ES2273574B1

ES2273574B1 - Metodo para la preparacion de sueros o plasmas autologos ricos en factores de crecimiento.

Info

Publication number: ES2273574B1
Application number: ES200501314A
Authority: ES
Inventors: Maria Jesus Vicente Lobera; Armando Giner Soria
Original assignee: Maria Jesus Vicente Lobera; Armando Giner Soria
Current assignee: DRA. VICENTE S.L.
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2005-06-01
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2025-06-01
Also published as: ES2273574A1

Abstract

Método para la preparación de sueros o plasmas autólogos ricos en factores de crecimiento. Tras una extracción de sangre, preferentemente del propio paciente, extremando las condiciones de asepsia, ésta se mezcla con un anticoagulante cuando se pretende obtener plasma, o se deja coagular si se pretende obtener suero, en cualquier caso la sangre se somete a una primera fase de centrifugación corta a 600 g, tras la que se desecha la parte inferior de los tubos que contiene la mayoría de los hematíes. Seguidamente el sobrenadante se somete a una centrifugación a 1000g, tras la que se extrae el plasma más próximo a la interfase con hematíes. Dicho plasma, ya bastante rico en factores de crecimiento se concentra a través de una fase de ultrafiltrado con un Amicon, utilizando un poro distinto según el factor o factores a aislar. El producto resultante se refrigera o se congela en función de que su uso sea inmediato o retardado en el tiempo.

Description

Método para la preparación de sueros o plasmas autólogos ricos en factores de crecimiento.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a nuevo método para la preparación, a partir de la sangre del paciente de un suero o plasmas autólogo, rico en factores de crecimiento tanto de origen plaquetar (gránulos alfa) como de los presentes en la sangre y que pueden ser utilizados para estimular la replicación y/o transcripción del DNA, que a su vez proporciones la formación y regeneración de tejidos sensibles a dichos factores.

Antecedentes de la invención

En la actualidad se conocen mas de cincuenta factores de crecimiento que actúan a través de receptores proteicos específicos y muchas veces en dominios distintos del propio receptor de membrana, provocando la liberación de segundos mensajeros que, solos o unidos a proteínas, son los responsables de los efectos observados.

En este sentido cabe citar la siguiente bibliografía:

-: Habbard. S.R. Structural análisis of Rececptor tyrosine kinases. Prog. Biophys. Mol. Biol. 71-242-258.

-: Robinson, D.R., Wu Y.M. y Lim S.F. 2000. The protein tyrosin family of the human genoma. Ocogene 19:5548-5557.

-: Schlesseinger, J. 2000. Cel signalint by receptor tyrosin kinases: Cell 103:13-15.

-: Carter-Su, C, y Smit, L.S. 1998. Signalin via JACK tyrosin kinases: Growth hormona receptor as a model system. Recent Prog. Horm. Recent Prog. Horm. Re 53:61-82.

-: Riedel, H. Dull, T.J. Honegger, A. M. Schelessinger y col A.1989 Citolplasmic domains determine signal specifity, cellular routing characterisitic and influence ligand binding of epidermal growth lacus and insulin receptors. Embo 5. 8:2943-2954.

-: Baraldi, E., Carugo, K.D. and cols 1999. Structure of the PH domanin from Bruton's tyrosine kinase in complex with Insitol 1, 3, 4, 5 tetrakisphosphate 1999. Structure Fold Des. 7:449-460.

-: Bourne, H.R., Sanders, D. A. and Mc Cormik, F. 1991. The GTP ose superfamily conserved otracture and molecular mechonisun. Nature 349: 117-127.

En otras ocasiones se provocan efectos kinasa-jack que pueden incluso favorecer el estímulo de protooncogenes que intervienen en la reparación de tejidos, tal como se describe en "Penisi, E. 1998 How a growth control paht takes a wrong turn to concern Science, 1998; 281.1438-1445".

Estos factores son bastante inespecíficos en su efecto inicial, siendo las células diana las que aportan sus diferentes efectos.

Existen múltiples publicaciones en las que se muestran los efectos beneficiosos de los factores existentes en los sueros/plasmas autólogos, tanto en lesiones corneales, óseas, cutáneas, musculares o de cirugía bucal. En este sentido cabe citar a su vez la siguiente bibliografía:

-: Scardovi, C. De Felice G. P. Gazzaniga, A. 1993. Epidermd grouth factor in the topical treatmen of traumatic corneal ulcers. Ophthalmologica, 1993; 206;119-124.

-: Nishida, T, Nakamura, M And col. Synergistic effects of resistance P with insuline-Like growth factor-1 an epitelial migration of the cornea J. Cell Physiol. 1996; 169;159-166.

-: Manolagas, S.C., and Jilka. R.L. Bone marrows, cytokines and Bone remodeling: Emerginginsights into the pathophysiology fo osteorporosis. N. England J. Med. 1995; 332; 305-310.

-: Murray, R.K. Metabolismo de los xenobióticos. Bioquímica de Harpez 2001; 893-947.

-: Zavala, L. Aplicaciones de los factores de crecimiento a la cirugía bucal. Prof Dent. 2001 vol 4: 627- 628.

Entre los componentes del suero/plasma autólogo que pueden ser considerados como factores de crecimiento, pueden destacarse los siguientes:

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-: EGF

-: TGB-\beta

-: AFGF

-: BFGF

-: Fibronectina

-: Alfa2 macroglobulina

-: Sustancia P

-: IGF-1

-: PDGF

Existen varios métodos de suero/plasma autólogo rico en factores de crecimiento, que aparecen descritos en la siguiente bibliografía:

-: Tsubota, K Goto E., and cels. Treatment of dry eye by antoligons serum application in Sjagren's syndrome. Br J. Opthalmol. 1999; 830;390-5.

-: Tsubota, K Goto E., and Treatment of persistente epitafial defect by autoligons serum application. Opthalmology, 1999; 106; 198-5.

-: Zimmermann, R. 2001. Different prearation methods to obtain plarelet components as a source fo growth factors for local application Transfusion 2001 41-10;1217-1225.

-: Geerhind. G. Hartwig, D. Autologons serum eye drops for ocular surface disorders. A literature review and recomendations for their application. Ophtalmology 2002;99; 909-959

Sin embargo los resultados dependen mucho del método seguido en su preparación y por tanto de la riqueza de factores, así como de la forma de utilización.

Descripción de la invención

El método que la invención propone resuelta extraordinariamente eficiente tanto en la curación de heridas traumatológicas como la acreción ósea o resolución de úlceras corneales.

De forma mas concreta dicho método consiste en la extracción de sangre del paciente en condiciones adecuadas para evitar la presencia en la misma de sueros lipémicos, a la que se aplica un anticoagulante, si se pretende obtener plasma, o se deja coagular si lo que se pretende obtener es suero.

Simultáneamente se obtiene una muestra de sangre con EDTA tripotásico al objeto de controlar el número de plaquetas basales.

La sangre obtenida se centrífuga en una primera fase corta, del orden de diez minutos, a 600 g, desechando la parte inferior que contiene la mayoría de los hematíes.

A continuación se efectúa una segunda centrifugación a 1000 g, tras la que se extrae el plasma mas próximo a la interfase con hematíes.

Dicho plasma, ya bastante rico en factores de crecimiento, se concentra a través de un filtro con un poro distinto en función de los kilodalton del factor o factores que se quieren aislar.

El producto resultante es un pellet que puede conservarse refrigerado para su uso inmediato o congelado a una temperatura de - 20 o - 70°C, según el periodo de tiempo que se desee conservar.

Ejemplo de realización práctica de la invención

Tras mantenerse el paciente en ayunas durante un periodo de 10 horas para evitar sueros lipémicos, se realiza una extracción de sangre del mismo, extremando las condiciones de asepsia y calidad del pinchazo para evitar hemólisis interferentes.

La cantidad de sangre extraída variará según las necesidades del paciente y su estado hemodinámico. Una porción de sangre se mezcla con un anticoagulante estándar, como por ejemplo citrato sódico, si lo que se pretende obtener es plasma, o bien se deja coagular si lo que se quiere obtener es suero. En el presente ejemplo práctico lo que se pretende utilizar es plasma, por lo que la sangre se mezcla con el citado anticoagulante.

De manera simultánea se adquiere una mezcla de sangre con EDTA tripotásico, al objeto de controlar en número de plaquetas basales, como anteriormente se ha dicho.

La sangre citratada se reparte en una pluralidad de tubos FALCON y se centrífuga en una primera fase corta a 600 g, desechando la parte inferior que contiene la mayoría de los hematíes.

Todo el sobrante, en su mayoría plasma, se somete a una centrifugación a 1000 g.

Tras la misma se extrae el plasma mas próximo a la interfase con hematíes con sumo cuidado. Dicho plasma, ya bastante rico en factores de crecimiento, se concentra a través de un Amicon-4-Centrifugal Filter Device con un poro distinto según los kilodalton del factor o factores que se quieren aislar.

El pellet resultante, denominado factor "G", se refrigera o se congela según su uso sea inmediato o a medio o largo plazo.

Nunca deben aplicarse estos productos de una persona a otra, para evitar contaminaciones no deseadas, ya que habitualmente en la preparación de éstos factores no se exploran VIH, hepatitis, etc. Por otra parte aunque los factores de crecimiento no actúan sobre las células procariotas, debe cuidarse siempre trabajar en las mejores condiciones de asepsia.

Desde el punto de vista de utilización, en preparados para su utilización oftálmica, debe utilizarse el factor "G" diluido con suero fisiológico en una proporción consensuada con el oftalmólogo y según la situación del paciente (ambulatorio o en cama), y sobre todo según el tipo de lesión y su amplitud. Los resultados son muy eficaces cuando la preparación es correcta.

Como regenerador de tejido óseo puede utilizarse el pellet bien directo, o diluido, ya sea con el ultrafiltrado del Amicon o con suero fisiológico, a su vez mezclado con sales alcalinotérreas en proporción adecuada, para obtener una masilla moldeable que se puede introducir en las cavidades óseas correspondientes. Su utilización será consensuada con el clínico y será distinta ya se trate de una fractura o de un alveolo dental como preparación al implante.

Por último, en heridas abiertas con pérdida de piel o lesiones cutáneas, puede utilizarse según las necesidades médicas el plasma rico en factores sin concentrar con el Amicon o el pellete en directo o diluido. Para cada caso debe consensuarse el criterio médico para proceder a su preparación y sobretodo a la forma de administración.

Claims

1. Método para la preparación de sueros o plasmas autólogos ricos en factores de crecimiento, caracterizado porque en el mismo se establecen las siguientes fases operativas:

-: Extracción de sangre del paciente en condiciones adecuadas para evitar sueros lipémicos.

-: Coagulación de la sangre si lo que se pretende obtener es suero, o mezcla de la misma con un anticoagulante si lo que se pretende obtener es plasma.

-: Centrifugación de la sangre en una primera fase corta a 600 g, desechando la parte inferior que contiene la mayoría de los hematíes.

-: Centrifugación del sobrenadante, en su mayoría plasma, en una segunda fase a 1000 g.

-: Extracción del plasma más próximo a la interfase con hematíes.

-: Concentración a través de una fase de ultrafiltrado, con distinto poro en función del factor o los factores que se desean aislar.

-: Refrigeración del pellet resultante, o congelación del mismo a - 20 o - 70°C en función de que se prevea para el mismo un uso inmediato o un uso a medio o largo plazo.

2. Método para la preparación de sueros o plasmas autólogos ricos en factores de crecimiento, según reivindicación 1ª, caracterizado porque el citado pellet resultante se diluye con suero fisiológico para su utilización oftálmica.

3. Método para la preparación de sueros o plasmas autólogos ricos en factores de crecimiento, según reivindicación 1ª, caracterizado porque el pellet resultante se mezcla con sales alcalinotérreas en proporción adecuada para obtener una masilla moldeable que se puede introducir en las cavidades óseas, en su utilización como regeneración de tejido óseo.