撹拌混合して、油中水型オイルアジュ
バントワクチンを調製した。次に界面活性剤として、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂
（株）製「ノニオン ＯＴ−２２１」、アシル基組成：
シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９
−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド
平均付加モル数２０、ＨＬＢ＝１５．８］０．２部をリ
ン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均一に分散させた
後、これを撹拌しながら、上記の油中水型オイルアジュ
バント１０部を徐々に加え、以下実施例７と同様に撹拌
混合して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンｅ
を調製した。

【００４９】《実施例９：ワクチンｆ》Ａ成分として、
オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタ
デセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含
量：９４重量％］６部と、グリセロールトリオレート
〔日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９９
３」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：
９９重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量
％〕６部とを用い、これらの油分に、ソルビタンセスキ
オレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−
９０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含
量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重
量％］０．９部と、グリセロールモノオレート［日本油
脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９９１」、アシル
基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：９９重量％、
シス−９−不飽和脂肪酸含量：９９重量％］０．８部
と、５０℃に加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油
［エチレンオキサイド平均付加モル数４０］０．３部を
加えて十分に撹拌した後、これに撹拌しながら、抗原を
含有する水相（リン酸緩衝生理食塩水）８部を徐々に加
え、以下、実施例１と同様に撹拌混合して、油中水型オ
イルアジュバントワクチンを調製した。次に界面活性剤
として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオ
キサイド平均付加モル数６０、ＨＬＢ＝１４．８］０．
１４部と、大豆水添レシチン［日本油脂（株）製、コー
トソームＮＣ−２１］０．０６部とをリン酸緩衝生理食
塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを撹拌し
ながら、上記の油中水型オイルアジュバント１０部を徐
々に加え、以下、実施例７と同様に撹拌混合して、水中
油中水型オイルアジュバントワクチンｆを調製した。

【００５０】《実施例１０：ワクチンＸ４》まずＢ成分
として、グリセロールモノオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９０１」、アシル基組成：シ
ス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量：９４重量％］５部を、またＥ成分と
して、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物３部および
マンニトール１部を精製水６部に溶解させた水溶液を用
い、このＢ成分およびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌
混合して、ゲル状物質を得た。次に油分として、エチル
オレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＥＯ−
９０」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含
量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重
量％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオ
レート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９
０２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含
量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重
量％］１．７部と、５０℃に加温したポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モル数４
０］０．３部とを加えて十分に撹拌し、これに前記ゲル
状物質１部を混合して、油相中に分散させたのち、これ
に抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相
８部を攪拌しながら徐々に加え、以下、実施例４と同様
に攪拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチン
を調製した。次に界面活性剤として、ポリオキシエチレ
ンポリオキシプロピレングリコール［エチレンオキサイ
ド平均重合度１６０、プロピレンオキサイド平均重合度
３０、ＨＬＢ１６．０］０．４部をリン酸緩衝生理食塩
水１０部に加えて均一に分散させた後、これを攪拌しな
がら、前記の油中水型オイルアジュバントワクチン１０
部を徐々に加え、常温にて、ＣＬＥＡＲＭＩＸ ＣＬＭ
−０．８Ｓ［エム・テクニック（株）製］を用いて、
８，０００回転／分で５分間攪拌混合して、水中油中水
型オイルアジュバントワクチンＸ４を調製した。

【００５１】《実施例１１：ワクチンＸ５》まずＢ成分
として、ソルビタンモノオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９０１」、アシル基組成：シ
ス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量：９４重量％］６部を、またＥ成分と
して、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物４部および
ラクチトール１部を精製水７部に溶解させた水溶液を用
い、このＢ成分およびＥ成分を、実施例４と同様に攪拌
混合して、ゲル状物質を得た。次に油分として、精製ヒ
マワリ油１０部と、スクアラン２部とを用い、これらの
油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂（株）製
「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９０２」、アシル基組成：シ
ス−９−オクタデセン酸含量：８８重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量：９４重量％］１．７部と、５０℃に
加温したポリオキシエチレン硬化ヒマシ油［エチレンオ
キサイド平均付加モル数４０］０．３部を加えて十分に
撹拌し、これに前記ゲル状物質１部を混合して、油相中
に分散させたのち、これを攪拌しながら抗原を含有す
る、リン酸緩衝生理食塩水からなる水相８部を攪拌しな
がら徐々に加え、以下、実施例４と同様の方法により攪
拌混合して、油中水型オイルアジュバントワクチンを調
製した。次に界面活性剤として、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート［日本油脂（株）製、「ノニオン
ＯＴ−２２１」、シス−９−オクタデセン酸含量５５
重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量７８重量％、エチ
レンオキサイド平均付加モル数２０、ＨＬＢ１５．８］
０．１４部と、大豆水添レシチン［日本油脂（株）製、
コートソームＮＣ−２１］０．０６部とをリン酸緩衝生
理食塩水１０部に加えて均一に分散させた後、これを攪
拌しながら、上記の油中水型オイルアジュバントワクチ
ン１０部を徐々に加え、以下実施例７と同様に攪拌混合
して、水中油中水型オイルアジュバントワクチンＸ５を
調製した。

【００５２】《比較例１：ワクチンｇ》油分として、軽
質流動パラフィン［エッソ（株）製「クリストール５
２」］６部を用い、これにソルビタンセスキオレート
［日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８３ＲＡＴ」、ア
シル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量
％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：８３重量％］０．８
部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート［日
本油脂（株）製「ノニオンＯＴ−２２１」、アシル基組
成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス
−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサ
イド平均付加モル数２０］０．２部とを加えて十分に撹
拌しながら、抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理食塩
水）３部を徐々に加え、以下、実施例１と同様に撹拌混
合して、比較オイルアジュバントワクチンｇ（油中水
型）を調製した。

【００５３】《比較例２：ワクチンｈ》Ａ成分として、
オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタ
デセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含
量：９４重量％］６部と、スクアラン６部とを用い、こ
れらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂
（株）製「ノニオン ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組
成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス
−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂
（株）製、「ノニオン ＯＴ−２２１」、アシル基組
成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス
−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサ
イド平均付加モル数２０］０．４部を加えて十分に撹拌
した後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝
生理食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様
の方法により撹拌混合して、比較オイルアジュバントワ
クチンｈ（油中水型）を調製した。

【００５４】《比較例３：ワクチンｉ》Ａ成分として、
オレイルオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ
ＯＯ−９０８０」、アシル基組成：シス−９−オクタ
デセン酸含量：８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含
量：９４重量％］６部と、スクアラン６部とを用い、こ
れらの油分に、ソルビタンセスキオレート［日本油脂
（株）製「ノニオン ＯＰ−８３ＲＡＴ」、アシル基組
成：シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス
−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量％］１．６部と、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート［日本油脂
（株）製「ノニオン ＯＴ−２２１」、アシル基組成：
シス−９−オクタデセン酸含量：５５重量％、シス−９
−不飽和脂肪酸含量：７８重量％、エチレンオキサイド
平均付加モル数２０］０．４部を加えて十分に撹拌した
後、撹拌しながら抗原を含有する水相（リン酸緩衝生理
食塩水）８部を徐々に加え、以下、実施例１と同様の方
法により撹拌混合して、油中水型オイルアジュバントワ
クチンを調製した。次に界面活性剤として、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油［エチレンオキサイド平均付加モ
ル数６０、ＨＬＢ１４．８］０．１４部と、大豆水添レ
シチン［日本油脂（株）製、コートソームＮＣ−２１］
０．０６部とをリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均
一に分散させた後、これを撹拌しながら、上記の油中水
型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、以
下、実施例７と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュ
バントワクチンｉ（水中油中水型）を調製した。

【００５５】《比較例４：ワクチンＹ１》ソルビタンモ
ノオレート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ
−９０１」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸
含量８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量９４重量
％］５部と、ラクチトール４部を精製水６部に溶解させ
た水溶液とを、実施例４と同様に撹拌溶解して、ゲル状
物質を得た。次に油分として、グリセロールトリオレー
ト［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＧＯ−９０
３」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：
８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量
％］１２部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレ
ート［日本油脂（株）製「ＮＯＦＡＢＬＥ ＳＯ−９０
２」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：
８８重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：９４重量
％］１部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレー
ト〔日本油脂（株）製「ノニオン ＯＴ−２２１」、シ
ス−９−オクタデセン酸含量５５重量％、シス−９−不
飽和脂肪酸含量７８重量％、エチレンオキサイド平均付
加モル数２０〕0.５部とを加えて十分に撹拌し、これに
前記ゲル状物質１部を混合して、油相中に分散させたの
ち、撹拌しながら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食
塩水からなる水相６部を徐々に加え、以下実施例４と同
様に撹拌混合して、比較オイルアジュバントワクチンＹ
１（油中水型）を調製した。

【００５６】《比較例５：ワクチンＹ２》油分として、
軽質流動パラフィン［エッソ（株）製「クリストール５
２」］６部を用い、この油分に、ソルビタンセスキオレ
ート〔日本油脂（株）製「ノニオンＯＰ−８３ＲＡ
Ｔ」、アシル基組成：シス−９−オクタデセン酸含量：
５５重量％、シス−９−不飽和脂肪酸含量：７８重量
％］0.８部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレ
ート［日本油脂（株）製「ノニオン ＯＴ−２２１」、
シス−９−オクタデセン酸含量５５重量％、シス−９−
不飽和脂肪酸含量７８重量％、エチレンオキサイド平均
付加モル数２０］0.２部とを加えて十分に撹拌しなが
ら、抗原を含有する、リン酸緩衝生理食塩水からなる水
相３部を徐々に加え、以下実施例１と同様に撹拌混合し
て、油中水型オイルアジュバントワクチンを調製した。
次に界面活性剤として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油［エチレンオキサイド平均付加モル数６０、ＨＬＢ１
4.８］0.２部をリン酸緩衝生理食塩水１０部に加えて均
一に分散させた後、これを撹拌しながら、前記の油中水
型オイルアジュバントワクチン１０部を徐々に加え、以
下実施例１０と同様に撹拌混合して、比較オイルアジュ
バントワクチンＹ２（水中油中水型）を調製した。

【００５７】［免疫試験］次に実際に種々の抗原を含有
するオイルアジュバントワクチンについて、免疫試験を
行った。各試験例中で用いているワクチンの記号は、そ
のワクチンが、前記実施例および比較例の各々の記号に
対応した処方に基づいて調製されたものであることを示
している。

【００５８】《試験例１：豚アクチノバシラス感染症
（App)不活化ワクチン》Actinobacillus pleuropneumon
iae NG-22 株（血清型２型）を液体培地に接種し、37℃
で通気撹拌培養した菌液をホルマリンで不活化し、遠心
分離により集菌・洗浄したものを抗原とした。この抗原
をリン酸緩衝生理食塩水を用いて、不活化前生菌数が１
０¹⁰個／ドーズとなるよう調製したものを水相として用
いた。免疫群は４週齢ＳＰＦ(Specific Pathogen Free)
ブタ各５頭に１頭当たりワクチンａ、ｃ、Ｘ２の１ml、
ワクチンｄ、ｆ、Ｘ４の２mlを４週間間隔で２回筋肉内
に注射した。比較免疫群は４週齢ＳＰＦブタ各５頭に１
頭当たりワクチンｇ、ｈの１ml、ワクチンｉ、Ｙ２の２
mlを４週間間隔で２回筋肉内に注射した。また、５頭の
非免疫同居対照群をおいた。各回注射後２週間について
注射局所を含む臨床症状の観察、および試験期間中経時
的に血清を採取し、その血清について補体結合反応（Ｃ
Ｆ）抗体価を測定し、推移を観察した。初回注射後１６
週に注射局所の剖検を行い、結節の大きさ・分布により
病変スコア（無；０〜重；３）をつけ、各群５頭の平均
を求めた。

【００５９】安全性の結果については、表１に示した。
免疫群に発熱、臨床症状の異常はみられなかった。比較
免疫群では、初回及び追加免疫直後に一過性の体温の上
昇および元気の消失が認められた。初回免疫後１６週の
剖検において、免疫群では病変はとくに認められなかっ
たが、比較免疫群では注射物によると思われる結節が認
められた。

【００６０】

【表１】 表１ （豚アクチノバシラス感染症不活化ワクチンの安全性） ─────────────────────────────────── 試験群 ワクチン 初回免疫後 追加免疫後 病変 臨床症状 体温 臨床症状 体温 スコア 免疫群 ワクチンａ ０／５¹⁾ ０／５¹⁾ ０／５ ０／５ ０ ワクチンｃ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ ワクチンｄ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ ワクチンｆ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ ワクチンＸ２ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ ワクチンＸ４ ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ 比較免疫群 ワクチンｇ ５／５ ５／５ ５／５ ５／５ ３ ワクチンｈ ３／５ ３／５ ３／５ ３／５ ２ ワクチンｉ ５／５ ５／５ ４／５ ５／５ １ ワクチンＹ２ ５／５ ５／５ ５／５ ５／５ ２ 対照群 − ０／５ ０／５ ０／５ ０／５ ０ ¹⁾ 異常を認めた個体数／試験頭数

【００６１】有効性の結果については、表２−１および
表２−２に示した。免疫群のなかでワクチンａ、ｃおよ
びＸ２注射群は注射後４週よりＣＦ抗体価が上昇し、注
射後８週においては１２８〜２５６倍の良好な抗体応答
を認め、対照となる比較免疫群のワクチンｇ注射群とほ
ぼ同等、またワクチンｈ注射群より明らかに高い抗体応
答を示した。本発明の水中油中水型エマルションタイプ
のオイルアジュバントワクチンであるワクチンｄ，ｆお
よびＸ４は、良好かつ安定な乳化状態を実現し、先述の
油中水型エマルションタイプのオイルアジュバントワク
チンとほぼ同等の良好な抗体応答を示した。対照となる
比較免疫群のワクチンｉおよびＹ２は調製したワクチン
の乳化状態が極めて不安定であり、その注射群はワクチ
ンｄ、ｆと比較して明らかに低い抗体応答を示した。以
上の成績は、本発明のオイルアジュバントワクチンが代
謝性油のみで構成されている場合でも、非代謝性の鉱物
油系ワクチンとほぼ同等の免疫賦活効果を示すととも
に、局所反応性においては、鉱物油系アジュバントワク
チンと比較して優れていることを証明するものである。
また、本発明の方法により調製されたオイルアジュバン
トワクチンが、代謝性油のみで構成されている場合にお
いても、高い安定性を有すると共に、非代謝性の鉱物油
のみによる従来のオイルアジュバントワクチンとほぼ同
等の免疫効果を長期間にわたって示すこと、および局所
反応性においては、鉱物油のみによる従来のワクチンと
比較して優れていることを証明するものである。

【００６２】

【表２】 表２−１（豚アクチノバシラス感染症不活化ワクチンの有効性） ──────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 ０ 4 6 8 免疫群 ワクチンａ ＜4 ¹⁾ 14 56 147 ワクチンｃ ＜4 18 111 169 ワクチンｄ ＜4 12 42 84 ワクチンｆ ＜4 11 37 74 比較免疫群 ワクチンｇ ＜4 37 97 111 ワクチンｈ ＜4 ＜4 4 4 ワクチンｉ ＜4 ＜4 4 ＜4 対照群 − ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ¹⁾幾何平均App(２型）ＣＦ抗体価

【００６３】

【表３】 表２−２（豚アクチノバシラス感染症不活化ワクチンの有効性） ──────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 ０ 4 6 8 12 16 免疫群 ワクチンＸ２ ＜4 ¹⁾ 24 147 169 147 74 ワクチンＸ４ ＜4 32 111 97 97 42 比較免疫群 ワクチンｇ ＜4 37 97 111 128 84 ワクチンＹ２ ＜4 ＜4 4 4 ＜4 ＜4 対照群 − ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ¹⁾幾何平均App(２型）ＣＦ抗体価

【００６４】《試験例２：日本脳炎不活化ワクチン》日
本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）中山株をマウスの脳内に接種
して培養し、ウイルスの最も増殖した時期に脳を採取し
た。採取した脳から脳乳剤を作製し、その乳剤を遠心
し、上清をホルマリンで不活化したものを抗原として用
いた。なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理食塩
水を用いて、不活化前ウイルス量が１０ ^6.0 ＬＤ₅₀／ド
ーズとなるよう調整したものを水相として用いた。免疫
群は１０週齢ＳＰＦブタ各５頭に１頭当たりワクチンｂ
の１ml、ワクチンｅの２mlを筋肉内に注射した。比較免
疫群は１０週齢ＳＰＦブタ５頭に１頭当たりワクチンｇ
の１mlを筋肉内に注射した。また、５頭の非免疫同居対
照群をおいた。注射後２週間について注射局所を含む臨
床症状の観察、および試験期間中経時的に血清を採取
し、その血清について赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を
測定し推移を観察した。注射後１６週に注射局所の剖検
を行い、結節の大きさ・分布により病変スコア（無；０
〜重；３）をつけ、各群５頭の平均を求めた。

【００６５】安全性の結果については、表３に示した通
りである。免疫群、比較免疫群ともに発熱、臨床症状の
異常はみられなかった。しかし、注射後１６週の剖検で
は、免疫群では病変は認められなかったが、比較免疫群
では注射物によると思われる結節が認められた。

【００６６】

【表４】 表３ （日本脳炎不活化ワクチンの安全性） ───────────────────────────── 試験群 ワクチン 成 績 病変 臨床症状 体温 スコア 免疫群 ワクチンｂ ０／５¹⁾ ０／５¹⁾ ０ ワクチンｅ ０／５ ０／５ ０ 比較免疫群 ワクチンｇ ０／５ ０／５ 2.6 対照群 − ０／５ ０／５ ０ ¹⁾異常を認めた個体数／試験頭数

【００６７】有効性については、表４に示したように、
免疫群であるワクチンｂ注射群は注射後４週にはＨＩ抗
体価の上昇が認められ、注射後８週においては８０〜１
６０倍の良好な抗体応答を示し、対照となる比較免疫群
のワクチンｇ注射群と同等の抗体応答が認められた。本
発明の水中油中水型エマルションタイプのオイルアジュ
バントワクチンであるワクチンｅは、良好かつ安定な乳
化状態を実現し、１回の注射によりＨＩ抗体価の上昇を
認め、先述の油中水型エマルションタイプのオイルアジ
ュバントワクチンと同等の良好な抗体応答を示した。

【００６８】

【表５】 表４ （日本脳炎不活化ワクチンの有効性） ──────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 0 4 6 8 免疫群 ワクチンｂ ＜10¹⁾ 61 80 139 ワクチンｅ ＜10 92 92 92比較免疫群 ワクチンｇ ＜10 70 92 92 対照群 − ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ¹⁾ 幾何平均ＪＥＶ−ＨＩ抗体価

【００６９】以上の成績は、本発明のオイルアジュバン
トワクチンが、抗原にＪＥＶを用いた場合においても非
代謝性油と同等の免疫効果を示すとともに、局所反応性
においては優れていることを証明するものである。

【００７０】《試験例３：鶏ニューカッスル病（ＮＤ）
不活化ワクチン》ニューカッスル病ウイルス石井株を１
０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に１０^5.0EID ₅₀/egg接種し、
３７℃で４日間培養後、感染尿膜腔液を採取した。これ
をホルマリン水溶液を用いて不活化したものを抗原とし
て用いた。なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理
食塩水を用い、不活化前ウイルス含有量として１０^8.5E
ID ₅₀／ドーズとなるように調整したものを水相として用
いた。まず、免疫群として、ＳＰＦ鶏群由来５週齢鶏各
１０羽に１羽当たりワクチンａ、ｂの0.5 ml、ワクチン
ｄ、ｅの１mlを筋肉内に注射し、さらに、各２０羽に１
羽当たりワクチンＸ１、Ｘ２の0.5 ml、ワクチンＸ５の
1.5 mlを筋肉内に注射した。比較免疫群としては、ＳＰ
Ｆ鶏群由来５週齢鶏各１０羽に１羽当たりワクチンｇの
0.5 ml、ワクチンｉの１mlを筋肉内に注射し、さらに、
各２０羽に１羽当りワクチンＹ２の0.5 mlを筋肉内に注
射した。また、それぞれに対して１０羽および２０羽の
非免疫同居対照群をおいた。ワクチンａ、ｂ、ｄ、ｅに
ついては、注射後１０週間注射局所を含む臨床症状を観
察すると共に、経時的に血清を採取し、その血清につい
て赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し推移を観察し
た。注射後１０週目に各群５羽について注射局所の剖検
を行い、残留物の程度・分布により病変スコア（無；０
〜重；３）をつけ、各群の平均を求めた。他の５羽につ
いてはＮＤウイルス佐藤株の１０⁴ 鶏致死量／羽を筋肉
内に注射し攻撃を行い、攻撃後２週間臨床症状を観察す
ると同時に、攻撃時及び攻撃後２週間目に採血し、得ら
れた血清についてＨＩ抗体価を測定し、感染の有無を判
定した。

【００７１】また、ワクチンＸ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｙ２に
ついては、注射後２０週間注射局所を含む臨床症状を観
察すると共に、経時的に血清を採取し、その血清につい
て赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し推移を観察し
た。注射後１０週目に各群１０羽について注射局所の剖
検を行い、残留物の程度・分布により病変スコア（無；
０〜重；３）をつけ、各群の平均を求めた。さらに１０
羽については注射後２０週目にＮＤウイルス佐藤株の１
０⁴ 鶏致死量／羽を筋肉内に注射し攻撃を行い、攻撃後
２週間臨床症状を観察すると同時に、攻撃時及び攻撃後
２週間目に採血し、得られた血清についてＨＩ抗体価を
測定し感染の有無を判定した。

【００７２】安全性の結果については、表５−１および
表５−２に示した通りである。比較免疫群であるワクチ
ンｇ、ｉ、Ｙ２注射群では、注射直後に一過性の跛行を
認めた。それに対し、免疫群では全てのワクチン注射群
において、試験期間中異常を認めなかった。注射後１０
週における剖検では、免疫群ではワクチンｂ注射群の５
羽中２羽、またワクチンＸ２注射群の１０羽中６羽に少
量の油状物が認められたが、他の注射群では病変を認め
なかった。比較免疫群ではワクチンｇ、ｉ、Ｙ２ともに
中度から重度のワクチン残留物が認められた。

【００７３】

【表６】 表５−１（鶏ニューカッスル病不活化ワクチンの安全性） ────────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 病変 0 2 3 4 6 10 スコア 免疫群 ワクチンａ O/10¹⁾O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 0 ワクチンｂ O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 0.4 ワクチンｄ O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 0 ワクチンｅ O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 0 比較免疫群 ワクチンｇ 6/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 2.2 ワクチンｉ 4/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 1.8 対照群 − O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 O/10 0 ¹⁾ 異常を認めた羽数／供試羽数

【００７４】

【表７】 表５−２（鶏ニューカッスル病不活化ワクチンの安全性） ─────────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 病変 0 2 3 4 6 8 12 16 20 スコア 免疫群 ワクチンＸ１ O/20¹⁾O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/10 O/10 O/10 0 ワクチンＸ２ O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/10 O/10 O/10 0.6ワクチンＸ５ O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/10 O/10 O/10 0 比較 ワクチンＹ２ 9/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/10 O/10 O/10 1.8免疫群 対照群 − O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/20 O/10 O/10 O/10 0 ¹⁾ 異常を認めた羽数／供試羽数

【００７５】有効性についての成績は、表６−１および
表６−２にまとめた通りである。油中水型オイルアジュ
バントワクチンである免疫群のワクチンａ、ｂ、Ｘ１、
Ｘ２と比較免疫群のワクチンｇの成績を比較するとき、
両者間に差はみられず同等と考えられた。水中油中水型
オイルアジュバントワクチンである免疫群のワクチン
ｄ、ｅ、Ｘ５と比較免疫群のワクチンｉ、Ｙ２の成績を
比較するとき、後者のＨＩ抗体価が明らかに低い値を示
した。以上の成績は、本発明のオイルアジュバントワク
チンが、代謝性油のみで構成されている場合において
も、非代謝性の鉱物油とほぼ同等の免疫効果を示すとと
もに、局所反応性においては、鉱物油系オイルアジュバ
ントワクチンの場合よりはるかに優れていることを証明
するものである。また、本発明の方法により調製された
オイルアジュバントワクチンが、高い安定性を有し、非
代謝性の鉱物油のみによる従来のオイルアジュバントワ
クチンとほぼ同等の免疫効果を示すとともに、局所反応
性においては、鉱物油のみによる従来のオイルアジュバ
ントワクチンと比較して優れていること、また、本発明
により調製された水中油中水型アジュバントワクチンに
ついても、同様に高い安定性を有し、長期にわたり良好
な有効性を発揮しながら、局所安定性の面では優れてい
ることを証明するものである。

【００７６】

【表８】 表６−１（鶏ニューカッスル病不活化ワクチンの有効性） ────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注射後週数 耐過率²⁾ ０ 10 （％） 免疫群 ワクチンａ ＜5 ¹⁾ 520 100 ワクチンｂ ＜5 453 100 ワクチンｄ ＜5 422 100 ワクチンｅ ＜5 394 100 比較免疫群 ワクチンｇ ＜5 597 100 ワクチンｉ ＜5 171 100 対照群 − ＜5 ＜5 0 ¹⁾幾何平均ＮＤ−ＨＩ抗体価 ²⁾無症状耐過羽数／供試羽数

【００７７】

【表９】 表６−２（鶏ニューカッスル病不活化ワクチンの有効性） ────────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注射後週数 耐過率²⁾ ０ 10 15 20 （％） 免疫群 ワクチンＸ１ ＜5 ¹⁾ 557 520 453 100 ワクチンＸ２ ＜5 640 485 520 100 ワクチンＸ５ ＜5 597 422 368 100 比較免疫群 ワクチンＹ２ ＜5 171 8 ＜5 100 対照群 − ＜5 ＜5 ＜5 ＜5 0 ¹⁾ 幾何平均ＮＤ−ＨＩ抗体価²⁾ 無症状耐過羽数／供試羽数

【００７８】《試験例４：牛流行熱不活化ワクチン》牛
流行熱（ＢＥＦ）ウイルスＹＨＬ株を、単層細胞層を形
成させたＨｍＬｕ−１細胞にＭＯＩ(Multiplicity of I
njection) 0.01になるように接種し、３７℃で６０分間
吸着させた後、３４℃で３日間培養した上清をホルマリ
ン水溶液を用いて不活化したものを抗原として用いた。
なお、ホルマリンを添加したリン酸緩衝生理食塩水を用
い、不活化前ウイルス含有量として１０^6.0TCID₅₀ ／ド
ーズとなるように調整したものを水相として用いた。免
疫群は体重約１５０ｋｇのウシ各２頭に、１頭当たりワ
クチンａ、Ｘ１、Ｘ３の１ml、ワクチンｄの３mlを筋肉
内に注射した。比較免疫群は体重約１５０ｋｇのウシ各
２頭に、１頭当たりワクチンｇ、Ｙ１の１mlを筋肉内に
注射した。また、２頭の非免疫同居対照群をおいた。注
射後２週間注射局所を含む臨床症状の観察、および体温
測定を行った。また、注射後経時的に血清を採取し、得
られた血清について中和抗体価を測定した。注射後２０
週には注射局所の剖検を実施した。

【００７９】安全性の結果は、表７にまとめた通りであ
る。免疫群、比較免疫群ともに臨床症状、体温に異常は
認められなかったが、注射局所の剖検においては、比較
免疫群は免疫群に比べてワクチンの残留が重度であっ
た。

【００８０】

【表１０】 表７ （牛流行熱不活化ワクチンの安全性） ───────────────────────────── 試験群 ワクチン 成 績 病変 臨床症状 体温 スコア 免疫群 ワクチンａ ０／２¹⁾ ０／２¹⁾ ０ ワクチンｄ ０／２ ０／２ ０ ワクチンＸ１ ０／２ ０／２ ０ ワクチンＸ３ ０／２ ０／２ ０ 比較免疫群 ワクチンｇ ０／２ ０／２ １ ワクチンＹ１ ０／２ ０／２ ０ 対照群 − ０／２ ０／２ ０ ¹⁾異常を認めた個体数／試験頭数

【００８１】また、有効性の結果については、表８−１
および表８−２にまとめた通りである。免疫群は注射後
４週より抗体の上昇を認め、比較免疫群と同様の抗体価
の推移を示し、さらに免疫群Ｘ１およびＸ３は、比較免
疫群のワクチンＹ１を上回る抗体価の推移を示し、その
傾向は注射後２０週まで維持されていた。

【００８２】

【表１１】 表８−１（牛流行熱不活化ワクチンの有効性） ─────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 ０ 4 6 8 免疫群 ワクチンａ ＜2 ¹⁾ 16 32 32 ＜2 32 64 64 ワクチンｄ ＜2 32 32 32 ＜2 64 32 32 比較免疫群 ワクチンｇ ＜2 32 64 32 ＜2 32 64 64 対照群 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 − ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ¹⁾ ＢＥＦ中和抗体価

【００８３】

【表１２】 表８−２（牛流行熱不活化ワクチンの有効性） ────────────────────────────────── 試験群 ワクチン 注 射 後 週 数 ０ 4 6 8 12 16 20 免疫群 ワクチンＸ１ ＜2 ¹⁾ 8 16 32 32 32 32 ＜2 32 32 64 64 64 64 ワクチンＸ３ ＜2 32 32 32 32 32 32 ＜2 32 64 64 64 32 32 比較免疫群 ワクチンＹ１ ＜2 8 8 4 4 4 4 ＜2 16 8 8 8 8 8 対照群 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 − ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ¹⁾ ＢＥＦ中和抗体価

【００８４】以上の成績は、本発明のオイルアジュバン
トワクチンが、代謝性油のみで構成されている場合にお
いても、非代謝性の鉱物油とほぼ同等の免疫効果を示す
とともに、局所反応性においては、鉱物油系アジュバン
トワクチンよりはるかに優れていることを証明するもの
である。また、本発明の方法により調製されたオイルア
ジュバントワクチンが、高い安定性を有し、かつ長期に
わたる免疫効果を示すとともに、局所反応性の面でも優
れていることを示すものである。

【００８５】〔安定性〕次に、前述の実施例４〜６、７
〜１１および比較例４〜５で調製した各オイルアジュバ
ントワクチンについて、その調製後、速やかに下記の要
領にて、安定性の評価を行った。これらの結果は、後記
の表９に示される通りであった。

【００８６】《試験例５：油中水型オイルアジュバント
ワクチン》油中水型オイルアジュバントワクチン５ml
を、１５mlのふた付きのポリプロピレン製スピッツ管
（滅菌済）に入れ、各温度での安定性の評価を行った。
調製１日後、３ケ月後、１２ケ月後に肉眼判定の後、位
相差顕微鏡（１０００倍）を用いて、各サンプルについ
てそれぞれ５視野ずつの観察を行い、その結果を以下の
基準で評価した。 ◎：相の分離がほとんど見られず、かつ乳化状態と粒子
径にほとんど変化がないもの ○：油相がわずかに分離しているか、油中水型の状態に
変化は認められないが、粒子径に若干の変化が認められ
るもの △：水相の分離が認められるか、あるいは、油中水型を
保持しているが、粒子の合一が明らかに認められるもの ×：油相、水相共に分離が認められるか、あるいは、エ
マルション粒子が大きな液滴となり、良好な油中水型が
認められないもの ××：内相の抗原がほとんど保持されておらず、明らか
に相分離が認められるもの

【００８７】《試験例６：水中油中水型オイルアジュバ
ントワクチン》水中油中水型オイルアジュバントワクチ
ン１０mlを、２０mlのふた付きのガラス製スクリュー管
（滅菌済）に入れ、各温度での安定性の評価を行った。
調製１日後、３ケ月後、１２ケ月後に肉眼判定の後、位
相差顕微鏡（１０００倍）を用いて、各サンプルについ
てそれぞれ５視野ずつの観察を行い、以下の基準で評価
した。 ◎：乳化状態と粒子径にほとんど変化が認められないも
の ○：水中油中水型の状態には変化が認められないが、粒
子径に若干の変化が認められるもの △：水中油中水型を保持しているが、粒子の合一が明ら
かに認められるもの ×：エマルション粒子が大きな液滴となり、良好な水中
油中水型が一切認められないもの ××：水中油中水型がほとんど保持されておらず、明ら
かに相分離が認められるもの

【００８８】

【表１３】 表９ オイルアジュバントワクチンの安定性 ─────────────────────────────────── ワクチン ４℃保存 常温保存 No. １日後 ３ケ月後 12ケ月後 １日後 ３ケ月後 12ケ月後 Ｘ１ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ Ｘ２ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ Ｘ３ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ Ｘ４ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ Ｘ５ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ Ｙ１ ◎ ○ △ ◎ ○ × Ｙ２ ○ × ×× ○ × ××

【００８９】前述の表１〜表８および表９の結果から明
らかなように、本発明により、安全性および抗体産生能
ともにすぐれたオイルアジュバントワクチンが得られる
こと、また油分に、ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライド
のエチレンオキサイド付加物と、本発明のＢ成分とＥ成
分の水溶液からなるゲル状物質を加えて混合したのち、
生物学的に許容される有効量の抗原を含有する水相を加
えて乳化させる方法により、低粘度であって、かつ長期
安定性および抗体産生持続能ともにすぐれたオイルアジ
ュバントワクチンを調製できること、そしてこの方法に
より調製した油中水型オイルアジュバントワクチンをさ
らに本発明の乳化剤を含有した水相に添加し、再乳化さ
せる方法により、安全性および抗体産生能ともにすぐれ
た水中油中水型オイルアジュバントワクチンを調製でき
ることがわかる。

【発明の効果】本発明により、植物由来のレクチンのよ
うな免疫刺激物質を処方中に全く使用しなくても、高い
抗体産生力を長期間発揮すると共に、医薬品としての製
剤安定性や局所反応性にすぐれた、有用なオイルアジュ
バントワクチンを調製することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 齋藤 晃一 兵庫県尼崎市西昆陽１丁目31−20 (72)発明者 岸本 洋子 兵庫県明石市魚住町錦が丘１丁目７−８ (72)発明者 徳山 悟 兵庫県西宮市池開町９−２−304

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ）常温で液状を示す油相２０〜９０重
   量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと
   脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イ
   オン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセ
   ライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との
   混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、およびＤ）生
   物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜７５重
   量％を含有する油中水型オイルアジュバントワクチン。
2. 【請求項２】 Ａ）常温で液状を示す油相２０〜９０重
   量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと
   脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イ
   オン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセ
   ライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との
   混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、Ｅ）アミノ酸
   またはその塩０．０１〜１０重量％および分子内に少な
   くとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アル
   コール０．０１〜１０重量％、およびＤ）生物学的に許
   容される有効量の抗原を含む水相５〜７５重量％を含有
   する油中水型オイルアジュバントワクチン。
3. 【請求項３】 Ａ）常温で液状を示す油相３０〜９０重
   量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと
   脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イ
   オン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセ
   ライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との
   混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、およびＤ）生
   物学的に許容される有効量の抗原を含む水相５〜６５重
   量％を含有する油中水型オイルアジュバント相と、Ｆ）
   非イオン系界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０
   以上である乳化剤０．２〜２０重量％を含有する外水相
   からなる水中油中水型オイルアジュバントワクチン。
4. 【請求項４】 Ａ）常温で液状を示す油相３０〜９０重
   量％、Ｂ）３個以上の水酸基を有する多価アルコールと
   脂肪酸との部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イ
   オン系界面活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセ
   ライドのエチレンオキサイド２０〜６０モル付加物との
   混合物である乳化剤０．５〜３０重量％、Ｅ）アミノ酸
   またはその塩０．０１〜１０重量％および分子内に少な
   くとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または糖アル
   コール０．０１〜１０重量％、およびＤ）生物学的に許
   容される有効量の抗原を含む水相５〜６５重量％を含有
   する油中水型オイルアジュバント相と、Ｆ）非イオン系
   界面活性剤を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である
   乳化剤０．２〜２０重量％を含有する外水相からなる水
   中油中水型オイルアジュバントワクチン。
5. 【請求項５】 Ａ）常温で液状を示す油相が脂肪酸エス
   テルである請求項１〜４のいずれか１項に記載のオイル
   アジュバントワクチン。
6. 【請求項６】 Ａ）常温で液状を示す油相が脂肪酸エス
   テルとスクアレンとの混合物である請求項１〜４のいず
   れか１項に記載のオイルアジュバントワクチン。
7. 【請求項７】 Ａ）常温で液状を示す油相が、シス−Δ
   ９−オクタデセン酸を８５重量％以上含有し、かつシス
   −Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量％以上含有する脂肪酸
   とアルコールとのエステル化物である請求項１〜４のい
   ずれか１項に記載のオイルアジュバントワクチン。
8. 【請求項８】 Ｂ成分の非イオン系界面活性剤を構成す
   る脂肪酸が、シス−Δ９−オクタデセン酸を８５重量％
   以上含有し、かつシス−Δ９−不飽和脂肪酸を９０重量
   ％以上含有する脂肪酸である請求項１〜４のいずれか１
   項に記載のオイルアジュバントワクチン。
9. 【請求項９】 Ｆ）の外水相が、非イオン系界面活性剤
   を含み、かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤とグ
   リセロリン脂質との混合物０．２〜２０重量％を含有す
   る外水相である請求項３または４に記載の水中油中水型
   オイルアジュバントワクチン。
10. 【請求項１０】 Ａ）常温で液状を呈する油相に、Ｂ）
    ３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との
    部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面
    活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエ
    チレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、Ｂ成分の非
    イオン系界面活性剤とＥ）アミノ酸またはその塩および
    分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖
    または糖アルコールを含有する水溶液とを、Ｂ成分の非
    イオン系界面活性剤：Ｅ成分の水溶液が重量比で１：１
    から１：２０となるように混合、攪拌したものとを加え
    たのち、Ｄ）生物学的に許容される有効量の抗原を含有
    する水相を加えて乳化させることを特徴とする請求項２
    に記載の油中水型オイルアジュバントワクチンの調製方
    法。
11. 【請求項１１】 Ａ）常温で液状を呈する油相に、Ｂ）
    ３個以上の水酸基を有する多価アルコールと脂肪酸との
    部分エステルで、４０℃で液状を呈する非イオン系界面
    活性剤と、Ｃ）ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエ
    チレンオキサイド２０〜６０モル付加物と、Ｂ成分の非
    イオン系界面活性剤とＥ）アミノ酸またはその塩および
    分子内に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖
    または糖アルコールを含有する水溶液とを、Ｂ成分の非
    イオン系界面活性剤：Ｅ成分の水溶液が重量比で１：１
    から１：２０となるように混合、攪拌したものとを加え
    たのち、Ｄ）生物学的に許容される有効量の抗原を含有
    する水相を加えて調製した油中水型オイルアジュバント
    ワクチンを、さらにＦ）非イオン系界面活性剤を含み、
    かつ全体のＨＬＢが１０以上である乳化剤０．２〜２０
    重量％を含有する水相中に添加し、乳化することを特徴
    とする請求項４に記載の水中油中水型オイルアジュバン
    トワクチンの調製方法。