CN103520014A - 含有来自水耕栽培人参的人参皂苷f2的皮肤外用剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有人参皂苷F2的皮肤外用剂组合物，更详细地涉及如下的组合物，该组合物含有由利用培基耕人参水耕栽培系统或喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶提取的人参皂苷F2，从而能够获得更高含量的人参皂苷F2。另外，由于该组合物中含有人参皂苷F2，从而不仅能够通过优异的抗氧化能力而提供防皮肤老化效果、皮肤保湿能力改善效果、抗炎效果、粉刺和特应性等皮肤问题改善效果，美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果、并通过改善血液循环而提供的面色改善等皮肤整体状态改善效果，而且能够提供防头屑效果、育发效果和防止白发效果等头皮和毛发状态改善效果。

Description

含有来自水耕栽培人参的人参皂苷F2的皮肤外用剂组合物
技术领域
本发明涉及含有人参皂苷F2的皮肤外用剂组合物，更详细地涉及如下组合物，该组合物含有由利用培基耕人参水耕栽培系统或喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶提取的人参皂苷F2，从而能够获得更高含量的人参皂苷F2。此外，由于该组合物中含有人参皂苷F2，从而不仅能够通过优异的抗氧化能力而提供防止皮肤老化效果、皮肤保湿能力改善效果、抗炎效果、粉刺和特应性等皮肤问题改善效果，美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果、并通过改善血液循环而提供的面色改善等皮肤整体状态改善效果，而且能够提供防头屑效果、育发效果和防止白发效果等头皮和毛发状态改善效果。
背景技术
人的皮肤作为人体的一次防御膜，发挥着保护体内的器官免受温度和湿度的变化、紫外线、有害物质之类的外部环境刺激的功能。随着年龄的增长，由于各种内在、外在因素发生变化（即，就内在而言，调节新陈代谢的各种激素的分泌减少，免疫细胞的功能和细胞的活性降低，从而生物体所必需的免疫蛋白质和生物体结构蛋白质的生物合成减少；就外在而言，由于臭氧层的破坏，太阳光线中到达地表的紫外线含量增加，环境污染越加严重，从而自由基和活性有害氧等增加），因此引起皮肤的厚度减小，皱纹增加，弹力减小，而且皮肤血色也变得暗沉，皮肤问题经常出现，痣和雀斑以及黄褐斑也增加，血色变差，皮肤色调也变暗等各种变化。
为了防止这样的由于内在和外在因素导致的皮肤状态的变化、维持健康的皮肤状态，一直努力将从目前已知的各种动物、植物、微生物等获得的生理活性物质添加在化妆品中使用，从而改善皮肤状态。
发明内容
对此，本发明的发明人发现人参皂苷F2不仅能够提供抗老化、改善皮肤皱纹、美白、改善保湿效果，而且能够提供粉刺和皮肤问题、特应性症状的改善效果，而且还能够提供皮肤血色改善效果、调节皮脂、毛孔收缩效果等皮肤状态改善效果，另外还能够提供防头屑、育发和防止白发等头皮和毛发状态改善效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供含有人参皂苷F2而能够改善皮肤的整体状态的皮肤外用剂组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种皮肤外用剂组合物，其中，所述皮肤外用剂组合物含有人参皂苷F2作为有效成分，所述人参皂苷F2由利用培基耕人参水耕栽培系统或喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶进行提取。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于抗老化的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于美白的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于保湿的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于改善粉刺的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于改善特应性的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于改善血色和皮肤色调的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于缩小毛孔的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于调节皮脂的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于防头屑的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于育发的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了含有人参皂苷F2作为有效成分用于防止白发的皮肤外用剂组合物。
另外，本发明提供了将人参皂苷F2作为天然防腐剂使用的皮肤外用剂组合物。
在本发明的组合物中利用的人参皂苷F2由利用培基耕人参水耕栽培系统和喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶提取，与现有的人参相比能够获得更多的人参皂苷F2，通过人参皂苷F2所具有的优异的抗氧化能力，不仅能够提供防止皮肤老化效果、皮肤保湿能力改善效果、抗炎效果、粉刺和特应性等皮肤问题改善效果，美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果、通过改善血液循环而提供的面色改善等皮肤整体状态改善效果，而且能够提供防头屑效果、育发效果和防止白发效果等头皮和毛发状态改善效果。
附图说明
图1是表示用80%乙醇进行提取时人参叶中存在的人参皂苷F2的含量差异的图。
图2是表示一般露地栽培人参叶、水耕栽培30天、60天、90天和120天的人参叶中存在的各成分分析结果的图。
图3是表示涂抹剂型例5和比较剂型例6后的毛生长效果的图。
具体实施方式
根据本发明的皮肤外用剂组合物含有人参皂苷F2作为有效成分。
在本发明中使用的人参皂苷F2具有下述化学式1的结构。
化学式1
Figure BDA00003469625300041
本发明的人参皂苷F2的特征在于是由根据韩国公开专利公报第10-1021-0001774号公开的方法利用培基耕人参水耕栽培系统或喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶提取的。
利用所述培基耕人参水耕栽培系统生产清洁原参和人参叶的方法包括以下步骤：
a）将苗参出库后移至15℃的储藏温室中保存1～2天后实施临时移植的纯化1步骤；
b）将临时移植的所述苗参在温室下保存1～2天而适应温室环境后，将所述苗参固定移植到在带有排水槽的苗床的内部形成的混合培养基的纯化2步骤；
c）调制营养液的步骤；
d）将适量的所述营养液供给到所述苗参的步骤；以及
e）4～5个月后收获的步骤。
另外，利用所述喷雾耕人参水耕栽培系统生产清洁原参和人参叶的方法包括以下步骤：
a）将苗参出库后移至15℃的储藏温室中保存1～2天后实施临时移植的纯化1步骤；
b）将临时移植的所述苗参在温室下保存1～2天而适应温室环境后，将所述苗参固定移植到苗床的纯化2步骤；
c）调制营养液的步骤；
d）将所述营养液通过喷雾嘴喷射到所述苗参的根部的步骤；
e）使用的所述营养液通过形成于所述苗床的一端的排水口流入营养液罐而再利用的步骤；以及
f）4～5个月后收获的步骤。
人参根或人参叶提取物不仅包括由利用所述方法栽培的人参根或人参叶进行浸出、煎出而得到的浸出液，还包括将浸出液重新部分浓缩或全部浓缩而得到的浓缩物或将所述浓缩物重新进行干燥而制备的浸出物
Figure BDA00003469625300051
煎剂、精提物
Figure BDA00003469625300052
液体浸膏以及人参中所含有的能够发挥各种效果的化学物质，当然也包括植物本身。另外，由人参提取物提取人参皂苷F2的方法可以使用公知的方法进行。
具体而言，所述人参皂苷F2可以从人参中利用本领域公知的用水或有机溶剂制备人参提取物后，将其进行分离得到。用于本发明的有机溶剂可以选自由乙醇、甲醇、丁醇、酯、乙酸乙酯、氯仿以及这些有机溶剂与水的混合溶剂组成的组，优选使用80%的乙醇。此时，提取温度优选为10～80℃，可以提取3～24小时。如果脱离所述提取温度和提取时间，可能会降低提取效率或发生成分的变化。
根据本发明的组合物，相对于组合物总质量，可以以0.001～50重量%、优选以0.01～30重量%、更优选以0.1～10重量%的含量含有人参皂苷F2。这是因为当所述人参皂苷F2的含量小于0.001重量%时，该成分带来的功效、效果微弱，当超过50重量%时，存在皮肤安全性或剂型上的问题。
人参皂苷F2是具有优异的抗氧化能力的成分，所以含有人参皂苷F2的本发明的组合物通过提供优异的抗氧化能力而可以作为用于抗老化的皮肤外用剂组合物而使用，其增进皮肤弹力并改善皱纹的效果优异。
本发明的组合物可以作为用于美白的组合物使用，其可以抑制酪氨酸酶活性并抑制黑色素的生成，从而提供优异的美白效果。
本发明的组合物可以作为用于保湿的皮肤外用剂组合物使用，其可以强化皮肤屏障功能，诱导皮肤角质形成细胞的分化。因此，可以作为预防或改善由于表皮分化得不完全而产生的皮肤干燥症、特应性皮炎、接触性皮炎或银屑病等的皮肤外用剂组合物而有用地使用。
本发明的组合物可以作为用于改善粉刺的皮肤外用剂组合物使用，其抗菌效果，特别是对粉刺病原菌的抗菌效果优异，另外还提供了抗炎效果。
本发明的组合物可以作为用于改善血色和皮肤色调的皮肤外用剂组合物使用，其用于皮肤时，能扩张毛细血管，促进血液循环，从而顺利地为皮肤供给营养成分，抑制皮肤老化，血色和皮肤色调改善效果优异。
本发明的组合物可以作为用于缩小毛孔、调节皮脂和改善皮肤问题的皮肤外用剂组合物使用，其用于皮肤时，抑制皮脂的过量分泌，促进活性氧清除和胶原合成，从而缩小毛孔，减少炎症因子的表达，抑制皮肤问题的效果优异。另外，由于具有优异的抗氧化能力，其能够防御皮肤刺激的生成。
本发明的组合物可以作为用于防头屑的皮肤外用剂组合物使用，其有效地将蓄积在毛发和头皮中的毒素排出来以净化头皮，抑制头屑菌的增殖和生长，能够预防头皮炎症反应，另外抑制活性氧的生成和作用的抗氧化功效优异，因此能够提供舒缓并强化头皮、强化自然的防御力的效果。
本发明的组合物可以作为用于育发的皮肤外用剂组合物使用，其促进休止期毛发周期向生长期毛发周期转移，从而能够提供促进毛发的生长、防止脱发的效果。
本发明的组合物可以作为用于防止白发的皮肤外用剂组合物使用，其能够明显提高在黑色素细胞中MITF的表达，从而抑制白发，促进黑发生长。
另外，在本发明的皮肤外用剂组合物中使用的人参皂苷F2能够提供作为天然防腐剂的效果。
本发明所述的皮肤外用剂组合物能够以化妆品组合物进行制剂，可以含有化妆品学或皮肤科学上可允许的介质或基质来制剂。这可以是适用于局部应用的所有剂型，例如，能够以溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物、在水相中分散油相而得到的乳液、悬浮液、微乳、微胶囊、微细颗粒或离子型（脂质体）和非离子型的小囊分散剂的形态提供，或以霜、化妆水、润肤露、粉、软膏、喷雾或遮瑕棒的形态提供。另外，还能够以泡沫（foam）的形态或进一步含有压缩的推进剂的气溶胶组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域中常规的方法进行制备。
特别是，当本发明的皮肤外用剂组合物作为用于防头屑、育发或防止白发的制品使用时，虽然不特别限定剂型，但可以作为用于头皮和毛发的组合物而制剂，例如可以制成生发剂、毛发营养化妆水、头皮修护素、护发修护素、洗发水、护发素、护发露或头皮毛发兼用修护素等。
另外，根据本发明的组合物可以含有脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、凝胶剂、软化剂、抗氧化剂、乳浊液、稳定剂、发泡剂（foaming agent）、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、多价螯合剂、螯合剂、防腐剂、维生素、阻断剂
Figure BDA00003469625300071
湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂囊泡或在化妆品中通常使用的任意其他成分之类的化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的助剂。所述助剂以化妆品学或皮肤科学领域中一般使用的量加入。
另外，本发明的组合物为了增加皮肤改善效果而可以含有皮肤吸收促进物质。
下面，举出试验例和剂型例进一步具体说明本发明的配方和效果。但是，这些试验例和剂型例仅是为了有助于对本发明的理解而以示例的目的来提供的，本发明的范畴和范围不被其所限定。
[参考例1]人参的水耕栽培
将低温储藏的苗参移到15℃的储藏温室中保存2天后，临时移植到含有70%至80%水分的园艺用育苗土（椰糠50%、泥炭藓30%、蛭石10%、沸石10%）中进行纯化。纯化步骤的温度维持在20至23℃，在5至7天后苗参的新芽变绿时移到25℃、湿度维持在80%至90%的温室中。2天后，将苗参固定移植到苗床后供给适量营养液来进行水耕栽培人参。所述营养液是将多量元素NO36.0mg/L、NH40.5mg/L、K4.0mg/L、Ca2.0mg/L、Mg1.0mg/L、PO41.5mg/L、SO41.0mg/L和微量元素Fe-EDTA3.0mg/L、Mn0.5mg/L、B0.5mg/L、Cu0.02mg/L、Mo0.05mg/L、Zn0.05mg/L的比例进行调制，pH为6.0±0.5，营养液的浓度从刚固定移植后到叶展开而纯化步骤结束为止的30天期间将离子浓度以0.8±0.1dS/cm2进行管理，以后生长期以1.1±0.1dS/cm2进行管理。
[参考例2]人参皂苷F2的含量比较
一般栽培（露地栽培）人参叶从锦山的人参买卖中心购买（2011年10月），水耕栽培人参叶是将苗参于2012年1月固定移植后利用所述参考例1的方法栽培30天、60天、90天、120天后进行采摘。
人参叶分别在55℃热风干燥机中干燥12小时，以具有相同量的水分含量的方式进行干燥，干燥的人参叶充分研磨成100～300目（mesh），每10g在200ml的80%乙醇中提取24小时。将提取的人参叶过滤并减压浓缩，制成提取物粉末，以10,000ppm溶解于80%的乙醇中，进行HPLC分析。
HLPC分析使用Waters（USA）株式会社的2695分离单元（separationmodule）和2996PDA检测器（detector），分析柱使用Kanto Chemical（Japan）株式会社的250mm4.6mm i.d.Mightysil C18反相柱（reverse phase column）。流动相溶液使用水和乙腈（acetonitrile），分析85分钟。详细而言，将水和乙腈之和作为100%，从0分钟至5分钟由水90%向水79%进行，从5分钟至10分钟由水79%向水79%进行，从10分钟至35分钟由水79%向77.5%进行，从35分钟至37分钟由水77.5%向水69%进行，从37分钟至77分钟由水69%向水50%进行，从77分钟至80分钟由水50%向水50%进行，从80分钟至83分钟由水50%向水90%进行，从83分钟至85分钟由水90%向水90%进行分析。
另外，人参皂苷F2的标准品购自Ambo研究所（Korea）。
测定结果在图1和图2中示出。可以确认在通过水耕栽培使人参生长的情况下，与在露地用一般方法进行生长的人参相比，人参皂苷F2的含量显著提高，特别是进行水耕栽培后，经过30天的人参叶的人参皂苷F2的含量最高，其后人参皂苷F2的含量减少。
[试验例1]抑制活性氧（ROS：reactive oxygen species）生成的效果
将从人的表皮组织中分离的角质形成细胞（keratinocyte）在24孔板的各孔中放入5×104个，使其附着24小时。16小时后，用1%的人参皂苷F2处理。此时，为了比较，对照组不用人参皂苷F2处理。2小时后除去培养液，在各孔中放入100μl的磷酸缓冲液（PBS）。利用紫外线B（UVB）灯（Model：F15T8，UV B15W，Sankyo Dennki公司，日本）对该角质形成细胞照射紫外线30mJ/cm2后，去掉PBS后，在各孔中添加角质形成细胞培养液200μl。再次对其用人参皂苷F2进行处理，按照一定时间用定量的紫外线刺激而增加的活性氧的量。ROS的量是参照由ROS而氧化的DCF-DA（dichlorofluorescin diacetate）荧光Tan方法进行定量测定（Tan et al.,1998,J.Cell Biol.Vol.141,pp1423-1432）的，将相对于仅用溶剂处理的对照组的ROS的比例的结果示于下表1中。
【表1】
Figure BDA00003469625300101
由表1的结果可知，根据本发明的人参皂苷F2有效抑制了已知由于紫外线而引起皮肤细胞损伤的ROS的生成，将ROS的生成抑制到紫外线刺激后ROS的量与不照射紫外线的情况几乎相同水平的程度，其抗氧化功效非常优异。因此，确认了根据本发明的人参皂苷F2能够抑制氧化并防止老化，从而能够预防毛孔扩大，防御皮肤刺激的生成，能够改善皮肤问题。
[试验例2]胰肽酶活性抑制功效的测定
将人参皂苷F2与EGCG的胰肽酶活性抑制能力进行比较测定。使用的胰肽酶和基质商购自美国西格玛奥德里奇公司（Cat.No.E0127）。
用下述试验方法试验胰肽酶活性抑制作用。
在96孔板中，将10mg/L Tris-HCL缓冲液（pH8.0）与人参皂苷F2（200μL）和20μg/mL胰肽酶III型溶液50μL混合。将EGCG250μM作为阳性对照组，将蒸馏水作为阴性对照组的非处理组。然后，添加用所述缓冲液调制的0.4514mg/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE100μL，在25℃下反应15分钟。反应结束后，测定波长415nm下的吸光度。用相同方法进行空白试验以进行修订。
胰肽酶活性抑制作用按如下述数学式1进行计算，结果示于下表2中。
【数学式1】
胰肽酶活性率(%)＝{1-(C-D)/(A-B)}×100
A：未添加试验物质、添加酶时在波长415nm下的吸光度
B：未添加试验物质、未添加酶时在波长415nm下的吸光度
C：添加试验物质、添加酶时在波长415nm下的吸光度
D：添加试验物质、未添加酶时在波长415nm下的吸光度
【表2】
化合物 抑制程度（%）
非处理组 0
EGCG 65
人参皂苷F2 78
如表2所示，人参皂苷F2的胰肽酶活性抑制程度与已知作为胰肽酶活性抑制剂的EGCG相比更为优异，可以确认本发明的人参皂苷F2的胰肽酶活性抑制效果优异。
[试验例3]胶原酶（MMP-1）抑制能力
将本发明的人参皂苷F2与维甲酸的胶原酶生成抑制能力进行比较测定。
在装有含有2.5%胎牛血清的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’sMedia）培养基的96孔平板培养器（96-well microtiter plate）中以达到5,000细胞/孔（well）的方式放入人成纤维细胞，在5%CO2、37℃的培养箱（incubator）中培养至生长70～80%的程度。将人参皂苷F2或维甲酸以10μg/ml浓度处理24小时后，取细胞培养液。
利用在商业上能够利用的胶原酶测定仪器（美国Amersham pharmacia公司，Catalog#：RPN2610）测定所取的细胞培养液的胶原酶生成程度。首先，在均匀涂布有1次胶原酶抗体的96-孔平板（96-well plate）中放入所取的细胞培养液，在恒温条件下进行3小时抗原-抗体反应。3小时后，将结合有发色团的2次胶原酶抗体放入96-孔平板（96-well plate）中，再反应15分钟。15分钟后，放入发色诱发物质（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，sigma），在室温下诱发发色15分钟，再放入1M硫酸，终止发色反应，反应液的颜色显示黄色，根据反应进行的程度而黄色显示的程度不同。
利用光度计在405nm下测定显示黄色的96-孔平板（96-well plate）的吸光度，通过下述数学式2计算胶原酶的合成程度，结果示于下表3中。此时将未经组合物处理的组中采集的细胞培养液的反应吸光度作为对照组。
【数学式2】
Figure BDA00003469625300121
【表3】
化合物 表达程度（%）
非处理组 100
维甲酸 75
人参皂苷F2 73
如表3所示，将人参皂苷F2的胶原酶表达程度与已知作为胶原酶表达抑制剂的维甲酸相比较，胶原酶表达抑制效果为相似的水平。
通过这样的结果可以确认，本发明的人参皂苷F2具有抑制基质胶原酶（MMP-1）的效果。
[剂型例1和比较剂型例1]
根据下表4的组成按照常规方法制备营养霜（单位：重量%）。
【表4】
Figure BDA00003469625300131
[试验例4]皮肤弹力提高功效确认
为了确认对于人的皮肤弹力提高效果，利用所述剂型例1和比较剂型例1的剂型进行如下评价。
将20名30～40岁的健康女性分别对应剂型例1和比较剂型例1这2组分成2组，每组10名，让她们将营养霜每天在面部涂抹1次，涂抹12周，然后利用皮肤弹力测定机（Cutometer SEM575，C+K Electronic Co.，Germany）测定皮肤弹力。其结果示于下表5中。表5的结果值以Cutometer SEM575的ΔR8值进行记载，R8值表示皮肤粘弹性（viscoelasticity）的性质。
【表5】
实验制品 皮肤弹力效果
剂型例1 0.32
比较剂型例1 0.10
如表5所示，将涂抹了含有本发明的人参皂苷F2的剂型例1与涂抹了比较剂型例1的组相比较，皮肤弹性进一步增加。
因此，可以确认含有本发明的人参皂苷F2的组合物对于皮肤弹力的提高非常有效。
[试验例5]皮肤皱纹改善功效确认
为了确认根据本发明的组合物对于人的皱纹的改善效果，利用所述剂型例1和比较剂型例1的剂型进行评价。
为了确认所述剂型例1和比较剂型例1的皱纹改善效果，进行如下评价。将20名40岁的健康女性分别对应剂型例1和比较剂型例1这2组分成2组，每组10名，将营养霜每天在面部涂抹1次，涂抹12周后，利用有机硅制成模写板，用皮肤测定机（visiometer，SV600，Courage+Khazaka electronicGmbH，Germany）测定皱纹的状态，进行图像分析。结果于下表6所示。下表6中的值表示从涂抹12周后的各个参数（parameter）值中减去涂抹前的参数值而得到的平均值。
【表6】
使用8周后临床结果 R1 R2 R3 R4 R5
剂型例1 0.13 0.12 0.09 0.01 0.01
比较剂型例1 0.27 0.26 0.21 0.03 0.03
R1：皱纹轮廓线的最高值与最低值的差值
R2：将皱纹轮廓线任意分成5个部分后其中R1值的平均值
R3：分成的5个部分中R1值的最高值
R4：从皱纹轮廓线的基线（baseline）中每个最高值和最低值的差值的平均值
R5：皱纹轮廓线的基线（baseline）与皱纹轮廓的差值
从表6所示的结果可知，剂型例1的外用剂组合物对皮肤皱纹改善效果非常优异。
[试验例6]酪氨酸酶抑制效果
酪氨酸酶使用西格玛（SIGMA）公司的从蘑菇（Mushroom）中提取的酪氨酸酶。首先，将作为基质的酪氨酸溶解于蒸馏水中，制成0.3mg/ml的溶液，将该溶液按每1.0ml放入试管后，向其中添加磷酸钾缓冲溶液（浓度为0.1mol，pH值为6.8）1.0ml和蒸馏水0.7ml。
将本发明的人参皂苷F2以适当的浓度混合于乙醇溶液中而制备的试样液0.2ml放入反应液中后，在37℃恒温槽中反应10分钟。此时，对照组制备的代替试样液仅加入了0.2ml溶剂，阳性对照组使用了抗坏血酸。在反应液中各加入2500单位/ml的酪氨酸酶溶液0.1ml，再在37℃恒温槽中反应10分钟。将装有反应液的试管放入冰水中使其骤冷来终止反应，用光电分光分析仪测定波长475nm下的吸光度，结果示于下表7中。酪氨酸酶抑制效果用下述数学式3算出。
【数学式3】
Figure BDA00003469625300151
【表7】
试验物质 酪氨酸酶抑制率（%）
对照组（无添加） 0
抗坏血酸 52
人参皂苷F2 69
由表7的结果可知，根据本发明的人参皂苷F2的酪氨酸酶抑制率与公知的作为酪氨酸酶抑制剂的抗坏血酸相比更高，美白效果非常优异。
[试验例7]利用了B16/F10黑色素细胞的黑色素生成抑制效果
分别将含有0.001重量%的人参皂苷F2和曲酸
Figure BDA00003469625300162
的试样作为试验物质，以一定浓度添加于B16/F10黑色素瘤细胞（韩国细胞株银行）的培养液中，培养3天后，除去培养液，用PBS清洗后，并用1N NaOH溶解细胞，然后在405nm下测定吸光度。将未添加试验物质的细胞作为对照组，与对照组中的黑色素含量比较，测定各试验物质的黑色素生成抑制程度。按照数学式4计算黑色素生成抑制率，结果示于表8中。
【数学式4】
Figure BDA00003469625300161
【表8】
试验物质 黑色素生成抑制率（%）
对照组（无添加） 0
曲酸 53
人参皂苷F2 72
由表8的结果可知，根据本发明的人参皂苷F2的黑色素生成抑制率与公知的作为黑色素生成抑制剂的曲酸相比更高，美白效果非常优异。
[试验例8]皮肤保湿能力增加效果测定
为了测定人参皂苷F2对皮肤保湿能力增加带来的效果，利用所述剂型例1和比较剂型例1的剂型进行评价。
将20名被分类为干燥皮肤的40～50岁成人男女分别对应剂型例1和比较剂型例1这2组分成2组，每组10名，将营养霜每天在面部涂抹2次，涂抹4周。涂抹开始前、涂抹后经过1周、2周、4周的时刻、以及终止涂抹经过2周（共经过6周）后在恒温、恒湿条件（24℃，相对湿度40%）下用皮肤水分量测定机（Corneometer CM825，C+K Electronic Co.,德国）测定皮肤水分量。结果示于下表9中。表9的结果是以刚要开始试验之前测定的皮肤水分量测定机的值为基准，将处理一定时间后的测定值的增加程度用百分比表示的。
【表9】
由表9的结果可以确认，在涂抹了比较剂型例1的情况下，直到进行了4周涂抹为止，显示出约30%左右的水分增加率，但是终止涂抹后，皮肤水分量减少；与此相反，在涂抹了含有人参皂苷F2的剂型例1的情况下，即使终止涂抹后，显示了30%以上的皮肤水分增加率。由此可知本发明的含有人参皂苷F2的组合物的皮肤保湿效果优异。
[试验例9]角质形成细胞分化促进效果测定
为了研究人参皂苷F2的角质形成细胞的分化促进效果，利用吸光度按如下方法测定角质形成细胞在分化时生成的CE（角化包膜，CornifiedEnvelop）量。
首先，将从新生儿的表皮分离并一次培养的人角质形成细胞放入培养用烧瓶中，使其附着于底部后，将人参皂苷F2以5ppm的浓度对培养液进行处理后，培养5天直到细胞生长至底部面积70～80%的程度。此时，将低钙（0.03mM）处理组和高钙（1.2mM）处理组分别作为阴性对照组、阳性对照组。然后收获培养的细胞，用PBS（磷酸缓冲液，Phosphate buffered saline）清洗后，加入含有2%SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）和20mM浓度的DTT（二硫苏糖醇，Dithiothreitol）的10mM浓度的三-盐酸缓冲液（Tris-HCl，pH7.4）1ml，进行超声（sonication）、煮沸（boiling）、离心分离，将沉淀物重新悬浮于1ml PBS中，测定340nm下的吸光度。另外，取一部分所述超声后的溶液，测定蛋白质含量，作为细胞分化程度评价时的基准。结果示于下表10中。
【表10】
Figure BDA00003469625300181
如表10所示，可知在用人参皂苷F2进行处理的情况下，角质形成细胞的分化促进效果优异。
[试验例10]皮肤屏障功能恢复效果测定
为了测定人参皂苷F2对由于皮肤损伤而受损的皮肤屏障功能的恢复带来的效果，进行了下述实验。将10名成人男女的上臂利用胶带剥离（TapeStripping）方法对皮肤屏障造成损伤，分别涂抹以下表11的组成制备的剂型例2和比较剂型例2两组配方，用Vapometer（Delfin，芬兰）测定比较7天内每天一次经皮水分损失（TWEL）的恢复程度。在这里，比较剂型例2作为阴性对照组药剂（vehicle）。实验结果示于下表12中。表12的结果是将屏障损伤前和屏障损伤后的处理前差异作为100%基准进行比较的。
【表11】
配料成分 剂型例2 比较剂型例2
纯净水 69 70
丙二醇 30 30
人参皂苷F2 1 -
【表12】
由表12可知，在用不含有人参皂苷F2的比较剂型例2进行处理的情况下，随着时间的推移，经皮水分损失量逐渐增多；与此相反，在用含有人参皂苷F2的剂型例2进行处理的情况下，经皮水分损失量以较快的速度回到正常，可以确认屏障损伤恢复。
[试验例11]血色改善效果
为了评价根据本发明的化妆品组合物的皮肤血液循环促进效果，利用LDPI（激光多普勒成像，Laser Doppler Perfusion Imager）测定皮肤的血液循环程度。LDPI作为测定皮肤中的血液循环的设备是众所周知的，并且作为目前使用的设备，其为不仅能够测定血液在皮肤的毛细血管中的速度和量而且能够测定小动脉和小静脉中的流动的非常敏感的设备。
在恒温恒湿室中，用香皂洗脸后，适应30分钟，利用LDPI测定初期值。首先，用LDPI测定30名平时手脚偏凉的女性的额头以下部分的初期血流量。然后，将给受试者使用1周所述剂型例1和比较剂型例1后测定的血流量与所述初期值进行比较，结果（皮肤血流量变化）示于下表13中。
【表13】
使用化妆料前后LDPI结果-皮肤血流量
试验物质 使用1周后皮肤血流量变化率（%）
剂型例1 13
比较剂型例1 5
由表13的结果可以确认，根据本发明的化妆品组合物与不含有人参皂苷F2的比较剂型例1相比能够显著增加皮肤血流量，通过这样的血液循环促进，改善血色。这从正面给出了根据本发明的含有人参皂苷F2的化妆品组合物能够有助于有效传输皮肤的营养成分、抑制并延迟皮肤老化的启示。
[试验例12]皮肤色调改善效果
为了研究所述剂型例1和比较剂型例1的皮肤色调改善效果，让30名受试者分别使用（晚上涂抹1次/天，共1周）后，利用Facial Stage DM-3（Moritex，Japan）设备评价皮肤色调改善程度。皮肤色调改善率是用皮肤的亮度和色彩测定值以及皮肤的亮度和色彩变化值判断的，结果示于下表14中。亮度和色彩变化值越大，意味着皮肤色调改善得越明显。
【表14】
Figure BDA00003469625300201
由表14的结果可以确认，不含有根据本发明的人参皂苷F2的比较剂型例1未显示显著的皮肤色调改善功效；与此相反，与使用前相比，使用了含有人参皂苷F2作为有效成分的剂型例1之后的皮肤色调得到明显改善。
[试验例13]毛孔缩小效果
1.通过胶原生物合成促进的毛孔缩小效果
将根据本发明的人参皂苷F2的胶原生物合成促进效果与TGF-β进行比较测定。首先，将成纤维细胞（fibroblast）按每孔105个接种于24孔（well）中，培养至生长90%左右。将其用无血清DMEM培养基培养24小时后，分别用溶解于无血清培养基的浓度为10ng/ml的本发明的人参皂苷F2和TGF-β进行处理，在CO2培养箱中培养24小时。取其上层液，利用前胶原型（I）ELISA试剂盒（procollagen type（I））研究前胶原（procollagen）是否增减。结果示于表15中，将非处理组设为100进行胶原合成功能的对比。
【表15】
试验物质 胶原合成能力（%）
非处理组 100
TGF-β 183.5
人参皂苷F2 191.6
由表15的结果可以确认，根据本发明的人参皂苷F2与作为阳性对照组的TGF-β相比能够显示出更高水平的优异的胶原合成功能。因此，可以确认根据本发明的人参皂苷F2能够使毛孔周边的胶原生成量增加，使扩大的毛孔缩小。
2.毛孔缩小效果
为了研究剂型例1和比较剂型例1的毛孔缩小效果，进行如下评价。选定毛孔大的受试者男女20名，分成2组，每组各10名，按照各组分别在面部涂抹4周剂型例1和比较剂型例1的营养霜。对毛孔缩小效果的判定是专家通过对拍摄实验前和实验4周后的照片进行肉眼评价而展开的。结果示于下表16中（评价等级：0-完全未缩小；5-明显缩小）。
【表16】
试验物质 评价等级
剂型例1 4
比较剂型例1 0
由表16的结果可知，比较剂型例1没有毛孔缩小效果，剂型例1的情况下显示出用肉眼可以观察程度的毛孔缩小效果，根据本发明的人参皂苷F2的减小毛孔大小的效果优异。
[试验例14]皮脂分泌抑制效果
1.通过5α-还原酶活性抑制的皮肤过量分泌抑制效果
为了确认5α-还原酶活性抑制效果，测定HEK293-5αR2细胞中[14C]睾酮变成[14C]二氢睾酮（DHT：dihydrotestosterone）的比例。对HEK293细胞转染p3×FLAG-CMV-5αR2，在24孔板中每孔放入2.5×105细胞进行培养（Parket al.,2003,JDS.Vol.31,pp.191-98）。第二天换成添加有酶基质和抑制剂的新的培养基。培养基的基质使用了0.05μCi[14C]睾酮（Amersham Pharmaciabiotech,UK）。
为了确认5α-还原酶活性抑制程度，放入人参皂苷F2，在37℃、5%CO2培养箱中培养2小时。此时，将未放入人参皂苷F2的作为阴性对照组，将未放入非那雄胺（finasteride）的作为阳性对照组。然后收集该培养基，将类固醇用800μl乙酸乙酯提取后，分离上部的有机溶剂层，干燥，将剩下的残留物重新用50μl乙酸乙酯溶解，在二氧化硅塑料片硅胶60F254（Silica plasticsheet kieselgel60F254）上以乙酸乙酯-己烷（1：1）作为溶剂进行展开。
将塑料试样在空气中干燥后，为了测定同位素的量，使用巴斯
Figure BDA00003469625300221
系统，将干燥的塑料试样和X射线胶片一同放入巴斯暗盒，1周后测定残留在胶片上的睾酮和二氢睾酮的同位素量，根据下述数学式5和6分别算出转化率和抑制率，结果示于下表17中。
【数学式5】
Figure BDA00003469625300231
【数学式6】
【表17】
试验物质 转化率（%） 抑制率（%）
阴性对照组 48.0 -
阳性对照组 27.6 42.5
人参皂苷F2 15.4 59.7
由表17的结果可以确认，人参皂苷F2能够有效抑制5α-还原酶的活性，从而能够阻断睾酮向二氢睾酮的转化。所述5α-还原酶发挥如下作用：将睾酮转化为二氢睾酮而与存在于细胞质内的受体蛋白结合并进入核内来活化皮脂腺细胞并促进分化，从而在皮脂腺内使皮脂过量分泌。与已知抑制5α-还原酶活性的非那雄胺相比，显示出了具有更优异的抑制效果。因此，确认了人参皂苷F2有效抑制了5α-还原酶的活性，从而能够抑制皮脂的过分泌。
2.皮脂分泌抑制效果
为了研究所述剂型例1和比较剂型例1的皮脂分泌抑制效果，进行如下评价。选定感觉皮脂分泌多的受试者男女30名，在指定部位每天涂抹剂型例1和比较剂型例1的营养霜，涂抹4周。对于皮脂减少效果的判定，使用皮脂量测定机（Sebumeter SM810，C+K Electronic Co.，德国）分别测定经过2周和4周后的平均皮脂减少率（%），结果示于下表18中。
【表18】
由表18的结果可知，含有根据本发明的人参皂苷F2作为有效成分的剂型例1与不含有人参皂苷F2的比较剂型例1相比，能够有效抑制过量分泌的皮脂。
[剂型例3和比较剂型例3-4]
根据下表19所示的成分和含量（重量%）制备剂型例3和比较剂型例3-4。具体说明如下：剂型例3配料含有人参皂苷F2，比较剂型例3完全不含有粉刺皮肤改善的有效成分，比较剂型例4是作为对于抗菌能力的基准的标准品，含有大量用作粉刺治疗剂的红霉素（erythromycin）。
剂型例3和比较剂型例3-4的制造方法如下：使下表19的A相的成分完全溶解，在另外的溶解槽中完全溶解B相的成分，将B相添加到A相中进行混合而溶液化。向其中按照表19中记载的配料比例添加C相的成分，使其混合均匀后，过滤，制备本组合物。
【表19】
Figure BDA00003469625300251
[试验例15]对粉刺菌的抗菌能力试验
分别按照剂型例3和比较剂型例3-4的组成制备的化妆品组合物，对粉刺病原菌株痤疮丙酸杆菌（ATCC6919：培养基-BHI高汤（broth））的抗菌能力进行试验。
对粉刺菌的抗菌能力试验方法如下：
（1）试验菌液准备
痤疮丙酸杆菌接种于BHI高汤中，并使用厌氧培养的培养液。
（2）稀释溶液准备
在BHI高汤（pH6.8）或LB高汤（pH4.5）15ml中添加所述试验菌液0.15ml，充分混合后，用作稀释溶液。
（3）试样准备
将由剂型例3和比较剂型例3-4制备的化妆品组合物原液直接作为试样使用。
（4）抗菌能力试验
1）在96孔平板（96well plate）第1行以符合起始浓度的方式放入试验，作为稀释溶液，各放入总量200μl。
2）将第1行的混合液充分混合后，取100μl放入第2行，充分混合后，再取100μl放入第3行，以此方式进行二倍稀释（double dilution）。
3）在32℃下分别静置培养24小时和48小时后，根据悬浊的程度判断菌有无增殖，将没有菌增殖的最小浓度确定为MIC（最小抑制浓度；MinimumInhibitory Concentration）值。如果混合液不透明而难以判断有无菌的增殖，则通过显微镜观察来确认。
将对粉刺菌的抗菌能力试验结果示于下表20中。MIC换算成剂型中含有的有效成分的浓度来表示。
【表20】
项目 pH 痤疮丙酸杆菌
剂型例3 5.7 >45ppm
比较剂型例3 5.7 最高浓度（无抗菌能力）
比较剂型例4 5.7 >100ppm
在MIC中，可以说ppm浓度越小，则为对粉刺菌的抗菌能力越有效的物质。在剂型例3的情况下，与使用了公知的粉刺治疗剂红霉素的比较剂型例4相比，ppm浓度显著小，从而可以确认含有人参皂苷F2的组合物对于试验菌具有明显优异的抗菌能力。
[试验例16]脂质合成（Lipogenesis）抑制试验
将小鼠的成纤维细胞株（fibroblast cell line）3T3-L1细胞在装有含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM（Dulbeco’s modified eagle’smedium，GIBCO BRL，Life Technologes公司）培养基的6孔培养板（cultureplate）中以1×105细胞/孔使其附着。经过2天后，再替换成新DMEM（含有10%FBS）培养基，培养2天。然后，将培养的细胞再用含有1μg/ml胰岛素（insulin）、0.5mM IBMX和0.25μM地塞米松（dexamethasone）的DMEM（含有10%FBS）进行分化诱导，将人参皂苷F2和咖啡因以50μM进行处理，经过处理2天后，再替换成含有胰岛素的DMEM培养5天。5天后，再替换成正常培养基（DMEM，含有10%FBS），观察培养至所述细胞从形态上变成脂肪细胞。
为了评价人参皂苷F2的脂肪细胞内脂肪蓄积抑制功效，利用上述分化结束的3T3-L1脂肪细胞进行苏丹III染色（S4136，sigma-aldrich）。将脂肪细胞在磷酸盐中用4%多聚甲醛（pH7.2）在常温下进行固定后，用PBS（磷酸缓冲液，phosphate buffered saline）进行清洗，并用苏丹III进行染色，然后拍摄照片，用肉眼进行比较。对照组使用不添加试验物质或比较物质的培养基，作为另一比较组，用咖啡因50μM进行处理。脂肪蓄积抑制程度是将染色的程度分成+++，++，+，-，赋予等级，此时，越向+++发展，意味着染色程度越大。结果示于下表21中。
【表21】
试样 抑制率%
对照组 +++
比较组 +
人参皂苷F2 -
如表21所示，就本发明中使用的人参皂苷F2而言，不仅脂肪细胞内蓄积的脂肪的量少，而且与公知的脂质合成抑制物质咖啡因相比，具有优异的脂质合成抑制效果。因此，由于脂质合成被抑制，所以能够减少皮脂而抑制粉刺发生。
[试验例17]改善粉刺和减少皮脂分泌和有无刺激的试验
将存在粉刺的30名受试者分成3组，每组各10名，对于对应各组的受试者，让他们使用由所述剂型例3和比较剂型例3-4制备的化妆品组合物一个月。粉刺改善尺度为1分至5分，1分用“不是”标记，3分用“一般”标记，5分用“非常同意”标记。实验结果在下表22中以10名的平均分数标记。
粉刺消除时间是以判断为消除的天数为基准，有无粉刺复发以1个月后的结果为基准。皮脂分泌减少为1分至5分，1分用“不是”标记，3分用“一般”标记，5分用“非常同意”标记。实验结果在下表22中以10名的平均分数标记。皮肤刺激的有无用（显示刺激反应的人数）/（总试验人数）考察。
【表22】
Figure BDA00003469625300281
如表22所示，一方面，剂型例3与比较剂型例3相比，粉刺没有复发，对于整体性的粉刺改善具有优异的效果。另一方面，在含有抗菌能力标准物质的比较剂型例4的情况下，虽然显示了粉刺改善效果，但是使用时皮肤刺激强而不适于长期使用。而根据本发明的组合物没有刺激，所以显示出适合长期使用。
[试验例18]炎症改善效果
1.前列腺素的生成抑制效果
用前列腺素的生成抑制效果评价抗炎症效果。利用人参皂苷F2以巨噬细胞为对象来测定效果。首先，向从小鼠的腹腔采集的巨噬细胞中以最终浓度为500M的方式添加阿司匹林，从而非可逆性地抑制细胞中残留的环氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性。然后，将悬浊液在96孔的细胞培养板的各孔中放入100μl，在5%CO2和37℃条件的培养器中培养2小时，使巨噬细胞附着于容器表面。接着，将附着的巨噬细胞用PBS清洗3次后，将其用于炎症改善效果试验。向培养的巨噬细胞5×104细胞/ml中添加含有1%（w/v）LPS的RPMI培养基，培养12小时后，诱发前列腺素的生成，用100μl人参皂苷F2处理，将游离的前列腺素用酶免疫分析法（ELISA）进行定量。
此时，就人参皂苷F2的前列腺素的生成抑制活性而言，将用LPS进行处理的组和未进行处理的组中各自生成的前列腺素的差异设定为100%，通过用LPS与试样一同处理而减少的前列腺素百分比，与对照组进行比较、判定，结果（前列腺素的生成抑制效果）示于下表23中。
【表23】
空白（Blank） 100%
对照组（阿司匹林处理组） 25.0%
人参皂苷F2 24.2%
如表23所示的实验结果可知，就如用阿司匹林进行处理的对照组那样，在用人参皂苷F2进行处理的情况下，前列腺素的生成抑制效果非常高。
由此可知，本发明的人参皂苷F2能够提供优异的炎症改善效果。
另外，可知人参皂苷F2能够抑制作为皮肤炎症因子的前列腺素的表达，防止并改善皮肤问题。
2.IL-8生成抑制效果
实验前一天，将皮肤角质上皮细胞（Normal human skin keratinocyte，NHEK，购自：Lonza）在96孔（well）板上以5×104细胞/孔进行分株后，在37℃、5%CO2培养箱（incubator）中培养24小时。24小时后，用PBS将细胞清洗2次，换成无血清KBM（无血清角质细胞培养基，serum freekeratinocyte basement media）。对各孔用人参皂苷F2以下表24的浓度进行处理反应30分钟后，分别用PGSA（10μg/ml）、PGSA（50μg/ml）、PGSA（50μg/ml）+LPS（1μg/ml）处理。在此，PGSA（源自S.aureus的肽聚糖，peptidoglycanfrom S.aureus）是从葡萄球菌中提取的肽聚糖（peptidoglycan），是革兰氏阳性（+）菌的细胞壁的主要组成成分。已知细菌的细胞膜成分会诱发炎症，特别是葡萄球菌的情况下，报告显示90%左右的特应性患者是由该菌导致的2次感染所引起的。LPS（脂多糖，lypopolysaccaride）是革兰氏阴性（-）细菌的细胞膜的主要组成成分，已知是炎症诱发的主要原因。
在37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后，取培养液，进行对于白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）的ELISA测定，结果示于下表24中。ELISA利用制造公司（BD science）的实验方法进行。
【表24】
区分 IL-8分泌（pg/ml）
无处理对照组（Control） 935.12
PGSA（10μg/ml） 4812.60
PGSA（50μg/ml） 5895.08
PGSA（50μg/ml）+LPS（1μg/ml） 6814.91
人参皂苷F2（5ppm） 1209.66
人参皂苷F2（25ppm） 1118.80
人参皂苷F2（50ppm） 1110.29
由表24可以确认，人参皂苷F2能够显著减少并抑制由于PGSA和LPS而增加的IL-8的分泌。因此，本发明的皮肤外用剂组合物通过显著减少由于PGSA和LPS而增加的IL-8的分泌，从而能够提供优异的抗炎症效果。
[试验例19]瘙痒缓和评价
实验前一天，将角质形成细胞（细胞株名称：HaCaT，购自：ATCC）在96孔（well）板上以4×104细胞/孔进行分株后，在37℃、5%CO2培养箱（incubator）中培养24小时。24小时后，用HBSS（Hanks’Balanced Saltsolution）缓冲液清洗（washing）96孔板2次，并将反应缓冲液（2μMFluo-4-AM，20%普朗尼克酸（pluronic acid），2.5mM4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸（probenecid））放入细胞。在37℃、5%CO2培养箱中反应30分钟，并在常温下反应30分钟后，用HBSS缓冲液清洗2次，用下表25所示浓度（%）的人参皂苷F2对细胞进行处理。
反应10分钟后，用2U/ml胰蛋白酶（Trypsin）或5μM PAR-2活性肽（SLIGKV）进行处理，测定80秒钟内细胞中Ca2+浓度变化。利用FlexStation3（Molecular Device，USA）测定细胞中Ca2+浓度的变化。用人参皂苷F2和2U/ml胰蛋白酶（Trypsin）或5μM PAR-2活性肽（SLIGKV）处理后，测定80秒钟内的曲线（flex），求出得到的最小值与最大值之差，然后将该值与用2U/ml胰蛋白酶或5μM PAR-2活性肽（SLIGKV）处理时的最小值与最大值之差进行比较，将对于钙离子流入细胞内的抑制率（%）示于下表25中。
【表25】
Figure BDA00003469625300311
由表25可知，根据胰蛋白酶或PAR-2活性肽（SLIGKV）的细胞内钙离子的流入随着人参皂苷F2的处理而减少，随着增加人参皂苷F2的浓度，可以确认细胞内钙离子的流入显著减少。
因此，含有本发明的人参皂苷F2的皮肤外用剂组合物能够有效地抑制诱发瘙痒的PAR-2活性，从而能够提供优异的抗瘙痒效果。
[剂型例4和比较剂型例5]
按照下表26的组成制备洗发水。具体而言，将表面活性剂和乙二醇二硬脂酸酯添加到纯净水中，加热至80℃，使其均匀溶解后，进行搅拌，缓慢冷却至40℃，向混合物中投入根据本发明的有效成分和防腐剂、粘度调节剂、香料、毛发调理剂并混合后，在搅拌下冷却至室温而制备得到。
【表26】
Figure BDA00003469625300321
[试验例20]抗头屑能力评价
测定所述剂型例4和比较剂型例5的抗头屑能力来进行比较。此时，使用属于头屑菌的皮屑芽孢菌（Pityrosporum Ovalae（ATCC12078））作为试验菌株。
抗菌能力测定方法利用皮肤片扩散法。皮肤片扩散法（skin disc diffusionmethod；SDDM）最接近消费者的习惯使用的方法，是将与人体皮肤类似的豚鼠（guinea pig）的皮肤为对象测定抗菌能力的方法。
具体而言，剥离豚鼠皮肤（guinea pig skin）后，用70%乙醇处理，将其均匀地铺平干燥后，切割成一定大小的皮肤片。将灭菌处理的皮肤片在洗发水稀释溶液中浸渍3分钟，用流水清洗。然后，将皮肤片放在接种有试验菌的固体培养基上，培养试验菌。测定培养后被抑制的菌的增殖的透明带（clearzone）的大小，测定出相对的抗菌能力。实验结果值取3次测定的结果的平均值，所得结果示于下表27中。
【表27】
抗头屑能力评价
Figure BDA00003469625300331
从表27的结果来看，可以确认在不含有人参皂苷F2的比较剂型例5的情况下，没有头屑菌减少的效果，但是在含有人参皂苷F2的剂型例4的情况下，能够有效减少头屑菌，因此具有优异的抗头屑效果。
[试验例21]头屑减少效果试验
选定头屑比较多的19～35岁的男性24名，分别对应剂型例4和比较剂型例5的洗发水分成2组，每组12名，1个月内按如下方式使用洗发水后，测定头屑减少率。
在试验开始前用一般通常的洗发水洗发，洗发后采集累积2天的头屑，将所采集的头屑的重量与分别用剂型例4和比较剂型例5的洗发水按2天一次洗发而试验结束后累积2天的头屑的重量进行比较评价。此时累积的头屑是利用真空吸入装置从头皮直接采集，根据下述数学式7求出头屑减少率，结果示于下表28中。
【数学式7】
Figure BDA00003469625300332
【表28】
由表28的结果可知，在含有人参皂苷F2的剂型例4的情况下，显示出了优异的防头屑效果。
[试验例22]头皮瘙痒症防止效果试验
选定感觉头皮瘙痒比较严重的25岁～45岁的男女24名，分成2组，每组各12名，分别将剂型例4和比较剂型例5的洗发水按3天1次使用2周后，通过下述评价基准评价头皮瘙痒防止效果，结果示于下表29中。
[评价基准]
非常优异—5分
优异—4分
普通—3分
不良—2分
非常不良—1分
【表29】
区分 剂型例4 比较剂型例5
头皮的瘙痒症清除效果 4.2 2.3
由表29的结果可知，在含有人参皂苷F2的剂型例4的情况下，对于防止头皮瘙痒症显示出了更优异的效果。
[试验例23]毛囊毛乳头细胞增殖效果
构成毛发的角质蛋白在毛根部角质形成细胞（keratinocyte）中生成，该角质形成细胞由毛乳头细胞分化得到。为了评价本组合物的毛乳头细胞的活性，本发明中使用DP6（永生化大鼠真皮乳头细胞，rat immortalized dermalpapilla cell）细胞株（Wendy Filsell，Journal of Cell Science107，1761-1772（1994））。毛乳头细胞株是利用显微解剖（microdissection）方法从雄性PVG大鼠胡须的毛根中进行分离而培养的细胞株，在含有10%FBS（太牛血清，Fetal bovine serum）的DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium，GibcoBRL，Gaithersburg，MD，USA）中，利用维持在5%CO2、37℃的培养箱培养24小时。将DP6放入96孔板中，在37℃培养箱中培养24小时后，将人参皂苷F2分别以5ppm、10ppm和20ppm的浓度进行处理。经过药物处理24小时后，使用WST-1试剂盒（Roche）测定细胞增殖能力。结果示于下表30中。
【表30】
区分 细胞增殖能力（%）
无处理对照组（Control） 100
人参皂苷F2（5ppm） 116
人参皂苷F2（10ppm） 122
人参皂苷F2（20ppm） 138
由表30的结果可知，在用人参皂苷F2进行处理的情况下，毛乳头细胞的增殖能力随着浓度的增大而显著增加。
[试验例24]钾离子通道活性增加效果评价
已知作为脱毛治疗剂的米诺地尔是潜在的线粒体钾离子通道开放剂（KATP channel opener），是用于雄激素性脱发的治疗的代表性药物。为了评价这样的米诺地尔的机制，使用了用在构成头皮的真皮的成纤维细胞中阻碍KATP通道的甲苯磺丁脲（SIGMA AlDRICH，T0891）进行处理来抑制细胞增殖，重新打开钾离子通道来恢复细胞增殖的试验方法。
为了评价本组合物的作为KATP通道开放剂的功能，在本发明中使用了成纤维细胞株NIH3T3（鼠胚胎成纤维细胞细胞株，Mouse embryonicfibroblast cell line）细胞株。本细胞株是将从NIH瑞士小鼠胚胎（Swiss mouseembryo）中分离的成纤维细胞株用3T3协议进行自然永生化的细胞株。所述细胞株在还含有10%FBS的DMEM（Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA）中，在维持5%CO2、37℃的培养箱中培养了24小时。将NIH3T3放入96孔板中，在37℃培养箱中培养24小时后，用2.5mM甲苯磺丁脲进行处理，10分钟后，将作为阳性对照组的米诺地尔10μM和人参皂苷F2分别以2.5ppm、5ppm和10ppm的浓度进行处理，经过药水处理48小时后，使用WST-1试剂盒（Roche）测定细胞增殖能力。结果示于下表31中。
【表31】
区分 细胞增殖能力（%）
无处理对照组（Control） 100
米诺地尔 132
人参皂苷F2（2.5ppm） 115
人参皂苷F2（5ppm） 120
人参皂苷F2（10ppm） 131
由表31的结果可知，在用人参皂苷F2进行处理的情况下，成纤维细胞的增殖能力恢复，细胞增殖能力随着处理的人参皂苷F2浓度的增加而增加。在将人参皂苷F2以10ppm进行处理的情况下，可以确认细胞的增殖能力恢复至用米诺地尔进行处理时的水平。
[剂型例5和比较剂型例6]
根据下表32的组成，按照通常方法制备霜基材的组合物（单位：重量%）。
【表32】
配料成分 剂型例5 比较剂型例6
甘油三酯（Labrafac） 23 23
吐温80（Tween80） 10.5 10.5
单硬脂酸甘油酯 4.0 4.0
硬脂酸 7.0 7.0
十六烷醇 2.0 2.0
丙三醇 9.0 9.0
单油酸甘油酯 3.5 3.5
人参皂苷F2 1 -
水 40 41
[试验例25]人参皂苷F2的毛生长效果
将ICR小鼠的背部的毛用除毛器脱除后，使用除毛霜（veet霜）完全除去毛。对除了对照组（正常组）以外的其他2个组采用1%DNCB200μl进行一天一次的皮肤涂抹，诱导皮肤炎症3天。从3天后，对除了对照组以外的组1天涂抹1次所述剂型例5和比较剂型例6的霜基材，观察各组的毛生长程度，结果示于图3。
由图3的结果来看，可以确认对照组在观察15天内在除毛的部分未看到毛生长现象，但是在仅采用不含有人参皂苷F2的霜基材进行处理的组中显示了略微的毛生长效果，采用含有人参皂苷F2的霜基材进行处理的组中除毛的部分整体上显示出显著的毛生长效果。
[试验例26]人参皂苷F2的养毛效果
利用所述试验例25的方法对将背部的毛去除后的小鼠采用二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）进行处理来诱发皮肤炎症，从而设定皮肤内的应激条件，最大限度地降低毛的生长。为了评价本发明组合物的毛发再生功效，采用含有人参皂苷F2的所述剂型例5和比较剂型例6的霜基材进行处理，测定随着处置天数毛的长度，与对照组进行比较。结果示于下表33中。
【表33】
Figure BDA00003469625300381
由表33的结果可知，采用剂型例5的霜基材进行处理的组的毛长与采用比较剂型例6的霜基材进行处理的组的毛长相比，在统计学上显示出了显著的差异（p<0.01），毛的长度随着处理天数增加而增长，第12天时，达到约1.1cm左右，由此可以确认，与采用不含有人参皂苷F2的比较剂型例6的霜基材进行处理的组相比，采用剂型例5的霜基材进行处理的组的毛长更长。
这判断为人参皂苷F2在皮肤应激下形成的毛发再生抑制条件下也能够促进毛发再生，由此可以确认，人参皂苷F2具有对应激下脱毛的毛发的再生功能。
[试验例27]人参皂苷F2的黑色素生成促进效果试验
利用在RPMI培养基中添加了5%的胎牛血清、100IU的青霉素G和0.2μM的TPA的培养基，将黑色素细胞（黑色素-A，melan-a）以50,000细胞/孔分株到24孔板（24-well microtiter plate）中。第二天，将分株的细胞采用最终浓度10ppm或50ppm的人参皂苷F2作为试验物质进行处理，作为阴性对照组，采用0.1%DMSO进行处理，作为阳性对照组，采用100μM IBMX进行处理后，在37℃温度下培养3天。培养后，用PBS清洗孔，分别放入1N NaOH100μl溶解细胞内的黑色素。利用平板培养测定机（酶标仪，microplate reader）在405nm下测定溶解的黑色素的吸光度。将人参皂苷F2的黑色素生成促进效果与对照组进行比较而得到的结果示于下表34中。
【表34】
试样 黑色素合成量（%）
DMSO（0.1%） 100
IBMX（100μM） 120
人参皂苷F2（10ppm） 113
人参皂苷F2（50ppm） 129
由表34的结果可知，人参皂苷F2促进黑色素细胞的黑色素合成，黑色素生成增加，从而显示出优异的黑色素生成促进效果。
[试验例28]人参皂苷F2在黑色素细胞内的MITF和酪氨酸酶（tyrosinase）表达促进效果
利用501mel细胞株在6孔板（6孔微量滴定板，6-well microtiter plate）中以500,000细胞/孔的方式进行分株，针对各孔，作为阴性对照组，用0.1%的DMSO以10ppm进行处理，作为阳性对照组，用100μM的IBMX以10ppm进行处理，并且作为试验组，用人参皂苷F2以10ppm进行处理，在37℃温度下培养24小时、48小时、72小时后获得蛋白质。对这样获得的蛋白质，利用MITF和酪氨酸酶抗体进行蛋白质印迹。蛋白质提取和蛋白质印迹按照本领域技术人员通常使用的标准方法进行。蛋白质印迹后，将阴性对照组作为100，并与该值进行比较作为其结果，示于下表35中。
【表35】
Figure BDA00003469625300401
由表35可以确认，人参皂苷F2在黑色素细胞中能够提高MITF和酪氨酸酶蛋白质表达。
[试验例29]利用人参皂苷F2促进白发产生的白斑症小鼠的生物体内防止白发产生和促进黑毛生长功效评价
白斑症小鼠（C57bl/6-Mitfmi-vit）是从美国的The Jackson Lab中购买使用的。按如下方法进行利用促进白发产生的小鼠的防止白发物质的效果实验。将12周龄的小鼠的背部毛用脱毛器（depilation）除去。但是，以每个个体除去毛的部位的宽度相同的方式进行调节。脱毛的第二天开始每天在脱毛的部位涂抹两次防止白发物质。防止白发物质的载体（vehicle）使用EtOH：1,3-BG：DW=3：2：5（体积比）的混合物，将所述载体作为阴性对照组，在此将添加有50mM的IBMX的液体作为阳性对照组，并且将添加有2.5%人参皂苷F2的液体作为试验组使用。约3周后各物质之间的防止白发功效差异能够用肉眼识别时，收集新长出的毛，测定毛发内的黑色素量。毛发内的黑色素量是利用作为蛋白水解酶的Esperase（Novozyme）测定的。在缓冲液（50mM Tris-HCl，5mM DTT，pH9.3）中以Esperase为1NPU/ml的浓度的方式进行溶解来制备反应缓冲液。在反应缓冲液1ml中放入小鼠毛发5mg，在37℃中以1,000rpm的速度搅拌反应13小时后，用瞬间离心分离机分离毛发和反应液。将这样得到的反应液装入96孔板中，在405nm波长下测定吸光度，则可测定反应液中的黑色素量。对促进白发产生的白斑症小鼠毛发用阴性对照组、阳性对照组、试验组物质进行处理的情况下，将对其功效用肉眼观察和毛发内的黑色素定量方法进行测定而得到的结果示于下表36中。
【表36】
阴性对照组 IMBX 人参皂苷F2
相对于对照组的% 100 105.9 110.8
根据表36的结果可知，人参皂苷F2能够在促进白发产生的小鼠生物体内抑制白发产生，增加毛发内黑色素量，从而能够促进黑毛生长。
[试验例30]人参皂苷F2的抗菌能力评价
为了评价人参皂苷F2的抗菌能力而进行抗菌实验。具体的实验方法如下：
在实验中使用的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株在胰蛋白酶大豆肉汤培养基（Tryptic Soy Broth）中培养，白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）菌株在沙氏葡萄糖肉汤培养基（Sabouraud DextroseBroth）中培养。将培养液在各培养基中稀释1/100（白色念珠菌菌株为1/10）而得到的稀释液用作试验菌液。黑曲霉是将以2×108cfu/ml的方式制备的孢子悬浮液用作试验菌液。
在各培养基15ml中添加所述试验菌液0.15ml，充分混合后，将其作为稀释溶液使用。
在96孔板（96well plate）的第1行分别放入16μl试样，分别放入稀释溶液184μl。其余孔分别放入稀释溶液100μl。将第1行的混合液充分混合后，取100μl，放入第2行，充分混合后，再取100μl放入第3行，以此方式分别稀释2倍。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）在32°C恒温槽中进行培养，白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）在25℃恒温槽中进行培养。
48小时后，用悬浊度和显微镜确认菌是否增殖，确定最小抑制浓度（MIC）值，结果示于下表37中。
【表37】
如表37所示，可以确认人参皂苷F2对多种菌株显示出了抗菌能力，由此可以预测人参皂苷F2在组合物中可以作为天然防腐剂或抗菌剂而发挥作用。

Claims (25)

1.一种皮肤外用剂组合物，其中，所述皮肤外用剂组合物含有由利用培基耕人参水耕栽培系统或喷雾耕人参水耕栽培系统进行栽培而收获的清洁原参和人参叶提取的下述化学式1表示的人参皂苷F2作为有效成分，
化学式1
Figure FDA00003469625200011
2.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述清洁原参和人参叶由包括以下步骤的利用培基耕人参水耕栽培系统的方法生产：
a）将苗参出库后移至15℃的储藏温室中保存1～2天后实施临时移植的纯化1步骤；
b）将临时移植的所述苗参在温室下保存1～2天而适应温室环境后，将所述苗参固定移植到在带有排水槽的苗床的内部形成的混合培养基的纯化2步骤；
c）调制营养液的步骤；
d）将适量的所述营养液供给到所述苗参的步骤；以及
e）4～5个月后收获的步骤。
3.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述清洁原参和人参叶由包括以下步骤的利用喷雾耕人参水耕栽培系统的方法生产：
a）将苗参出库后移至15℃的储藏温室中保存1～2天后实施临时移植的纯化1步骤；
b）将临时移植的所述苗参在温室下保存1～2天而适应温室环境后，将所述苗参固定移植到苗床的纯化2步骤；
c）调制营养液的步骤；
d）将所述营养液通过喷雾嘴喷射到所述苗参的根部的步骤；
e）使用的所述营养液通过形成于所述苗床的一端的排水口流入营养液罐而再利用的步骤；以及
f）4～5个月后收获的步骤。
4.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述人参皂苷F2相对于所述组合物总重量的含量为0.001～50重量%。
5.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于抗老化。
6.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于提高皮肤弹力。
7.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于改善皮肤皱纹。
8.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于美白。
9.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于保湿。
10.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于强化皮肤屏障功能。
11.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于诱导皮肤角质形成细胞的分化。
12.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于改善粉刺。
13.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于抗菌。
14.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于抗炎。
15.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于抑制脂质生成。
16.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于改善特应性。
17.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于改善血色和皮肤色调。
18.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于缩小毛孔。
19.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于调节皮脂。
20.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于改善皮肤问题。
21.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于防御生成皮肤刺激。
22.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于防头屑。
23.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于育发。
24.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述组合物用于防止白发。
25.根据权利要求1所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述人参皂苷F2用作天然防腐剂。
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