CN106061489B - 获得卵泡蛋白制剂的方法及用该方法生产的制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，并且可以发现生产应用，以从有机材料获得可用于药物中在移植干预期间抑制免疫力来治疗子宫内膜异位和一些肿瘤疾病以及用于兽药中的蛋白质制剂。根据用于生产卵泡蛋白质的技术，收集并冷却大型有角家畜卵泡液，在冷却后进行离心分离来生产上清液，上清液与冷却的丙酮混合，将所得混合物沉降，冷冻干燥，并且通过重复离心分离进行提纯来生产冻干产品，冻干产品溶解在缓冲液中，以8000‑10000rmp的速度将所得悬浮液离心分离15‑30分钟产生上清液，将上清液用DEAE‑琼脂糖离子交换色谱法分离，收集按洗脱液中氯化钠浓度为0.11‑0.19M所产生的流出物，并用水渗析至少8小时来生产所述制剂。从大型有角家畜卵泡液获得卵泡蛋白质制剂。所述制剂包含血清白蛋白和以抑制素βA免疫特异性为特征的TGF‑β家族蛋白质，其成分为如下比率(重量％)：以抑制素βА免疫特异性为特征的TGF‑β家族蛋白：0.00005–3.0；血清白蛋白：余量。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，并且可以发现生产应用，以从有机材料获得可用于药物中在移植干预期间抑制免疫力来治疗子宫内膜异位和一些肿瘤疾病以及用于兽药中的蛋白质制剂。
最近的调查显示，携带编码了抑制素βA的突变基因的人具有较高的子宫内膜异位发生率【Lin J.,L.Zong,S.H.Kennedy,K.T.Zondervan Coding regions of INHBA,SFRP4and HOXA10 are not linked to chromosome 7p13-15//Molecular HumanReproduction.2011年，第17卷，第10期，605-611页】，并且在文献【Bristol-Gould SK,Hutten CG,Sturgis C,Kilen SM,Mayo KE,Woodruff TK.–The development of a mousemodel of ovarian endosalpingiosis.//Endocrinology.2005；146(12):5228-36】中能找到关于抑制这种疾病在子宫内膜异位的小鼠模型中的发展情况的一些数据。
另外，在非典型子宫内膜中，存在关于激活素A(一种TGF-β家族蛋白)数量增加的数据，激活素A是一种患有子宫内膜异位的妇女体内的抑制素的生理拮抗物【Rombauts L.,J.Donoghue,L.Cann,R.L.Jones and D.L.Healy–Endometrial activin-A secretion inendometriosis Activin-A secretion is increased in the eutopic endometriumfrom women with endometriosis.//Australian and New Zealand Journal ofObstetrics and Gynaecology 2006；46期：148-153页】。
这两种类型的蛋白质通过对性类固醇激素的活性产生影响而起作用：激活素增强雌激素的活性，而抑制素抑制该活性。【Peng C,Ohno T,Khorasheh S,Leung PC.,-Activinand follistatin as local regulators in the human ovary.//BiolSignals.1996Mar-Apr；5(2):81-9；Knight PG,Glister C.,-Local roles of TGF-betasuperfamily members in the control of ovarian follicle development.//AnimReprod Sci.2003年10月15日；78(3-4):165-83】。
因此，生产一种在用于治疗目的时不含有任何一种呈现出相反效果的成分的制剂是非常重要的。
背景技术
已知获得卵泡调节蛋白质的常规技术，其包括使用卵泡液作为原料，该原料从猪卵巢中分离并且用硫酸铵沉淀。使如此得到的部分通过用pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液平衡的橙色A凝胶。将结合部分用相同缓冲溶液中0.5M KCl洗脱。收集含有芳香酶抑制剂的部分(根据Ohno)，用蒸馏水渗析并冷冻干燥。随后，使用阴离子交换柱通过阴离子交换层析(mono Q)来提纯所得产品，然后经由高效液相层析使用水中的Spherogel TSK G 300000W6通过凝胶色谱来洗脱和提纯具有TGF活性的部分。所得的卵泡调节蛋白质使用具有P10的超过滤器(Amicon)Diaflow系统(US 5102867 A,1992年4月7日)通过超滤来浓缩。
作为常规技术的分析结果，应注意其特征在于实施复杂，劳动强度高，这使得其工业实施较困难。此外，常规技术无法从卵泡调节蛋白质组分中分离特定成分，该特定成分能够有效地产生例如靶向子宫内膜异位的积极治疗效果。该技术生产的制剂特征在于治疗效果差。
已知从大型有角家畜卵泡液获得蛋白质的技术，根据该技术，将卵泡液沉淀并将沉淀物冷冻干燥，此外，在沉淀之前，应该将卵泡液冷却并离心分离18-25分钟。
用冷却至-18℃的丙酮进行杂质的沉淀，丙酮以成分比例V/V添加到卵泡液中：卵泡液-2，丙酮-3。以1000rpm速度将所得悬浮液沉降并离心分离20-35分钟；随后，收集沉淀物并冷冻干燥(RU 2185180 C2，2002年7月20日)。
作为已知技术的分析结果，应注意该技术在完成的制剂中产生高含量的杂质，该制剂包括促进子宫内膜异位的激活素并且因此不能有效用于这种疾病，即，其具有有限的应用范围。
已知提纯从大型有角家畜卵泡液获得的转化生长因子家族蛋白质的技术，根据该技术，将蛋白质溶解在具有中性pH的缓冲溶液中，通过硝化纤维过滤器过滤该溶液。对所得的上清液采用离子交换色谱法。因此，离子交换色谱法产生的组分用相同的缓冲液通过8mm柱(Cybracon by ICN)，收集活性部分并用凝胶色谱提纯。用UPM 200过滤器过滤所得产品，收集滤液。之后，对滤液进行两步提纯。在第一步，使用反向高压色谱法进行滤液提纯。在滤液提纯的第二步，制备式等电聚焦(RU 2201241 C2，2003年3月27日)获得最接近的类似物。
作为常规技术的分析结果，应注意该技术特征在于实施复杂，劳动强度高，阻碍了其工业实施。此外，该技术无法从转化生长因子中专门获得有效靶向子宫内膜异位的治疗成分。
发明内容
该组发明的技术结果是开发一种简单可用的技术，用于生产具有特定成分的蛋白质制剂，其获得高生物活性的制剂以及其对环境因素(温度，湿度等)的抵抗力，因此与已知技术相比提供了更长的保藏期限。
用于获得卵泡蛋白质制剂的新技术中的内容提供了所述技术结果，根据该新技术，收集并冷却大型有角家畜卵泡液，在冷却后进行离心分离来生产上清液，上清液随后与冷却的丙酮混合，将所得混合物沉降，随后冷冻干燥，并且通过重复离心分离进行提纯来生产冻干产品，其新颖之处在于，所述冻干产品溶解在缓冲液中，以8000-10000g的速度将所得悬浮液离心分离15-30分钟产生上清液，将上清液用基于DEAE-琼脂糖的离子交换色谱法分离，收集按洗脱液中氯化钠浓度在0.11M到0.19M之间所产生的流出物，并用水渗析至少8小时来生产所述制剂。
从大型有角家畜卵泡液获得的卵泡蛋白质制剂包含血清白蛋白和以抑制素βА的免疫特异性为特征的TGF-β家族(TGF-β，转化生长因子)蛋白质，其成分为如下比例(w/w％)：
以抑制素βА的免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白质：0.00005–3.0；
血清白蛋白：余量
使用从大型有角家畜卵巢卵泡分离的卵泡液作为获得卵泡蛋白质制剂的原料是必要的，因为：首先，其保证容易获得来源，其次，根据调查，使用其他动物品种的卵泡液作为原料无法生产具有所需要量的活性成分的蛋白质产品。根据实验数据，利用例如猪卵泡液生产卵泡蛋白质制剂(美国专利No.5102867)无法获得具有指定蛋白质组分的产品。
在第一次离心分离直线进行液体冷却允许能够保持蛋白质在其天然状态下完整并且增加其产量。
离心分离(第一次和第二次两者)提供了从细胞残留物提纯可溶蛋白质。
在冷却的丙酮中进行沉淀允许从非蛋白质成分提纯制剂。
DEAE-琼脂糖离子交换色谱法使得获得具有特定组分的卵泡蛋白质制剂，该组分包括以抑制素βA免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白质和大型有角家畜血清白蛋白。
通常使用术语“抑制素βA”。在文献中还可以发现其相同的名称-抑制素A。
冻干卵泡蛋白质制剂允许更长时间地存储制剂。
应该注意，并且已经在实验上证明所请求的技术结果只有通过无条件完成申请材料中记录的所有行为，严格遵守其请求的顺序和方式并且主语制剂成分的数量比才能实现。因此，权利要求中所述的发明特征及其完成顺序是必须的。
具体实施方式
用几个步骤实现用于生产卵泡蛋白质制剂的技术。
首先，从卵巢收集大型有角家畜卵泡液。以8000-10000g离心分离收集的液体来胜寒上清液。将离心分离产生的上清液导入干净的容器中，并且冷却到4-8℃，以便增加沉淀的蛋白质的量。此后，冷却到-18℃的丙酮(ASC级别)以1/1至2/3的体积比加入上清液中，混合并以8000-10000g离心分离(Eppendorf 5804离心机)15-25分钟来产生沉淀。丢掉上清液。将沉淀物转移到容器中，冷却至-18℃并且在冷冻干燥器(VirTis benchtop SLC)中干燥直到其完全干燥。结果，获得难溶于水的、白色至深黄色的球形粉末形式的冻干产品。
下一步，连续搅拌15-30分钟将冻干产品溶于pH7.2的缓冲液中。以8000-10000g的速度将所得悬浮液离心分离15-30分钟以产生上清液。将所得上清液倒入并施加到DEAE-琼脂糖柱上。柱填充花费6-8小时。用缓冲液将柱平衡12-24小时，直到pH等于7-7.2。
接下来的蛋白质制剂的分离可以用产生相同结果的两种方式进行：
从3g冷冻卵泡液获得的上清液应用到柱上并使180ml缓冲液流过。使用具有针对λ＝280nm波长的UV探测器的BioRad BioLogic LP色谱系统，加入112ml的0.11M NaCl溶液(近似2.6体积柱)。然后，120ml的0.11-0.19M NaCl溶液和缓冲液一起加入，并且同时开始将流出物收集到容器中。此后，40ml的2M NaCl溶液加入柱中，以去除柱中残留的所使用的物质。所收集的流出物在-18℃-35℃下在冷冻箱(三洋MDF-436)中冷冻，然后冷冻干燥。
从3g冷冻卵泡液获得的上清液应用到柱上并使用色谱系统(如BioRad)用pH7.05-7.20的缓冲液中0-1M梯度的NaCl洗脱。收集用0.11-0.19M的NaCl冲洗的流出物。该控制使用自动记录仪实现。所收集的流出物在-18℃-35℃下在冷冻箱(三洋MDF-436)中冷冻，然后冷冻干燥。
作为方法1或方法2的结果，获得了相同的结果；因此，使用其中一种方法或另一种法的考量取决于器械储备和技术条件。
作为上述操作的结果，产生了具有缓冲液的蛋白质制剂，轻质白色超微粉末。
为了从生产的制剂中去除残余缓冲液污染物，在下一步，对具有缓冲液的蛋白质制剂进行渗析，结束后：
将制剂溶解于蒸馏水中；
用2升蒸馏水以14kDa的拒绝体积进行通过膜(ROTH)的渗析，根据以下模式置换馏出物：
渗析3小时(2升馏出物)；
置换馏出物；
渗析3小时(2升馏出物)；
置换馏出物；
渗析2小时(2升馏出物)。
该方法在4-8℃下进行。
产生渗析液。切开膜，将溶液倒入玻璃烧杯中并冷冻干燥。
使用普通的ELISA技术检测权利要求中所述的成分的定量含量，并且用确定VERO细胞培养物的生物活性的标准方法来检测蛋白质制剂的活性。
作为该技术实现的结果，获得了卵泡蛋白质制剂，其包含血清白蛋白和以抑制素βA免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白质，其成分为如下比率(重量％)：
以抑制素βА免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白：0.00005-3.0；
血清白蛋白：余量。
从给出的实施例将更容易理解所要求保护的过程的本质。首先，收集大型有角家畜卵泡液，结束后，用96％酒精擦拭卵泡区的大型有角家畜卵巢，然后用一次性无菌注射器刺穿，将10ml卵泡液收集到酒精冲洗的体积不超过20ml的离心测试管中。以8000g将卵泡液离心分离(Eppendorf 5804离心机)25分钟。所得上清液倒入干净容器中并冷却至6℃。然后，将冷却至-18℃的丙酮(HPLC级)以1/1体积比加入上清液中，混合并以8000g离心分离(Eppendorf 5804离心机)15分钟。丢掉上清液。将沉淀物转移到容器中，冷却至-18℃并且在冷冻干燥器(VirTis benchtop SLC)中干燥直到其完全干燥。
此外，将1.3g冻干的卵泡液溶解在50ml玻璃烧瓶内的40ml的pH 7.2的缓冲液中，并使用超声搅拌器UZM 001(波兰)连续搅拌30分钟。以8000g的速度使用Eppendorf 5804离心机将所得悬浮液离心分离30分钟。上清液(大约8ml)倒入并施加到柱(批号：57407-08-6DFF100，Sigma，二氨基乙基琼脂糖。柱：玻璃，大小为1.5*30cm，有效体积42ml。柱填充时间为6小时。用缓冲液将柱平衡至pH7.2的时间为12小时。)之后，从1.3g冷冻卵泡液产生的上清液应用到柱上并用180ml缓冲液清洗柱。使用色谱系统(具有针对λ＝280nm波长的UV探测器的BioRad BioLogic LP)，加入112ml的0.11M NaCl溶液(近似2.6体积柱)。然后，120ml的0.19M NaCl溶液和缓冲液一起加入，并且同时开始将流出物收集到容器中(应该得到120ml溶液)。此后，40ml的2M NaCl溶液加入柱中，以去除柱中残留的所使用的物质。所收集的流出物在-18℃-35℃下在冷冻箱(三洋MDF-436)中冷冻，然后冷冻干燥。
之后，对所得的冻干物进行渗析，结束后：
将0.26g蛋白质溶于10ml蒸馏水中。
用2升蒸馏水以14kDa的拒绝体积进行通过膜的渗析，根据以下模式置换馏出物：
渗析3小时(2升馏出物)；
置换馏出物；
渗析3小时(2升馏出物)；
置换馏出物；
渗析2小时(2升馏出物)。
该方法在6℃下进行。
获得12ml渗析物。切开膜，将溶液倒入50ml的玻璃烧杯中。根据Bradford确定蛋白质浓度，并重复冷冻干燥过程。
使用ELISA技术检测权利要求中所述的成分的含量，并且通过用VERO细胞培养物确定生物活性来检测蛋白质制剂活性。
结果，获得0.26g卵泡蛋白质制剂，其包含：
大型有角家畜血清白蛋白0.254813g
以抑制素βА免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白0.000013g
杂质0.005174g，其对所述技术结果不产生显著影响。
应该注意只有在如权利要求中所述的卵泡蛋白质制剂的成分含量限制范围才能实现所述技术结果。
在以抑制素βА免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白含量较低的情况下，制剂丧失其活性。在该蛋白含量较高的情况下，出现病理性副反应的风险上升。血清白蛋白的存在为蛋白质制剂中的抑制素提供了稳定性。
该制剂已经在子宫内膜异位的大鼠模型中得到证实。对患有手术引起的子宫内膜异位的大鼠以每只40μg剂量的制剂进行腹腔给药，每日一次，给药10天，导致这些大鼠内的植入体积下降7.9倍。
工业实用性
此技术生产并且具有前述组分的制剂用于治疗妇女的子宫内膜异位。
子宫内膜异位是子宫内膜(子宫壁的内层)细胞生长超出该层时的一种常见妇科疾病。子宫内膜样的组织具有激素的受体；因此，其很容易具有在正常子宫内膜中发生并在月经期间自身脱落的相同变化。这些少量出血导致周围组织的炎症，并引起主要的疾病表现：疼痛、器官体积增大和不孕症。当前子宫内膜异位治疗的主要方法是激素疗法和手术。
实施例
用具有以下组分的制剂(用量0.3mg)进行治疗：
大型有角家畜血清白蛋白0.25mg
以抑制素βА免疫特异性为特征的TGF-β家族蛋白0.000013mg
治疗给药方案：
第一个月-注射10次，每次0.3mg，每次从月经周期第五天开始
第二个月-注射10次，每次0.3mg，每次从月经周期第五天开始
第三个月-注射10次，每次0.3mg，每次从月经周期第五天开始。
患者U.，27岁。临床诊断：弥散性子宫内膜异位，于2008年确诊。抱怨严重的痛经。
治疗的前临床生化指标：尿分析，总血细胞计数，生物化学，凝血象，肿瘤标记物在正常限度内。血液激素水平：雌二醇0.618nmol/L，黄体酮7.6nmol/L。盆腔内器官超声检查：子宫内膜异位。形态结论：活跃子宫腺肌病。
在治疗背景下记录的积极动态：无疼痛，适量的月经。临床生化指标在正常限度内。在激素血液分析中，注意到雌二醇增加到0.72nmol/l，黄体酮下降到3.97nmol/l。骨盆器官的超声检查：积极动态。形态结论：没有发现子宫内膜异位(积极动态)。
患者S.，39岁。临床诊断：病灶性子宫内膜异位，于2002年确诊。抱怨严重的痛经。
治疗的前临床生化指标：尿分析，总血细胞计数，生物化学，凝血象，肿瘤标记物在正常限度内。总血细胞计数：Hb-110g/l。肿瘤标记物CA125-47.6(规格小于35U/ml)。血液激素：雌二醇0.56nmol/L，黄体酮1.8nmol/L。盆腔内器官超声检查：子宫内膜异位。形态结论：中度活跃子宫腺肌病。
在治疗背景下记录的积极动态：疼痛和月经过量症状减少。临床生化指标在正常限度内。临床血液分析：Hb–102g/l。在激素血液分析中，注意到雌二醇水平增加到0.8nmol/l，黄体酮水平下降到0.2nmol/l。骨盆器官的超声检查：积极动态。形态检查：弱活性子宫内膜异位(积极动态)。
患者U.，33岁。临床诊断：弥散型子宫内膜异位，于2000年确诊。抱怨大量的月经。不规则月经周期。
治疗的前临床生化指标：尿分析，总血细胞计数，生物化学，凝血象，肿瘤标记物在正常限度内。血液激素：雌二醇0.538nmol/L，黄体酮3.7nmol/L。盆腔内器官超声检查：子宫内膜异位。形态结论：轻度活跃子宫腺肌病。
注意在治疗背景下的积极动态：月经过量症状减少。临床生化指标在正常限度内。在激素血液分析中，注意到雌二醇下降到0.218nmol/l，黄体酮增加到36.7nmol/l。骨盆器官的超声检查：积极动态。形态检查：没有发现子宫内膜异位(积极动态)。
在治疗过程中没有观察到副作用。
对罹患子宫内膜异位的患者进行制剂给药已使得：月经过量消失-8％的病例，月经过量减少-92％的病例；痛经消失-36％的病例，痛经减少-64％的病例。
在评价疾病严重程度过程中，32％的病例症状消失，68％的病例严重程度降低。
基于综合(组织学和免疫形态学)检查的结论，80％的病例确定了积极效果，在余下的病例中，发现了子宫腺肌病病灶活性降低的趋势。
该制剂还能够用于治疗一些肿瘤疾病和用于兽药中。
Claims (2)
1.获得用于治疗子宫内膜异位症的卵泡蛋白质制剂的方法，包括以下步骤，收集并冷却大型有角家畜卵泡液，在冷却后进行离心分离来生产上清液；所述上清液与冷却的丙酮混合，将所得混合物沉降，冷冻干燥，并且通过重复离心分离进行提纯来生产冻干产品，其特征在于，将冻干产品溶解在缓冲液中，以8000-10000g的速度将所得悬浮液离心分离15-30分钟产生上清液，将上清液用DEAE-琼脂糖离子交换色谱法分离，收集按pH7.0-7.2洗脱液中氯化钠浓度为0.11-0.19M所产生的流出物，流出物用水渗析至少8小时获得渗析液，将所得渗析液冷冻干燥，即得用于治疗子宫内膜异位症的卵泡蛋白质制剂，所述用于治疗子宫内膜异位症的卵泡蛋白质制剂包含血清白蛋白和TGF-β家族蛋白质，其成分为如下比率(重量％)：TGF-β家族蛋白：0.00005–3.0；血清白蛋白：余量。
2.采用权利要求1中获得用于治疗子宫内膜异位症卵泡蛋白质制剂的方法制备的卵泡蛋白质制剂。
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