CN103463622A - 姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用，属于生物医学技术领域。本发明采用的姚虻抗血栓多肽vasotab TY，分子量为6133.72，等电点是6.88；本发明的姚虻抗血栓多肽vasotab TY在制备治疗血管舒张、抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、血栓性疾病的药物中的应用。本发明的优点在于：姚虻抗血栓多肽vasotab TY有效的舒张血管，高效的抑制血小板聚集，且不具备溶血活性和细胞毒性，具有很好的抗血栓形成活性，能够用于制备治疗血管舒张、抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、血栓性疾病的药物。

Description

姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用

技术领域：

本发明涉及姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用，属于生物医学技术领域。 

背景技术：

随着经济的发展，人们生活水平的提高，以及不合理的饮食及生活习惯的养成，导致心脑血管等疾病的发病率越来越高。世界卫生组织公布的一项最新报告显示在所有导致人类死亡的疾病中，心脑血管疾病排名首位。在我国，约每十秒钟就有一人死于心脑血管疾病。内皮功能损伤及血栓形成是心脑血管疾病发生及发展的最主要特征，内皮通过释放一些作用于血管的活性物质如：一氧化氮、前列腺环素、缓激肽、内皮缩血管肽等来维持血管收缩与舒张、抗血栓形成与促血栓形成、抗炎症与促炎症等之间的平衡。这种内皮保持的平衡一旦被打破，就会导致心脑血管疾病的发生，因此，一个具有血管舒张和抗血栓形成活性的药物将是治疗此类疾病的理想药物。目前，临床上使用的此类药物主要有前列腺环素、阿司匹林、环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂等。但这些药物在使用过程中都会导致诸如低血压、出血、头痛、面部潮红、胸腔积液等副作用。因此，亟待开发新型的更安全的抗血栓药物。 

虻科昆虫俗称牛虻，属于吸血节肢动物，为保证其吸血，牛虻在吸血的过程中会释放促进血管舒张、抗血小板聚集、抗免疫反应、抗血栓等活性物质。这些活性物质存在显著的生化和药理学多样性，具有很好的开发新型药物，尤其是治疗血栓性疾病药物的前景。 

本发明研究的姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用，经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。 

发明内容：

本发明的目的在于提供姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用。 

本发明的姚虻抗血栓多肽vasotab TY采用基因工程手段，通过大肠杆菌表达体系获得。其中，编码姚虻抗血栓多肽vasotab TY的基因由231个核苷酸组 成，自5’端至3’端序列为： 

atgaaattca ccctgttcag tgttttagtt gttctgttga ttgcaacatt tgttgctgct       60 

gatgattgcc cacgtatttg cacagctgac tttagaccgg tatgtggcac tccttccggc      120 

ggtcgccgaa gcgcgaacag gacttttgga aatcaatgca gcctcgactc acacaactgc      180 

ttgaacaagg gagatactta cgacaaactg catgatggcg agtgcaagta a               231 

编码姚虻抗血栓多肽vasotab TY的为该基因的第71－228位核苷酸，其氨基酸序列为： 

Asp Asp Cys Pro Arg Ile Cys Thr Ala Asp Phe Arg Pro Val Cys Gly 

1               5                   10                  15 

Thr Pro Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Asn Arg Thr Phe Gly Asn Gln 

            20                  25                  30 

Cys Ser Leu Asp Ser His Asn Cys Leu Asn Lys Gly Asp Thr Tyr Asp 

        35                  40                  45 

Lys Leu His Asp Gly Glu Cys Lys 

    50                  55 

姚虻抗血栓多肽vasotab TY的分子量为6133.72，等电点是6.88。 

本发明的优点在于： 

1、姚虻抗血栓肽vasotab TY在0.2μg/ml浓度时能有效的舒张去氧肾上腺素诱导收缩的大鼠股动脉。 

2、在抑制血小板聚集方面，vasotab TY在9.6μg/ml的浓度时能完全抑制血小板的聚集。 

3、在体内，浓度为5、10、和20nmol/kg的vasotab TY能分别抑制47.2、72.2和86.1%的角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓。在大鼠动静脉旁路血栓形成实验中，20nmol/kg的vasotab TY能使对照组重量为7±0.6mg的血栓减少至4.6±0.3mg。 

4、在实验过程中，姚虻抗血栓肽vasotab TY无细胞毒和溶血毒性，也没有出血副作用。 

5、姚虻抗血栓肽vasotab TY能有效安全的用于制备治疗血管舒张、抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、血栓性疾病的药物。 

附图说明：

图1表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY对由去氧肾上腺素诱导收缩的大鼠股动脉的舒张作用。 

图2表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY对人血小板聚集的抑制作用，其中血小板聚集用2mmol/L的ADP作为诱导剂。 

图3A，3B分别表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY在大鼠动静脉旁路模型实验中的抗血栓形成作用和在角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓实验中的抗血栓形成作用。 

图4A，4B分别表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY对人角质形成细胞HaCaT和人单核细胞THP-1的细胞毒作用；图4C表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY的溶血风险评估；图4D表示姚虻抗血栓多肽vasotab TY的出血风险评估。 

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。 

实施例一：姚虻抗血栓肽vasotab TY的血管舒张作用 

雄性Wistar大鼠（180-200g）断劲处死后剥离股动脉，剪下10mm长的股动脉放置于克-林二氏重碳酸盐溶液（118mM NaCl,5mM KCl,2.5mM CaCl₂,1.2mMMgSO₄.7H₂O,1.2mM KH₂PO₄,1mM EDTA,1.1mM抗坏血酸,11mM葡萄糖）中，剔除其结缔组织和脂肪，用棉签去除血管内皮，制成2～3mm长的动脉环，悬挂于HV-4血管环灌流系统的血管槽中，并用37℃的克林氏缓冲液注入小浴槽中，用95%O₂＋5%CO₂混合气体进行氧饱和。通过数据线接于BL-420E生物机能实验系统，将血管张力值转换为数据信号。先用正常的克-林二氏缓冲液反复冲洗血管环至张力为2.0g，再加入5μmol/L的去氧肾上腺素获得100%的收缩对照，之后加入测试样品，同时，记录实验数据。 

结果如图1所示，0.2μg/ml的姚虻抗血栓多肽vasotab TY能明显的舒张由去氧肾上腺素诱导收缩的大鼠股动脉。 

实施例二：姚虻抗血栓肽vasotab TY对血小板聚集的抑制作用 

健康人血小板用血浆稀释至2.5×10⁸个/ml。取富血浆血小板300μl，加入适量样品保温5min后，添加2mmol/L的ADP诱导聚集，在血小板聚集仪上绘制5min内的聚集曲线。以没有样品处理过的血小板聚集为对照。 

聚集抑制率（I）的计算： 

I=B/A×100％ 

A=激动剂所能达到的最大聚集（以透光率表示）； 

B=样品作用后加入激动剂所能达到的最大聚集（以透光率表示）。 

如图2所示，姚虻抗血栓多肽vasotab TY以梯度依赖的形式抑制由ADP诱导的血小板的聚集，4.8μg/ml的姚虻抗血栓多肽vasotab TY能抑制约50%的血小板的聚集，9.6μg/ml的姚虻抗血栓多肽vasotab TY能完全抑制血小板的聚集。 

实施例三:姚虻抗血栓多肽vasotab TY在大鼠动静脉旁路模型实验中的抗血栓形成作用 

雄性Wistar大鼠（180-200g，每组9只）腹腔注射氯胺酮（50mg/kg）和赛拉嗪（15mg/kg）麻醉后，剥离颈部皮肤及肌肉，插入一根三叉分流导管（其中两个为10厘米长的聚乙烯管(PE-60)，分别连接动静脉，中间一个为3厘米长的聚乙烯管（PE-160）），其中，一个折叠成两段的粗糙尼龙丝（6厘米长，直径为0.26毫米）放置在中间的聚乙烯管内。剥离股静脉给药15分钟后打开分流器，5分钟后关闭，取下尼龙丝并称重。 

结果如图3A所示，阴性对照生理盐水组血栓的重量为7±0.6mg，当用20和16nmol/kg的姚虻抗血栓多肽vasotab TY给药后，血栓重量分别减少至4.6±0.3和5.4±0.5mg。姚虻抗血栓多肽vasotab TY能以剂量依赖形式减少大鼠动静脉旁路模型实验中血栓的形成。阳性对照依替巴肽组也能相应减少血栓的形成。 

实施例四：姚虻抗血栓多肽vasotab TY在角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓实验中的抗血栓形成作用 

雄性昆明小鼠（18-20g，每组9只），通过尾静脉注入测试样品及对照。给药30分钟后，实验小鼠通过腹腔给40μl溶于生理盐水1%的角叉菜胶，用于诱导血栓的形成。6小时后，通过尾静脉再次给相同剂量的测试样品，48小时后，根 据尾部皮肤颜色变化来判定血栓形成的出现率和平均长度。 

结果如图3B所示，剂量分别为5，10，20nmol/kg的姚虻抗血栓多肽vasotab TY给药后，小鼠尾部血栓的长度明显减短，呈梯度依赖性，且效果也明显好于阳性对照奥扎格雷组。 

实施例五：姚虻抗血栓多肽vasotab TY的细胞毒性测试 

人角质形成细胞HaCaT及人单核细胞THP-1分别在含有10％胎牛血清及双抗（青霉素和链霉素各100U/ml）的DMEM和RPMI1640培养基中培养至对数期，细胞用PBS（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO₄·H₂O1.56g，KH₂PO₄0.20g，加去离子水至1000ml，调PH值至7.2）洗细胞三遍后，用新鲜培养基悬浮细胞（HaCaT用0.25%的胰蛋白酶消化），调整细胞密度至1×10⁶个/ml，以每孔200ul的体积铺96孔板。细胞铺板过夜后加入不同浓度的测试样品，在37℃，5%CO₂条件下共培养24小时，培养结束后，每孔加入20μl5mg/ml MTT溶液（溶于细胞用PBS），继续培养4h，用移液枪吸出孔中液体，每孔加入200μl的DMSO，室温下轻摇10分钟，用酶标仪检测490nm波长的光吸收，对照用生理盐水。 

样品细胞毒性（I）表示 

I=(B-A)/B×100％ 

A=样品组在490nm处的吸光度值； 

B=生理盐水组在490nm处的吸光度值。 

结果如图4A，4B所示，在6.25～200μg/ml的浓度范围内，姚虻抗血栓多肽vasotab TY对人角质形成细胞HaCaT和单核细胞THP-1没有细胞毒性。 

实施例六：姚虻抗血栓多肽vasotab TY的溶血活性测试 

兔心脏采血，将所采集血液与阿氏液（8.0g柠檬酸钠，0.55g柠檬酸，20.5g葡萄糖，4.2g NaCl，加去离子水至1L，调pH至6.1，高压灭菌后4℃保存）按1:1比例混合置于离心管中，1000rpm离心5min，生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止。将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成10⁷-10⁸浓度的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品37℃保温30min，1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水， 阳性对照使用Triton X-100，溶血活性与540nm吸收值成正比。 

样品溶血活性（I）的计算： 

I=(A-NC)/(PC-NC)×100％ 

A=测试样品在540nm的吸光值； 

NC=阴性对照组在540nm波长的吸光度值； 

PC=阳性对照组在540nm波长的吸光度值。 

结果如图4C所示，在5～320μg/ml的浓度范围内，姚虻抗血栓多肽vasotab TY没有溶血活性。 

实施例七：姚虻抗血栓多肽vasotab TY的出血风险评估 

雄性昆明小鼠（18-20g）6只一组，测试样品及对照通过静脉注射给药，给药120分钟后，将小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，用消毒保险刀片切去尾尖约2mm，立即将鼠尾浸入37℃的生理盐水中，以血流停止时间为指标，观察记录断尾出血停止的时间。 

结果如图4D所示，在30μg/kg剂量时，姚虻抗血栓多肽vasotab TY存在很小的出血活性，但是在60和120μg/kg剂量时，却没有出血风险。相反，对照奥扎格雷组有非常明显的出血活性。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院昆明动物研究所

 

<120>  姚虻抗血栓多肽vasotab TY的应用

 

<130>  2013

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  231

<212>  DNA

<213>  Tabanus Yao

 

<400>  1

atgaaattca ccctgttcag tgttttagtt gttctgttga ttgcaacatt tgttgctgct       60

 

gatgattgcc cacgtatttg cacagctgac tttagaccgg tatgtggcac tccttccggc      120

 

ggtcgccgaa gcgcgaacag gacttttgga aatcaatgca gcctcgactc acacaactgc      180

 

ttgaacaagg gagatactta cgacaaactg catgatggcg agtgcaagta a               231

 

 

<210>  2

<211>  56

<212>  PRT

<213>  Tabanus Yao

 

<400>  2

 

Asp Asp Cys Pro Arg Ile Cys Thr Ala Asp Phe Arg Pro Val Cys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Pro Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Asn Arg Thr Phe Gly Asn Gln

            20                  25                  30         

 

 

Cys Ser Leu Asp Ser His Asn Cys Leu Asn Lys Gly Asp Thr Tyr Asp

        35                  40                  45             

 

 

Lys Leu His Asp Gly Glu Cys Lys

    50                  55     

 

 

Claims (1)

1.姚虻抗血栓多肽vasotab TY在制备治疗血管舒张、抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、血栓性疾病的药物中的应用。

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