CN103602599B - 电激转化法选育高温型阿魏菇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食用菌品种培育技术领域，是一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其包括第一步阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立、第二步外源基因的获得、第三步电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体、第四步筛选优良再生菌株、第五步转化子的鉴定。与现有技术相比，本发明获得了生长速度快、不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新种质，其出菇温度为温度白天 25 ℃，夜间 17 ℃，并且出菇时间提前了 30 天。在经济效益上，该发明有效地改良了阿魏菇的品质，不仅缩短了生长周期、节约了栽培成本，而且可以开展反季节生产，真正为种植农户增收添砖加瓦。

Description

电激转化法选育高温型阿魏菇的方法

技术领域

本发明涉及食用菌品种培育技术领域，是一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法。

背景技术

阿魏菇(Pleurotus ferulae) 中文学名为准噶尔阿魏侧耳，是一种低温型菇类，要求空气新鲜，适宜冬暖夏凉地域的潮湿环境栽培。菌丝生长的最适温度为25℃至28℃，在35℃至36℃时菌丝停止生长。阿魏菇子实体分化温度在0℃至15℃，子实体在5℃至18℃均可生长，以在13℃至15℃时生长较快且菇质好。阿魏菇必须经过低温刺激才能通过生理成熟，否则难以出菇。阿魏菇菌丝生3段养料含水量应在60%至70%。子实体生长发育时要求空气相对湿度保持在85%至95%。目前，除新疆、北京外，国内其它地方也有栽培。但由于阿魏菇是一种中低温型食用菌。胡清秀提出充分发菌后的菌袋于4℃低温处理数天再进行出菇管理，否则必须经过2个月以上的菌丝后熟才能出菇。菌丝满袋后仍需要30天至40天后熟培养才能进行催蕾出菇。由此可见，阿魏菇原基的形成需要低温刺激的作用，如果阿魏菇不通过低温（春化阶段）处理，会造成出菇率低，很少能同时出菇。乌鲁木齐周边阿魏菇种植户每年因要对阿魏菇进行低温刺激，把阿魏菇菌袋运至天山冰川生产。这都给人工栽培带来了更多的资金投入和生产难度。

发明内容

本发明提供了一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，克服了上述现有技术存在的问题，其不但可开展反季节生产，而且能够有效的缩短常规阿魏菇栽培的生成周期，降低生产成本。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立：对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为：在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8 天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体，该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 ℃酶解3 h获得原生质体达5×10 ⁶  个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为：在0.8 mol/L 蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6%；

第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA：称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入1mlCTAB混合，该CTAB为含DTT50μL /ml的水溶液；倒入已加入100μL氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65℃水浴锅中30min，接着室温放置15min；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，轻轻混匀，13000rpm离心7min；取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或-20℃，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min；弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc 1mL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，-20℃保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA 进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到1μg/μL；

第三步，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体：用1mol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2×10 ⁵ 个/ml置于42℃浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300μL的原生质体溶液和20μL平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25℃黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；

第四步，筛选优良再生菌株：将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32℃时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32℃时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，测定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为一个转化子；

第五步，转化子的鉴定：1）酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2）纤维素酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法；3）RAPD分析；最终，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。

对上述本发明的技术方案进一步进行如下的选择或/和优化：

将上述高温型阿魏菇菌株在白天温度为25℃、夜间温度为17℃的现有公知的阿魏菇生长环境中进行出菇试验，90天能正常出菇。

本发明的积极效果是：与现有技术相比，本发明首先建立了高效的阿魏菇原生质体制备与再生体系，为植物的分子修饰提供良好的受体；同时，建立了电激法遗传转化体系，其操作简单方便，没有化学物质对原生质体的伤害，确保了外源基因的整合，使得转基因株系具有优良的生物学特性；经过临界生长温度的筛选，并结合分子生物学检测手段，有效验证了外源基因的整合，获得了生长速度快，不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新种质，其出菇温度为温度白天25℃，夜间17℃，并且出菇时间提前了30天。在经济效益上，该发明有效地改良了阿魏菇的品质，不仅缩短了生长周期、节约了栽培成本，而且可以开展反季节生产，真正为种植农户增收添砖加瓦。

附图说明

附图1是本发明的工作原理图。

附图2是制备的阿魏菇原生质体。此图为阿魏菇菌丝酶解后获得原生质体形态图，图中阿魏菇原生质体体积较大，数目多，有利原生质体的收集，为电激转化奠定基础。

附图3是再生的阿魏菇菌丝。经过酶解的原生质体，其细胞壁都受到不同程度的破坏，将其涂布于含有稳定剂的再生培养基中，有效维持了原生质体内部渗透压的稳定性，使得原生质体得以较好的恢复，为后期转基因株系的筛选提供物质保障。

附图4是获得的优良转化菌株。转化菌株与野生型菌株生长速度的对比，转化菌株的生长速度是野生型菌株生长速度的3-4倍。

附图5是优良菌株的出菇结果图。转化菌株与野生型菌株出菇实验对比，两者之间在形态上无差异。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1，如附图1至5所示，该电激转化法选育高温型阿魏菇的方法按下述步骤进行：

第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立：对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为：在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8 天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体，该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 ℃酶解3 h获得原生质体达5×10 ⁶  个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为：在0.8 mol/L 蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6%；以上阿魏菇原生质体制备与再生体系的建立，为后期电激转化提供了坚实基础;

第二步，外源基因的获得,提取平菇总DNA:称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入1mlCTAB(含DTT50μL /ml现用现配已配好DTT1M)混合，该CTAB为含DTT50μL /ml的水溶液；倒入已加入100μL氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65℃水浴锅中30min，接着室温放置15min；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，轻轻混匀，13000rpm离心7min；取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或-20℃，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min,弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc 1mL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，-20℃保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA 进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到1μg/Μl;

第三步，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体:用1mol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2×10 ⁵ 个/ml置于42℃浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300μL的原生质体溶液和20μL平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25℃黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；

第四步，筛选优良再生菌株:将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32℃时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32℃时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，测定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为一个转化子；

第五步，转化子的鉴定：1）酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2）纤维素酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法；3）RAPD分析；最终，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。

实施例2，与实施例1的不同之处在于：将上述实施例1所得的高温型阿魏菇菌株在白天温度为25℃、夜间温度为17℃的现有公知的阿魏菇生长环境中进行出菇试验（与现有公知的阿魏菇生产方法相同），使出菇时间提前30天，由120天提前到90天。其中进棚到原基出现15天左右，幼菇到成菇5-7天。

本发明中：除另有规定外，百分比%的单位都为质量百分比。

Claims (1)

1.一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立：对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其制备原生质体的条件为：在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8 天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体，该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 ℃酶解3 h获得原生质体达5×10⁶ 个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其条件为：在0.8 mol/L 蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6%；

第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA：称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入1mlCTAB混合，该CTAB为含DTT50μL /ml的水溶液；倒入已加入100μL氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65℃水浴锅中30min，接着室温放置15min；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，轻轻混匀，13000rpm离心7min；取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或-20℃，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min；弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc 1mL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，-20℃保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA 进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到1μg/μL；

第三步，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体：用1mol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2×10⁵个/ml置于42℃孵育5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300μL的原生质体溶液和20μL平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25℃黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；

第四步，筛选优良再生菌株：将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32℃时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32℃时菌丝能正常生长，并且第三获得的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，测定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为一个转化子；

第五步，转化子的鉴定：1）酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2）纤维素酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法；3）RAPD分析；最终，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。