KR20170017318A - 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물 - Google Patents

수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 면역세포 활성 억제, 아토피 피부염 유발균주의 생육억제 활성, 항산화활성 및 항염증 활성을 가지는 수경재배 인삼의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 아토피 피부염을 개선하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물{Cosmetic composition for improving atopic dermatitis comprising Panax ginseng leaves cultured by hydroponics}
본 발명은 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 면역세포 억제 활성, 아토피 피부염 유발균주의 생육억제 활성, 항염증 활성을 가지는 수경재배 인삼의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 아토피 피부염을 개선하는 화장료조성물에 관한 것이다.
면역계는 다양한 이물질 및 병원체의 인체 침입에 대항하는 인체 방어시스템을 말하며, 외부 환경의 각종 감염성미생물, 이물질 및 대기오염물질 등이 피부로 유입되었을 때, 생체의 면역반응이 과도하게 진행되면, 염증, 알레르기 및 아토피 피부염 등이 발생하게 된다. 아토피 피부염, 비염, 천식 등은 환경이 오염되면서 야기되거나 악화되는 질병으로 환경성 질환이라 하며, 최근 몇 년 사이 아토피 피부염은 우리 사회의 중요한 문제가 되어 아이들 뿐 아니라, 성인의 발병률도 큰 증가세를 보이고 있다. 아토피 피부염은 타인과 어울리기 싫어하는 대인기피증과 사회와 학교생활에서의 부적응증을 야기할 수 있으며, 우울증, 소외감, 불안증, 수면장애 등 심각한 정신적, 육체적, 사회적 장애를 유발한다. 또한, 아토피가 피부뿐만 아니라 체내 면역질환까지 일으키는 큰 질환으로 지속적으로 이어질 경우, 천식 및 알레르기성 비염으로 발전할 수 있다.
현재 사용되고 있는 아토피 피부염 치료제로는 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제, 면역억제제 등이 있지만, 이들은 인체에 심각한 부작용을 초래할 수 있어 지속적인 사용이 어렵고, 대부분 증상을 완화시키는 목적의 치료제이므로, 보다 근본적이며 획기적이고 지속적 사용이 가능한 아토피 피부염 개선제 개발이 절실한 상황이다.
최근 화장품 분야에서도 단순한 피부 보습효과와 유연 및 촉촉함을 부여해주는 화장품보다는 실질적으로 약과 같은 특정 효능을 갖고 있으면서, 처방 없이 구입 가능한 기능성 화장품이 주목 받고 있다. 이러한 화장품 시장의 경향을 따라잡기 위해 대부분의 화장품 회사들은 우수한 효능을 발휘할 수 있는 기능성 화장품 개발에 많은 노력을 기울이고 있다.
그 일 예로써 천연물을 함유하여 인체에 안전하며, 지속적으로 사용이 가능한 아토피 개선활성을 가지는 화장품의 연구개발이 활발하게 이루어지고 있다. 그러나 아토피 피부염 개선 화장품들은 단순히 아토피를 악화시키는 외부요인(건조, 땀, 먼지, 자극성 화합물 등)들로부터 피부를 보호하고 피부 보습력을 높이는데 주력하고 있으며, 손상된 피부의 2차 감염 및 면역 세포 활성에 의한 가려움증 및 부종 등을 개선하는 데는 한계가 있었다.
본 발명자들은 피부 보습력을 높이고 피부를 보호할 뿐 아니라 아토피 유발 균주에 대한 항균효과와 면역 세포의 활성 억제 등을 동시에 만족시켜 아토피 피부염의 근본적인 원인을 제거하고 소비자가 쉽게 사용할 수 있는 아토피 피부염 개선용 화장료의 개발을 위하여 노력하였다.
이에 NF-kB 전사인자의 유전자 발현 억제 물질 스크리닝을 통해 다양한 천연물들 중에서 후보 물질을 선정하였으며, 그 중에서도 진세노사이드 Rg1, Rh1, Rb1 등이 다량 함유되어 있는 수경재배 인삼 잎 추출물이 아토피 피부염 유발 균주에 대한 항균효과 및 면역 세포의 활성 억제 효과가 우수하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0006418호(2014.01.16.) 대한민국 공개특허 제10-2013-0071903호(2013.07.01.)
본 발명은 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하여 아토피 피부염 개선활성을 가지는 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물이 제공된다. 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 수경재배 인삼 잎의 열수추출물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 용매에 의한 추출물이며, 바람직하게는 70% 에탄올 추출물이다. 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 화장료조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30중량% 함유된다.
상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 아토피 유발 피부상주균에 대한 항균활성을 가진다. 또한, 수경재배 인삼 잎 추출물은 염증 사이토카인 PGE2, TNF-α의 발현을 억제하는 활성, 아토피관련 유전자 COX-2, iNOS의 발현을 억제하는 활성, 피부질환 지표 물질인 CCL5, CCL17 단백질의 발현을 억제하는 활성, 과민성 염증반응 사이토카인(IL-4, IL-13) 발현을 억제하는 활성, 알레르기 유발 사이토카인 β-hexosaminidase 발현 억제활성 및 피부염증 억제활성이 우수하다.
본 발명에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물은 인체에 안전하여 지속적인 사용이 가능하며, 아토피 피부염 유발 균주에 대한 항균효과 및 면역 세포의 활성 억제 효과가 우수하므로 아토피 피부염 개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 항균활성 시험결과를 나타내고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 세포독성 시험결과를 나타내고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 염증반응 관련 사이토카인 발현억제 활성시험결과를 나타내고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 아토피 관련 유전자 발현억제 활성시험결과를 나타내고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 피부질환 지표물질 발현억제 활성시험결과를 나타내고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 과민성 염증성 사이토카인 발현억제 활성시험결과를 나타내고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 알레르기 유발 사이토카인 β-hexosaminidase 발현억제 활성시험결과를 나타내고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 수경재배 인삼 잎 추출물의 염증 억제효과 시험결과를 나타낸다.
인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 우리나라의 대표적인 약용식물이다. 항당뇨, 항산화, 항암, 신경세포보호, 간기능 개선, 항스트레스 효과 등이 알려져 있다. 인삼에는 대표적인 성분인 사포닌이 3~6%, 단백질, 아미노산, 펩타이드, 핵산, 알칼로이드와 같은 함질소화합물이 12~16%, 지질, 지방산, 정유, 테르페노이드, 폴리아세틸렌, 페놀화합물과 같은 지용성 성분 1~2%, 비타민 0.05%, 탄수화물 60~70%, 회분 4~6% 등이 함유되어 있다.
사포닌의 하나인 진세노사이드(ginsenoside)는 Rg1, Rg2, Rb1, Rb2, Rg3 등 34여 종에 달하는 것으로 알려져 있으며, 진세노사이드 중 Rg2는 이미 항암효과 및 항노화 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있고 이를 이용한 기능성 화장품이 개발되어 상품화되어 있다. 각각의 진세노사이드의 효능이 밝혀지고 있지만, 새로운 진세노사이드가 발견되고 있으며, 진세노사이드 간의 혼합물에 대한 효능이나, 진세노사이드와 다른 무기 영양성분 등과의 혼합사용에 따른 효능을 밝히는 것 등은 여전히 과제로 남아 있다.
한편, 진세노사이드와 같은 인삼의 약용성분은 인삼의 종류마다 그 종류와 함유량이 다르고, 또한 잎, 줄기, 뿌리 등 부위 별로도 함유량이 다르다. 최근에는 토양 대신 물과 수용성 영양분으로 만든 배양액 속에서 3~5개월 동안 수경(水耕)재배하여 인삼을 수확하는 재배법이 도입되어 농가에 보급되고 있다. 인삼 수경재배라 함은 인삼에 필요한 양분을 깨끗한 물에 용해시켜 배양액을 만든 후, 이를 잘 흡수할 수 있도록 지하부와 지상부 환경을 인위적으로 조절하면서 청정한 환경에서 인삼을 단기간에 재배하는 방법이다.
농촌진흥청이 개발한 인삼 수경재배 기술(대한민국 공개특허 10-2010-0001774)은 농약을 사용하지 않는 친환경재배가 가능하고, 단기간에 제품을 출하할 수 있는 장점이 있다. 노지재배의 경우 수확을 위해서는 1~2년 이상이 걸리는데 반해, 수경재배기술을 이용하면 3~5개월 만에 생산이 가능하다. 또한, 수경재배 인삼은 뿌리만 이용하는 토경(土耕)재배 인삼과 달리 뿌리, 줄기, 잎 등 작물 전체를 이용할 수 있다.
특히 수경재배 인삼 유래의 인삼 잎에는 2~3종의 특정 진사노사이드가 상대적으로 다량 함유되어 있으며, 인삼 잎의 사포닌 함량은 약 140mg/g 함유되어 뿌리에 비하여 약 9배 높으며, 뿌리 삼에서는 거의 검출되지 않는 진세노사이드 Rh1과 같은 진세노사이드가 함유되는 특징을 가지는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 특징을 고려하여 수경재배 인삼은 뿌리, 잎, 전초를 이용하는 쌈 채소, 녹즙용 채소 또는 샐러드 소재로 소비되고 있다. 수경재배 인삼이 웰빙 채소용 인삼으로서 새로운 농가 소득 작물로 육성되고 있지만, 그 판로가 확보되지 않아 그 소비에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이러한 수경재배 인삼의 잎을 이용하여 고부가가치의 기능성 화장품을 제조하는데 사용한다면 인삼 수경재배를 촉진하며 농가의 소득 증대에 기여할 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, 수경재배 인삼 유래의 인삼 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 다음과 같은 방법에 의하여 재배된 인삼으로부터 제조될 수 있다.
배수 홈이 있는 베드의 내부에 형성된 혼합 배지에 저온 저장되었던 묘삼을 정식한 후, 양액을 조제하여 적정량을 상기 묘삼에 공급하면서 재배 후 3~5개월 후 수확하게 된다. 이 때, 저온 저장 되었던 상기 묘삼은 정식하기 위하여, 출고 후 15℃ 내외의 저장온실에 옮겨 1~2일 정도 보관 후 가식하는 순화 1단계를 실시한 후, 온실에서 1~2일 정도 내부 환경에 적응시킨 뒤 상기 묘삼을 정식하는 순화 2단계를 실시한다. 상기 순화 1단계는 온도조절은 20~23℃ 범위로 관리하고, 5~7일 후 상기 묘삼의 새싹이 녹화되면 상기 순화 2단계를 위해 온실로 이동한다. 상기 순화 2단계는 상기 묘삼을 가로 8㎝ 및 세로 10㎝ 간격으로 30°정도 비스듬하게 정식하고, 활착되기 전까지 온실 내부온도를 25℃, 습도는 80~90%로 설정한다. 상기 베드의 내부 상단에는 혼합배지를 형성한다. 바람직하게는 황토와 팽연 왕겨를 6:4 부피비로 혼합한 혼합배지에서 재배한다.
상기 양액은 NO3-N 6.0meL-1, NH4-N 0.5meL-1, K 4.0meL-1, Ca 2.0meL-1, Mg 1.0meL-1, PO4-P 1.5meL-1, SO4-S 1.0 meL-1, Fe-EDTA 3.0μ㏖, Mn 0.5μ㏖, B 0.5μ㏖, Cu 0.02μ㏖, Mo 0.05μ㏖, Zn 0.05μ㏖의 비율로 조제하고, pH는 6.0±0.5로, 이온농도는 1.0±0.2 dS/m 으로 설정하여, 일사비례제어방식으로 공급된다. 이때, 상기 일사비례제어방식은 1,000~1,200w/㎠의 설정값을 가진다.
본 발명의 수경재배 인삼 잎 추출물은 상기와 같은 방법으로 재배한 인삼 잎을 열수추출하거나, 유기용매로 추출하여 제조된다. 본 발명에 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 70% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 수경재배 인삼 잎 70% 에탄올 추출물에서 염증성 사이토카인 억제활성 및 알레르기 억제 활성이 특히 우수하게 나타났다. 본 발명에서 바람직하게는 상기 수경재배 인삼은 100~120일 재배 후 수확한 것을 사용하는 것이 바람직한데, 120일 경과 후 수확한 인삼 잎 추출물에서 가장 우수한 아토피 피부염 개선효과를 나타내었다.
상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30중량%, 보다 바람직하게는 0.1~20% 중량%의 양으로 함유할 수 있다. 상기 수경재배 인삼 잎 추출물의 함량이 0.001중량%미만이면 아토피 피부염 개선 효과가 미약하고, 30중량%를 초과하면 피부 안전성 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, 아토피 피부염 개선 활성성분인 수경재배 인삼 잎 추출물은 다양한 진세노사이드 및 인삼 잎 추출물 내의 다른 성분들과의 상승작용에 의하여 우수한 아토피 피부염 개선활성을 나타낸다.
상기 활성성분인 수경재배 인삼 잎 추출물은 아토피 유발 피부상주균에 대한 우수한 항균활성(시험예 1)을 가지며, 염증 사이토카인 PGE2, TNF-α의 발현을 억제하는 활성(시험예 3), 아토피관련 유전자 COX-2, iNOS의 발현을 억제하는 활성(시험예 4), 피부질환 지표 물질인 CCL5, CCL17 단백질의 발현을 억제하는 활성(시험예 5), 과민성 염증반응 사이토카인(IL-4, IL-13) 발현을 억제하는 활성(시험예 6), 알레르기 유발 사이토카인 β-hexosaminidase 발현 억제활성(시험예 7), 피부염증 억제활성(시험예 8)이 우수하게 나타났다.
수경재배 인삼 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
참고예 1 : 인삼 수경재배
인삼 수경재배의 배지는 황토와 팽연 왕겨를 6:4의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 양액의 농도는 NO3-N 6.0meL-1, NH4-N 0.5meL-1, K 4.0meL-1, Ca 2.0meL-1, Mg 1.0meL-1, PO4-P 1.5meL-1, SO4-S 1.0 meL-1, Fe-EDTA 3.0μ㏖, Mn 0.5μ㏖, B 0.5μ㏖, Cu 0.02μ㏖, Mo 0.05μ㏖, Zn 0.05μ㏖의 비율로 조제하여 사용하였다. 양액의 pH는 6.5, EC는 1.0 dS/m으로 조절하여 일사비례제어방식으로 공급하였다. 이때, 상기 일사비례제어방식은 1,000~1,200w/㎠의 설정값을 가진다.
참고예 2 : 수경재배 인삼의 부위별 성분함량
상기 참고예 1과 같은 방법으로 재배된 수경재배 인삼을 120일 경과 후 수확하여 부위별 진세노사이드 성분 함량을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Ginsenoside 뿌리
Mean(%)		 줄기
Mean(%)		 잎
Mean(%)
Rg1 0.41 0.45 4.04
Rd 0.13 0.08 4.15
Rh1 0.27 0.01 1.41
Rc 0.15 0.02 1.53
Re 0.17 0.26 1.42
Rf 0.06 0.01 0.01
Rb1 0.33 0.01 0.33
Rg2 0.03 0.05 1.0
Rb2 0.02 0.01 0.22
Total 1.58 0.88 14.11
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 수경재배 방법으로 수확한 상기 인삼 잎의 진세노이드 총 함량은 141.1 ㎎/g 으로서 뿌리에 비하여 9배 정도 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 조성별로는 Rg1과 Rd 등이 많이 함유되어 있고, Rh1, Re 및 Rc 성분 함량도 높은 것으로 나타났다.
실시예 1 : 수경재배 인삼 잎의 열수추출물 제조
진세노사이드가 가장 많이 함유된 것으로 확인된 수경재배 인삼 잎을 채취하여 열수추출물을 제조하였다. 120일 재배 후 수확한 인삼에서 잎을 채취하여 40℃~50℃에서 열풍 건조하였다. 5배 중량의 정제수를 가한 후 80℃에서 5시간 환류 추출하였으며, 추출액을 여과 후 60℃에서 감압농축하여 열수추출물을 제조하였다.
실시예 2 : 수경재배 인삼 잎의 메탄올 추출물 제조
상기 수경재배 인삼 잎을 채취하여 메탄올을 용매로 하여 추출물을 제조하였다. 120일 재배 후 수확한 인삼에서 잎을 채취하여 40℃~50℃에서 열풍 건조하였다. 10배 중량의 80% 메탄올을 가한 후 상온(22~25℃)에서 3시간 추출 후 부직포를 이용하여 1차 여과 후, 1um 여과지(5C)를 이용하여 2차 여과하였다. 여과물은 60℃에서 감압농축하여 메탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 3 : 수경재배 인삼 잎의 에탄올 추출물 제조
상기 수경재배 인삼 잎을 채취하여 70% 에탄올을 용매로 하여 추출물을 제조하였다. 120일 재배 후 수확한 인삼에서 잎을 채취하여 40℃~50℃에서 열풍 건조하였다. 10배 중량의 70% 에탄올을 가한 후 상온(22~25℃)에서 3시간 추출 후 부직포를 이용하여 1차 여과 후, 1um 여과지(5C)를 이용하여 2차 여과하였다. 여과물은 60℃에서 감압농축하여 에탄올 추출물을 제조하였다.
시험예 1: 수경재배 인삼 잎 추출물의 항균활성 시험
상기 실시예에서 제조된 수경재배 인삼 잎 추출물을 사용하여, 아토피 유발 피부상주균에 대한 디스크 검사를 실시하였다. 균주는 한국생명공학연구원에서 구입하여 사용하였으며, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. Coli)을 균 생육배지에 배양하였다.
E.coli 균주에 대한 항균활성
순수 분리된 균주의 단일집락을 취해 10ml의 균 생육 액체배지에 접종하여 각각 균주의 생육적온에서 18-24시간씩 배양한 후 항균활성 시험균주로 사용하였다. 항균성 시험용 평판배지의 조제는 각각 균주의 15%의 한천이 첨가된 생육배지를 멸균하여 페트리 디쉬에 15ml씩 분주하여 배지를 응고시키고, 시험밀도(optical density, O.D.) 값이 0.4(106 CFU/mL)인 시험균을 0.7% 한천이 첨가된 중층용 배지에 무균적으로 가하여 잘 혼합한 다음 배지 위에 분주한 다음 고르게 응고시켰다. 고체배지 위에 멸균된 8mm 페이퍼 디스크(paper disc)를 올려놓은 후, 농도 0, 5, 10, 20 mg/ml의 추출물을 30 ul씩 디스크에 흡수시킨 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 디스크 주변의 클리어 존(clear zone)을 관찰하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 열수 추출물의 경우 E.coli에 대한 항균활성을 보이지 않지만, 에탄올, 메탄올추출물의 경우 농도 의존적인 항균활성을 보였다.
Staphylococcus aureus 균주에 대한 항균활성
순수 분리된 균주의 단일집락을 취해 10ml의 균 생육 액체배지에 접종하여 각각 균주의 생육적온에서 18-24시간씩 배양한 후 항균활성 시험균주로 사용하였다. 향균성 시험용 평판배지의 조제는 각각 균주의 15%의 한천이 첨가된 생육배지를 멸균하여 페트리 디쉬에 15ml씩 분주하여 배지를 응고시키고, 시험밀도(optical density, O.D.) 값이 0.4(106 CFU/mL)인 시험균을 0.7% 한천이 첨가된 중층용 배지에 무균적으로 가하여 잘 혼합한 다음 배지 위에 분주한 다음 고르게 응고시켰다. 고체배지 위에 멸균된 8mm 페이퍼 디스크(paper disc)를 올려놓은 후, 농도 0, 5, 10, 20 mg/ml의 추출물을 30 ul씩 디스크에 흡수시킨 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 디스크 주변의 클리어 존(clear zone)을 관찰하였다.
Staphylococcus epidermis 균주에 대한 항균활성
순수 분리된 균주의 단일집락을 취해 10ml의 균 생육 액체배지에 접종하여 각각 균주의 생육적온에서 18-24시간씩 배양한 후 항균활성 시험균주로 사용하였다. 향균성 시험용 평판배지의 조제는 각각 균주의 15%의 한천이 첨가된 생육배지를 멸균하여 페트리 디쉬에 15ml씩 분주하여 배지를 응고시키고, 시험밀도(optical density, O.D.) 값이 0.4(106 CFU/mL)인 시험균을 0.7% 한천이 첨가된 중층용 배지에 무균적으로 가하여 잘 혼합한 다음 배지 위에 분주한 다음 고르게 응고시켰다. 고체배지 위에 멸균된 8mm 페이퍼 디스크(paper disc)를 올려놓은 후,농도 0, 5, 10, 20 mg/ml의 추출물을 30 ul씩 디스크에 흡수시킨 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 디스크 주변의 클리어 존(clear zone)을 관찰하였다.
도 1에서 확인되는 바와 같이 열수 추출물의 경우 Staphylococcus aureus 균과 Staphylococcus epidermis 균주에 대한 항균활성을 보이지 않지만, 에탄올, 메탄올추출물의 경우 농도 의존적인 항균활성을 보였다.
시험예 2 : 수경재배 인삼 잎 추출물의 세포독성 시험
세포성 면역 활성 효과를 검증하기 위한 선행실험으로서, 수경재배 인삼 잎 추출물들이 나타내는 세포 생존에 미치는 효과를 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Medison, WI)를 이용하여 분석하였다.
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포들은 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. RAW264.7 세포의 배지는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 96-well plate에 5×105의 세포를 plating하고 37℃에서 각 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, 열수 추출물과 에탄올 추출물을 농도별(0, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ppm)로 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 수경재배 인삼 잎 열수 추출물에서는 500 ppm까지는 세포 생존률에 큰 변화는 없었으나, 1000 ppm에서 약 30%의 세포 생존률 감소를 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 70% EtOH 추출물에서는 100 ppm까지는 세포 생존률에 큰 변화는 없었으나 500, 1000 ppm에서 생존률이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 이후 진행되는 실험에서는 두 추출물 모두 100 ppm에서 효능평가를 진행하였다.
시험예 3 : 염증 반응 관련 사이토카인 PGE2, TNF-α의 발현억제활성 시험
PGE2의 발현억제활성
Prostaglandin(PG)은 세포막에 존재하는 인지질에서 생성된 arachidoni acid (AA)로부터 유래된 불포화지방산에 속하는 호르몬으로 알려져 있다. 생성된 PG들 중에서 PGE2는 알러지에 의해 유도되는 염증 반응에 깊이 관여하며, 종양의 세포사멸을 억제하고 혈관생성을 유도하여 종양생성에 기여한다. 알러지에 의해 유도되는 염증 반응에 관여하는 대표적인 사이토카인인 PGE2의 생성능이 수경재배 인삼 잎 추출물에 의해 억제되는지를 확인하기 위하여 ELISA법을 통해 사이토카인 분비량을 측정하였다.
RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 96 well plate에 각 well당 5×105개의 세포를 분주한 다음, 24시간 배양하였다. 그 후 수경인삼잎 추출물 50, 100 ppm을 1시간 전처리하였다. 처리 후 LPS 10 ul를 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 상층액을 모아서 ELISA 방법으로 PGE2를 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. LPS 자극에 의해 생성된 PGE2 분비가 수경재배 인삼 잎 추출물에 의해 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 27.5%, 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 100 ppm에서는 41.6%, 수경재배 인삼 잎 EtOH 추출물 50 ppm에서는 43.6%, 수경재배 인삼 잎 EtOH 추출물 100 ppm에서는 55.7% 감소함을 확인하였다.
TNF-α의 발현억제활성
TNF-α는 염증반응을 매개하는 물질로 특히 초기 염증반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있으며, LPS반응의 주요 매개체로서, 염증성 병변과정에서 발현이 증가되는데 대식세포와 mast cell에서 분비되는 TNF-α는 tumor cell에 세포독성을 나타낸다. 알러지에 의해 유도되는 염증 반응에 관여하는 대표적인 사이토카인인 TNF-α의 생성능이 수경재배 인삼 잎 추출물에 의해 억제되는지를 확인하기 위하여 ELISA법을 통해 사이토카인 분비량을 측정하였다.
RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 96 well plate에 각 well당 5×105개의 세포를 분주한 다음, 24시간 배양하였다. 그 후 수경인삼잎 추출물 50, 100 ppm을 1시간 전처리하였다. 처리 후 LPS 10 ul를 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 상층액을 모아서 ELISA 방법으로 PGE2를 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. LPS 자극에 의해 생성된 TNF-α 분비가 수경재배 인삼 잎 추출물에 의해 감소됨을 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 22.7%, 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 100 ppm에서는 27.9%, 수경재배 인삼 잎 EtOH 추출물 50 ppm에서는 35.9%, 수경재배 인삼 잎 EtOH 추출물 100 ppm에서는 45.2% 감소함을 확인하였다.
시험예 4 : 아토피 관련 유전자 COX-2, iNOS 발현 억제활성 시험
RAW264.7 세포(106 cells/ml)를 6 well plate에 분주하여 24시간 배양시킨 후 수경재배 인삼 잎 추출물을 각각 50, 100 ppm 처리하고, 1시간 뒤 LPS(1 μg/ml)을 가하여 37℃, 5% CO2에서 21시간 배양하였다. 이 후 세포들을 모아서 단백질을 추출하여 western blotting 방법을 사용하여 단백질 발현 양상을 확인하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. LPS 자극에 의하여 COX-II와 iNOS 발현이 증가되었다. 두 단백질 모두 수경재배 인삼 잎 추출물에 의하여 발현이 감소됨을 확인하였다.
시험예 5 : 피부질환 지표 물질인 CCL5, CCL17 발현 억제활성 시험
인간 피부세포주인 HaCaT 세포들은 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. HaCaT 세포의 배지는 10% FBS가 포함된 DMEM을 사용하였다. HaCaT 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 96 well plate에 각 well당 106개의 세포를 분주한 다음, 24시간 배양하였다. 그 후 수경재배 인삼 잎 추출물 50, 100 ppm을 2시간 전처리하였다. 처리 후 TNF-α 와 IFN-γ 10 ng/ml을 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 상층액을 모아서 ELISA 방법으로 CCL5와 CCL17을 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 수경재배 인삼 잎 추출물에 의하여 증가된 CCL5의 단백질 발현이 감소됨을 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 34.4%, DW 추출물 100 ppm에서는 70.7%, EtOH 추출물 50 ppm에서는 60.8%, EtOH 추출물 100 ppm에서는 74.2% 감소하였다.
수경재배 인삼 잎 추출물에 의하여 증가된 CCL17의 단백질 발현이 감소됨을 확인하였다. 수경재재 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 31.7%, DW 추출물 100 ppm에서는 56.2%, EtOH 추출물 50 ppm에서는 49.8%, EtOH 추출물 100 ppm에서는 65.7% 감소하였다.
시험예 6 : 과민성 염증반응 사이토카인(IL-4, IL-13) 발현 확인 시험
IL-4, IL-13 등의 Type-2 helper T cell(Th2) 관련 사이토카인은 Th2 관련 면역 반응을 증가시키고 IgE의 생산을 증가시킴으로써 만성 알레르기 반응에 기여한다고 알려져 있다. IL-13은 IL-4와 별개로도 면역반응을 일으킬 수 있음이 발견되었는데, IL-13은 점액 변질과 호산구 세포 사멸의 조절, 그리고 기도 개형을 유도한다고 알려져 있으며, 아토피와 아토피 천식 환자에게서 과도한 IL-13가 생산된다.
RBL-2H3 세포 (3×105 cells/ml)를 48 well plate에 250 ul/well로 분주하여 24시간 배양시킨 후 수경인삼잎 추출물을 50, 100 ppm 처리하고, 1시간 뒤 PMA (50 ng/ml)와 ionomycin (0.5 uM)을 가하여 37℃, 5% CO2에서 16시간 배양하였다. 이 후 상등액만 취해 상등액 중의 사이토카인을 ELISA kit를 이용하여 그 농도를 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
PMA와 ionomycin 자극에 의해 생성된 IL-4 분비가 수경재배 인삼 잎 추출물에 의해 감소됨을 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 17.6%, DW 추출물 100 ppm에서는 20.4%, EtOH 추출물 50 ppm에서는 30.1%, EtOH 추출물 100 ppm에서는 38.1% 감소하였다.
PMA와 ionomycin 자극에 의해 생성된 IL-13 분비가 수경인삼 잎 추출물에 의해 감소됨을 확인 하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 18.9%, DW 추출물 100 ppm에서는 25.3%, EtOH 추출물 50 ppm에서는 27.6%, EtOH 추출물 100 ppm에서는 36.0% 감소하였다.
시험예 7: 알레르기 유발 사이토카인 β-hexosaminidase 발현 억제활성 시험
RBL-2H3 세포(5×105 cells/ml)를 24 well plate에 500 ul/well로 분주하여 24시간 배양시킨 후 수경인삼잎 추출물을 50, 100 ppm을 처리하고, 1시간 한 뒤 PMA (50 ng/ml)와 ionomycin (0.5 uM)을 가하여 30분 배양한 후 10분간 냉각시켜 반응을 종결하였다. 이 후 상등액만 취해 β-hexosaminidase ELISA kit를 이용하여 상등액 중의 농도를 측정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 수경재배 인삼 잎 추출물에 의하여 증가된 β-hexosaminidase의 유리가 감소됨을 확인하였다. 수경재배 인삼 잎 DW 추출물 50 ppm에서는 26.8%, DW 추출물 100 ppm에서는 57.3%, EtOH 추출물 50 ppm에서는 28.6%, EtOH 추출물 100 ppm에서는 63.3% 감소하였다.
시험예 8 : 염증 억제 효과 시험
Hairless mouse에 oxazolone을 이용하여 접촉성 피부염을 유발시킨 후, 수경재배 인삼 잎 추출물의 염증 억제 효과를 확인하였다.
Hairless 마우스의 등 부위에 5% oxazolone을 잘 도포하여 감작시키고 7일후부터 추출물을 도포한 다음 30분 후에 다시 oxazolone을 5%로 조제하여 도포하여 접촉성 피부염을 유발시켰다. 2일 간격으로 9회 반복하여 피부염을 유발시키고 병변 부위를 관찰하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. Oxazolone에 의하여 hairless 마우스 등 부위에 피부염이 유도되는 것을 확인하였다. 이 마우스에 oxazolone과 함께 수경재배 인삼 잎 추출물 DW 100 ppm과 EtOH 100 ppm을 처리하였을 때 병변 부위의 염증이 완화 되는 것을 확인하였다.
제형 실시예 1 : 수경재배 인삼 잎 추출물 함유 로션의 제조
수경재배 인삼 잎 추출물을 함유한 로션을 하기의 표 2의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
성분 (중량%) 함량(중량%)
수경재배 인삼 잎 에탄올 추출물
(실시예 3)		 1.0
밀납 1.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄 세스퀴올레이트 0.5
유동 파라핀 10.0
소르비탄 스테아레이트 0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5
스테아린산 1.5
글리세릴스테아레이트/
피이지-400 스테아레이트		 1.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제 미량
정제수 To 100

Claims (5)

  1. 수경재배 인삼 잎 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 수경재배 인삼 잎의 열수추출물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30중량% 함유되는 것임을 특징으로하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 아토피 유발 피부상주균에 대한 항균활성을 가지는 것임을 특징으로하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수경재배 인삼 잎 추출물은 면역 세포의 활성 억제 효과를 나타내는 것임을 특징으로하는 아토피 피부염 개선용 화장료조성물.

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