JP6214248B2

JP6214248B2 - 水耕栽培朝鮮人参由来ジンセノシドｆ２を含有する皮膚外用剤組成物及びジンセノシドｆ２の製造方法

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Publication number: JP6214248B2
Application number: JP2013141650A
Authority: JP
Inventors: 權烈柳; 東 ▲玄▼ 金; 沃 ▲粲▼ 李; 賢喜金; 明 ▲フン▼ 廉; 濬 ▲テツ▼ ▲ソウ▼
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2017-10-18
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103520014A; KR101877801B1; CN107693527A; US20140039170A1; CN103520014B; KR20140006418A; JP2014015462A; CN107693527B

Description

本発明は、ジンセノシドＦ２を含有する皮膚外用剤組成物に関し、より詳細には、ジンセノシドＦ２を培地耕の朝鮮人参水耕栽培システム及び噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムで栽培して収穫した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉から抽出することによって、さらに高い含量のジンセノシドＦ２を収得することができ、また、ジンセノシドＦ２を含有することによって、ジンセノシドＦ２が有する優れた抗酸化力を通じて皮膚老化防止効果、皮膚保湿力改善効果、抗炎症効果、にきび及びアトピーなどの皮膚トラブル改善効果、美白効果、皮脂調節効果、毛穴収縮効果、血行改善による顔色改善などの全般的な皮膚状態改善効果だけでなく、フケ防止効果、育毛効果及び白毛防止効果などの頭皮及び毛髪状態改善効果を提供することができる組成物に関する。

人間の皮膚は、人体の一次防御膜であって、温度及び湿度の変化、紫外線、公害物質のような外部環境の刺激から体内の器官を保護する機能をし、年が取るにつれてさまざまな内的、外的要因によって変化を経験する。すなわち、内的には、新陳代謝を調節する各種ホルモンの分泌が減少し、免疫細胞の機能と細胞の活性が低下し、生体に必要な免疫タンパク質及び生体構成タンパク質の生合成が減少するようになり、外的には、オゾン層の破壊によって太陽光線のうち地表に到逹する紫外線量が増加し、環境汚染がさらに深刻化するにつれてフリーラジカル及び活性酸素などが増加することによって、皮膚の厚さが減少し、しわが増加し、弾力が減少するだけでなく、皮膚血色も悪くなり、皮膚トラブルがしばしば発生し、しみとそばかす及び斑点が増加し、血色が悪くなり、皮膚トーンも暗くなるなど様々な変化を起こすようになる。

このような皮膚内的及び外的要因による皮膚状態の変化を防止し、元気な皮膚状態を維持するために、既存の各種動物、植物、微生物などから得た生理活性物質を化粧品に付加して使用することによって、皮膚状態を改善させるための努力が進行されてきた。

大韓民国公開特許公報第10-2010-0001774号

これより、本発明者は、ジンセノシドＦ２が抗老化、皮膚しわ改善、美白、保湿改善効果だけでなく、にきび及び皮膚トラブル、アトピー症状の改善効果を提供することができ、皮膚血色改善の効果、皮脂調節、毛穴収縮効果などの皮膚状態改善効果を提供することができ、また、フケ防止、育毛及び白毛防止などの頭皮及び毛髪状態改善効果を提供することができることを知見し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、ジンセノシドＦ２を含有し、皮膚の全般的な状態を改善することができる皮膚外用剤組成物を提供する。

上記目的を達成するために、本発明は、ジンセノシドＦ２を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物であって、前記組成物は、美白用、保湿用、にきび改善用、脂質生成抑制用、毛穴収縮用、皮脂調節用、フケ防止用、育毛用、及び白毛防止用からなる群から選ばれた少なくとも１つの用途を有する皮膚外用剤組成物を提供する。

また、本発明は、ジンセノシドＦ２を天然防腐剤として含有する皮膚外用剤組成物を提供する。
また、本発明は、
ａ）苗参を出庫後、１５℃の貯蔵温室に移して１〜２日保管した後、仮植を行う順化１段階と；
ｂ）仮植された上記苗参を温室で１〜２日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化２段階と；
ｃ）ＮＯ _３、ＮＨ _４、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、ＰＯ _４、及びＳＯ _４イオンを含有する養液を調剤する段階と；
ｄ）上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と；
ｅ）前記混合培地に定植する順化２段階終了後３０日〜１２０日後に収穫する段階と；
を含む水耕栽培方法で苗参を栽培し、生産される朝鮮人参の葉のジンセノシドＦ２の含有量を増大させた後、抽出及び分離してジンセノシドＦ２を得るジンセノシドＦ２の製造方法を提供する。

本発明の組成物において利用するジンセノシドＦ２は、培地耕の朝鮮人参水耕栽培システム及び噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムで栽培して収穫した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉から抽出することによって、既存の朝鮮人参よりさらに高含量のジンセノシドＦ２を収得することができ、ジンセノシドＦ２が有する優れた抗酸化力を通じて皮膚老化防止効果、皮膚保湿力改善効果、抗炎症効果、にきび及びアトピーなどの皮膚トラブル改善効果、美白効果、皮脂調節効果、毛穴収縮効果、血行改善による顔色改善などの全般的な皮膚状態改善効果だけでなく、フケ防止効果、育毛効果及び白毛防止効果などの頭皮及び毛髪状態改善効果を提供することができる。

図１は、一般露地栽培朝鮮人参の葉、水耕栽培３０日、６０日、９０日及び１２０日生長朝鮮人参の葉から８０％エタノールで抽出されたジンセノシドＦ２の含量を示すグラフである。図２は、一般露地栽培朝鮮人参の葉、水耕栽培３０日、６０日、９０日及び１２０日生長朝鮮人参の葉の成分のＨＰＬＣ分析結果を示す図表である。図３は、剤形例５及び比較剤形例６を塗布したマウスの発毛効果を観察した試験例２５の結果を示す写真である。

本発明による皮膚外用剤組成物は、ジンセノシドＦ２を有効成分として含有する。
本発明で使用するジンセノシドＦ２は、下記化学式１の構造を有する。

本発明のジンセノシドＦ２は、大韓民国公開特許公報第10-2010-0001774号に公開された方法によって培地耕の朝鮮人参水耕栽培システム及び噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムで栽培して収穫した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉から抽出したものであることを特徴とする。

上記培地耕の朝鮮人参水耕栽培システムを利用した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉の生産方法は、次の段階を含む：
ａ）苗参を出庫後、１５℃の貯蔵温室に移して１〜２日保管した後、仮植を行う順化１段階と；
ｂ）仮植された上記苗参を温室で１〜２日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化２段階と；
ｃ）養液を調剤する段階と；
ｄ）上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と；
ｅ）前記混合培地に定植する順化２段階終了後３０日〜１２０日後に収穫する段階。

また、上記噴霧耕の朝鮮人参水耕栽培システムを利用した清浄な生の朝鮮人参及び朝鮮人参の葉の生産方法は、次の段階を含む：
ａ）苗参を出庫後、１５℃の貯蔵温室に移して１〜２日保管した後、仮植を行う順化１段階と；
ｂ）仮植された上記苗参を温室で１〜２日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参をベッドに定植する順化２段階と；
ｃ）養液を調剤する段階と；
ｄ）上記養液をミストノズルを通じて上記苗参の根に噴射する段階と；
ｅ）使用された上記養液が上記ベッドの一端に形成された排水口を通じて養液槽に流入されて再使用される段階と；
ｆ）前記ベッドに定植する順化２段階終了後３０日〜１２０日後に収穫する段階。

朝鮮人参の根または朝鮮人参の葉抽出物は、上記方法で栽培した朝鮮人参の根または朝鮮人参の葉から浸出、煎出して得た浸出液のみならず、浸出液をさらに一部または全部濃縮して得た濃縮物または上記の濃縮物をさらに乾燥させて製造した浸剤、煎剤、チンキ、流動エキス及び朝鮮人参の中に含有され、主効果を発揮する化学物質はもちろん、植物それ自体をすべて含む。また、朝鮮人参抽出物からジンセノシドＦ２を抽出するには、公知の方法を用いればよい。

具体的に、上記ジンセノシドＦ２は、朝鮮人参から当業界によく知られた方法で水または有機溶媒で朝鮮人参抽出物を製造した後、前記抽出物から分離することができる。本発明に使用する有機溶媒は、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート、クロロホルム及びこれら有機溶媒と水との混合溶媒よりなる群から選択でき、好ましくは８０%エタノールであるのがよい。

この際、抽出温度は１０〜８０℃であることが好ましく、また、抽出時間が３〜２４時間であることが好ましい。上記抽出温度及び抽出時間の範囲から外れた場合には、抽出効率の低下、又は成分変化が生じる。

本発明による組成物は、ジンセノシドＦ２を組成物全体重量に対して０．００１〜５０重量%、好ましくは０．０１〜３０重量%、より好ましくは０．１〜１０重量%の量で含有することができる。上記ジンセノシドＦ２の含量が０．００１重量%未満であると、上記成分による効能及び効果が弱く、５０重量%を超過すると、皮膚安全性または剤形上の問題があるからである。

本発明の組成物は、ジンセノシドＦ２を有効成分として含有することで、優れた抗酸化力を発現する。

本発明の組成物は、抗老化用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、皮膚弾力を増加させ、しわを改善させる効果に優れている。

本発明の組成物は、美白用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これはチロシナーゼ活性を阻害し、メラニンの生成を抑制することによって、優れた美白効果を提供することができる。

本発明の組成物は、保湿用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、皮膚障壁機能を強化させ、皮膚角質形成細胞の分化を誘導させることができる。したがって、表皮分化の不完全に起因して生ずる皮膚乾燥症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎または乾癬などを予防または改善する皮膚外用剤組成物として有用に使用されることができる。

本発明の組成物は、にきび改善用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、抗菌効果、特ににきび原因菌に対する抗菌効果に優れており、また、抗炎効果を提供する。

本発明の組成物は、血色及び皮膚トーン改善用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、皮膚に適用時に毛細管を拡張させ、血液循環を促進させることによって、皮膚に営養分を円滑に供給し、皮膚老化を抑制させて、血色及び皮膚トーン改善効果に優れている。

本発明の組成物は、毛穴縮小、皮脂調節及び皮膚トラブル改善用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、皮膚に適用時に過剰分泌される皮脂を抑制し、活性酸素除去とコラーゲン合成を促進することによって、毛穴を縮小させ、炎症因子の発現減少により皮膚トラブルを抑制する効果に優れている。また、優れた抗酸化力によって皮膚刺激の生成を防御することができる。

本発明の組成物は、フケ防止用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、毛髪と頭皮に蓄積された毒素を効果的に排出して頭皮を浄化し、フケ菌の増殖と成長を抑制し、頭皮炎症反応を予防することができ、また、活性酸素の生成及び作用を抑制する抗酸化効能に優れていて、頭皮を鎮定させ、強化させ、本然の防御力を強化させる効果を提供することができる。

本発明の組成物は、育毛用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、休止期毛髪周期の成長期毛髪周期への移行を促進させることによって、毛髪の生長を促進し、脱毛を防止する効果を提供することができる。

本発明の組成物は、白毛防止用皮膚外用剤組成物として使用されることができ、これは、メラノサイトでＭＩＴＦの発現を顕著に上昇させて、白毛を抑制し、黒毛誘発を促進させることができる。

また、本発明の皮膚外用剤組成物に使用されるジンセノシドＦ２は、天然防腐剤としての効果を提供することができる。

本発明の皮膚外用剤組成物は、化粧料組成物として剤形化することができ、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有して剤形化することができる。これは、局所適用に適したすべての剤形であり、例えば、溶液、ゲル、固体、無水ペースト、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球または、イオン性（リポソーム）及び非イオン性の小胞分散剤の形態、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシルステッキの形態として提供されることができる。また、フォーム（foam）の形態、または圧縮された推進剤をさらに含有するエアゾール組成物の形態として使用されることができる。これら組成物は、当該分野の通常的な方法により製造されることができる。

特に、本発明の皮膚外用剤組成物がフケ防止、育毛または白毛防止用として使用される場合には、頭皮及び毛髪用組成物として剤形化することができ、剤形は特に限定されるものではないが、例えば、ヘアトニック、毛髪栄養化粧水、スキャルプトリートメント、ヘアトリートメント、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアローションまたは頭皮毛髪兼用トリートメントなどを挙げることができる。

また、本発明による組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（foaming agent）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞、または化粧品に通常的に使用される任意の他の成分のような化粧品学または皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤等を含有することができる。上記補助剤は、化粧品学または皮膚科学分野において一般的に使用される量で含有される。また、本発明の組成物は、皮膚改善効果を増加させるために皮膚吸収促進物質を含有することができる。

以下、試験例及び剤形例により本発明の構成及び効果をさらに具体的に説明する。しかし、これら試験例及び剤形例は、本発明に対する理解を助けるために例示の目的だけで提供されるものであって、本発明の範疇及び範囲が下記例によって制限されるものではない。

〔参考例１〕朝鮮人参の水耕栽培
低温貯蔵された苗参を１５℃の貯蔵温室に移して２日間保管後、７０%〜８０%水分を含有する園芸用床土（ココピート５０%、ピートモス３０%、バーミキュライト１０%、ゼオライト１０%）に仮植して順化させた。順化段階の温度は、２０〜２３℃に維持し、５〜７日後、苗参の若芽が緑化した後、２５℃、湿度８０%〜９０%に維持された温室に移した。２日後、苗参をベッドに定植した後、養液を適正量供給し、水耕栽培朝鮮人参を栽培した。

上記養液は、イオンとして、多量要素であるＮＯ₃：６．０mg/L、ＮＨ₄：０．５mg/L、Ｋ：４．０mg/L、Ｃa：２．０mg/L、Ｍg：１．０mg/L、ＰＯ₄：１．５mg/L、ＳＯ₄：１．０mg/Lを含むと共に、微量要素であるＦe-EDTA：３．０mg/L、Ｍn：０．５mg/L、Ｂ：０．５mg/L、Ｃu：０．０２mg/L、Ｍo：０．０５mg/L、Ｚn：０．０５mg/Lを含み、ｐＨは、６．０±０．５とし、養液の濃度は、定植直後から葉が展開し順化完了段階までの３０日間はイオン濃度を０．８±０．１dS/cm²で管理し、その後、生育期には、１．１±０．１dS/cm²で管理した。

〔参考例２〕ジンセノシドＦ２の含量比較
一般栽培（露地栽培）朝鮮人参の葉は、金山の朝鮮人参卸売りセンターで購入（２０１１年１０月）し、水耕栽培朝鮮人参の葉は、苗参を２０１２年１月定植した後、上記参考例１の方法で栽培し、３０日、６０日、９０日、１２０日後に採取した。

〔参考例３〕ジンセノシドＦ２の取得
水耕栽培した朝鮮人参に特有のジンセノシドであるジンセノシドＦ２の含量を高めるために、８０％エタノールで抽出した水耕栽培朝鮮人参抽出物（上記抽出物パウダー）５ｇを水５００ｍｌに溶解させた後、同量の水飽和ブタノール（water saturated butanol）を加えて分液漏斗に入れ、この分液漏斗を何度も振った後、水飽和ブタノール層を分取し、得られた水飽和ブタノール溶液を減圧下に濃縮し、ジンセノシドＦ２の含量が高くなった水耕栽培朝鮮人参抽出物を得た。

各朝鮮人参の葉は、５５℃熱風乾燥器で１２時間乾燥し、各朝鮮人参の葉が同量の水分量を有するようにさらに乾燥させた。得られた乾燥した朝鮮人参の葉は、１００〜３００メッシュ（mesh）に細かく粉砕し、該朝鮮人参の葉１０ｇ当たり２００mLの８０%エタノールで２４時間抽出した。抽出された朝鮮人参の抽出物は、濾過と減圧濃縮を行い、抽出物パウダーにし、１０，０００ppmで８０%エタノールに溶かして、ＨＰＬＣ分析を行った。

ＨＬＰＣ分析は、(株)Waters（USA）の２６９５分離モジュール（separation module）と２９９６ＰＤＡ検出器（detector）を使用し、分析カラムは、(株)Kanto Chemical（Japan）の２５０mm ４．６mm i.d. Mightysil C18逆相カラム（reverse phase column）を使用した。移動相溶液は、水とアセトニトリル（acetonitrile）を使用して８５分間分析した。詳しくは、水とアセトニトリルの合計を１００%にして０分から５分まで水９０%から水７９%に進行、５分から１０分まで水７９%から水７９%に進行、１０分から３５分まで水７９%から７７．５%に進行、３５分から３７分まで水７７．５%から水６９%に進行、３７分から７７分まで水６９%から水５０%に進行、７７分から８０分まで水５０%から水５０%に進行、８０分から８３分まで水５０%から水９０%まで進行、８３分から８５分まで水９０%から水９０%に進行して分析した。
また、ジンセノシドＦ２の標準品は、アンボ研究所（Korea）から購入した。

各朝鮮人参の葉の８０％エタノール抽出液のＨＰＬＣ分析結果を図１及び図２に示す。水耕栽培を通じて成長させた朝鮮人参は、露地で一般的な方法で成長させた朝鮮人参に比べてジンセノシドＦ２の含量が著しく高く、特に水耕栽培した後、３０日が経過したときの朝鮮人参の葉は、ジンセノシドＦ２の含量が最も高く現われ、その後は、ジンセノシドＦ２の含量が減少することを確認することができる。

〔試験例１〕活性酸素種（ROS：reactive oxygen species）生成抑制効果
人間の表皮組職から分離した角質形成細胞（keratinocyte）を２４ウェルプレートの各ウェルに５×１０⁴個を入れ、２４時間付着させた。１６時間後、この角質形成細胞を濃度１%のジンセノシドのＤＭＳＯ溶液で処理した。この際、対照群は、ジンセノシドＦ２を処理しなかった。２時間後に培養液を除去した後、各ウェルに１００μLのリン酸緩衝溶液（PBS）を入れた。この角質形成細胞に紫外線Ｂ（UVB）ランプ（Model：F15T8、UV B 15W、Sankyo Dennki社、Japan）を利用して紫外線３０mJ/cm²を照射した後、ＰＢＳを取り出し、各ウェルに角質形成細胞培養液２００μLを添加した。これにジンセノシドＦ２をさらに処理し、一定時間帯別に紫外線刺激によって増加した活性酸素種の量を定量した。ＲＯＳの量は、ＲＯＳによって酸化されるＤＣＦ−ＤＡ（dichlorofluorescin diacetate）の蛍光を測定するＴａｎの方法を参照して定量し（Tan et al., 1998, J. Cell Biol., Vol. 141, pp1423-1432）、ビヒクルだけを処理した対照群のＲＯＳに対する比率を算出した。結果を表１に示す。

上記表１の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２は、紫外線によって皮膚細胞損傷を起こすと知られたＲＯＳの生成を効果的に抑制し、紫外線刺激後のＲＯＳの量が紫外線を照射しない場合とほぼ類似な水準でＲＯＳの生成を抑制する程度に抗酸化効能に非常に優れていることが分かる。したがって、本発明によるジンセノシドＦ２が酸化を抑制し、老化を防止することによって、毛穴が広くなることを予防することができ、皮膚刺激の生成を防御することによって、皮膚トラブルを改善させることができることを確認した。

〔試験例２〕エラスターゼ活性抑制効能測定
ジンセノシドＦ２のエラスターゼ活性阻害能をＥＧＣＧと比較して測定した。使用したエラスターゼ及び基質は、米国シグマアルドリチ社から購入した（Cat.No.E0127）。

下記の試験方法でエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
９６ウェルプレートで１０mg/L Tris-HCL緩衝液（ｐＨ８．０）で調剤したものにジンセノシドＦ２のＤＭＳＯ溶液２００μL及び２０μg/mLエラスターゼ・タイプIII溶液５０μLを混合した。陽性対照群としてエラスターゼ活性抑制剤として知られるＥＧＣＧを２５０μM使用し、陰性対照群である非処理群は、蒸留水を使用した。その後、上記緩衝液として調剤した０．４５１４mg/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE １００μLを添加し、２５℃で１５分反応させた。反応終了後、波長４１５nmにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い、補正した。エラスターゼ活性阻害作用の計算方法は、下記数式１に示された通りであり、結果は、下記表２に示した。

Ａ：試験物質無添加、酵素添加での波長４１５nmにおける吸光度
Ｂ：試験物質無添加、酵素無添加での波長４１５nmにおける吸光度
Ｃ：試験物質添加、酵素添加での波長４１５nmにおける吸光度
Ｄ：試験物質添加、酵素無添加での波長４１５nmにおける吸光度

上記表２に示されたように、ジンセノシドＦ２のエラスターゼ活性抑制程度がＥＧＣＧよりも著しく優れたものと現われ、本発明のジンセノシドＦ２がエラスターゼ活性抑制効果に優れていることを確認することができる。

〔試験例３〕コラゲナーゼ（MMP-1）阻害能
本発明のジンセノシドＦ２のコラゲナーゼ生成阻害能をコラゲナーゼ発現阻害剤として知られるレチノイン酸と比較して測定した。
２．５%の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）培地が入っている９６孔平板培養器（96-well microtiter plate）に人間の線維芽細胞を５，０００細胞／孔（well）になるように入れ、ＣＯ₂ ５%、３７℃の培養器（incubator）で７０〜８０%程度成長するまで培養した。ジンセノシドＦ２またはレチノイン酸を１０μg/mL濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。

採取した細胞培養液のコラゲナーゼ生成程度をコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムファルマシア社、Catalog＃：RPN2610）を利用して測定した。まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６−孔平板（96-well plate）に採取した細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽で行った。３時間後、発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−孔の平板（96-well plate）に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine、sigma）を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、発色反応を中止させれば、反応液の色は、黄色を帯びるようになり、反応進行の程度によって黄色の程度が異なるように現われた。

黄色を帯びる９６−孔の平板（96-well plate）の吸光度を吸光計を利用して４０５nmで測定し、下記数式２によってコラゲナーゼの合成程度を計算し、その結果を下記表３に示した。この際、組成物を処理しない群で採取した細胞培養液の反応吸光度を対照群とした。

上記表３に示されたように、ジンセノシドＦ２のコラゲナーゼ発現程度がコラゲナーゼ発現阻害剤として知られているはレチノイン酸と比較しても、コラゲナーゼ発現阻害効果が類似な水準であることが分かる。
このような結果を通じて、本発明のジンセノシドＦ２は、基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１）を阻害する効果を有することを確認することができる。

〔剤形例１及び比較剤形例１〕
下記表４の組成からなる栄養クリームを一般的な方法で製造した（単位：重量%）。

〔試験例４〕皮膚弾力向上効能確認
人間での皮膚弾力向上効果を確認するために、上記剤形例１と比較剤形例１の剤形で次のように評価した。
３０〜４０代の元気な女性２０人をそれぞれ剤形例１と比較剤形例１の２つの群に対して１０人ずつ２グループに分けて栄養クリームを毎日１回ずつ１２週間顔面に塗布するようにした後、皮膚弾力測定器（Cutometer SEM 575、Ｃ＋Ｋ Electronic Co. Germany）を利用して皮膚弾力を測定した。その結果を表５に示す。表５の結果値は、Cutometer SEM 575のΔＲ８値で記載したが、Ｒ８値は、皮膚粘弾性（viscoelasticity）の性質を示す。

上記表５に示されたように、本発明のジンセノシドＦ２が含有された剤形例１は、比較剤形例１を塗布した群に比べて皮膚弾力性がさらに増加した。
したがって、本発明のジンセノシドＦ２を含有する組成物は、皮膚弾力向上に非常に効果的であることを確認することができる。

〔試験例５〕皮膚しわ改善効能確認
本発明の組成物による人間でのしわ改善効果を確認するために、上記剤形例１と比較剤形例１を利用した。
上記剤形例１と比較剤形例１のしわ改善効果を確認するために、次のように評価した。４０代の元気な女性２０人をそれぞれ剤形例１と比較剤形例１の２つの群に対して１０人ずつ２グループに分けて栄養クリームを毎日１回ずつ１２週間顔面に塗布するようにした後、シリコーンを利用してレプリカを作成し、しわの状態を皮膚測定器（visiometer、SV600、Courage＋Khazaka electronic Gmbh、Germany）で測定し、画像分析した。その結果を表６に示す。下記表６の値は、塗布１２週後のそれぞれの変数（parameter）値から塗布前の変数値を差し引いたものの平均を示したものである。

Ｒ１：しわ等高線の最高値と最低値との差の値
Ｒ２：しわ等高線を任意に５個ずつ分けた後、それらのうちＲ１値の平均
Ｒ３：５個ずつ分けたＲ１値のうち最高値
Ｒ４：しわ等高線のベースライン（baseline）から各角の頂上と谷の値を差し引いた平均値
Ｒ５：しわ等高線のベースライン（baseline）から各角のしわ輪郭を差し抜いた値の差の値

上記表６に示されたように、剤形例１の外用剤組成物は、皮膚しわ改善効果に非常に優れていることが分かった。

〔試験例６〕チロシナーゼ阻害効果
チロシナーゼ酵素は、きのこ類（Mushroom）から抽出したもので、シグマ（SIGMA）社のものを使用した。まず、基質であるチロシンを蒸留水に溶解させて０．３mg/mLの溶液とし、その溶液を１．０mLずつ試験管に入れた後、これにポタシウム−ホスフェート緩衝溶液（0.1mol濃度、pH6.8）１．０mL及び蒸留水０．７mLを添加した。
本発明のジンセノシドＦ２をエタノール溶液に適当な濃度で混合して準備した試料液０．２mLを反応液に入れた後、３７℃恒温槽で１０分間反応させた。この際、対照群は、各試料液の代わりに、溶媒のみを０．２mL入れたものを準備し、陽性対照群としては、アスコルビン酸を使用した。この反応液に２５００ユニット／mLのチロシナーゼ溶液０．１mLずつを入れ、さらに３７℃恒温槽で１０分間反応させた。この反応液が入った試験管を氷水の中に入れて急冷させて反応を中止させ、光電分光分析計で波長４７５nmでの吸光度を測定し、その結果を表７に示す。それぞれのチロシナーゼ阻害効果は下記数式３で算出した。

上記表７の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２のチロシナーゼ抑制率が、公知されたチロシナーゼ阻害剤であるアスコルビン酸よりも顕著に高くて、美白効果に非常に優れていることが分かる。

〔試験例７〕Ｂ１６／Ｆ１０メラノマ細胞を利用したメラニン生成抑制効果
ジンセノシドＦ２及びコウジ酸をそれぞれ０．００１重量%で含有する試料を試験物質として一定濃度でＢ１６／Ｆ１０メラノマ細胞（韓国細胞株銀行）の培養液に添加し、３日間培養した後、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄し、1N-ＮａＯＨで細胞をとかして、４０５nmで吸光度を測定した。試験物質を添加しない細胞を対照群として対照群でのメラニン含量と比較し、各試験物質のメラニン生成阻害程度を測定した。数式４によってメラニン生成抑制率を計算し、その結果を表８に示す。

上記表８の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２のメラニン生成抑制率が、公知されたメラニン生成阻害剤であるコウジ酸よりも非常に高くて、美白効果に非常に優れていることが分かる。

〔試験例８〕皮膚保湿力増加効果測定
ジンセノシドＦ２が皮膚保湿力増加に及ぶ効果を測定するために、上記剤形例１及び比較剤形例１を利用し、下記のように評価した。
乾燥皮膚として分類された４０〜５０代の大人男女２０人をそれぞれ剤形例１及び比較剤形例１の２つの群に対して１０人ずつ２グループに分けて栄養クリームを毎日２回ずつ４週間顔面に塗布するようにした。塗布開始前と、塗布後に１週、２週、４週経過した時点、そして塗布を中止した２週経過（総６週経過）後に恒温、恒湿条件（２４℃、相対湿度４０%）で皮膚水分量測定器（Corneometer CM825、Ｃ＋Ｋ Electronic Co., ドイツ）で皮膚水分量を測定した。結果を表９に示す。表９の結果は、試験開始直前に測定した皮膚水分量の値を基準として一定期間処理した後の測定値の増加分を百分率で表示したものである。

上記表９の結果から、比較剤形例１を塗布した場合には、塗布が行われた４週までは約３０%程度の水分増加率を示すが、塗布を中止した後には皮膚水分量が減少し、一方、ジンセノシドＦ２を含有する剤形例１を塗布した場合には、塗布を中止した後にも３０%以上の皮膚水分増加率が維持されることが確認された。これにより、ジンセノシドＦ２を含有する本発明の組成物は、皮膚保湿力効果に優れていることが分かる。

〔試験例９〕角質形成細胞分化促進効果測定
ジンセノシドＦ２の角質形成細胞の分化促進効果を調べるために、下記のように角質形成細胞の分化時に生成されるＣＥ（Cornified Envelop）量を吸光度を利用して測定した。
まず、新生児の表皮から分離して一次培養した人間の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて底に付着させた後、ジンセノシドＦ２を培養液に５ppm濃度で処理した後、細胞が底面積の７０〜８０%程度成長するまで５日間培養した。この際、低カルシウム（0.03mM）処理群と高カルシウム（1.2mM）処理群をそれぞれ陰性対照群、陽性対照群とした。次に、上記培養した細胞を収穫し、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で洗浄した後、２%ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）と２０mM濃度のＤＴＴ（Dithiothreitol）を含有する１０mM濃度のトリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl、pH7.4）１mLを加えて、ソニケーション（sonication）、ボイリング（boiling）、遠心分離を行い、沈殿物をさらにＰＢＳ１mLに懸濁させて３４０nmでの吸光度を測定した。これと別に、上記ソニケーション後の溶液を一部取って、タンパク質の含量を測定し、細胞分化程度の評価時に基準とした。結果を表１０に示す。

上記表１０に示されたように、ジンセノシドＦ２を処理した場合、角質形成細胞の分化促進効果に優れていることを確認することができた。

〔試験例１０〕皮膚障壁機能回復効果測定
ジンセノシドＦ２が皮膚損傷によって損傷された皮膚障壁機能の回復に及ぶ効果を測定するために、下記のような実験を行った。成人男女１０人の上膊をテープストリピング（Tape Stripping）方法を利用して皮膚障壁に損傷を与え、それぞれ下記表１１の組成で製造した剤形例２及び比較剤形例２の２つの群を塗布しながら７日間一日に一度ずつ経皮水分損失量（TWEL）の回復程度をVapometer（Delfin、フィンランド）で測定比較した。ここで、比較剤形例２は、陰性対照群としてビヒクル（vehicle）である。結果を表１２に示す。表１２の結果は、障壁損傷前と障壁損傷後の処理前の差異を１００%を基準として比較した。

上記表１２から分かるように、ジンセノシドＦ２を含有しない比較剤形例２を処理した場合には、時間が経過するにつれて経皮水分損失量が次第に多くなる一方で、ジンセノシドＦ２を含有する剤形例２を処理する場合には、速い速度で経皮水分損失量が正常に戻り、障壁損傷が回復することを確認することができる。

〔試験例１１〕血色改善効果
本発明による化粧料組成物の皮膚血液循環促進効果を評価するために、ＬＤＰＩ（Laser Doppler Perfusion Imager）を利用して皮膚での血液循環程度を測定した。ＬＤＰＩは、皮膚での血液循環を測定する機器として広く知られており、皮膚の毛細血管で血液の速度及び量だけでなく、小動脈と小静脈でのフローまで測定することができる非常に敏感な機器である。
普段手足が冷たい女性３０人を対象に、恒温恒湿室で顔をせっけんで水洗した後、３０分間適応させ、ＬＤＰＩを利用して額の下部分の初期血流量を測定した。その後、上記剤形例１及び比較剤形例１を１週間被試験者に使用するようにした後に測定した血流量と上記初期測定値を比較した結果（皮膚血流量変化）を表１３に示す。

上記表１３の結果から、本発明による化粧料組成物は、ジンセノシドＦ２を含有しない比較剤形例１よりも皮膚血流量を著しく増加させ、このような血液循環促進を通じて血色が改善することを確認することができた。これは、窮極的に本発明によるジンセノシドＦ２を含有する化粧料組成物が皮膚の栄養分を効果的に伝達し、皮膚老化を抑制し、遅延させるのに寄与することができることを示唆する。

〔試験例１２〕皮膚トーン改善効果
上記剤形例１及び比較剤形例１の皮膚トーン改善効果を調べるために、３０人の被験者にそれぞれ使用（夕方１回／日塗布、総１週間）するようにした後、Facial Stage DM-3（Moritex、Japan）機器を活用して皮膚トーン改善程度を評価した。皮膚トーン改善率は、皮膚の明度及び色彩測定値で皮膚の明度及び色彩変化値として判断し、その結果は、下記表１４に示した。明度及び色彩変化値が大きいほど皮膚トーンが改善したことを意味する。

表１４の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２を含有しない比較剤形例１は、有意的な皮膚トーン改善効能を示さない一方で、ジンセノシドＦ２を有効成分として含有する剤形例１は、使用前よりも使用後の皮膚トーンが大きく改善することを確認した。

〔試験例１３〕毛穴縮小効果
１．コラーゲン生合成促進による毛穴縮小効果
本発明によるジンセノシドＦ２のコラーゲン生合成促進効果をＴＧＦ−βと比較して測定した。まず、線維芽細胞（fibroblast）を２４ウェル（well）に１孔当たり１０⁵個ずつ播種（seeding）し、９０%程度成長するまで培養した。これを２４時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養した後、無血清培地にとかした本発明のジンセノシドＦ２とＴＧＦ−βをそれぞれ１０ng/mLずつ処理し、ＣＯ₂培養器で２４時間培養した。これらの上澄み液を取って、プロコラーゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキット（procollagen type(I)）を利用してプロコラーゲン（procollagen）の増減有無を調べた。その結果を表１５に示し、コラーゲンの合成能は、非処理群を１００として対比した。

上記表１５の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２は、陽性対照群であるＴＧＦ−βよりも水準の優れたコラーゲン合成能を示すことが確認された。したがって、本発明によるジンセノシドＦ２が毛穴周辺のコラーゲン生成量を増加させて、広くなった毛穴を縮小させることができることを確認した。

２．毛穴縮小効果
剤形例１及び比較剤形例１の毛穴縮小効果を調べるために次のように評価した。毛穴サイズが広い被験者男女２０人を選定し、１０人ずつ２つの群に分けて各群別に顔に剤形例１及び比較剤形例１の栄養クリームを４週間毎日塗布するようにした。毛穴縮小の効果に対する判定は、実験前と４週後に写真を撮って専門家の目視評価で行われた。その結果を下記表１６に示した（評価等級：０−全然縮小されなかった；４−非常に縮小された）。

上記表１６の結果から、比較剤形例１は、毛穴縮小効果がないが、剤形例１の場合には、目視で確認可能な程度の毛穴縮小効果を示し、本発明によるジンセノシドＦ２は、毛穴のサイズを減少させる効果に優れていることが分かった。

〔試験例１４〕皮脂分泌抑制効果
１．５α−リダクターゼ活性抑制による皮膚過分泌抑制効果
５α−リダクターゼ活性抑制効果を確認するために、ＨＥＫ２９３−５αＲ２細胞で［¹⁴Ｃ］テストステロンが［¹⁴Ｃ］ジヒドロテストステロン（DHT：dihydrotestosterone）に変換される比率を測定した。ＨＥＫ２９３細胞にｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５αＲ２を形質感染させて、２４ウェルプレートにウェル当たり２．５×１０⁵細胞で入れて培養した（Park et al., 2003、JDS. Vol.31, pp.191-98）。翌日、酵素基質と阻害剤が添加された新しい培地に変えた。培地の基質としては、０．０５μＣｉ［¹⁴Ｃ］テストステロン（Amersham Pharmacia biotech、UK）を使用した。

５α−リダクターゼ活性抑制程度を確認するために、ジンセノシドＦ２を入れ、３７℃、５%ＣＯ₂培養器で２時間培養した。この際、ジンセノシドＦ２を入れないものは陰性対照群として使用し、フィナステライド（finasteride）を入れたものを陽性対照群として使用した。その後、培養培地を回収し、ステロイドを８００μLエチルアセテートで抽出した後、上部の有機溶媒層を分離して乾燥した後、残った残留物をさらに５０μLエチルアセテートでとかして、シリカプラスチックシートカイゼルゲル６０Ｆ２５４（Silica plastic sheet kiesel gel 60 Ｆ２54）上でエチルアセテート−ヘキサン（１：１）を溶媒として展開した。
プラスチック試料を空気中で乾燥した後、同位元素の量を測定するために、バースシステムを使用したが、乾燥したプラスチックシートとX線フィルムを一緒にバースカセットに入れ、１週間後にフィルムに残っているテストステロンとジヒドロテストステロンの同位元素の量を測定した後、下記数式５及び６によって転換率及び阻害率をそれぞれ算出し、その結果を下記表１７に示した。

上記表１７の結果から、テストステロンをジヒドロテストステロンに転換させて、細胞質内にある受容体タンパク質と結合し、核内に入って皮脂腺細胞を活性化し、分化を促進させて、皮脂腺内で皮脂を過分泌させる役目をする５α−リダクターゼの活性をジンセノシドＦ２が効果的に抑制することによって、テストステロンのジヒドロテストステロンへの転換を遮断することを確認することができ、５α−リダクターゼの活性を抑制するものと知られたフィナステライドよりも優れた抑制効果を有するものと現われた。したがって、ジンセノシドＦ２は、５α−リダクターゼの活性を効果的に抑制させることによって、皮脂の過分泌を抑制させることができることを確認した。

２．皮脂分泌抑制効果
上記剤形例１及び比較剤形例１の皮脂分泌抑制効果を調べるために、次のように評価した。皮脂分泌が多いと感じる被験者男女３０人を選定し、指定された部位に剤形例１及び比較剤形例１の栄養クリームを４週間毎日塗布するようにした。皮脂減少の効果に対する判定は、皮脂量測定器（Sebumeter SM810、Ｃ＋Ｋ Electronic Co.,ドイツ）を使用して２週及び４週経過後に平均皮脂減少率（%）をそれぞれ測定し、その結果を下記表１８に示した。

上記表１８の結果から、本発明によるジンセノシドＦ２を有効成分として含有する剤形例１は、これを含有しない比較剤形例１よりも過剰で分泌される皮脂を効果的に抑制することができることが分かった。

〔剤形例３及び比較剤形例３〜４〕
下記表１９に示した成分及び含量（重量%）によって剤形例３及び比較剤形例３〜４を製造した。具体的に説明すれば、剤形例３は、ジンセノシドＦ２を配合させたものであり、比較剤形例３は、にきび皮膚改善の有効成分を全く含ませないものであり、比較剤形例４は、抗菌力に対する基準とする標準物質としてにきび治療剤に多く使用されるエリスロムマイシン（erythromycin）を含有させたものである。
剤形例３及び比較剤形例３〜４の製造方法は、次の通りである。表１９のＡ相の成分を完全溶解させ、別の溶解槽でＢ相の成分を完全溶解させた後、Ｂ相をＡ相に添加して混合し、可溶化させた。これにＣ相の成分を表１９に記載した配合比率によって添加して混合し、均一化させた後、濾過させて、本組成物を製造した。

〔試験例１５〕にきび菌に対する抗菌力試験
剤形例３及び比較剤形例３〜４の組成で製造されたそれぞれの化粧料組成物について、にきび原因菌株であるプロピオニバクテリウムアクネス（ATCC 6919：培地−ＢＨＩブロス（broth））に対する抗菌力を試験した。
にきび菌に対する抗菌力試験方法は、次の通りである。
（１）試験菌液準備
プロピオニバクテリウムアクネスは、ＢＨＩブロスに接種し、嫌気培養した培養液を使用した。
（２）希釈溶液準備
ＢＨＩブロス（pH6.8）またはＬＢブロス（pH4.5）１５mLに上記試験菌液を０．１５mL添加し、よく混合したものを希釈溶液として使用した。
（３）試料準備
剤形例３及び比較剤形例３〜４で製造された化粧料組成物原液そのままを試料として使用した。
（４）抗菌力試験
１）９６ウェルの細胞培養管（96 well plate）１番の行に出発濃度に合うように試料を入れ、希釈溶液として総量を２００μLずつ入れる。
２）１番の行の混合液をよく混ぜた後、１００μLを取って、２番の行に入れ、よく混ぜた後、さらに１００μLを取って３番の行に入れる方式で二重希釈（double dilution）を行う。
３）３２℃で２４時間及び４８時間静置培養した後、懸濁された程度によって菌の増殖有無を判断し、菌の増殖がない最小濃度をＭＩＣ（最小阻止濃度；Minimum Inhibitory Concentration）値として決定する。混合液が不透明なために、菌の増殖有無を判断しにくい場合は、顕微鏡観察を通じて確認する。
にきび菌に対する抗菌力試験結果を表２０に示す。ＭＩＣは、剤形に含有された有効成分の濃度に換算して表記した。

ＭＩＣでppm濃度が小さいほど、にきび菌に対する抗菌力に対して有効な物質であると言えるが、剤形例３の場合、公知のにきび治療剤であるエリスロムマイシンを使用した比較剤形例４よりもppm濃度が顕著に小さく現れ、ジンセノシドＦ２を含有する組成物は、試験菌に対してさらに優れた抗菌力を有することが示された。

〔試験例１６〕脂質合成（Lipogenesis）抑制試験
マウスの線維芽細胞株（fibroblast cell line）である３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０%の牛胎児血清（fetal bovine serum、FBS）が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's modified eagles medium、GIBCO BRL、Life Technologes社）培地が収容された６ウェル培養プレート（culture plate）に１×１０⁵細胞／ウェルで付着させた。２日後、さらに新しいＤＭＥＭ（10%FBS含有）培地に交換し、２日間培養した。次に、上記培養した細胞をさらに１μg/mLインシュリン（insulin）、０．５mM ＩＢＭＸ及び０．２５μMデキサメタソン（dexamethasone）を含有するＤＭＥＭ（10%FBS含有）で分化誘導を行い、ジンセノシドＦ２及びカフェインを５０μMで処理した後、処理２日が経過した後、さらにインシュリンが含まれたＤＭＥＭに交換し、５日間培養した。５日後、さらに正常培地（DMEM、10%FBS含有）に交換し、上記細胞が形態的に脂肪細胞に変化するまで観察しながら培養した。

ジンセノシドＦ２の脂肪細胞内の脂肪蓄積抑制効能を評価するために、上記で分化が完了した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を利用してズダンIII染色（S4136、sigma-aldrich）を実施した。脂肪細胞をリン酸塩バッファー内で４%パラホルムアルデヒド（pH7.2）で常温で固定した後、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）で水洗し、ズダンIIIで染色した後、写真を撮って目視で比較した。対照群は、試験物質や比較物質を添加しない培地のみを使用したものであり、他の比較群としてカフェイン５０μMを処理した。脂肪蓄積抑制程度は、染色された程度を＋＋＋、＋＋、＋、−に分けて等級を付与し、この際、＋＋＋に行くほど、染色程度が大きいことを意味する。結果を表２１に示す。

上記表２１に示されたように、本発明に使用されたジンセノシドＦ２は、脂肪細胞内に蓄積された脂肪の量が少ないだけでなく、既知の脂質合成阻害物質であるカフェインよりも優れた脂質合成阻害効果があることが分かる。したがって、脂質合成が抑制されることによって、皮脂が減少し、にきび発生を抑制することができる。

〔試験例１７〕にきび改善と皮脂分泌減少及び刺激有無の試験
にきびを保有している３０人を１０人ずつ３つの群に分けてそれぞれの群に該当する被験者に上記剤形例３及び比較剤形例３〜４で製造された化粧料組成物を１ヶ月間使用するようにした。にきび改善尺度は、１点から５点までであり、１点では、‘改善しない’、３点は‘普通である’、５点は‘非常に改善する’で表記するようにした。実験結果は、下記の表２２に１０人の平均点数で表記した。
にきび消滅時期は、消滅が確認された日数を基準とし、にきび再発は、有無で１ヶ月後の結果を基準とした。皮脂分泌減少は、１点から５点までであり、１点では‘減少しない’、３点は‘普通である’、５点は‘非常に減少する’で表記するようにした。実験結果は、下記表２２に１０人の平均点数で表記した。皮膚刺激の有無は、（刺激反応を示した人数）／（総試験者の数）から確認した。

上記表２２に示されたように、剤形例３は、比較剤形例３に比べてにきびが再発せず、全般的ににきび改善に対して優れた効果があることが分かる。一方、抗菌力標準物質を含有する比較剤形例４の場合、にきび改善効果を示しているが、使用するにあたって皮膚刺激が強くて、長期的に使用するに適していないものと認められるが、本願発明による組成物は、刺激がなくて、長期間の使用にも適当なものと現われた。

〔試験例１８〕炎症改善効果
１．プロスタグランジンの生成抑制効果
抗炎症効果をプロスタグランジンの生成抑制効果で評価した。ジンセノシドＦ２を利用して大食細胞を対象として効果を測定した。まず、マウスの腹腔で採取した大食細胞に最終濃度が５００Ｍになるようにアスピリンを添加し、細胞に残存するシクロオキシゲナーゼ（cyclooxygenase、COX）活性を非可逆的に抑制した。その後、上記懸濁液を９６ウェルの細胞培養管の各ウェルに１００μLを入れ、５%ＣＯ₂と３７℃条件の培養器で２時間培養し、大食細胞を容器の表面に付着させた。次いで、付着した大食細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、これを炎症改善効果試験に使用した。上記培養された大食細胞５×１０⁴細胞／mLにＬＰＳを１%（w/v）で含有するＲＰＭＩ培地を添加し、１２時間培養した後、プロスタグランジンの生成を誘発し、ジンセノシドＦ２を１００μL処理し、遊離されたプロスタグランジンを酵素免疫分析法（ELISA）を利用して定量した。
この際、ジンセノシドＦ２のプロスタグランジンの生成抑制活性は、ＬＰＳを処理した群と処理しない群でそれぞれ生成したプロスタグランジンの差を１００%に設定し、ＬＰＳと試料を一緒に処理し、減少したプロスタグランジンの百分率により対照群と比較、判定した。その結果（プロスタグランジンの生成抑制効果）を表２３に示す。

上記表２３から明らかなように、ジンセノシドＦ２を処理した場合にも、アスピリン処理の場合に匹敵するプロスタグランジンの生成抑制効果が非常に高いことが分かった。
これにより、本発明のジンセノシドＦ２は、優れた炎症改善効果を提供することができることが分かる。
また、ジンセノシドＦ２は、皮膚炎症因子であるプロスタグランジンの発現を抑制し、皮膚トラブルを防止し、改善させることができることが分かる。

２．ＩＬ−８生成抑制効果
実験１日前に、皮膚角化上皮細胞（Normal human skin keratinocyte、ＮＨＥＫ、入手先：Lonza）を９６ウェル（well）プレートに５×１０⁴細胞／ウェルになるように分株した後、３７℃、５%ＣＯ₂インキュベーター（incubator）で２４時間培養した。２４時間後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、無血清ＫＢＭ（serum free keratinocyte basement media）に交替した。それぞれのウェルにジンセノシドＦ２を下記表２４の濃度別に処理して３０分間反応させた後、ＰＧＳＡ（10μg/mL）、ＰＧＳＡ（50μg/mL）、ＰＧＳＡ（50μg/mL）＋ＬＰＳ（１μg/mL）をそれぞれ処理した。ここで、ＰＧＳＡ（peptidoglycan from S.aureus）は、葡萄状球菌から抽出したペプチドグリカン（peptidoglycan）であって、グラム陽性（＋）菌の細胞壁の主要構成成分であり、バクテリアの細胞膜成分は、炎症を誘発させるものと知られており、特に葡萄状球菌の場合、アトピー患者の９０%程度がこの菌による２次感染を起こすものと報告されている。ＬＰＳ（lypopolysaccaride）は、グラム陰性（−）バクテリア菌の細胞膜主要構成成分であり、炎症誘発の主原因として知られている。
２４時間３７℃、５%ＣＯ₂インキュベーターで培養した後、培養液を取って、インターロイキン−８（Interleukin-8、IL-8）に対するＥＬＩＳＡを進行し、その結果を下記表２４に示した。ＥＬＩＳＡは、製造会社（BD science）の実験方法を利用した。

上記表２４から明らかなように、ジンセノシドＦ２はＰＧＳＡとＬＰＳによって増加したＩＬ−８の分泌量を顕著に減少及び抑制することが確認された。したがって、本発明の皮膚外用剤組成物は、ＰＧＳＡとＬＰＳによって増加したＩＬ−８の分泌を顕著に減少させることによって、優れた抗炎症効果を提供することができることが分かる。

〔試験例１９〕かゆみ緩和評価
実験１日前に角質形成細胞（細胞株名：HaCaT、入手先：ATCC）を９６ウェル（well）プレートに４×１０⁴細胞／ウェルになるように分株した後、３７℃、５% ＣＯ₂インキュベーター（incubator）で２４時間培養した。２４時間後、ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt solution）バッファーで９６ウェルプレートを２回ウォシング（washing）した後、反応バッファー（2μM Fluo-4-AM、20% pluronic acid、2.5mM probenecid）を細胞に入れた。３７℃、５% ＣＯ₂インキュベーターで３０分、常温で３０分間反応させた後、ＨＢＳＳバッファーで２回ウォシングし、下記表２５のような濃度（%）のジンセノシドＦ２で細胞を処理した。

１０分間反応させた後、２U/mLトリプシン（Trypsin）または５μM ＰＡＲ−２活性ペプチド（SLIGKV）を処理し、８０秒間細胞内Ｃa²⁺濃度変化を測定した。細胞内Ｃa²⁺濃度変化測定は、フレックスステーション３（FlexStation 3：Molecular Device、USA）を利用した。ジンセノシドＦ２と２U/mLトリプシン（Trypsin）または５μM ＰＡＲ−２活性ペプチド（SLIGKV）処理後、８０秒間のフレックス（flex）を測定して得た値の最小値と最大値の差を求めた後、その値を２U/mLトリプシンまたは５μM ＰＡＲ−２活性ペプチド（SLIGKV）処理時の最小値と最大値の差と比較し、カルシウムイオンの細胞内流入に対する抑制率（%）を下記表２５に示した。

上記表２５から明らかなように、トリプシンまたはＰＡＲ−２活性ペプチド（SLIGKV）による細胞内カルシウムイオンの流入がジンセノシドＦ２の処理によって減少し、ジンセノシドＦ２の濃度を高めることによって、細胞内カルシウムイオンの流入が顕著に減少することを確認することができた。
したがって、本発明のジンセノシドＦ２を含有する皮膚外用剤組成物は、痒さを誘発させるＰＡＲ−２活性を効果的に抑制することによって、優れた抗掻痒効果を提供することができる。

〔剤形例４及び比較剤形例５〕
下記表２６の組成でシャンプーを製造した。具体的に、界面活性剤とエチレングリコールジステアレートを精製水に添加し、８０℃になるまで加熱して均一に溶解させた後、攪拌の下に４０℃まで徐々に冷却し、上記混合物に本発明による有効成分と防腐剤、粘度調節剤、香料、毛髪コンディショニング剤を投入して混合した後、攪拌の下に室温まで冷却させて製造した。

〔試験例２０〕抗フケ性評価
上記剤形例４及び比較剤形例５の抗フケ性を測定して比較した。この際、試験菌株としては、フケ菌であるピチロスポルム‐オバーレ（Pityrosporum Ovalae(ATCC12078)）を使用した。
抗菌力測定方法は、皮膚ディスク拡散法を利用した。皮膚ディスク拡散法（skin disc diffusionmethod；SDDM）は、消費者の使用習慣に最も近接した方法であり、人間の皮膚と類似のギニーピッグ（guinea pig）の皮膚を対象として抗菌力を測定する方法である。
具体的には、ギニーピック皮膚（guinea pig skin）をむいた後、７０%エタノールで処理し、均一に広げて乾かした後、一定のサイズに切断した皮膚ディスクを使用した。滅菌処理された皮膚ディスクをシャンプー希釈溶液に３分間浸漬してから、流水で洗浄した。その後、皮膚ディスクを試験菌が接種された固体培地上に載置し後、試験菌を培養した。培養後、菌の増殖が抑制された透明帯（clear zone）のサイズを測定し、相対的な抗菌力を測定した。実験結果値は、３回測定した結果の平均値として表２７に示した。

上記表２７から明らかなように、ジンセノシドＦ２を含有しない比較剤形例５の場合には、フケ菌の減少効果がないが、ジンセノシドＦ２を含有する剤形例４の場合には、効果的にフケ菌を減少させるので、優れた抗フケ効果があることを確認することができる。

〔試験例２１〕フケ減少効果
試験フケが比較的多い１９〜３５歳の男性２４人を選定し、各剤形例４及び比較剤形例５のシャンプーに対して１２人ずつ２つのグループとして１ヶ月間以下の手順で使用後、フケ減少率を測定した。
試験開始前に、通常のシャンプーで洗髪し、洗髪後、２日間累積したフケを採集した。各剤形例４及び比較剤形例５のシャンプーを使用して、１ヶ月間、２日に１回ずつ洗髪し、試験終了後、２日間累積したフケを採集し、試験開始前と試験終了後のフケ重量を比較評価した。この際、累積したフケは、真空吸入装置により頭皮から直接採集し、下記数式７に基づいてフケ減少率を求めた。結果を表２８に示す。

前述した表２８から明らかなように、ジンセノシドＦ２を含有する剤形例４の場合は、優れたフケ防止効果を示すことが判明した。

〔試験例２２〕頭皮かゆみ症防止効果試験
比較的頭皮痒さをひどく感じる２５歳〜４５歳の男女２４人を選定し、１２人ずつ２つのグループに分けて各剤形例４及び比較剤形例５のシャンプーを３日に１回ずつ２週間使用するようにした後、頭皮かゆみ防止効果を下記評価基準を用いて評価し、その結果を下記表２９に示した。
〔評価基準〕
非常に優秀−５点
優秀−４点
普通−３点
不良−２点
非常に不良−１点

前述した表２９から明らかなように、ジンセノシドＦ２を含有する剤形例４の場合が頭皮かゆみ症を防止するのにさらに優れた効果を示すことが分かる。

〔試験例２３〕毛包毛乳頭細胞増殖効果
毛髪を構成するケラチンタンパク質は、毛根部ケラチン形成細胞（keratinocyte）で生成され、このケラチン形成細胞は、毛乳頭細胞から分化される。本組成物による毛乳頭細胞の活性を評価するために、本発明では、ＤＰ６（rat immortalized dermal papilla cell）細胞株を使用した（Wendy Filsell、Journal of Cell Science 107、1761-1772(1994)）。この毛乳頭細胞株は、雄性ＰＶＧラットひげの毛根から顕微解剖（microdissection）方法で分離して培養した細胞株であり、１０%ＦＢＳ（Fetal bovine serum）が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium、Gibco BRL、Gaithersburg、MD、USA）で５%ＣＯ₂、３７℃が維持されるインキュベーターで２４時間培養した。ＤＰ６を９６ウェルプレートに入れ、２４時間３７℃インキュベーターで培養した後、このジンセノシドＦ２をそれぞれ５ppm、１０ppm及び２０ppmの濃度で処理した。薬物処理２４時間経過後に、ＷＳＴ−１キット（Roche）を使用して細胞増殖能を測定した。結果は、下記表３０に示した。

上記表３０から明らかなように、ジンセノシドＦ２を処理した場合、無処理対照群に比べて毛乳頭細胞の増殖能が増大した。これは、濃度依存的に有意的に増加することを確認することができる。

〔試験例２４〕カリウムイオンチャネル活性増加効果評価
脱毛治療剤であるミノキシジルは、潜在的なミトコンドリアカリウムイオンチャネルオープナー（Ｋ_ATP channel opener）として知られており、アンドロゲン性脱毛の治療に使用される代表的な薬物である。このようなミノキシジルの機作を評価するために、頭皮の真皮を構成する線維芽細胞でＫ_ATPチャネルを阻止するトルブタミド（SIGMA ALDRICH、T0891）を処理し、細胞増殖を抑制し、さらにカリウムイオンチャネルを開いて細胞増殖が回復される試験法を使用した。
本組成物のＫ_ATPチャネルオープナーとしての機能を評価するために、本発明では、線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３（Mouse embryonic fibroblast cell line）細胞株を使用した。本細胞株は、ＮＩＨスイスマウス胚芽（Swiss mouse embryo）から分離した線維芽細胞株を３Ｔ３プロトコルで自然不滅化させた細胞株である。上記細胞株は、１０%ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ（Gibco BRL、Gaithersburg、MD、USA）で５%ＣＯ₂、３７℃が維持されるインキュベーターで２４時間培養した。ＮＩＨ３Ｔ３を９６ウェルプレートに入れ、２４時間３７℃インキュベーターで培養した後、２．５mMトルブタミドを処理し、１０分後に陽性対照群であるミノキシジル１０μMとジンセノシドＦ２をそれぞれ２．５ppm、５ppm及び１０ppmの濃度で処理し、薬物処理４８時間経過後に、ＷＳＴ−１キット（Roche）を使用して細胞増殖能を測定した。結果を表３１に示す。

上記表３１から明らかなように、ジンセノシドＦ２を処理した場合、線維芽細胞の増殖が回復し、処理したジンセノシドＦ２の濃度増加に依存して細胞増殖能も増加することが分かった。ジンセノシドＦ２を１０ppmで処理した場合には、ミノキシジル処理に匹敵する細胞増殖能が回復することを確認することができる。

〔剤形例５及び比較剤形例６〕
表３２の成分配合比（単位：重量%）で通常的な方法でクリーム基材の組成物を製造した。

〔試験例２５〕ジンセノシドＦ２の発毛効果
ＩＣＲマウスの背中の毛を除毛器で除毛した後、除毛クリーム（ヴィートクリーム）を使用して毛を完全に除去した。対照群（normal群）を除いた他の２つの群に対して１%ＤＮＣＢで２００μLずつ皮膚に１日１回塗布し、皮膚炎症を３日間誘発させた。３日後から対照群を除いた群に対して上記剤形例５及び比較剤形例６のクリーム基材を１日１回塗布し、各群の発毛程度を観察した。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、１５日間の観察で、対照群は除毛された部分で発毛現象が認められなかった。ジンセノシドＦ２を含有しないクリーム基材のみを適用した群では微々たる発毛効果を示した。一方、ジンセノシドＦ２を含むクリームを適用した群では、除毛された部分全体で顕著な発毛効果を示すことを確認することができる。

〔試験例２６〕ジンセノシドＦ２の養毛効果
上記試験例２５の方法で背中の毛を除毛したマウスにジニトロクロロベンゼン（dinitrochlorobenzene、DNCB）を適用し、皮膚炎症を誘発させて皮膚内ストレス条件を与えて、毛の生長を著しく低下させた。本発明の組成物における毛髪再生効能を評価するために、ジンセノシドＦ２を含む上記剤形例５及び比較剤形例６のクリームをマウスに適用し、各適用日数時に発毛した毛の長さを測定し、対照群と比較した。結果を表３３に示す。

上記表３３から明らかなように、剤形例５のクリーム基材を適用した群の毛の長さは、比較剤形例６のクリーム基材を適用した群に比べて統計的に有意な差（ｐ＜０．０１）を示し、適用日数の経過にともなって毛の長さが増加し、１２日目には約１．１cm程度まで成長した。剤形例５のクリーム基材を適用した群は、ジンセノシドＦ２を含有しない比較剤形例６のクリーム基材を適用した群に比べて、発毛した毛の長さがさらに長くなったことを確認することができる。
これは、ジンセノシドＦ２が皮膚ストレスの下に形成された毛髪再生抑制条件の下でも毛髪再生を促進したものと判断され、これにより、ジンセノシドＦ２は、ストレスの下で脱毛された毛髪に対する再生機能があることが分かる。

〔試験例２７〕ジンセノシドＦ２のメラニン生成促進効果試験
ＲＰＭＩ培地に５%の牛胎児血清、１００ＩＵのペニシリンＧ及び０．２μMのＴＰＡを添加した培地にメラニン細胞（melan-a）を２４ウェルプレート（24-well microtiter plate）に５０，０００細胞／ウェルになるように分株した。翌日、分株された細胞に試験物質としてジンセノシドＦ２を最終濃度１０ppmまたは５０ppmで処理し、陰性対照群としては０．１%ＤＭＳＯを、陽性対照群としては１００μM ＩＢＭＸを処理した後、３７℃で３日間培養した。培養後、ＰＢＳでウェルを洗浄し、1N ＮaＯＨを１００μLずつ入れた後、細胞内のメラニンを溶解させた。溶解されたメラニンの吸光度を平板培養測定器（microplate reader）を利用して４０５nmで測定した。ジンセノシドＦ２のメラニン生成促進効果を対照群と比較した結果を表３４に示す。

上記表３４から明らかなように、ジンセノシドＦ２がメラノサイトのメラニン合成を促進させて、メラニン生成が増加し、優れたメラニン生成促進効果を示すことが分かる。

〔試験例２８〕ジンセノシドＦ２のメラノサイトでのＭＩＴＦ及びチロシナーゼ（tyrosinase）発現促進効果
５０１ｍｅｌ細胞株を利用して６ウェルプレート（6-well microtiter plate）に５００，０００細胞／ウェルになるように分株し、各ウェルに陰性対照群としてはＤＭＳＯ０．１%、陽性対照群としてはＩＢＭＸ１００μM、そして試験群としてはジンセノシドＦ２を１０ppmで処理し、３７℃で２４時間、４８時間、７２時間培養した後、タンパク質を得た。このように得たタンパク質に対してＭＩＴＦ及びチロシナーゼ抗体を利用してウェスタンブロットを行った。タンパク質抽出とウェスタンブロットは、通常、当業者が使用する標準方法で行った。ウェスタンブロット後、その結果を陰性対照群を１００にしてこの値と比較し、表３５に示す。

上記表３５から明らかなように、ジンセノシドＦ２は、メラノサイトでＭＩＴＦとチロシナーゼタンパク質の発現を上昇させることを確認することができる。

〔試験例２９〕白毛発生が促進された白斑症マウスを利用した生体内ジンセノシドＦ２の白毛防止及び黒毛誘発効能評価
白斑症マウス（C57bl/6-Mitf^mi-vit）は、米国のThe Jackson Labで購入して使用した。上記白毛発生が促進されたマウスを利用した白毛防止物質効果実験方法は、下記の通りである。１２週齢のマウスの背中の毛を脱毛（depilation）で除去した。但し、毛を除去する部位の広さは、個体ごとに同一となるように調節した。毛を抜いた翌日から１日に２回ずつ白毛防止物質を、毛を抜いた部位に塗布した。白毛防止物質の運搬体（vehicle）としては、ＥｔＯＨ：１、３−ＢＧ：ＤＷ＝３：２：５（体積比）の混合物を使用し、上記運搬体を陰性対照群として、これにＩＢＭＸ５０mMを添加した液を陽性対照群として、そしてジンセノシドＦ２を２．５%添加した液を試験群として使用した。約３週が経過した後、各物質間の白毛防止効能差が目視で識別されれば、新たに育った毛を収集し、毛髪内のメラニン量を測定した。毛髪内のメラニン量は、タンパク質加水分解酵素であるエスペラゼ（Esperase、Novozyme）を利用して測定した。バッファー（５０mM Tris-HCl、５mM DTT、ｐＨ９．３）にエスペラゼを１ＮＰＵ／mLの濃度になるようにとかして反応バッファーを製造した。反応バッファー１mLにマウス毛髪５ｍｇを入れ、３７℃で１，０００rpmの速度で攪拌しながら１３時間反応させた後、瞬間的な遠心分離により毛髪と反応液を分離した。このように得られた反応液を９６ウェルプレートに収納し、４０５nm波長で吸光度を測定すれば、反応液内のメラニン量を測定することができる。白毛発生が促進された白斑症マウスモデルに陰性対照群、陽性対照群、試験群物質を処理した場合、その効能を目視観察及び毛髪内のメラニン定量方法で測定した結果を下記表３６に示した。

上記表３６から明らかなように、ジンセノシドＦ２は、白斑症マウス生体内で白毛を抑制し、毛髪内のメラニン量を増加させて、黒毛誘発を促進させることができることが分かる。

〔試験例３０〕ジンセノシドＦ２の抗菌力評価
ジンセノシドＦ２の抗菌力を評価するために抗菌実験を実施した。具体的な実験方法は、次の通りである。
実験に使用したスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）菌株は、トリプチックソイブロス（Tryptic Soy Broth）で、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスぺルギルスニガー（Aspergillus niger）菌株は、サブローデキストロースブロス（Sabouraud Dextrose Broth）で培養した。培養液を各培地に１／１００（カンジダ・アルビカンス菌株は１／１０）希釈した希釈液を試験菌液として使用した。アスぺルギルスニガーは、２×１０⁸cfu/mLになるように製造した胞子懸濁液を試験菌液として使用した。
各培地１５mLに上記試験菌液を０．１５mL添加し、よく混合したものを希釈溶液として使用した。
９６ディップウェルプレート（96 well plate）１番の行に試料を１６μLずつ入れ、希釈溶液を１８４μLずつ入れた。残りのウェルには、希釈溶液１００μLずつ入れた。１番の行の混合液をよく混ぜた後、１００μLを取って２番の行に入れ、よく混ぜた後、さらに１００μLを取って３番の行に入れる方式で２倍ずつ希釈させた。
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）は、３２℃恒温槽で、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスぺルギルスニガー（Aspergillus niger）は２５℃恒温槽で培養した。
４８時間後、菌増殖の可否を懸濁度と顕微鏡で確認し、最小阻害濃度（ＭＩＣ）値を決定した。結果を表３７に示す。

上記表３７から明らかなように、ジンセノシドＦ２は、多様な菌株に対して抗菌力を示すことを確認することができ、これにより、ジンセノシドＦ２は、組成物内で天然防腐剤、または抗菌剤として作用することができることを予測することができる。

Claims

下記化学式１で表現されるジンセノシドＦ２を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物であって、該組成物は、美白用、保湿用、にきび改善用、脂質生成抑制用、毛穴収縮用、皮脂調節用、フケ防止用、育毛用、及び白毛防止用からなる群から選ばれた少なくとも１つの用途を有することを特徴とする、皮膚外用剤組成物。
下記化学式１で表現されるジンセノシドＦ２を天然防腐剤として含有することを特徴とする、皮膚外用剤組成物。
上記ジンセノシドＦ２は、
ａ）苗参を出庫後、１５℃の貯蔵温室に移して１〜２日保管した後、仮植を行う順化１段階と；
ｂ）仮植された上記苗参を温室で１〜２日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化２段階と；
ｃ）ＮＯ _３、ＮＨ _４、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、ＰＯ _４、及びＳＯ _４イオンを含有する養液を調剤する段階と；
ｄ）上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と；
ｅ）前記混合培地に定植する順化２段階終了後３０日〜１２０日後に収穫する段階と；
を含む水耕栽培方法で生産される朝鮮人参の葉から抽出及び分離されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚外用剤組成物。
前記養液は、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ、Ｂ、Ｃｕ、Ｍｏ、及びＺｎをさらに含有することを特徴とする、請求項３に記載の皮膚外用剤組成物。
上記ジンセノシドＦ２は、組成物全体重量に対して０．００１〜５０重量%の量で含有されることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚外用剤組成物。
上記抽出は、エタノールと水との混合溶媒を用いて行うことを特徴とする、請求項３に記載の皮膚外用剤組成物。
上記混合溶媒は、８０％エタノールであることを特徴とする、請求項６に記載の皮膚外用剤組成物。
ａ）苗参を出庫後、１５℃の貯蔵温室に移して１〜２日保管した後、仮植を行う順化１段階と；
ｂ）仮植された上記苗参を温室で１〜２日保管し、上記温室の環境に適応させた後、上記苗参を排水溝付きのベッドの内部に形成された混合培地に定植する順化２段階と；
ｃ）ＮＯ _３、ＮＨ _４、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、ＰＯ _４、及びＳＯ _４イオンを含有する養液を調剤する段階と；
ｄ）上記養液の適正量を上記苗参に供給する段階と；
ｅ）前記混合培地に定植する順化２段階終了後３０日〜１２０日後に収穫する段階と；
を含む水耕栽培方法で苗参を栽培し、生産される朝鮮人参の葉のジンセノシドＦ２の含有量を増大させた後、抽出及び分離してジンセノシドＦ２を得ることを特徴とする、ジンセノシドＦ２の製造方法。
上記養液は、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ、Ｂ、Ｃｕ、Ｍｏ、及びＺｎをさらに含有する、請求項８に記載のジンセノシドＦ２の製造方法。
上記抽出は、エタノールと水との混合溶媒を用いて行うことを特徴とする、請求項８に記載のジンセノシドＦ２の製造方法。
上記混合溶媒は、８０％エタノールであることを特徴とする、請求項１０に記載のジンセノシドＦ２の製造方法。