KR20060015525A - 혈관형성을 촉진하는 사슴뿔 추출액 - Google Patents

Abstract

10 kDa 이하의 분자량을 보유하고 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 성분을 함유하는 녹용의 분리된 추출액.

녹용의 분리된 추출액

Description

혈관형성을 촉진하는 사슴뿔 추출액{DEER ANTLER EXTRACT FOR PROMOTING ANGIOGENESIS}

본 발명은 사슴뿔(deer antler) 추출액에 관한다. 특히, 본 발명은 녹용으로부터 수득된 혈관형성 추출액 및 인간과 동물 의학 분야에서 상처, 손상, 질병의 치료에 사용되는 상기 추출액을 함유하는 조성물에 관한다.

치료하기 어려운 상처, 특히, 지속적인 상처는 상처 부위에 영양을 공급하고 회복 과정을 매개하며 흉터 형성을 최소화시킬 수 있는 혈액 공급을 필요로 한다. 일반적으로, 지속적인 상처를 치료하는데 가장 일반적으로 이용되는 치료법은 상처 부위에 혈액이 자체적으로 공급되도록 보조하지 않기 때문에, 치료 과정이 느리다.

만성적인 상처의 치료를 위한 다양한 치료법이 존재하긴 하지만, 압박 붕대의 이용이 여전히 일반적인 치료법으로 생각된다(Marshall et al.,2001). 다른 치료법이 이용가능하며, 산소 분압(oxygen tension)의 조절을 수반하는 기전을 통하여 작동하고 고압 산소(hyperbaric oxygen) 치료를 원조하는 일부 자연 치료법이 제안되었다(Sen et al., 2002).

혈관형성(조직의 맥관화 과정)의 증가에 의한 상처의 치료는 일부 제안된 치료법에서 명백하다. 최근의 한 연구에서, 아데노신은 아데노신 A(2A) 수용체 항진 제로서 작용함으로써 상처의 치료 속도를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Montesinos et al.,2002). 이는 치료된 상처 부위에서 미세 혈관의 수를 증가시켰다. 증가된 혈관형성은 본원에서 예증된 향상된 치료의 가능 기초 기전이다.

널리 공지된 고전적인 혈관형성 성장 인자인 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 국소의 지속적인 전달을 담보하기 위하여 유전자 요법으로 전달되는 경우에, 혈관형성 및 강화된 상처 치유를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Deodato et al., 2002). Malinda 등(1998)은 티모신(Thymosin) α1이 내피 세포 이동, 혈관형성, 상처 치유를 촉진한다는 것을 발견하였는데, 이런 사실은 잠재적 상처 치유제로서 이의 효능을 확증한다.

사슴뿔은 매년 뿔갈이되고 재생된다. 사슴뿔은 성장기 동안 매일 2 ㎝씩 성장하는데, 이런 단계의 사슴뿔을 ‘녹용’이라 한다. 성장은 사슴뿔 정점의 중배엽 조직에서 발견되는 줄기 세포의 개체군에 의해 유도된다(Li et al.,2002). 녹용은 고도로 맥관화되는데, 뿔 내에서 혈관은 뿔 성장을 뒷받침하기 위하여 뿔과 동일한 속도로 성장한다. 본 발명에서는 상기 시스템이 상처 치유 과정을 뒷받침하는 혈관형성 인자의 잠재적 공급원임을 확인하였다.

한 논문에서는 발생모체(blastema)라고 불리는 치료 또는 재생 육경(pedicle)이 혈관형성 잠재력을 보유한다고 암시하였다(Auerbach et al.,1976). 상기 논문에서 저자는 일부 조직이 혈관형성 잠재력을 보유한다는 것을 입증하기 위하여, 사슴뿔 발생모체를 비롯한 다양한 조직을 스크리닝하였다. 하지만, 상기 논문에서는 실제 혈관형성 또는 상처 치유 활성을 보여주는 데이터를 전혀 제시하지 않았다. 치유 조직이라고 하는 발생모체는 사슴뿔이 뿔갈이될 때 나타나고, 본 발명자들이 연구하고 본 명세서에 개설된 더욱 성숙한 성장 사슴뿔과는 구별된다.

혈관형성 효과와 관련하여 성장 녹용을 조사한 논문은 보고된 바가 없다. 본 발명자들은 성장 녹용의 전체 단백질 추출액이 혈관형성 인자를 함유한다는 것을 확인하였다.

본 명세서에 개설된 연구 결과는 이들 혈관형성 인자를 함유하는 녹용의 추출액이 사슴뿔 전체에서 추출되며, 성장 사슴뿔 정점 내에 농축되어 있지 않다는 것을 보여준다.

본 발명자들은 혈관형성 효과를 보유하고 상처를 치료하는데 이용될 수 있는 녹용으로부터 추출되는 분리된 펩티드 추출액의 조성물을 제조하였다.

본 발명자들은 녹용을 분획하여 혈관형성 잠재력을 평가하였다. 분획 과정의 일부로서, 본 발명자들은 녹용의 저분자량과 고분자량 분획물을 조사하였는데, 놀랍게도 저분자량 분획물이 우수한 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 이는 소형 분자가 상처 내에서 안정하고 쉽게 분해되지 않을 가능성이 더욱 높다는 점에서, 고무적인 결과이다.

분자량에 기초하여, 대부분의 고전적인 혈관형성 성장 인자는 고분자량 분획물에서 관찰될 것으로 예상되지만, 이런 규칙의 한가지 예외는 티모신 계통의 단백질이다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 또는 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 참조로 한다. 어떤 참고문헌도 선행 기술로서 인정되지 않는다. 참고문헌의 언급은 이들의 저자가 주장하는 바를 제시하며, 본 출원인은 언급된 문서의 정확성과 타당성에 이의를 제기할 권리가 있다. 본원에 다수의 기존 간행물이 인용되긴 했지만, 이런 참고대상은 뉴질랜드 또는 다른 국가에서 선행 기술로서 인정되지 않는다.

‘포함한다’는 관할 지역에 따라 배타적 또는 포괄적 의미로 해석된다. 달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에서 ‘포함한다’는 포괄적 의미를 갖는다 - 다시 말하면, 이는 직접적으로 언급된 성분뿐만 아니라 다른 명시되지 않은 성분 또는 구성요소를 포괄한다. 이런 원리는 방법 또는 공정에서 한가지이상의 단계와 관련하여 이용된 용어‘포함하는’에도 적용된다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하거나 대중에게 유용한 선택권을 부여하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 특징과 이점은 실례로서 제공된 아래의 상세한 설명으로부터 명백하다.

본 발명의 한 관점에서, 10 kDa 이하의 분자량을 보유하고 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 성분을 함유하는 사슴뿔의 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 10 kDa 이하의 분자량을 보유하고 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 펩티드를 함유하는 사슴뿔의 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 성분이 아래의 과정: 최대 3분동안 100℃로 가열; 2.5 Mrad 이상의 γ-방사선에 노출에 의한 멸균; 또는 냉동 해동 중에서 적어도 한가지 과정에 적용된 이후에도 내피 세포에 대한 증식 효과 또는 혈관형성을 촉진하는 능력을 유지하는 사슴뿔의 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 펩티드가 아래의 과정: 최대 3분동안 100℃로 가열; 2.5 Mrad 이상의 γ-방사선에 노출에 의한 멸균; 또는 냉동 해동 중에서 적어도 한가지 과정에 적용된 이후에도 내피 세포에 대한 증식 효과 또는 혈관형성을 촉진하는 능력을 유지하는 사슴뿔의 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 상처의 치료를 위한 약물의 제조에서 사슴뿔로부터 추출된 성분의 용도를 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 상처의 치료를 위한 약물의 제조에서 사슴뿔로부터 추출된 펩티드의 용도를 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 지속적인 상처의 치료를 위한 약물의 제조에서 사슴뿔로부터 추출된 성분의 용도를 제시한다.

본 발명의 다른 관점에서, 지속적인 상처의 치료를 위한 약물의 제조에서 사슴뿔로부터 추출된 펩티드의 용도를 제시한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 상기한 추출액에 존재하는 적어도 한가지 성분을 함유하는 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 상기한 추출액에 존재하는 적어도 한가지 펩티드를 함유하는 분리된 추출액을 제시한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 상처 치유를 위하여 상기한 추출액에 존재하는 성분의 치료 효과량을 함유하는 조성물을 제시한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 동물에서 상처를 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 상기한 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 상처 치유를 위하여 상기한 추출액에 존재하는 펩티드의 치료 효과량을 함유하는 조성물을 제시한다.

상기 조성물은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 형태로 조제될 수 있다. 가령, 조성물은 당업자에게 공지된 바와 같이, 겔, 로션, 방향, 스프레이, 경피 드레싱 등으로 조제될 수 있다.

본 명세서에서 ‘펩티드’는 사슴뿔에 존재하는 임의의 펩티드 또는 펩티드의 조합, 예를 들면, 아미노산의 중합체를 포함하는 펩티드, 단백질, 폴리펩티드; 탄수화물 및/또는 지질 부분 등을 비롯한 다른 부분을 보유하도록 변형된 펩티드, 단백질, 폴리펩티드를 의미한다.

본 명세서에서 ‘성분’은 사슴뿔에 존재하는 임의의 성분 또는 성분의 조합, 예를 들면, 펩티드, 탄수화물, 핵산, 유리 아미노산, 지질, 성장 인자를 의미한다.

본 명세서에서 ‘증식 효과’는 세포 및/또는 조직을 신속하게 성장시키거나 증식시켜 새로운 세포 또는 조직을 생성하는 본 발명에 따른 추출액 또는 조성물의 능력에 관한다.

본 명세서에서 ‘내피 세포’는 혈관의 내부 표면에 정렬된 내피를 구성하는 세포에 관한다. 여기에는 심장의 모세혈관, 관상 혈관, 내막뿐만 아니라 정맥과 동맥 혈관이 포함된다.

본 명세서에서 ‘상처’는 피부, 조직 또는 장기가 질병, 사고 또는 수술의 결과로서 찢어지거나, 관통되거나, 절단되거나, 갈라지거나 또는 파열되는 손상을 의미한다. 상기 용어는 궤양을 비롯한 종기 또는 병소를 의미한다.

본 명세서에서 ‘지속적인 상처’는 치유가 느리게 진행되고 오랫동안 지속되는 상처를 의미한다. 상기 용어는 만성적인 상처를 의미할 수도 있다.

본 명세서에서 ‘냉동 해동’은 본 발명의 펩티드를 -20℃로 냉동하고, 이후 18-25℃의 실온으로 상승시키는 과정을 의미한다.

본 발명에 따른 펩티드의 분자량은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 방법으로 결정될 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 펩티드의 분자량은 겔 여과 크로마토그래피, 전기영동, 질량 분광측정법 또는 다른 적절한 방법으로 결정된다.

본 명세서에서 ‘사슴뿔’, ‘뿔’ 또는 ‘녹용’은 성장하는 사슴뿔의 일부를 의미한다. 일반적으로, 사슴뿔의 모든 가지와 전체 줄기가 포함된다. 하지만, 바람직한 구체예에서, 혈관형성 추출액을 제조하는 과정에서 녹용 껍질은 제거되고, 돌출 가지에 인접하거나 아래에 위치하는 줄기의 기부 역시 제외된다.

녹용은 건조되는 경우에, 펩티드, 단백질, 미네랄로 주로 구성될 뿐만 아니라 다른 성분, 예를 들면, 탄수화물, 지질, 유리 아미노산을 함유하는 복합 조직이다. 이런 이유로, 녹용의 추출액은 추출 용제에 용해되는 모든 성분의 혼합물을 함유한다. 수성 추출 조건이 이용되는 경우에, 추출액의 주요 성분은 펩티드 또는 단백질일 것으로 예상된다(Sunwoo et al.,1995).

일반적으로, 녹용은 적록(red deer)으로부터 채취된다. 하지만, 사슴의 다른 종, 예를 들면, 와피티(wapiti), 펠로우(fellow) 또는 화이트 테일(white tail) 역시 녹용의 공급원으로서 이용될 수 있다.

본 명세서에서 ‘혈관형성’은 혈관의 성장을 유도하는 물질의 능력을 의미한다.

적절하게는, 녹용은 성장기동안 수집된다. 하지만, 성숙 사슴뿔에서도 녹용이 수집되고 본 발명에 이용될 수 있기 때문에, 이는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

녹용은 보존을 위하여 아래의 방법 중에서 한가지이상의 방법으로 가공될 수 있다: 냉동-건조, 냉동, 핫 딥핑(hot dipping) 또는 오븐 건조. 하지만, 이는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

적절하게는, 녹용은 핫 딥핑으로 가공된다.

본 발명의 성분은 제약학적으로 또는 수의학적으로 수용가능한 담체, 부형제, 안정제 및/또는 당업자에게 공지된 다른 제형 첨가제를 함유할 수 있다.

녹용은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 방법으로 추출될 수 있다.

바람직한 한 구체예에서, 추출은 유기 용제를 이용한다.

다른 바람직한 구체예에서, 추출은 수용액을 이용한다.

본 명세서에서 “전체 단백질 추출액”은 추출액에 함유된 펩티드 또는 단백질의 분자량을 조절하는 임의의 시도없이 제조된 수성 추출액을 의미한다. 정의에 의해, 전체 단백질 추출액은 펩티드 또는 단백질이 아니지만 이들 펩티드 또는 단백질과 함께 추출되는 녹용의 다른 수용성 성분 역시 함유한다.

본 발명의 녹용 추출액은 다양한 방법, 예를 들면, 한외여과, 겔 여과 크로마토그래피, 투석, 또는 유기 용제의 이용으로 분획하여 저분자량 분획물을 산출할 수 있다. 하지만, 다른 적절한 방법 역시 이용될 수 있다는 점에서, 이들 목록은 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

바람직한 한 구체예에서, 분획 방법은 70% 에탄올을 유기 용제로 이용하는데, 녹용은 수성 추출에 앞서 상기 에탄올에 담겨진다. 본 명세서에서 “에탄올 전처리이후 추출액”은 상기 방법을 이용하여 제조된 추출액을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에서, 분획 방법은 녹용 전체 단백질 추출액의 수용액에 냉각 알코올을 첨가하여 고분자량 단백질의 침전을 유도하고, 이후 상기 단백질을 원심분리 또는 여과로 제거한다. 본 명세서에서 “에탄올 침전된 추출액”은 상기 방법을 이용하여 제조된 추출액을 의미한다.

또 다른 구체예에서, 분획 방법은 한외여과를 이용한다.

일반적으로, 본 발명의 최종 녹용 추출액은 수용액, 건조된 무정형 고체 또는 냉동-건조된 분말이다. 하지만, 이는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

적절하게는, 수용액은 물, 인산염 완충액(PBS) 또는 다른 적절한 수성 용제에 기초한다.

바람직한 추출 방법과 관련하여 본원의 명세에 더하여, NZ 524868과 PCT 출원 No. NZ2004/000058에서 상세하게 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 선행 기술에 비하여 아래와 같은 여러 이점을 제공한다:

1. 녹용으로부터 혈관형성 조성물을 수득하기 위한 추출 방법을 제공한다.

2. 혈관형성 효과를 보유하는 녹용 유래의 조성물을 제공한다.

3. 상처 또는 손상의 치료에 사용될 수 있는 녹용 유래의 조성물을 제공한다.

4. 지속적인 상처의 치료에 사용될 수 있는 녹용 유래의 조성물을 제공한다.

아래의 실시예 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다른 특징은 명백하다.

도 1. 전체 단백질 추출액의 한외여과에 의해 유래된 녹용의 고분자량 분획물의 겔 여과 크로마토그래피 프로필. 근사한 분자량 눈금은 크로마토그램 아래에 표시하고, 파선(broken line)은 10 kDa 단백질의 예상 용출 위치를 나타낸다.

도 2. 전체 단백질 추출액의 한외여과에 의해 유래된 녹용의 저분자량 분획물의 겔 여과 크로마토그래피 프로필. 근사한 분자량 눈금은 크로마토그램 아래에 표시하고, 파선(broken line)은 10 kDa 단백질의 예상 용출 위치를 나타낸다.

도 3. 녹용의 전체 단백질 추출액의 겔 여과 크로마토그래피 프로필. 근사한 분자량 눈금은 크로마토그램 아래에 표시하고, 파선(broken line)은 10 kDa 단백질의 예상 용출 위치를 나타낸다.

도 4. 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 수성 추출에 의해 유래된 저분자량 추출액의 겔 여과 크로마토그래피 프로필. 근사한 분자량 눈금은 크로마토그램 아래에 표시하고, 파선(broken line)은 10 kDa 단백질의 예상 위치를 나타낸다.

도 5. 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 추출에 의해 유래된 저분자량 녹용 추출액(“LMW 추출액”)과 녹용의 전체 단백질 추출액(“TP 추출액”)의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동. (A) Coomassie Brilliant Blue G250으로 염색. (B) 이후, 은으로 염색. 레인은 5, 10, 25 또는 50 ㎍ 추출액을 보유하였다. 분자량 마커(“MW 마커”)의 혼합물은 겔의 첫 번째 레인과 마지막 레인에 적하하고, 마커 단백질의 분자량은 영상 옆에 표시한다.

도 6. 1% 혈청(“대조”), 3분간 끓임 이전 전체 단백질 녹용 추출액(“전체 단백질 추출액”)과 3분간 끓임 이후 전체 단백질 녹용 추출액(“끓여진 전체 단백질 추출액”), 또는 70% 에탄올로 전처리이후 추출로 제조된 저분자량 추출액(“저분자량 추출액”)에 반응하여, 인간 배꼽 정맥 내피 세포의 증식에 대한 상이한 사슴뿔 추출액의 효과를 개략적으로 보여주는 막대그래프. 녹용 추출액은 500 ㎍/㎖의 농도로 사용되고, 1% 혈청을 또한 함유하였다.

도 7. 세포 이동 검사의 결과를 보여주는 그래프. 1% 혈청(“대조”), 전체 단백질 녹용 추출액(“전체 단백질”), 에탄올 침전으로 제조된 저분자량 추출액(“EtOH 침전됨”), 또는 한외여과로 제조된 저분자량 추출액(“한외여과액”)에 반응한 BAE 세포의 이동. 녹용 추출액은 100 ㎍/㎖와 500 ㎍/㎖의 농도로 사용되고, 1% 혈청을 또한 함유하였다.

도 8. 세포 이동 검사의 결과를 보여주는 다른 그래프. 1% 혈청(“대조”), 또는 3분간 끓임 이전(“AE”) 또는 이후(“끓여진 AE”) 저분자량 녹용 추출액(70% 에탄올로 전처리이후 녹용의 추출로 제조됨)에 반응한 BAE 세포의 이동. 녹용 추출액은 100 ㎍/㎖와 500 ㎍/㎖의 농도로 사용되고, 1% 혈청을 또한 함유하였다.

도 9. 녹용 정점의 전연골 부위에서 VEGF 프로브를 이용한 in situ 혼성화의 사진. A) 안티센스 프로브의 명시야(brightfield). B) 혼성화 지역을 보여주는 안티센스 프로브의 암시야(darkfield). C) 센스 프로브의 명시야. D) 배경만을 보여주는 센스 프로브의 암시야. * 표지된 전연골 지역; V, 혈관.

도 10. 쥐 상처 치유 시험의 결과를 보여주는 그래프. 상처는 25 ㎕의 염수(“대조”) 또는 저분자량 녹용 추출액(염수에서 1 ㎎/㎖)(“치료됨”)으로 치료하였다. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하였다. 1회 분량은 0, 2, 4, 7, 10일에 투여하였다. 제시된 데이터는 최초 상처 크기의 백분율로서, 상처 발생이후 평균 상처 크기(day)이다. 2, 4, 7, 10, 14, 17일에 표시된 오차 막대는 평균간 차이의 표준 오차이다. 별표로 표시되는 유의성 수준은 아래와 같다: *P <0.05, **P < 0.01.

도 11. 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 수성 추출에 의해 유래된 저분자량 추출액의 상처 봉합(wound closure) 속도에 대한 투여 효과를 조사하는 쥐 상처 치유 시험의 결과를 보여주는 그래프. 상처는 25 ㎕의 염수(“대조”) 또는 염수에 담긴 저분자량 녹용 추출액(“치료됨”)으로 치료하였다. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하고, (a) 0.1 ㎎/㎖, (b) 2 ㎎/㎖, (c) 10 ㎎/ ㎖, (d) 100 ㎎/㎖로 투여하였다. 1회 분량은 10일에 투여되지 않은 100 ㎎/㎖를 제외하고 0, 2, 4, 6, 8, 10일에 투여하였다. 제시된 데이터는 최초 상처 크기의 백분율로서, 상처 발생이후 평균 상처 크기(day)이다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16일에 표시된 오차 막대는 평균간 차이의 표준 오차이다. 별표로 표시되는 유의성 수준은 아래와 같다: *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

도 12. 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 수성 추출에 의해 유래된 저분자량 추출액의 상처 봉합(wound closure) 속도에 대한 투여 빈도 효과를 조사하는 쥐 상처 치유 시험의 결과를 보여주는 그래프. 상처는 25 ㎕의 염수(“대조”) 또는 염수에 담긴 저분자량 녹용 추출액(“치료됨”)으로 치료하였다. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하였다. (a)에서 복수 분량은 0, 2, 4, 6, 8, 10일에 10 ㎎/㎖으로 제공하고, (b)에서 단일 분량은 0일에 10 ㎎/㎖로 제공한다. 제시된 데이터는 최초 상처 크기의 백분율로서, 상처 발생이후 평균 상처 크기(day)이다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16일에 표시된 오차 막대는 평균간 차이의 표준 오차이다. 별표로 표시되는 유의성 수준은 아래와 같다: *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

도 13. 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 수성 추출에 의해 유래된 저분자량 추출액의 서로 다른 제형의 상처 봉합(wound closure) 속도에 대한 효과를 조사하는 쥐 상처 치유 시험의 결과를 보여주는 그래프. 상처는 저분자량 녹용 추출액을 함유하는(“처리됨”) 또는 함유하지 않는(“대조”) 25 ㎕의 다양한 제형으로 치료하였다. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하였다. 치료 된 상처에는 (a) 인산염 완충액(PBS), (b) Methocel E-4M 겔, (c) Pluronic F-127 겔 또는 (d) Carbopol-934P 겔에서 2 ㎎/㎖으로 조제된 추출액을 0, 2, 4, 6, 8일에 투여하였다. 제시된 데이터는 최초 상처 크기의 백분율로서, 상처 발생이후 평균 상처 크기(day)이다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16일에 표시된 오차 막대는 평균간 차이의 표준 오차이다. 별표로 표시되는 유의성 수준은 아래와 같다: *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

도 14. 저분자량 녹용 추출액(“치료됨”) 또는 PBS(“대조”)의 단일 투여이후 4일 시점에 상처 조직의 마송 삼색 염색(Masson's Trichrome staining)에 의해 노출된 상처 조직을 보여주는 영상. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하였다. (A)는 대조 상처의 저확대도 영상인데, 여기서 펀치 생검(punch biopsy)(상처)은 수평선의 우측에서 명확하게 나타난다. 대조 상처의 더욱 높은 확대도 영상(C)은 상처의 표면에서 딱지(S) 및 아래의 상처 조직(WT)을 보여준다. 저분자량 추출액으로 치료이후 펀치 생검(상처)은 (B)에서 명확하게 나타난다. 치료된 상처의 더욱 높은 확대도 영상(D)은 혈관 공간으로 생각되는 것들이 존재하는 피부 조직(DT) 및 형성 표피(E)를 보여준다. (A)와 (B)에서 표시자(scale bar)는 200 ?m이고, (C)와 (D)에서 표시자는 100 ?m이다.

도 15. 저분자량 녹용 추출액(“치료됨”) 또는 PBS(“대조”)의 단일 투여이후 4일 시점에 상처 조직의 라미닌 면역조직화학. 저분자량 추출액은 에탄올로 전처리이후 추출로 제조하였다. (A) 대조 상처에서 라미닌은 상처 가장자리의 조직 내에서만 검출되고 펀치 생검 내에서는 검출되지 않았다. (B) 치료된 상처에 서 라미닌은 상처 가장자리와 상처 내에서 모두 검출되었다. (C) 혈관이 거의 관찰되지 않는 (A)에서 대조 상처의 더욱 높은 확대도 영상. (D) 상피 아래에 기초 혈관과 새로운 혈관이 명확하게 나타나는 (B)에서 치료된 상처의 더욱 높은 확대도 영상. (E) (A)에서 상처 가장자리의 더욱 높은 확대도 영상은 상처입지 않은 조직에서만 혈관을 보여준다. (F) 신호의 검출이 없는 라미닌 항체에 대한 토끼 IgG 대조. (A)와 (B)에서 표시자는 200 ?m이고, (C)와 (F)에서 표시자는 100 ?m이다.

본 발명을 수행하기 위한 최적 양식

실험

방법

조직의 수집:

녹용은 뿔갈이이후 55-60일의 성장 시점에서 3년생 적록으로부터 수집한다.

녹용은 Code of Recommendations and Minimum Standards for the Welfare of Deer during the Removal of Antlers, July 1992(revised 1997), Ministry of Agriculture and Fisheries, Wellington, New Zealand에 명시된 규정에 따라 떼어낸다.

녹용은 핫 딥핑(hot dipping) 또는 냉동-건조에 의해 상업적으로 가공한다. 핫 딥핑은 전통적인 중국식 방법에 기초하는데, 여기서 사슴뿔의 줄기는 기부(즉, 아래쪽 정점)로부터 부유시키고 짧은 시간동안 반복적으로 끓는 물에 담근다. 담근 이후, 이들은 냉각시키고 다시 담근다. 담금은 사슴뿔의 절단 기부로부터 투명한 혈장이 거품으로 빠져나올 때까지 지속한다. 이후, 사슴뿔은 건조될 때까지 수주동안 대략 15℃에서 낮은 습도 건조기에 놓아둔다.

가공된 사슴뿔(핫 딥핑되거나 냉동-건조된)은 선별한다. 녹용의 껍질은 날카로운 칼을 이용하여 사슴뿔로부터 제거한다. 55-60일 성장 시점에서 적록 사슴뿔의 모든 부분에는 줄기의 기부 부위가 제외되고 돌출 가지가 포함된다. 녹용은 띠톱을 이용하여 1-2 ㎝ 두께 고리로 얇게 절단하고, 이후 끌을 이용하여 수 ㎝ 크기의 작은 블록으로 자르고 0.5 ㎜ 스크린이 구비된 제분기(Thomas, USA)를 이용하여 분말로 만든다.

추출과 분획

녹용은 추출하고 분획하여 저분자량 분획물을 산출하는데, 상기 분획물은 혈관형성 성장 인자가 풍부하다. 이런 분획물은 한외여과, 투석, 겔 여과 크로마토그래피, 유기 용제(가령, 에탄올)의 사용으로 용액으로부터 고분자량 단백질의 침전, 또는 유기 용제(가령, 70% 에탄올)로 녹용의 전처리이후 수성 추출을 비롯한 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 추출액의 생산에 이용되는 3가지 방법은 한외여과, 에탄올을 이용한 고분자량 침전, 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 수성 추출이다.

녹용의 추출 및 한외여과에 의한 분획

녹용의 전체 단백질 추출액의 제조

인산염 완충액 추출액은 100 ㎖의 인산염 완충액을 이용하여 5 g의 냉동 건조된 녹용 분말로부터 제조하였다. 인산염 완충액은 오르토인산 수소 이나트륨(di-sodium hydrogen orthophosphate)(1.15 g/ℓ), 오르토인산 이수소 칼륨(potassium di-hydrogen orthophosphate)(0.24 g/ℓ), 염화칼륨(0.2 g/ℓ), 염화나트륨(8.0 g/ℓ)을 함유하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 교반하고, 이후 유리 섬유 필터 페이퍼(Whatman GF/A)를 통하여 여과하였다. 여과액은 4℃에서 30분동안 11,500 rpm으로 원심분리하였다. 상층액(93 ㎖)은 칭량된 Schott 병에 옮기고 쉘(shell) 냉동시키며, 이후 15℃에서 냉동-건조시켰다.

한외여과에 의한 녹용의 전체 단백질 추출액의 분획

인산염 완충액 녹용 추출액(15 ㎎)은 1 ㎎/㎖의 농도로 탈이온수에 용해시키고 10 kDa의 분획분자량(nominal molecular weight cut off)을 보유하는 한외여과 장치(Centriprep-YM10, Amicon, USA)로 옮겼다. 튜브는 4℃에서 40분동안 2,100 g로 원심분리하였다. 이후, 한외여과액은 이전하고, 튜브는 각각 소량의 고분자량 보유액(retentate)이 남을 때까지 20분간 2회 추가로 원심분리하였다. 한외여과액은 합치고 새로운 Centriprep 튜브에 이전하였다. 한외여과를 반복하여 고분자량 단백질에 의한 오염이 존재하지 않도록 담보하였다. 저분자량 분획물을 함유하는 최종 한외여과액은 냉동-건조시키고 칭량하며 추후 사용을 위하여 보관하였다. 고분자량 분획물을 함유하는 보유액은 유사하게 처리하였다.

에탄올을 이용한 전체 단백질 추출액의 용액으로부터 고분자량 단백질의 침전에 의한 저분자량 추출액의 제조

녹용의 전체 단백질 추출액은 실온에서 3시간동안 탈이온수(100 ㎖)에서 건조된 녹용 분말(10 g)을 부드럽게 교반하여 제조하였다. 혼합물은 15분동안 2,100 g로 원심분리하고, 상층액은 깨끗한 원심분리 병으로 옮겼다. 상층액은 15분동안 21,000 g로 추가로 원심분리하여 전체 단백질 추출액 용액을 완전히 투명하게 하고, 상기 용액은 이후 4℃로 냉각하였다. 차가운(4℃) 100% 에탄올(3 볼륨)은 지속적으로 교반하면서 점진적으로 첨가하였다. 흐린 혼합물은 4℃에서 30분동안 21,000 g로 원심분리하여 침전된 고분자량 단백질을 제거하였다. 상층액은 Buchi 증발 플라스크로 이전하고, 이후 진공하에 Buchi 회전 증발기에서 용제를 제거하였다. 저분자량 녹용 추출액을 함유하는 건조된 무정형 잔류물은 사용에 앞서, 실온에서 증발 플라스크에 밀봉 보관하였다.

에탄올로 전처리이후 녹용의 추출에 의한 저분자량 추출액의 제조

실험실 규모 제조

이런 추출액을 제조하는데 선택되는 방법은 70% 에탄올로 녹용 분말의 전처리이후 수성 추출이다. 이런 경우에, 100 g의 핫 딥핑된 녹용 분말은 600 ㎖의 70% 에탄올(식용 등급)과 혼합하였다. 혼합물은 3시간동안 교반하고 소결된 유리 깔때기를 통하여 여과하였다. 남아있는 에탄올은 Buchi 회전 증발기를 이용하여 녹용 잔류물로부터 진공하에 제거하였다. 전체 증발 과정동안, 30℃에서 수조를 이용하여 증발 플라스크에 온화한 열을 제공하였다. 탈이온수(2 ℓ)를 건조된 녹용에 첨가하고, 혼합물은 12시간동안 교반하였다. 이후, 추출 혼합물은 Whatman No 1 페이퍼, No 6 페이퍼, 유리 섬유 필터 페이퍼(Whatman GF/A)에 순차적으로 여과하였다. 녹용 잔류물은 폐기하고, 여과액은 20℃에서 10분동안 11,500 rpm으로 원심분리하였다. 상층액은 쉘 냉동시키고 15℃에서 냉동-건조시켰다. 4.10 g(4.1% 수율)의 생산물이 수득되었는데, 이는 아래에 상술된 시험관내 생물검정 시험에 사용하였다.

파일럿-규모 제조

상기와 바와 같이 제조된 핫 딥핑된 녹용으로부터 분말은 34개의 개별 배치(batch)에서 70% 에탄올로 전처리하였다. 84.0-172.6 g 녹용 분말의 각 배치는 6 볼륨(w/v)의 70% 에탄올과 함께 실온에서 3시간동안 교반하였다. 대부분의 용제는 30℃ 수조(Buchi Rotavapor-R)가 구비된 회전 증발기와 오일펌프(Edwards Speedivac ED35)가 구비된 회전 증발기를 순차적으로 이용하여 진공하에 제거하였다. 이후, 전처리된 녹용 분말은 플라스틱 용기에서 냉동시키고 냉동-건조기(Cuddon)에서 건조시켜 최종적으로 남아있는 용제를 제거하였다.

식수(86 ℓ)를 모아진 에탄올 전처리된 녹용 분말(4.3 ㎏)에 첨가하고, 혼합물은 실온에서 3시간동안 교반하였다. 고체 잔류물은 혼합물을 Dynocone Model 612 연속 고체 사발식 원심분리기(Clark Chapman, Derby UK)에 통과시켜, 액체 추출액으로부터 제거하였다. 녹용 추출액은 10 ㎛ 필터 백과 1 ㎛ 필터 백(GAF)에 순차적으로 여과하고, 이후 스테인리스 스틸 트레이에서 냉동시키고 냉동-건조기(Cuddon)에서 건조시켰다. 냉동-건조된 저분자량 녹용 추출액은 건조기 트레이로부터 긁어모아 92 g(2.1% 수율)의 연한 갈색 무정형 고체를 얻었다. 상기 물질(90 g)은 γ-방사선(Schering-Plough, Upper Hutt, NZ)으로 멸균시켰는데, 이런 처리동안 상기 물질은 2.5 Mrad의 최소 선량이 적용되고, 아래의 상술된 조제와 쥐 상처 치유 연구에 이용되었다.

겔 여과 크로마토그래피

녹용 추출액은 0.3 M 염화나트륨과 0.05% 아지화나트륨(sodium azide)을 함 유하는 0.05 M 인산염 완충액(pH 6.9)을 용출 완충액으로 이용하여 Superose 12 HR 10/30 칼럼(Amersham Biosciences)에서 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)로 분석하였다. 샘플은 2-5 ㎎/㎖의 농도로 0.05 M 인산염 완충액(pH 6.9)에 용해시키고, 10 ㎕의 각 용액은 칼럼에 주입하고 0.75 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다. 용출된 단백질은 280 nm에서 UV 흡광도의 측정으로 검출하였다.

Superose 12 칼럼의 분자량 조정은 녹용 추출액에 이용된 것과 동일한 조건하에, 공지된 분자량의 공지된 단백질의 표준 혼합물의 분리로 수행하였다. 혼합물은 티로글로불린(thyroglobulin)(669 kDa); 소 γ-글로불린(Cohn fraction Ⅱ, 160 kDa); 소 혈청 알부민(66.7 kDa); 난알부민(등급 VI, 46 kDa); 탄산탈수효소(carbonic anhydrase)(소)(29 kDa); 사이토크롬 C(말 심장)(12.4 kDa); L-티로신(181 Da)을 함유하였다. 모든 표준은 BDH로부터 입수된 L-티로신을 제외하고, Sigma로부터 구입하였다. 용출된 단백질 피크의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)은 조정 곡선을 이용한 내삽으로 결정하였는데, 상기 곡선은 체류 시간(retention time)에 대한 단백질 분자량의 대수를 도면에 기입함으로써 작성하였다.

SDS-PAGE 전기영동

녹용의 전체 단백질 추출액 및 저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)은 16.5% Tris-Tricine SDS-폴리아크릴아마이드 겔(BioRad)에서 이동시켰다. 샘플은 2-멀캡토에탄올로 변성시키고 4분동안 99℃로 가열하며, 이후 겔에 적하하였다. 10 ㎕의 MultiMark 분자량 마커 혼합물 및 5, 10, 25, 50 ㎍의 각 추 출액을 겔에 적하하였다. 겔은 190 볼트에서 50분동안 이동시켰다. 겔은 이전하고, 동등 비율의 메탄올과 25% 트리클로로아세트산으로 구성된 Coomassie Brillant Blue G-250(BDH)의 0.25% 용액으로 45분동안 염색하였다. 이후, 겔은 5% 트리클로로아세트산 용액에서 하룻밤동안 탈염색하였다. 겔은 25% 메탄올/1% 아세트산에서 5분동안, 이후 1% 메탄올/0.5% 아세트산에서 5분동안 세척하고, 1% 글루타르알데하이드 용액에서 5분동안 추가로 고정시켰다. 그 다음, 탈이온된(MilliQ) 물에서 6회 세척(1.5분/세척)하였다.

은 염색은 1.44 ㎖의 28% 암모니아 용액에 92.5 ㎕의 10M 수산화나트륨을 첨가하고 MilliQ 물로 45 ㎖로 희석하여 용액 A를 생산함으로써 수행하였다. 용액 B는 2.5 ㎖ MilliQ 물에 녹인 0.5 g 질산은으로 구성되었다. 용액 A와 B는 사용 직전에 혼합하고, 겔은 혼합물에서 10분동안 염색하였다. 염색이후, 겔은 총 10분동안 MilliQ 물에서 3회 세척하였다. 최종적으로, 겔은 0.005% 구연산/0.02% 포름알데하이드 용액에서 대략 1분동안 현상시키고, 현상은 2분동안 25% 메탄올/0.26% 아세트산을 첨가하여 중단시켰다. 이후, 겔은 전시를 위하여 Kodak DC120 디지털 카메라를 이용하여 촬영하였다.

세포 증식 검사

인간 배꼽 정맥 내피 세포는 5% CO₂, 37℃에서, T75 조직 배양 플라스크(Nunclon^TM)에 담긴 10% 소 태아 혈청(GibcoBRL), 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 보충 된 Medium 199(GibcoBRL)에서 배양하였다. 세포는 트립신처리(0.025% 트립신, 0.265 mM EDTA, GibcoBRL)하고 96-웰 평판(Nunclon^TM)에 3000 세포/웰/200 ㎕의 밀도로 정종하며 3일동안 배양하였다. 세포는 1% 혈청에서 24시간동안 기아 배양하고, 이후 녹용 추출액의 존부하에 1 ng/㎖ bFGF를 함유하는 1% 혈청으로 추가로 48시간동안 처리하였다. 배양의 종결 2시간 전에, 20 ㎕의 Celltiter 96? Aqueous One Solution Reagent를 각 웰에 첨가하였다. 가습된 5% CO₂ 대기하에 37℃에서 배양의 완결이후, 평판 판독기(Bio-Tek)를 이용하여 490 nm에서 웰의 흡광도(“OD₄₉₀”)를 기록하였다.

소 대동맥 내피 세포의 이동

소 대동맥 내피(BAE) 세포는 12-웰 평판(Nunclon^TM)에서 10% 소 태아 혈청(GibcoBRL)을 보유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, GibcoBRL?)에 합류 수준으로 성장시켰다. 이후, 단층은 일회용 피펫으로 접시를 엇갈려 긁음으로써 ‘상처’를 입혔다. 둘베코(Dulbecco) PBS + 칼슘(0.1 g/ℓ)(GIBCO™, Invitrogen Corporation)으로 세척한 이후, 상처 입은 단층은 녹용 추출액의 존부하에 신선한 1% 혈청에서 추가로 48시간동안 배양하였다. 이들은 전체 단백질 녹용 추출액, 한외여과로 제조된 저분자량 추출액, 전체 단백질 추출액 용액으로부터 고분자량 단백질의 침전으로 제조된 저분자량 추출액, 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 제조된 저분자량 추출액이었다. 후자 저분자량 추출액은 또한, 3분동안 100℃로 끓인 이후 에 검사하였다. 일부 웰은 양성 대조로서 포함되었고, 앞에서와 대조적으로 10% 혈청에서 배양되었다. 상처 입은 단층에서 세포의 이동 정도는 최초 상처 발생 시점 및 상처 발생이후 48시간 시점에서 현미경 사진을 촬영함으로써 결정하였다. 현미경 사진은 Olympus CK2 역상 현미경에서 20x 확대도로 촬영하고 15 ㎝ 너비 x 10 ㎝ 깊이의 표준 크기로 인쇄하였다. 라인이 1.5 ㎝ 이격되고 기준선까지 10 ㎝ 병렬로 이동하는 격자를 사진 위에 위치시켰다. 기준선은 세포가 처음 긁힌 “상처 라인” 위에 위치시켰다. 각 라인에 의해 차단되는 세포의 수를 기록하였다. 이를 통하여, 현미경 사진에서 기준선으로부터 1.5, 3.0, 4.5, 6.0, 7.5 또는 9.0 ㎝ 이동한 세포의 수를 사정할 수 있었다.

in situ 혼성화

프로브 생산

in situ 혼성화 프로토콜은 Clark et al..(1996)에 기술된 방법에 기초하였다. VEGF의 엑손 1-4에 걸친 프로브는 전사 벡터 pGEMT?Easy(Promega, Madison, WI)에 클론하였다. 이는 SacII, NcoI(New England Biolabs, Beverly, MA), 또는 SalI(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용한 제한 절단으로 선형화시켜 센스와 안티센스 프로브를 수득하였다. 단일 가닥 센스와 안티센스 리보프로브(riboprobe)는 제조업체(Promega, Madison, WI) 사용설명서에 따라, 10?Ci/㎕ [³³P] UTP와 함께 전사하여 표지하였다.

절편 제조

절편은 자일렌과 감소하는 농도의 에탄올에서 순차적으로 탈랍(dewaxing)시키고, 이후 0.2M HCl에 20분동안 담그고 2 x SSC(1 X SSC는 150 mM 염화나트륨과 15 mM 염소산나트륨(sodium chlorate), pH 7.0을 함유한다)에서 30분동안 세척하였다. 단핵분해효소 K(Sigma Chemical) 절단은 37℃에서 15분동안 200 mM Tris-HCl(pH 7.2), 50 mM EDTA(pH 8.0)에 2 ㎍/㎖의 농도로 수행하였다. 이후, 슬라이드는 100 mM 트리에탄올아민(pH 8.0), 0.25% 아세트산 무수물에 2 x 5분(실온)동안 담갔다. 슬라이드는 2 x SSC(실온)에서 5분동안 세척하고 탈수하고 건조시켰다.

혼성화

프로브 생산(대략 2 x 10⁶ cpm/㎕)하에 상기한 바와 같이 표지된 1 ㎕의 리보프로브는 20-60 ㎕ 혼성화 완충액과 혼합하였다. 혼성화 완충액은 50%(v/v) 탈이온화된 포름아마이드, 0.3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10 mM 인산나트륨(pH 6.8), 5 mM EDTA(pH 8.0), 1 x Denhardts 용액(각각 0.02%(w/v)의 BSA, Ficoll, 폴리비닐 피롤리돈), 10%(w/v) 황산덱스트란, 50 mM 디티오트레이톨, 1 ㎎/㎖ 효모 tRNA(Life Technologies)를 함유하였다. 프로브를 함유하는 상기 혼합물은 95℃로 변성시키고 전처리되고 건조된 조직 절편에 적용하며, 이후 상기 절편은 파라필름의 작은 조각으로 덮었다; 사전혼성화는 수행하지 않았다. 혼성화는 50% 포름아마이드와 0.3 M NaCl로 가습된 밀봉 용기에서 54℃에서 18시간동안 수행하였다.

슬라이드는 5 x SSC에서 50℃에서 15분(x2), 이후 50% 포름아마이드를 함유하는 2 x SSC에서 65℃에서 30분동안 세척하였다. 각 5분간 4회 세척은 2 x SSC에 서 37℃에서 수행하였다. 슬라이드는 1 x 세척 용액(400 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5)에서 20 ㎍/㎖의 농도로 RNase A(Sigma Chemical)와 함께 37℃에서 30분동안 배양하였다. RNase A는 50% 포름아마이드를 함유하는 2 x SSC에서 65℃에서 30분동안, 이후 37℃에서 2 x SSC와 0.2 x SSC에서 15분동안 슬라이드를 세척하여 제거하였다. 절편은 0.3 M 아세트산암모늄을 함유하는 30, 60, 80, 95% 에탄올을 통하여 탈수시키고, 이후 100% 에탄올 단독에서 2회 최종 세척하였다.

절편은 대기 건조시키고 자가방사성 에멀젼(LM-1 에멀젼; Amersham International plc)으로 코팅하였다. 에멀젼-코팅된 슬라이드는 광차단 상자에서 4℃에서 3주동안 건조 보관하였다. 이후, 슬라이드는 현상시키고(D19 현상기; Kodak, Rochester, NY, USA) 사진에 고정시켜(30% 티오황산나트륨) 혼성화 부위에서 가시적인 은 흔적을 유도하였다. 절편은 Gills Haemotoxylin으로 대비 염색하고 명시야 조명과 암시야 조명을 모두 이용하여 Zeiss Axioplan 현미경에서 관찰하였다.

저분자량 녹용 추출액을 함유하는 제형의 제조

녹용으로부터 혈관형성 추출액의 국소 겔 제형은 서로 다른 유형의 중합체, 다시 말하면, Carbopol-934P, Pluronic F-127, Methocel-E4M을 이용하여 제조하였다. Carbopol-934P는 Chemcolor New Zealand Limited로부터, Pluronic F-127은 BASF New Zealand Limited로부터, Methocel-E4MFG는 Dow Chemical Limited Australia로부터 무상으로 제공되었다.

등장성 인산염 완충액의 제조

등장성 인산염 완충액(0.063M) pH 7.0은 1.295 g의 무수성 오르토인산 수소이나트륨(Na₂HPO₄), 0.9125 g의 오르토인산 이수소나트륨(NaH₂PO₄.H₂O), 1.199 g의 염화나트륨을 물에 용해시켜 준비하였다. 이후, 물을 사용하여 부피를 250 ㎖로 만들었다.

Carbopol-934P를 함유하는 제형

Carbopol은 물에 녹인 등장성 만니톨 용액에서 제조하였다.

이중 강도 Carbopol 겔을 제조하기 위하여, 0.5 g의 Carbopol-934P를 50 ㎖의 이중 강도 등장성 만니톨 용액에 첨가하고, 상기 혼합물은 자성 교반기를 이용하여 30분동안 교반하고, 이후 방치하여 기포가 표면으로 상승할 수 있도록 하였다. 만니톨 용액은 물에 용해된 5.07 g 만니톨을 50 ㎖ 부피로 혼합하여 만들었다. pH는 물에 녹인 10%(w/v) 수산화나트륨 용액을 첨가하여 7.0으로 조정하였다.

저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)의 이중 강도 용액은 추출액을 증류수에 4 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 만들었다.

대조 제형을 만들기 위하여, 3 g의 이중 강도 Carbopol 겔을 3 ㎖의 물에 첨가하고, 상기 혼합물은 압설기로 부드럽게 혼합하였다. 이후, 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

치료 제형을 만들기 위하여, 3 g의 이중 강도 Carbopol 겔을 3 ㎖의 이중 강도 추출액 용액에 첨가하고, 상기 혼합물은 압설기로 부드럽게 혼합하였다. 이후, 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

Pluronic F-127을 함유하는 제형

Pluronic F-127 제형은 등장성 인산염 완충액 pH 7.0에서 제조하였다.

이중 강도 Pluronic 겔은 20 g의 Pluronic F-127을 50 ㎖의 차가운 등장성 인산염 완충액에 첨가하고, 상기 혼합물을 자성 교반기를 이용하여 부드럽게 교반하여 만들었다. 첨가이후, 용액은 추가로 10분동안 교반하였다. 이후, 4℃에서 하룻밤동안 유지시키고 3시간동안 초음파처리하며 4℃에서 하룻밤동안 보관하였다.

저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)의 이중 강도 용액은 추출액을 등장성 인산염 완충액에서 4 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 만들었다.

대조 제형은 4 g의 이중 강도 Pluronic 겔을 칭량하고 4 ㎖의 등장성 인산염 완충액을 여기에 첨가하여 만들었다. 이후, 수분동안 아이스박스에 유지시켜 Pluronic 겔을 용액으로 전환시켰다(물에 담긴 Pluronic는 4℃에서 용액이고, 37℃에서 겔이다). 그 다음, 압설기로 부드럽게 혼합하고 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

치료 제형을 만들기 위하여, 4 g의 이중 강도 Pluronic 겔을 바이알에 취하였다. 여기에 4 ㎖의 이중 강도 추출액 용액을 첨가하고, 이후 수분동안 아이스박스에 유지시켜 Pluronic 겔을 용액으로 전환시켰다. 그 다음, 압설기로 부드럽게 혼합하고 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

Methocel-E4M을 함유하는 제형

Methocel-E4M 제형은 등장성 인산염 완충액 pH 7.0에서 제조하였다.

이중 강도 Methocel 겔은 2 g의 Methocel-E4M FG를 25 ㎖의 교반된 등장성 인산염 완충액에 서서히 첨가하고, 상기 혼합물을 80℃로 가열하여 만들었다. 4℃로 냉각된 25 ㎖의 등장성 인산염 완충액을 Methocel 분산액에 추가로 첨가하고 3분동안 추가로 교반하였다. 이후, 혼합물은 4℃에서 5시간동안 유지시켰다.

저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)의 이중 강도 용액은 추출액을 등장성 인산염 완충액에서 4 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 만들었다.

대조 제형 단독은 5 g의 이중 강도 Methocel 겔을 칭량하여 만들었다. 여기에 55 ㎖의 인산염 완충액을 첨가하고, 혼합물은 압설기로 부드럽게 혼합하였다. 이는 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

치료 제형을 만들기 위하여, 5 g의 이중 강도 Methocel 겔을 바이알에 취하였다. 여기에 55 ㎖의 이중 강도 추출액 용액을 첨가하고, 이후 압설기로 부드럽게 혼합하였다. 상기 혼합물은 사용에 앞서 4℃에서 보관하였다.

쥐 상처 치유 시험

이들 실험은 Wellington School of Medicine and Health Sciences의 Animal Ethics Committee에 의해 규정된 조건하에 수행되었다.

수컷 Lewis 쥐(19-23주령)는 주변 환경에 동화시키고 전체 실험 기간동안 개별적으로 사육하였다. 이들 쥐들은 전체 실험 기간동안 0일부터 일일 경구 분량의 한천(4 ㎖)으로 보충된 정상적인 사료와 물을 섭취하였다. 0일에, 동물은 케타민(100 ㎎/㎏ 체중)과 자일라진(5 ㎎/㎏ 체중)의 주사(i.p.)로 마취시켰다. 각 동물은 등뼈를 따라 등 표면에 2개의 8 ㎜ 전피(full skin) 생검을 수행하였다. 상처는 두개골의 기부에서 6 ㎝와 8 ㎝ 지점에 만들었다. 각 생검이 피부에서 정확한 각도 로 수행되도록 주의하였다. 상처는 거즈로 닦아 과도한 혈액을 제거하고, 이후 스케일 마커 및 확인 번호와 함께 사진 촬영하였다. 그 다음, 치료 용액과 대조 용액을 상처 부위에 첨가하였다. 회복이후, Temgisic을 0.05 ㎎/㎏ 체중으로 피하 주입하였다. 치료 용액과 대조 용액은 도 범례(도 10-13)에 지시된 바와 같이 2-3일 간격으로 재투여하는데, 이런 과정동안 동물들은 3.5% 할로탄(halothane)으로 가볍게 마취시켰다. 상처는 재투여 시점 및 완전한 상처 봉합이 달성될 때까지 매 2-3일마다 사진 촬영하였다.

저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)의 투여량과 투여 빈도를 쥐 상처 치유 모델에서 평가하였다. 운반체, 투약 섭생, 녹용의 농도는 도 범례(도 10-13)에서 지시한다. 각 동물은 한 상처 부위에 25 ㎕의 치료 물질이 투여되고 다른 상처에는 25 ㎕의 대조 물질이 투여되었다. 모든 실험은 4마리에서 수행된 1 ㎎/㎖ 분량을 제외하고, 6마리 동물에서 수행되었다(도 10). 각 상처의 사진은 Canon EOS 3000N 카메라(F2.8 매크로 렌즈)로 촬영하였다. 각 노출의 프린트(print)는 디지털 형식으로 기록하고, 상처 면적은 NIH Image 1.63 소프트웨어를 이용하여 이들 영상으로부터 계산하였다. 각 시점에서 상처의 크기는 최초값의 백분율로 계산하고, 통계학적 분석은 각 시점에 대한 분산분석(ANOVA)으로 수행하였다.

상처 조직

상처는 상기한 바와 같이 쥐의 등에 만들었다. 0일에 각 쥐에서 대조 상처에는 PBS를 단일 투여하고, 치료된 상처에는 PBS에 담긴 저분자량 녹용 추출액(에탄 올 전처리이후 추출로 제조됨)의 10 ㎎/㎖ 용액을 동일자로 투여하였다. 동물(N=6)은 상처 발생이후 4일 시점에 안락사시켰다. 상처 부위는 절개하고, 4마리 동물에서 조직은 24시간동안 10% 중성 완충 포르말린에 위치시키고, 이후 70% 에탄올로 이전하였다. 다른 2마리 동물로부터 조직은 콜라겐 분석을 위하여 유지시켰다. 이들 상처 부위는 절반으로 분할한 이후, 파라핀 왁스에 포매하고 절단 표면을 얇은 절편으로 만들었다. 절편은 APES(3-아미노프로필트리에톡시-실란)으로 코팅된 슬라이드에 5 ㎛로 절단하였다.

마송 삼색 염색(Masson's Trichrome)으로 상처의 염색

염색은 Bancroft와 Stevens(1990)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 절편은 자일렌(5분 x 2)으로 탈랍하고, 이후 감소하는 농도의 일련의 에탄올 용액에서 재수화시켰다. 이후, 이들 절편은 Weigerts Haematoxylin으로 10분동안 염색하고 유수(running water)에서 10분동안 세척하였다. 이들은 0.5% Acid Fuchsin 용액에 5분동안 위치시키고, 이후 증류수에서 씻었다. 1% 인몰리브덴산(Phosphomolybdic acid)을 5분동안 사용하고 2% 메틸 블루로 5분동안 염색하며 증류수에서 세척하였다. 1% 아세트산으로 2분동안 처리한 이후, 절편은 증가하는 농도의 일련의 에탄올 용액에서 탈수, 자일렌으로 처리, DePeX(BDH)로 커버 슬립핑(cover slipping)을 수행하였다.

사진은 Zeiss Axioplan 현미경을 이용하여 Canon PowerShot G5(5 메기 픽셀) 디지털 카메라로 촬영하였다. 영상은 인치당 72 픽셀의 해상도로 Canon Remote Control 소프트웨어 프로그램을 이용한 리모트 컨트롤로 포착하고, 전시를 위하여 Adobe Photoshop(버전 5.5)으로 옮겨 주석을 달았다.

상처에서 라미닌 면역조직화학

절편은 자일렌(5분 x 2)으로 탈랍하고, 이후 감소하는 농도의 일련의 에탄올 용액에서 재수화시켰다. 모든 반응물, 항체, 효소는 달리 명시하지 않는 경우에 Zymed Laboratories Inc, CA로부터 구입하였다. 절편은 37℃에서 15분동안 펩신(Cat No. 20671651)으로 처리하였다. 후속 과정은 실온에서 수행하였다. 인산염 완충액(PBS)(5분 x 2)로 씻은 이후, 비-특이적 결합 부위는 1% BSA/PBS에 담긴 20% 정상 염소 혈청으로 30분동안 처리하여 차단하였다. 이후, 절편은 다클론 토끼 항-라미닌 항체(1:1000 희석도)(Novus Biologicals Inc., Cat No. NB 300-144)와 함께 1시간동안 배양하였다. 네거티브 대조를 위하여, 상기 일차 항체는 비-면역 토끼 면역글로불린 IgG(10 ㎍/㎖)로 대체하였다. 절편은 PBS(5분), 0.5% 탈지분유/0.1% Tween-20/2 PBS(10분 x 2), PBS(5분)에서 세척, 이후 비오틴처리된 이차 염소 항-토끼 항체(5 ㎍/㎖)와 함께 30분동안 배양을 수행하였다. 절편은 PBS(5분), 0.5% 탈지분유/0.1% Tween-20/2 PBS(10분 x 2), PBS(5분)에서 다시 세척하였다. Zymed Peroxo-블록은 불활성 내인성 과산화효소에 9분동안 적용하였다. PBS(5분 x 2)로 세척한 이후, 절편은 HRP-스트렙타비딘 공액체(2.5 ㎍/㎖)와 함께 10분동안 배양하였다. 절편은 PBS(5분 x 2)에서 세척하고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 키트로 현상시켰다. 물에서 씻어낸 이후, 절편은 증가하는 농도의 일련의 에탄올 용액에서 탈수, 자일렌으로 처리, DePeX(BDH)를 이용한 커브 슬립핑을 수행하였다. 사진은 Zeiss Axioplan 현미경을 이용하여 400ASA Kodak 명암 필름에 촬영하였다. 영상은 전시를 위하여 Adobe Photoshop(버전 5.5)으로 옮겨 주석을 달았다.

결과

분획과 겔 여과 크로마토그래피

Centriprep - YM10 장치를 통한 한외여과에 의한 녹용의 분획은 고분자량 분획물(도 1)과 저분자량 분획물(도 2)을 결과하였다.

전체 단백질 추출액의 겔 여과 크로마토그래피 프로필은 도 3에 제시한다. 이는 전체 단백질 녹용 추출액에서 단백질이 다양한 분자량을 보유하고, 예상된 바와 같이 고분자량 단백질이 우세하다는 것을 보여준다. 대조적으로, 70% 에탄올로 녹용의 전처리로 유도된 저분자량 추출액의 대응 프로필(도 4)은 에탄올 전처리 과정이 주로 10 kDa 미만의 단백질을 함유하는 녹용 추출액을 결과한다는 것을 보여준다. 상기 추출액에서 6개의 주요 피크가 분명하게 나타난다.

SDS-PAGE 전기영동

Coomassie(도 5A)와 은(도 5B)으로 염색된 SDS-폴리아크릴아마이드 겔은 전체 단백질 추출액에 비하여, 저분자량 녹용 추출액 내에 존재하는 단백질을 가시화시키고 더욱 특성화시키는데 이용하였다. Coomassie 또는 은 염색에서, 전체 단백질 추출액에는 특히 60 kDa 초과와 20 kDa 정도의 다양한 단백질이 나타나는 반면, 저분자량 추출액에는 2개의 분명한 밴드만이 나타났다. 이들은 6 kDa 정도 및 60 kDa 초과의 겉보기 분자량을 보유하였다.

세포 증식 검사

사슴뿔 추출액은 1% 혈청에 비하여, 배양중인 인간 배꼽 정맥 내피 세포의 증식을 강화시킬 수 있었다(도 6). 이런 강화된 증식은 저분자량 추출액(70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 제조됨)에서 가장 현저하였다. 흥미롭게도, 전체 단백질 녹용 추출액은 3분간 끓여지는 경우에도, 내피 세포에 대한 증식 활성을 유지하였다.

소 대동맥 내피 세포의 이동

이들 추출액의 혈관형성 활성을 확증하기 위하여, 소 대동맥 내피(BAE) 세포의 이동을 조사하였다. 한외여과와 에탄올 침전 방법으로 만들어진 저분자량 추출액은 대조에 비하여, 세포가 처음 긁힌 상처 라인으로부터 이동하는 세포의 거리와 수를 현저하게 증가시켰다(도 7).

도 8에 도시된 바와 같이, 저분자량 추출액(에탄올 전처리 방법으로 유래됨)의 3분간 끓임은 BAE 세포의 이동에 대한 추출액의 강화 효과를 감소시키지 않았다.

In Situ 혼성화

이에 더하여, 사슴뿔의 혈관형성 활성은 가장 널리 공지된 단백질 혈관형성 인자인 혈관 내피 세포 인자(VEGF)와 무관한 것으로 확인되었다. In situ 혼성화는 VEGF의 엑손 1-4에 걸쳐있어 모든 절단접합 변이체를 검출할 수 있는 프로브를 이용하여 수행하였다. 도 9의 결과는 VEGF mRNA가 사슴뿔의 전열골 세포에서만 검출되고, 혈관에 바로 인접한 세포 내에서는 검출되지 않는다는 것을 입증한다. VEGF에 대한 mRNA의 양은 상대적으로 적은 것으로 생각된다.

in situ 혼성화를 이용하여 일부 다른 고전적인 혈관형성 인자에 대한 사슴 뿔 mRNA를 또한 검사하였다. 놀랍게도, 산성 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자 mRNA을 현저한 수준으로 발견할 수 없었는데, 이는 다른 인자가 사슴뿔 내에서 혈관형성에 중요한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.

쥐 상처 치유 시험

도 10에서는 염수, 또는 70% 에탄올로 녹용의 전처리이후 만들어진 저분자량 추출액의 1 ㎎/㎖ 용액으로 치료된 상처의 봉합 비율을 도시한다. 치료된 상처는 염수만으로 치료된 대조 상처보다 현저하게 빠른 상처 치유를 보였다.

쥐 상처 치유 모델을 이용하여 치료의 용량 범위를 조사하였다. 저분자량 녹용 추출액(에탄올로 전처리이후 추출로 제조됨)은 PBS 담체 단독(대조 치료)과 비교하였다. 25 ㎕ 부피의 이들 용액을 상처 부위에 위치시켰다. 0.1 ㎎/㎖ 분량의 녹용 추출액에서는 대조군과 치료군 사이에 약간의 차이가 있긴 했지만, 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(도 11a). 2 ㎎/㎖의 분량에서 저분자량 녹용 추출액은 2, 4, 6, 8, 10, 14일에 상처 봉합 속도를 현저하게 개선시켰다(도 11b). 10 ㎎/㎖ 분량의 저분자량 녹용 추출액은 8일과 10일에 통계학적으로 신속한 상처 봉합을 보였다(도 11c). 매우 높은 분량(100 ㎎/㎖)의 추출액은 6, 8, 10, 12, 14, 16일에 상처 봉합 속도를 유사하게 강화시키고, 현저한 개선을 보였다(도 11d).

상처 발생 당일에 10 ㎎/㎖로 저분자량 녹용 추출액(에탄올 전처리이후 추출로 제조됨)의 단일 투여 효과를 담체 단독(대조)과 비교하였다(도 12). 추출액의 단일 투여는 상처 봉합 속도를 개선하였는데, 치료된 상처와 대조 상처 사이의 차이는 8일에 통계학적으로 유의하였다.

저분자량 녹용 추출액(에탄올로 전처리이후 추출로 제조됨)의 다양한 제형을 2 ㎎/㎖ 분량에서 조사하였다(도 13). 각 경우에 대조는 추출액이 존재하지 않는 담체 단독이었다. Methocel로 조제된 추출액은 담체 단독에 비하여, 2-14일에 상처 봉합 속도를 현저하게 개선하였다(도 13b). Pluronic으로 조제된 추출액은 모든 측정 일자에서 상처 봉합 속도를 현저하게 개선시킨 반면, 담체 단독(대조)은 초기 치유 단계에 부정적인 영향을 주었다(도 13c). 추출액을 Carbopol로 조제하는 경우에, 상처 봉합 속도는 2, 4, 6, 8, 10, 14일에 현저하게 개선되었다(도 13d).

상처 조직

상처 조직은 PBS의 단일 투여에 비하여, 10 ㎎/㎖의 저분자량 녹용 추출액(에탄올로 전처리이후 추출로 제조됨)의 단일 투여이후 4일 시점에 치유를 조사하였다. 본 시험에 6마리 동물이 이용되었지만, 조직 검사에는 4마리만 이용되었다. 치유중인 펀치 생검 부위는 생검의 좌측에 위치한 상처입지 않은 조직과 분명하게 차별되었다(도 14A,B). 대조 상처에서, 펀치 생검 부위는 표면에서 딱지 및 아래의 상처 조직으로 구별되었다. 상기 상처 조직은 붕괴되었고 산재된 세포 성분과 함께 세포외 기질로 구성되었다(도 14A,C). 치료된 상처는 현저하게 상이한 조직을 보였다(도 14B,D). 딱지(도 14B)는 상피와 유사한 위치에서 나타났다. 표면 아래에, 피부 조직이라고 하는 체계화된 조직 층이 존재하였다(도 14D). 여기에는 흉터를 유발할 만큼 많은 콜라겐이 존재하지 않았다. 이는 우수한 세포 조직을 보유하고, 자연적인 상처 치유 과정을 매개하는 풍부한 혈관망을 보유하는 것으로 나타났다. 4마리의 동물 중에서 3마리로부터 치료된 상처 부위는 도 14에 도시된 것과 매우 유 사한 반면, 나머지 하나의 치료된 상처 부위는 도 14에 도시된 것에 비하여 치료된 상처와 대조 상처 사이에 차이가 덜하였다.

조직학적 조사에 뒤이어 기저 막 단백질 라미닌에 대한 면역조직화학을 수행하였다. 대조 상처에 대한 라미닌 면역조직화학의 결과는 특히, 상피 표면 아래에서 치료된 상처에 비하여 혈관 없음 또는 감소된 숫자의 혈관을 보였다(도 15A,C). 대조 상처에서 라미닌은 상처 가장자리에서 검출되었는데, 이는 항체 염색이 이들 절편에서 기능하였음을 지시한다(도 15E). 치료된 상처 내에서, 기저 혈관 및 상피 표면 아래의 혈관이 분명하게 나타났다(도 15B,D). 표면 혈관은 기저 혈관과 상이한 형태를 보유하고, 상피 표면에 비하여 더욱 밝게 염색되었다.

고찰

본원에서는 녹용으로부터 유래된 추출액과 분획물에 포함된 펩티드와 단백질의 크기에 집중하였다. 이는 건조된 녹용 조직의 주요 성분이 단백질이고, 고전적인 혈관형성 인자 역시 단백질이라는 인식에 기인하였다. 하지만, 다른 비-단백질 성분 역시 본 발명자들에 의해 기술된 녹용 추출액과 분획물에 함유되고, 관찰된 활성에 기여하거나 이런 활성의 원인이 된다는 것은 의심할 여지가 없다.

혈관형성 활성을 보유하는 10 kDa 이하의 저분자량 분획물의 확인은 많은 고전적인 혈관형성 성장 인자가 10 kDa를 초과한다는 점에서 놀라운 것이었다(표 1).

겔 여과 크로마토그래피 분석과 SDS-PAGE 분석은 저분자량 녹용 추출액의 조성에 관하여 겉보기에 상반되는 정보를 제공하였다. Coomassie Brilliant Blue G250과 은으로 염색된 SDS-PAGE 겔(도 5)에서, 저분자량 추출액은 겔 여과 크로마 토그래피 분석의 결과(도 4)로부터 예상되는 것보다 적은 수의 밴드를 보였다. 이에 더하여, 10 kDa 초과 분자량의 단백질이 예상했던 것보다 상대적으로 더 강하게 염색되었다. 하지만, SDS-PAGE 겔에서 단백질의 불완전 염색 또는 염색 부재는 Coomassie와 은 염색의 널리 인정되는 특징이다(참조: Smith, 2002; Kondratiuk et al., 1982). 저분자량 추출액에서 10 kDa-이하 단백질의 예상보다 낮은 염색 강도는 이런 현상에 기인하는 것으로 생각된다.

녹용 조직에서 in situ 혼성화에 의한 검출(도 9)에서 강력한 혈관형성 성장 인자 VEGF에 대한 메신저 RNA는 전연골 부위에 한정되었고 낮은 수준으로만 존재하였다. aFGF 또는 bFGF mRNA에 대한 In situ 혼성화에서, 혈관형성이 진행되는 부위와 연관된 전사체가 관찰되지 않았다(데이터 제시하지 않음). 이는 어떤 인자가 사슴뿔에서 최대 2 ㎝/day의 혈관 성장을 유도하는 지에 관한 의문을 제기하였다.

추출액에 대한 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)의 증식 반응을 측정하였다. 전체 단백질 녹용 추출액은 3분간 끓임 이후에도 HUVEC의 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 6). 저분자량 녹용 추출액(70% 에탄올로 전처리이후 추출로 제조됨)은 HUVEC의 현저한 증식을 유도하였다. 소 대동맥 내피(BAE) 세포를 이용한 내피 세포 이동 검사에서, 전체 단백질 녹용 추출액, 에탄올 침전으로 제조된 저분자량 추출액, 한외여과로 제조된 저분자량 추출액 모두 더욱 많은 세포가 긁힌 부위로 이동하도록 하였다(도 7). 에탄올 침전으로 제조된 저분자량 추출액은 100 ㎍/㎖에서 최대 반응을 보이고, 500 ㎍/㎖에서는 반응이 덜하였는데, 이는 용량 반응을 지시한다.

70% 에탄올로 전처리이후 녹용의 추출로 제조된 저분자량 추출액은 3분간 끓임 전후에 활성을 조사하였다(도 8). 이의 결과는 이런 끓임이 검사된 분량에서 활성에 전혀 영향을 주지 않음을 보여준다. 이는 혈관형성 활성에 관여하는 분자들이 최대 3분동안 가열되어도 안정하다는 것을 입증한다.

70% 에탄올로 전처리이후 녹용의 추출로 제조된 저분자량 추출액은 쥐의 생체내에서 검사하였는데, 상처 치유를 최대 3일까지 가속화시키는 것으로 밝혀졌다(도 10). 치료된 상처 부위는 치료 과정의 시작과 종결 시점 모두에서 훨씬 빠르게 치유되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 추출액이 전체 치유 기간동안 효과를 발휘한다는 것을 암시한다.

동물 상처 치유 시험의 결과는 저분자량 녹용 추출액(에탄올로 전처리이후 추출로 제조됨)에 대한 다수의 긍정적인 특성을 지시한다. 가령, 이는 멸균 선량(2.5 Mrad)의 γ-방사선에 노출된 이후에도 강력한 활성을 유지하였다. 상기 추출액은 1 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖의 분량에서 향상된 상처 봉합 속도를 보유하는 것으로 보인다(도 10과 11). 어떤 분량에서도 부정적인 영향은 관찰되지 않았다. 반응을 유도하는데 요구되는 투여 횟수는 상처 발생 당일에 저분자량 녹용 추출액의 단일 처리를 제공하여 조사하였다(도 12). 대조 상처에 비하여 강화된 상처 봉합 속도가 관찰되었는데, 이런 차이는 한 시점(8일)에서 통계학적 유의성에 도달하였다. 이는 흥미로운 결과이며, 최적 결과를 제공하는 투약 섭생을 확인하기 위하여 다양한 투약 섭생의 조사가 요구된다.

2 ㎎/㎖ 분량에서 저분자량 녹용 추출액(에탄올로 전처리이후 추출로 제조 됨)의 다양한 제형을 쥐 상처 치유 모델에서 검사하였다(도 13). Methocel과 Carbopol로 만들어진 제형은 PBS를 담체로 이용한 제형과 매우 유사하였고, 대부분의 시점에서 상처봉합 속도를 현저하게 개선하였다. Pluronic 제형은 담체 단독이 최초 상처 봉합 속도에 부정적인 영향을 주었기 때문에 금기시된다(도 13c). 이들 결과는 추출액이 다양한 제형으로 전달되고, 활성을 여전히 보유할 수 있다는 것을 지시한다.

상처 조직은 마송 삼색 염색(Masson's Tichrome)으로 조사하였는데, 이는 일반적인 염색법이긴 하지만 세포외 기질 단백질을 표시하는데 효과적이다. 도 14에서 영상은 상처 발생이후 4일 시점에서, 저분자량 치료된 상처 내에서 피부 조직이 정상 피부에서 예상되는 수준의 구조를 보유한다는 것을 보여준다. 이는 상피가 재형성되고, 혈관 및 체계화된 세포 성분을 보유하는 피부 조직이 상처 부위로 이동했다는 것을 입증한다. 대조 상처는 여전히 초기 상처 회복 단계에 머물러 있는데, 딱지 및 주로 콜라겐인 피부 상처 조직이 특정한 체계가 없는 세포 성분과 함께 산재한다. 따라서, 이런 조직학적 성상은 저분자량 추출액 치료된 상처가 더욱 진전된 치유 단계에 있음을 암시한다. 또한, 이런 조직학적 성상은 상기 추출액이 단순한 콜라겐성 흉터가 아닌 정상적인 상처 봉합을 결과하는 조직 회복을 매개한다는 것을 암시한다.

상처는 기저 막 단백질, 라미닌에 대하여 면역염색하였다. 라미닌은 내피의 기저 표면에서 기저 막과 결합한다. 이의 결과는 상처 발생이후 4일 시점에, 대조(PBS 치료된) 상처 내에서보다 저분자량 녹용 추출액 치료된 상처의 상처 부위 내 에서 더욱 많은 혈관이 존재한다는 것을 보여준다. 대조 상처에 비하여 치료된 상처의 정단/상피-이하 부분에서 혈관 숫자의 증가가 가장 현저하였다. 대조 상처는 상처 부위 내에서 혈관이 거의(또는 전혀) 관찰되지 않았다(도 15A,D,E). 대조 상처의 가장자리에서, 상처입지 않은 부위에서 혈관은 분명한데, 이는 면역염색이 이들 절편에서 성공적으로 수행되었음을 지시한다(도 15E). 저분자량 녹용 추출액 치료된 상처에서 혈관은 라미닌에 대한 면역염색이 도 14에 도시된 것과 상이한 동물로부터 도출되긴 했지만, 마송 삼색 염색에 의해 제안된 방식에서 상처의 상피 아래에서 분명하게 관찰되었다. 치료된 상처의 표면에서 혈관은 상피 표면에서 더욱 밝게 염색되었다(도 15D). 또한, 혈관은 표면을 향하여 정렬되는데, 이는 이들 혈관이 정단면(apical surface)을 향하여 발달하고, 이들 혈관 주변에 기저 막이 구축되는 과정에 있음을 암시한다. 라미닌 면역조직화학의 결과는 증가된 혈관형성이 저분자량 녹용 추출액의 상처로의 적용에 기인한다는 것을 암시한다.

결론적으로, 이들 결과는 녹용으로부터 유래된 조성물이 혈관형성 활성을 보유한다는 것을 입증한다. 특히, 에탄올 전처리이후 추출로 제조된 저분자량 녹용 추출액은 강력한 상처 치유 활성을 보유한다. 시험관내에서 이는 내피 세포의 증식과 이동을 증가시켰다. 생체내 상처 치유 모델에서, 저분자량 녹용 추출액은 1 ㎎/㎖ - 100 ㎎/㎖의 용량 범위에서 상처 봉합 속도를 증가시켰다. 어떤 단계에서도 이들 동물에 대한 임의의 부작용은 관찰되지 않았다. 치료된 상처의 형태는 상기 추출액이 혈관형성을 수반하는 유익한 상처 치유 반응을 유도한다는 것을 암시한다. 이들 결과는 저분자량 녹용 추출액으로 상처 치료가 상처 봉합 속도를 개선하 고 상처 치유를 보조하는데 유효한 방법임을 지시한다.

본 발명의 여러 특징은 실례로서만 기술되었으며, 첨부된 특허청구범위에 정의된 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다.

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Claims (15)

10 kDa 이하의 분자량을 보유하고 내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 성분을 함유하는 녹용의 분리된 추출액.

제 1항에 있어서, 성분은 펩티드인 것을 특징으로 하는 녹용의 분리된 추출액.

제 1항 또는 2항에 있어서, 성분은 아래의 과정: 최대 3분동안 100℃로 가열; 2.5 Mrad 이상의 γ-방사선에 노출에 의한 멸균; 또는 냉동 해동 중에서 적어도 한가지 과정에 적용된 이후에도 내피 세포에 대한 증식 효과 또는 혈관형성을 촉진하는 능력을 유지하는 것을 특징으로 하는 녹용의 분리된 추출액.

제 1항 또는 2항에 있어서, 상처의 치료를 위한 약물의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 녹용의 분리된 추출액.

제 1항 또는 2항에 있어서, 지속적인 상처의 치료를 위한 약물의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 녹용의 분리된 추출액.

제 1항에 있어서, 성분은 펩티드, 탄수화물, 핵산, 유리 아미노산, 지질, 성 장 인자 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 녹용의 분리된 추출액.

내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 제 1항의 추출액에 존재하는 적어도 한가지 성분을 함유하는 녹용의 분리된 추출액.

내피 세포에 대한 증식 효과를 발휘하거나 혈관형성을 촉진하는 제 2항의 추출액에 존재하는 적어도 한가지 펩티드를 함유하는 녹용의 분리된 추출액.

상처 치유를 위하여 제 7항의 추출액에 존재하는 성분의 치료 효과량을 함유하는 조성물.

상처 치유를 위하여 제 8항의 추출액에 존재하는 펩티드의 치료 효과량을 함유하는 조성물.

상처 치유를 위하여 제 2항, 3항, 6항중 어느 한 항에 따른 분리된 추출액의 치료 효과량을 함유하는 조성물.

동물에서 상처를 치료하는 방법에 있어서, 제 9항, 10항, 11항중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.

본원에서 임의의 실례로서 기술된 상처 치유용 분리된 추출액.

본원에서 임의의 실례로서 기술된 상처 치유용 약물의 제조에 사용되는 분리된 추출액.

본원에서 임의의 실례로서 기술된 상처 치유용 조성물.

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