CN104994886A - 病毒灭活的生物混合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病毒灭活的生物液体或干燥混合物及其制备。主要地,本发明涉及但不限于源自血小板源的混合物。
Description
技术领域
一般来将,本发明涉及病毒灭活的生物液体或干燥混合物,并且涉及其制备。主要地,本发明涉及但不限于病毒灭活的血小板提取物及其制备。
背景技术
血小板是在止血和愈合中发挥基础作用的小的、形状不规则的无核细胞。血小板包含完整的预合成蛋白阵列,其中包括信号蛋白、细胞骨架蛋白、膜蛋白和调节蛋白。它们参与损伤部位处的组织再生和愈合过程的关键阶段中,这主要是由于包含大量生物活性分子(包括生长因子(GF)、细胞因子和趋化因子)的血小板颗粒内容物。
诸如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)之类的血小板生长因子在伤口愈合级联的以下全部阶段中起关键作用:炎症、增殖和重塑阶段。
研究已表明,血小板衍生的生长因子刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖、中性粒细胞和巨噬细胞、胶原合成、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮形成和趋化作用。
血小板通常通过输注使用来例如促进止血。最近,血小板越来越多地以富血小板血浆(PRP)的形式使用,其也称为PRP凝胶、血小板凝胶、PRP凝块等。通常,PRP是由在有限体积的血浆中浓缩的自体血小板构成的间接体内制剂(Lacci KM,Dardik A.Platelet-rich plasma:support for its use inwound healing.Yale J Biol Med.2010年3月;83(1):1-9)。
对于局部施用,PRP通常通过添加凝血酶和/或CaCl2,从而通过凝血酶(内源性或外源性的)与纤维蛋白原之间的相互作用形成纤维蛋白凝胶而活化。活化时,血小板发生活性脱颗粒作用,并释放出各种调节剂,包括GF(Lacci KM,Dardik A,2010)。PRP的注射用途目前构成了小规模但快速成长的细分市场。将PRP用于软和硬组织填充的基本原理是其可能增强不愈性损伤中的组织再生、加速伤口成熟、血管形成和上皮形成、减少疤痕形成以及减少术后并发症和发病率(Lacci KM,Dardik A,2010)。
连同各种细胞类型使用活化的PRP的研究已表明从PRP释放的因子例如生长因子可诱导细胞增殖[(例如Kanno等人,Platelet-rich plasmaenhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation.J OralMaxillofac Surg.2005年3月;63(3):362-9;Bertrand-Duchesne等人,Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelialcell proliferation in vitro.J Periodontal Res.2010年2月;45(1):87-93;Kakudo等人,Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts.Plast Reconstr Surg.2008年11月;122(5):1352-60),调节人内皮细胞的血管生成能力(Sulpice等人,Cross-talk between the VEGF-A and HGF signalling pathways in endothelialcells.Biol Cell.2009年9月;101(9):525-39;Rughetti等人,Platelet gel-released supernatant modulates the angiogenic capability of human endothelialcells.Blood Transfus.2008年1月;6(1):12-7),并且引发骨诱导性能(Intini G.The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy.Biomaterials.2009年10月;30(28):4956-66)]。此外,据发现,在与胎牛血清支持的水平相当或更高的水平下,活化的PRP支持体外细胞生长并维持多个目标细胞的生存能力,所述目标细胞包括骨髓瘤、杂交瘤、肝细胞、成纤维细胞和上皮细胞(Johansson等人,Platelet lysate:a replacement forfetal bovine serum in animal cell culture?Cytotechnology.2003年7月;42(2):67-74)。
PRP及释放的生长因子目前用于多种组织再生手术,主要是骨科和牙科手术(Nurden等人,Platelets and wound healing.Front Biosci.2008年5月1日;13:3532-48)。在骨科手术中,PRP主要用于膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变(见Nurden等人2008年的综述)。牙科学和颌面外科学PRP应用主要包括钛种植体的巩固、上颌窦提升和骨重塑(见Nurden等人2008年的综述)。PRP还越来越多地用于肌腱和韧带修复、面部整形和重建手术、慢性皮肤伤口愈合、眼科学、面神经再生以及心脏和减肥手术(见Nurden等人2008年的综述)。
然而,自体PRP及释放因子的当前应用的主要缺点在于缺乏标准化。值得注意的是,可以商购获得参数,诸如制备时间、血小板收率和采集效率,不同的用于制备PRP的不同人工、半自动和全自动系统(Mazzucco等人,Not every PRP-gel is born equal.Evaluation of growth factor availability fortissues through four PRP-gel preparations:Fibrinet,RegenPRP-Kit,Plateltex andone manual procedure.Vox Sang.2009年8月;97(2):110-8)。
另一个重要的变量是用于血小板活化的技术[自体、异源或重组凝血酶,氯化钙或巴曲酶(Rozman P,Bolta Z.Use of platelet growth factors intreating wounds and soft-tissue injuries.Acta Dermatovenerol Alp PanonicaAdriat.2007年12月;16(4):156-65)],其可影响颗粒释放效率和分泌的GF的量(Rozman P,Bolta Z,2007)。此外,由于血小板对机械应力和周围环境的变化非常敏感,因此,它们可在预期活化步骤之前,在加工过程中活化并释放GF(Mazzucco等人,2009)。这种不受控制的活化可进一步增加在使用不同PRP制备系统时最终产品组成的变化。另外,自体PRP制剂的一个主要固有弱点在于血小板GF含量在个体中不同,并因此可导致次最佳的结果。最后,当处理自体PRP时,应考虑专用设备、一次性PRP加工试剂盒以及对专门人才的需要所造成的经济负担。
背景技术包括Su等人“A virally inactivated functional growth factorpreparation from human platelet concentrates”.Vox Sang.2009年8月;97(2):119-128;Burnouf等人“A novel virally inactivated human platelet lysatepreparation rich in TGF-beta,EGF and IGF,and depleted of PDGF and VEGF”.Biotechnol Appl Biochem.2010年8月6日;56(4):151-60;和美国专利公开US 2012-0156306。
发明内容
在一个方面,本发明涉及一种用于制备病毒安全生物液体混合物的方法,所述方法包括以下步骤:提供生物液体混合物;进行溶剂/洗涤剂(S/D)病毒灭活处理;使经S/D处理的混合物与两亲性聚合物接触;通过疏水作用色谱(HIC)和/或通过油提取移除S/D;收集包含来自HIC的流过级分和/或来自油提取的液体级分的材料;以及使材料经受至少再一次正交病毒灭活处理。
在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为无毒的。
然而,在本发明的另一个实施例中,两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
然而,在本发明的另一个实施例中,两亲性聚合物具有约3.5千道尔至小于约40千道尔顿范围内的平均分子量。
在本发明的一个实施例中,平均分子量为约30千道尔顿。
然而,在本发明的另一个实施例中,烃基表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
在本发明的一个实施例中,PVP具有约30千道尔顿(kDa)的平均分子量。
在本发明的一个实施例中,HIC包括以下步骤:将经S/D处理的和聚合物接触的混合物上样到HIC;利用包含有机溶剂和/或盐的溶液进行洗涤;以及收集经洗涤的级分。
在本发明的一个实施例中,有机溶剂为乙醇。
在本发明的一个实施例中,盐为氯化钠。
在本发明的另一个实施例中,所述至少再一次正交病毒灭活处理包括热灭活。
在本发明的一个实施例中,所述方法还包括浓缩材料的步骤。
在本发明的一个实施例中,所述方法用于制备病毒安全血小板提取物,并且生物液体混合物为富含血小板的级分。
在本发明的一个实施例中,所收集的材料包含与HIC洗涤级分混合的HIC流过级分。
在另一方面,本发明涉及一种可根据本发明的方法获得的病毒安全生物液体混合物。
在本发明的一个实施例中,PVP K25的浓度在0.1%(w/w)至低于1%(w/w)的范围内。
在本发明的某些实施例中,PVP K25的浓度在0.1%(w/w)至0.5%(w/w)范围内。
在本发明的一个实施例中,病毒安全生物液体混合物中的PVP K17、K25、K30浓度在0.01-5%(w/w)范围内。
在本发明的某些实施例中,生物液体混合物为富含PDGF-AB、PDGF-BB、EGF、VEGF和/或bFGF的血小板提取物。
在另一方面,本发明涉及从包含溶剂-洗涤剂(S/D)的生物液体混合物移除S/D的方法,所述方法包括以下步骤:提供包含S/D的混合物;使混合物与两亲性聚合物接触;通过疏水作用色谱(HIC)和/或通过油提取从混合物移除S/D;以及收集包含来自HIC的流过级分和/或来自油提取的液体级分的材料。
在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为无毒的。
在本发明的一个实施例中,生物液体混合物为富含血小板的级分。
在本发明的另一个实施例中,混合物包含趋化因子、细胞因子、生长因子、营养因子或者它们的混合物。
在本发明的一个实施例中,HIC包括以下步骤:利用包含有机溶剂和/或盐的溶液进行洗涤;以及收集经洗涤的级分。
在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
在本发明的一个实施例中,烃基表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
在本发明的一个实施例中,有机溶剂为乙醇。
在本发明的一个实施例中,盐为氯化钠。
在本发明的一个实施例中,所收集的材料包含与洗涤级分混合的流过级分。
在本方法的一个实施例中,源首先与S/D进行接触,然后与两亲性聚合物进行接触。
在本方法的一些实施例中,经S/D处理的源中的PVP浓度在约0.01至0.9mM、0.01至0.3mM、或者0.025至0.3mM的范围内。
在本方法的一些实施例中,经S/D处理的源中的HPMC浓度在约0.01至0.3mM范围内。
在一些实施例中,所述方法还包括干燥材料的步骤,从而导致生物干燥混合物。
在某一方面,公开了一种用于从生物源制备生物液体混合物组合物的方法。所述方法包括以下步骤:提供源;提供PVP和/或HPMC;利用溶剂洗涤剂(S/D)处理源以允许病毒灭活,并且利用PVP和/或HPMC进行处理;通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触来移除S/D;以及收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
在某一方面,公开了一种可根据本发明所公开的方法获得的生物液体混合物组合物。
在一个实施例中,组合物包括约0.07至6mM、0.07至2mM或者0.17至2mM的范围内的PVP浓度。
在另一个实施例中,组合物包括约0.07至1.5mM范围内的HPMC浓度。
在某一方面,公开了一种药物组合物,所述药物组合物包含两亲性聚合物;选自趋化因子、生长因子、细胞因子、营养因子及其混合物的血小板衍生蛋白质;和药学上可接受的载体,其中所述两亲性聚合物为浓度在约0.07至6mM的范围内的PVP或浓度在约0.07至1.5mM的范围内的HPMC。
附图说明
图1示出了利用在S/D移除(处理2和处理4)之前通过使裂解物与肝素接触获得的血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。在S/D移除之前裂解物未与肝素接触的前提下制备的血小板提取物用作对照组(处理1和3)。
图2示出了利用在S/D移除(处理2)之前或期间通过使裂解物与低分子量肝素(LMWH)接触制备的血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。在S/D移除之后在不存在裂解物与低分子量肝素(LMWH)接触的前提下获得的血小板提取物用作对照组(处理1)。
图3示出了利用在S/D移除之后在存在不同分子量PVP聚合物的情况下获得的提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖:PVP K25-处理3;或者PVP K30-处理7。
图4示出了利用包括不同浓度PVP的提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。样品17(处理17)和样品19(处理19)在S/D移除的第二洗涤方面为不同的,其中分别使用0.1%和0.5%的PVP。
图5示出了利用在PVP K25(处理1)存在下S/D移除之后或者在肝素(处理2)存在下S/D移除之后获得的大规模血小板提取物处理的3T3成纤维细胞的增殖。
此外,所有图包括通过GraphPad Prism软件计算的R2拟合,半数有效浓度(EC50)和95%置信区间EC50值。
图6示出了执行手术后2星期时的大鼠背侧皮瓣(3×10cm)。沿头至尾的方向抬高皮瓣。A,B,C,D和E被采用样品用于组织学分析的不同区域。A最靠近尾侧皮瓣附接部分,并且因此愈合最好,而E处于皮瓣的头部,其显示最高程度的坏死(黑色)。通过腹侧中线切口(沿皮瓣中心的线)移除腹部和胸部脏器。
图7示出了正常和愈合皮肤的典型着色图案:H&E着色(表皮增生,分数1并且表皮完全愈合处理后,分数0),真皮和表皮增殖的PCNA着色(增殖组织,分数1并且正常组织,分数0)以及角蛋白6着色(上基底着色,分数1,对于愈合,并且对于正常皮肤的基部着色,分数0)。
图8示出了2周后大鼠背侧皮瓣附着性等级的分数,在通过利用组织镊子轻轻地牵拉区域A-C(参见图6)中的皮瓣远离创面来对其进行测试时。将皮瓣附接到下层组织与皮肤的正常区域的附接对比,并且如下将等级分为1至3:1=皮瓣与下层组织之间无粘附性至低附着性,2=皮瓣与下层组织之间低于但接近正常粘着性,或者3=皮瓣与下层组织之的约正常粘着性。
具体实施方式
本发明涉及一种用于制备病毒安全生物液体混合物诸如病毒安全的血小板提取物的方法。血小板包含涉及组织再生和愈合过程的关键阶段的一整套因子。目前,将完整的自体活化血小板(来源于患者)用于促进伤口愈合。然而,使用完整的自体血小板存在多个缺点,特别是缺乏标准化;愈合所需的因子在患者自身的血小板中可能缺乏;制备血小板因子混合物需要专用设备;程序耗时并且需要对患者自身进行附加步骤;以及需要经过医学培训的人员。这些问题可例如通过使用由多个供体制得的血小板提取物来解决。
然而,来源于人类血液的产品可存有传播感染原诸如病毒的风险。有效地降低病毒传播风险可通过包括至少两次正交病毒灭活步骤而实现。另外,在血小板提取物的制造中包括附加步骤可影响其中所含因子的回收率和活性。
病毒灭活的这些方法中的一个为“溶剂洗涤剂(S/D)病毒灭活处理”。
这种灭活包括利用S/D处理和移除S/D。根据本发明可发现,在通过HIC移除S/D之后某些生长因子的回收率受损。
根据本发明可发现,可通过在移除S/D之前和/或期间使经S/D处理的材料与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)(PVP和HPMC均为无毒两亲性分子)接触来增加某些血小板因子例如PDGF-AB;PDGF-BB;和bFGF的回收率。
根据本发明可发现,使经S/D处理的材料与PVP和HPMC接触导致PDGF-AB和其他血小板因子例如PDGF-BB和bFGF增加的回收率或富集。
在S/D移除期间,从使经S/D处理的材料与肝素和低分子量肝素(两者皆已知为绑定特定生长因子)接触来增加因子的回收率,同时从使经S/D处理的材料与PVP接触的角度来讲,这些发现为令人惊讶的,所述PVP为完全不同的化合物(具有两亲性特性),其具有S/D移除期间对生长因子回收率相似的有利影响。
另外,这些发现令人惊讶,因为添加PVP K30、K25、K17和K12在某些测试条件下不影响S/D移除。
据发现,利用根据本发明的方法从包括源自血小板的因子混合物的源移除S/D导致高因子回收率、高生物活性和有效的S/D移除。
据发现,在S/D移除期间利用PVP K12、K17、K30或PVP K25增加血小板生长/营养因子的回收率。据发现,利用K30的回收率高于利用K25的回收率。利用PVP K25获得并且因此包括PVP K25的材料比利用PVPK30获得包括PVP K30的材料具有更高的增殖活性。
结果还显示,可能的是,使与血小板因子混合物接触的PVP K25浓度降低到低于0.5%或0.17mM(从而使PVP在S/D移除后获得的提取物中降低到低于0.5%或0.17mM),并且仍获得因子回收率的增加同时维持HIC的能力以有效地移除S/D。
结果显示,提取物中不同量的PVP K25,例如0.1%(0.03mM)和0.5%(0.17mM)不影响其活性。
结果显示,不同于处于一定浓度的肝素和硫酸葡聚糖,最终提取物中PVP的存在不抑制凝血酶活性。当将纤维蛋白粘合剂用作血小板提取物(“血小板提取物”为一种生物液体混合物组合物)的递送剂时,PVP的这种特性是特别重要的。
结果显示,在存在PVP K25的情况下在大规模处理中生长因子回收率和活性相当于小规模中的那些。
这些结果表明,在S/D移除期间可有利地使用PVP以便获得具有增加的生物效能的最终提取物,前提条件是所使用PVP的类型及其浓度(例如,混合物中PVP的w/w或摩尔浓度)不影响S/D移除。
在一个实施例中,在S/D移除步骤期间使生物源与PVP(PVP与乙醇和氯化钠混合)接触之后,获得了血小板提取物。提取物包括PDGF-AB/TGF-β1;PDGF-AB/VEGF;TGF-β1/bFGF;和VEGF/bFGF比率,这些比率类似于经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP-LR)的原料中和S/D移除之前材料中的比率。
这些发现为制备根据本发明的生物液体混合物组合物提供了准备。
本发明的方法允许制备下述血小板提取物,该血小板提取物在S/D移除之后具有细胞因子、生长因子、趋化因子和/或营养因子增加的回收率。
本发明公开了一种用于从生物源制备病毒安全生物液体混合物组合物的方法,该方法包括以下步骤:提供源;提供两亲性聚合物;利用溶剂洗涤剂(S/D)处理源以允许病毒灭活,并且利用两亲性聚合物进行处理;
通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触来移除S/D;以及收集包含来自HIC的未结合级分的材料;其中该方法包括至少再一次正交病毒灭活处理,从而获得病毒安全生物液体混合物组合物。
在一个方面,本发明提供用于制备病毒安全生物液体混合物的方法,该方法包括以下步骤:
提供源;进行溶剂/洗涤剂(S/D)病毒灭活处理;
使经S/D处理的材料与无毒的两亲性聚合物接触;通过疏水作用色谱(HIC)和/或通过油提取来移除S/D;和使材料经受至少再一次正交病毒灭活处理。
源的实例包括但不限于体液,诸如血液;血液级分、冷沉淀物、细胞培养物、亲脂性蛋白剂;细胞、细胞粒子和/或细胞器;细胞裂解物;血小板裂解物;血沉棕黄层;动物组织提取物,诸如牛肺、牛肠或动物骨提取物明胶、牛血清白蛋白,以及来源于动物的与水不混溶的脂肪,诸如羊毛脂。源可源自多个供体。
在一个方面,本发明公开了一种用于从包含S/D的生物源中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法,该方法包括以下步骤:提供源;提供两亲性聚合物;利用S/D并且利用两亲性聚合物处理源;通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触从生物源中移除S/D;以及收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
在一个实施例中,移除S/D的方法省略了油提取的另外的步骤。
已发现,本发明的方法可用于在不存在油提取分离的步骤情况下移除S/D。
在一个实施例中,本发明涉及一种用于制备病毒安全的血小板提取物的方法,该方法包括以下步骤:提供来自多于一个供体的富含血小板的级分;进行溶剂/洗涤剂(S/D)病毒灭活处理;使S/D处理的材料与无毒的两亲性聚合物接触;移除S/D;和使材料经受至少再一次正交病毒灭活处理。
术语“血小板提取物”是指包括血小板衍生因子的生物混合物。通常,提取物不含细胞。
在一个实施例中,该方法包括制备血小板裂解物。术语“裂解物”是指当通过分裂细胞的细胞膜来破坏细胞时产生的溶液。血小板的裂解以及血小板中截留的因子(例如,各种血小板生长因子和/或营养因子)的释放可通过冷冻和解冻富含血小板的级分、通过S/D处理、通过超声处理[Slezak等人,(1987)J.Exp.Med.第166卷,第489-505页]、通过弗氏压碎器[Salganicoff等人,(1975)Biochem.Biophys.Acta,第385卷,第394-411页]和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。
在本发明的一个实施例中,血小板的裂解通过冷冻和解冻富含血小板的级分然后进行S/D处理来进行。通常,血小板的裂解产生无细胞的血小板裂解物。
术语“病毒安全生物液体混合物”是指经受至少两个正交病毒灭活处理的混合物和/或组合物。
术语“病毒安全血小板提取物”是指经受至少两次正交病毒灭活处理的提取物。
术语“病毒灭活处理”和“灭活病毒”是指其中将病毒维持在溶液中但使其无活性例如通过溶解其脂质衣壳的情形;和/或其中将病毒例如通过尺寸排阻技术从溶液中物理移除的情形。
术语“正交病毒灭活处理”涉及执行至少两种用于灭活病毒的不同的且独立的处理。可以使用以下非限制性处理实例中的两种或更多种的组合:热灭活、溶剂/洗涤剂(S/D)、纳滤、低pH处理、紫外线辐照和硫氰酸钠处理。
“溶剂/洗涤剂(S/D)病毒灭活处理”通常是指通过破坏病毒的脂质包膜来使包膜或脂质衣壳病毒灭活的过程。处理可通过上样洗涤剂(诸如TritonX-45、Triton X-100或聚山梨酸酯80)和溶剂[诸如磷酸三正丁酯(TnBP)、二或三烷基磷酸酯]来进行。用于灭活脂质衣壳病毒的溶剂-洗涤剂组合可以为本领域已知的任何溶剂-洗涤剂组合,诸如TnBP和Triton X-100、聚山梨酸酯80和胆酸钠以及其他组合。
所用的一种或多种溶剂/一种或多种洗涤剂浓度可以是本领域中常用的那些,例如US5094960A、US4789545A中进行的。在本发明的一个实施例中,使用>0.1%TnBP与>0.1%Triton X-100的组合。在本发明的另一个实施例中,使用1%Triton X-100和0.3%TnBP的组合。通常,溶剂-洗涤剂灭活病毒所处的条件包括:10-100mg/ml的溶剂/洗涤剂,5-8范围内的pH水平,2-37℃范围内的温度,持续30分钟至24小时。然而,其他溶剂/洗涤剂组合和合适的条件对于本领域的任何技术人员将是显而易见的。这种灭活包括利用S/D处理和移除S/D。
“热灭活”通常是指热破坏脂质包膜和无包膜病毒两者的过程。“热灭活”可与术语“巴氏灭菌”互换。热灭活可在59.5至60.5℃范围内的温度下进行9至10.5个小时,例如灭活可在60℃下进行10小时。在热灭活步骤期间可将稳定剂例如蔗糖和甘氨酸添加到材料中。
“纳滤”通常是指通过使用纳米级滤器,诸如PlanovaTM 20N、35N和75N;Viresolve/70TM,Viresolve/180TM,从样品中排除类脂包膜和无包膜病毒的过程。过滤器可具有小于70nm,优选地介于15nm和50nm之间的孔尺寸。然而,具有足以从样品中减少或消除病毒的孔尺寸的任何膜均可用于纳滤。通过纳滤移除的病毒可以为包膜病毒[例如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒、西尼罗河病毒、细胞巨化病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒]和无包膜病毒(例如甲肝病毒、细小病毒B19(paravirus B19)、脊髓灰质炎病毒)。
低pH处理通常对包膜病毒有效。在本发明的一个实施例中,使血小板裂解物经受低pH(通常经受为4的pH)并持续介于6小时和21天之间的任何时间。“低pH处理”可与术语“酸性pH灭活”互换。
在本发明的一个实施例中,提取物制备的第一病毒灭活步骤包括血小板的溶剂-洗涤剂(S/D)处理以消除包膜病毒。S/D处理还促进血小板的裂解并将它们的内容物释放到溶液中。对于最佳的包膜病毒灭活,可在S/D处理步骤过程中进行包括聚集体移除(例如,通过过滤)的子步骤。
术语“来自多于一个供体的富含血小板的级分”是指得自至少两个个体的富含血小板的材料。个体可以是人或其他哺乳动物。在一些实施例中,血小板从5至12个供体收集。
术语“富含血小板的级分”是指下述等离子体组合物,该等离子体组合物具有高于血液中正常存在的血小板浓度的血小板浓度。在具体实施例中,血小板浓度高于正常基准血小板浓度,例如约200,000血小板/μL。例如,血小板浓度可为血液中正常浓度的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100倍或更多。在某些实施例中,富含血小板的级分具有大于约200,000血小板/μL、300,000血小板/μL、400,000血小板/μL、500,000血小板/μL、600,000血小板/μL、700,000血小板/μL、800,000血小板/μL、900,000血小板/μL、1,000,000血小板/μL、1,100,000血小板/μL、1,200,000血小板/μL、1,300,000血小板/μL、1,400,000血小板/μL、1,500,000血小板/μL、1,600,000血小板/μL、1,700,000血小板/μL、1,800,000血小板/μL、1,900,000血小板/μL、或2,000,000血小板/μL的血小板浓度。
可从其获得富含血小板的材料的级分包括但不限于血液级分、血浆级分、单采的经洗涤和白细胞减除的血小板以及单采血小板。在一个实施例中,将通过多个供体混合的经洗涤和/或白细胞减除的血小板用作制备血小板提取物的原料。
将经洗涤的血小板用作制备提取物的原料允许获得具有减少等离子体杂质(例如减少lgG和纤维蛋白原水平)的不可凝固的血小板提取物。
通常,术语“血小板原料”是指从在本发明的方法中使用的多于一个供体获得的富含血小板的级分。富含血小板的级分可例如从多个单位的全血、从血液级分和/或从血浆级分分离。富含血小板的级分可得自单采捐献样品。原料可以为经洗涤的和/或白细胞减除的。在本发明的一个实施例中,富含血小板的级分经洗涤和减除白细胞并得自单采捐献样品。在一个实施例中,单采的白细胞减除采集单位中的最低血小板数为约或高于3.0×1011,如“Circular of Information for the Use of Human Blood and BloodComponents”中说明的。
术语“经洗涤的血小板”是指经受洗涤步骤的血小板。在洗涤程序过程中,还可能丧失血小板。洗涤可使用含有或不含少量右旋糖的0.9%氯化钠进行。洗涤程序可如“Circular of Information for the Use of Human Bloodand Blood Components”中所详述的进行。在本发明的一个实施例中,洗涤如下进行:在温和条件下离心血小板材料单位。然后,弃去上清液,将血小板沉淀用盐水在温和条件下洗涤至少两遍(在洗涤之间进行离心)。可将经洗涤和重悬的血小板冷冻,直到在本发明的方法中使用。
术语“白细胞减除的”是指比全血中的白细胞含量更低的白细胞含量(全血中的含量为每单位血液约1至10×109个白细胞)。可使用任何白细胞减除方法例如通过过滤来获得白细胞减除的单位。白细胞减除可在单采过程中进行。通常,将包含少于约5×106个白细胞的白细胞减除的血小板单位用作制备血小板提取物的原料。
术语“单采”通常是指从单个供体抽取血液,其中将一部分(例如血小板)分离和保留而将其余部分输回供体中。得自单个供体的一个单位的单采血小板可包含约或高于3.0×1011个血小板。在本发明的一个实施例中,得自单个供体的一个单位的单采血小板包含最高至6.0×1011个血小板。通常,当在一个捐献样品中存在多于6×1011个血小板时,将所述捐献样品单元分到两个独立袋中。
术语“两亲性聚合物(amphiphilic polymer)”或“两亲聚合物(amphipathic polymer)”为具有亲水性(具有水亲和力,极性)和亲脂性(具有脂类亲和力)特性的聚合物。亲脂基团通常为大烃结构部分,诸如形式CH3(CH2)n的长链,其中n>4。在一个实施例中,亲水基团落入以下类别中的一个:
1.带电基团:
阴离子。具有由R表示的分子的亲脂部分的实例为:
羟酸盐:RCO2-;
硫酸盐:RSO4-;
磺酸盐:RSO3-。
磷酸盐:磷脂中的带电官能团。
阳离子。实例:
胺:RNH3+。
2.极性、不带电基团。实例为具有大R基团的醇类,诸如二酰基甘油(DAG),和具有长烷基链的多甘醇。
通常,两亲性物质具有若干亲脂部分、若干亲水部分、或者若干亲脂和亲水部分。蛋白质和一些嵌段共聚物为此类实例。
两亲性化合物具有亲脂(通常为烃)结构和亲水极性官能团(离子的或不带电的)。
由于具有亲脂和亲水部分两者,因此一些两亲性化合物可溶解于水并且一定程度上溶解于非极性有机溶剂。
当放置在由水性和有机溶剂组成的不混溶的双相系统中时,两亲性化合物将分为两相。疏水和亲水部分的程度决定划分的程度。
无毒的两亲性聚合物的非限制性实例为聚乙二醇(PEG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(2-丙烯酰胺基十六烷磺酸(PAMC16S)、脂多糖(2-甲基-2-唑啉)(LipoPOxs)、羟乙基淀粉(HES)、源自用于基因治疗的三(羟甲基)-丙烯酸胺基甲烷(THAM)阳离子聚合物(如多聚赖氨酸(PLL)系和聚乙烯亚胺(PEI)系聚合物)的两亲性聚合物。
通常术语“无毒的”是指在所采用的剂量和浓度情况下对患者无毒的产品、物质、或化合物,并且将不导致对健康的不利影响,无论是即刻还是长远来讲。无毒的或生理上安全的化合物被理解为具有500mg/kg的LD50(大鼠),更好的为950mg/kg,并且最好的为2000mg/kg。
在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
术语“烃基表面活性剂”为降低液体表面张力、两种液体之间或者液体和固体之间的界面张力的烃化合物。烃表面活性剂可充当洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。
术语“接触”在本文中最广义地使用,并且是指任何类型的混合动作,所述混合动作例如使两亲性聚合物充分接近存在于经S/D处理的材料或源中的感兴趣因子(例如,生长因子、细胞因子、趋化因子和/或营养因子),使得结合作用将在两亲性聚合物和因子之间发生。接触包括但不限于混合、掺混和/或将两亲性聚合物添加到经S/D处理的材料和/或将两亲性聚合物添加到用于洗涤HIC柱和/或在油中用于提取S/D的缓冲液。
聚合物可具有200至低于50000道尔顿的平均分子量。在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PVP可在12-30K范围内,或者约12、13、14、15、16、117、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30K。
在本发明的一个实施例中,两亲性聚合物为具有3500至40000道尔顿的范围内的平均分子量的聚乙烯吡咯烷酮。例如,所使用的PVP可具有3500道尔顿的平均分子量和/或10.2-13.8的范围内的K-值;8000道尔顿的平均分子量和/或16.0-18.0的范围内的K-值;30000道尔顿的平均分子量和/或22.5-27.0的范围内的K-值;或者40000道尔顿的平均分子量和/或27.0-32.4的范围内的K-值。不同的两亲性聚合物的组合和/或具有不同平均分子量的相同聚合物的组合可用于接触经S/D处理的材料。在一个实施例中,在S/D移除之前,例如在将材料上样到柱上之前,将具有30000道尔顿的平均分子量的PVP上样到经S/D处理的材料中;然后将具有30000道尔顿的分子量的PVP添加到用于洗涤柱的缓冲液中。
据发现,(0.3mM)1%或更高浓度的PVP K25导致S/D材料,即TritonX-100,以超过容许极限的情况存在于SDR后材料中。
在本发明的一个实施例中,在0.01%(w/w)至低于1%(w/w)的浓度范围内;在0.1%(w/w)至低于1%(w/w)的范围内;或在0.1%(w/w)至0.5%(w/w)的范围内,使两亲性聚合物与经S/D处理的材料接触。
在下一步骤中,实施S/D移除步骤。术语“溶剂-洗涤剂移除(S/D移除)”是指移除用于S/D处理的大部分溶剂-洗涤剂。移除溶剂-洗涤剂包括使用疏水相互作用色谱柱(HIC),例如C-18二氧化硅填料和SDR(溶剂-洗涤剂移除)HyperD;油提取;它们的组合或本领域中已知的任何其他方法。
在本发明的一个实施例中,油提取用于移除溶剂-洗涤剂。
液-液提取,还称为“溶剂提取”和“分离”、或者“消耗分离”,为基于化合物在两种不同不混溶的液体中的相对溶解度来分离化合物。它是将物质从一个液相提取到另一个液相。两种不混溶的液体可为油和含水液体。通常在这种情况下,利用油和含水分离来移除物质称为“油提取”。将油添加到包含溶剂洗涤剂的水性溶液,混合并且允许水和油的分离,将导致大部分溶剂洗涤剂留在油相中。
在本发明的另一个实施例中,将SDR HyperD用于移除溶剂-洗涤剂,SDR HyperD是一种由二氧化硅小球制成的色谱填料,二氧化硅小球的孔内容积由三维交联疏水性丙烯酸类聚合物填充。SDR HyperD有利地涉及疏水相互作用的混合模式吸附,并与分子排阻效应相关[Guerrier L等人,“Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivatedbiological fluids”.J Chromatogr B Biomed Appl.1995年2月3日;664(1):119-125]。
术语“疏水作用色谱(HIC)”是指例如填充有疏水性聚合物树脂的柱。通常,允许混合物以一定流速行进穿过包括填充树脂的柱,并且S/D材料被移除。可分批实施HIC。
疏水性树脂在本领域中为熟知的。非限制性实例为例如C-18二氧化硅填充材料和SDR(溶剂-洗涤剂移除)HyperD。
可通过包括以下步骤的方法来实施疏水作用色谱:将经S/D处理的和接触聚合物的材料上样到HIC;利用包括低浓度的有机溶剂(例如,在5-15%的浓度范围的乙醇)和/或盐(例如,0.2-1.2M的浓度的NaCl)的水性溶液进行洗涤;并且收集洗涤材料。
盐的非限制性实例为KCl、MgCl2、CaCl2等。
有机溶剂的非限制性实例为异丙醇、甘油、乙二醇等。
术语“上样到HIC”指将材料施加到柱。然而,如果需要,相同的树脂可“分批”用于移除S/D材料。如本文所用,“分批”通常是指树脂和混合物例如在搅拌槽、间歇式反应器或容器中一起温育的技术,并且以连续方式进行吸附。在本发明的一个实施例中,混合物与树脂在容器例如管中接触,并且在温育期之后,对容器进行离心处理并且收集包括血小板衍生因子的上清液(S/D材料存在于沉淀物内)。可在容器或间歇式反应器中实施分批方法。
术语“经S/D处理的和接触聚合物的材料”是指经受S/D以用于病毒灭活并且与上文定义的两亲性聚合物接触的物质。
上样到HIC柱的材料可溶于结合缓冲液。可在上样材料之前例如通过利用结合缓冲液洗涤柱来平衡柱。
术语“平衡”是指允许和/或调节柱达到特定的缓冲条件,诸如特定的pH水平、特定的两亲性聚合物浓度和离子强度。在本发明的一个实施例中,通过在将经S/D处理和接触聚合物的材料上样到柱上之前利用具有预定pH水平和离子强度的平衡缓冲液洗涤柱来进行柱的调节。在本发明的一个实施例中,平衡缓冲液包括处于pH 6.8-7.4的20mM醋酸钠和10mM甘氨酸;0.2%(总体积的w/w)人血清白蛋白(HSA)和0.1%两亲性聚合物。
在本发明的一个实施例中,用于从生物液体混合物中移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法包括以下步骤:使经S/D处理的材料与无毒的两亲性聚合物接触;通过使混合物经受疏水作用色谱(HIC)和/或油提取从混合物中移除S/D,并且收集包含来自HIC的流过级分和/或来自油提取的液体级分的材料。
在另一个实施例中,HIC包括以下步骤:利用包含有机溶剂和/或盐的溶液进行洗涤;
在本发明的另一个实施例中,所收集的材料包含与HIC洗涤级分混合的流过级分。
术语“结合缓冲液”是指将经S/D处理的和接触聚合物的材料上样到色谱柱上期间所使用的缓冲液。通常,用于在对材料进行上样之前和/或期间调节柱的平衡缓冲液称为结合缓冲液。在本发明的一个实施例中,结合缓冲液包括处于pH 6.8-7.4的20mM醋酸钠和10mM甘氨酸;0.2%(总体积的w/w)人血清白蛋白(HSA)和0.1%两亲性聚合物。
HIC还可包括以下步骤:利用平衡缓冲液和/或结合缓冲液洗涤HIC;以及收集未结合材料。
流过材料或未结合材料通常是指在通过使用用于平衡的相同缓冲液和/或用于将混合物上样到柱上的缓冲液(“结合缓冲液”)洗涤已上样的柱之后收集到的级分。
术语“洗涤”是指利用与用于上样和/或平衡柱的溶液或条件相同或不同的溶液或条件,和/或与上述步骤所使用的溶液相同或不同的溶液,在S/D移除期间洗涤柱。洗涤条件为使得S/D基本上保持结合到柱/树脂,然而因子被洗涤/未结合。
洗涤条件可涉及盐浓度的增加和/或使有机溶剂包含于溶液内。
血小板提取物可包括生长因子、营养因子、趋化因子和/或细胞因子的混合物。
术语“生长因子”通常是指促进细胞生长、增殖和/或分化的物质。生长因子的实例包括但不限于转化生长因子(TGF)例如TGF-b1、成纤维细胞生长因子(FGF)例如bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)例如PDGF-AB等。
术语“营养因子”通常是指刺激细胞分化和/或存活的物质。营养因子的实例包括但不限于粘附分子、骨形态发生蛋白、细胞因子、eph受体酪氨酸激酶、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、GDNF、肝素结合生长因子、胰岛素样生长因子、神经营养因子、脑信号蛋白、转化生长因子(TGF)β、酪氨酸激酶受体配体等。
术语“细胞因子”通常是指源于细胞的信号蛋白质分子,所述信号蛋白质分子由细胞分泌并且为广泛用于细胞间通信的信号分子的类别。免疫细胞释放细胞因子。
血小板因子可具有生长活性、细胞因子、趋化活性和/或营养活性。
在另一方面,本发明涉及可根据本发明的方法获得的源于多个供体的活性和病毒安全(至少双重病毒灭活)血小板提取物;并且涉及其应用。病毒安全血小板提取物包含生物活性血小板细胞生长因子、趋化因子、细胞因子和/或营养因子。
在另一方面,本发明涉及一种用于从包括两亲性毒性分子的生物液体混合物中移除两亲性毒性分子诸如溶剂-洗涤剂(S/D)的方法。所述方法包括提供包括两亲性毒性分子的生物液体混合物的步骤;使混合物与无毒的两亲性聚合物诸如PVP接触;以及从混合物中移除两亲性毒性分子。
两亲性毒性分子通常包括但不限于Triton X-45、聚山梨酸酯(例如,聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80)、Brij(聚氧乙烯十二烷基醚,例如,Brij30、Brij 35、Brij 58)、IGEPAL(乙基苯基聚乙二醇,例如,IGEPAL CA-630)等。
术语“生物液体混合物”是指从生物源和/或包括重组配料和/或重组血小板衍生因子(例如,趋化因子、生长因子、细胞因子、营养因子或它们的组合)的液体中获得的任何类型的液体物质。“生物源”通常包括但不限于得自体液的制剂,诸如全血浆或血液级分,例如冷冻耗尽血浆、冷沉淀物、血浆或血清;精液;痰液;粪便;汗液;唾液;鼻粘液;脑脊液;血小板衍生级分,诸如富含血小板血浆凝胶PRP-R(PRP-凝胶);和尿液,以及得自细胞培养物的液体,其包含通过细胞分泌进制剂中的生物物质,或包含最初存在于细胞内并因各种操纵诸如细胞裂解或细胞激活而释放到液体制剂中的物质。
术语“冷沉淀物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)解冻,导致形成包含纤维蛋白原和因子XIII的沉淀的上清液时,可获得冷沉淀物。可例如通过离心收集沉淀物。BAC溶液还包含因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等,例如如US-B-6,121,232和WO9833533中所述。
在一个实施例中,可在生物液体制剂的病毒灭活过程之后使用根据本发明的移除S/D的方法。将源于生物的液体制剂诸如血液和血浆制剂用作可纯化多种生物有用化合物的原料。此类化合物的实例包括免疫球蛋白、因子VIII、白蛋白、α1抗胰蛋白酶、因子IX、因子XI、PPSB、纤维蛋白原和凝血酶(凝血酶原)。此外,从得自细胞培养物的生物制剂分离出各种生物产品,诸如激素、生长因子、酶、配体和抗体。
然而,在另一方面,本发明涉及一种药物组合物,该药物组合物包括0.07至6mM的浓度范围内的PVP和血小板衍生蛋白质组合物,该血小板衍生蛋白质组合物包括趋化因子、生长因子、细胞因子、营养因子或它们的混合物。
本文示出,利用0.9mM(在最终产品中为6mM)浓度的PVP执行S/D移除导致triton的98%被移除以达到170ppm的最终浓度。在下游处理中,柱之后保留在材料中的Triton X-100的痕迹被移除,直到在最终产品检测不到triton痕迹。考虑这些结果,利用浓度高于0.9mM的PVP可导致在下游无法移除的浓度下的triton从柱洗脱。
术语“药物组合物”是指任何化合物或物质组合物或化学级分组合,它们在施用给受试者时通过局部和/或系统作用引起生理效应和/或生物效应(例如,细胞增殖、细胞运动、细胞-细胞相互作用和/或细胞形态学变化的诱导)。
在S/D移除期间利用PVP K12和PVP K25可发现,可能的是获得具有相当于WAP原料中的比率的因子比率的组合物。
本发明公开了具有约0.3-0.4的范围内的PDGF-AB/TGF-β1;约41至约102的范围内的PDGF-AB/VEGF;约1500至约1700的范围内的TGF-β1/bFGF;和/或约6.0至12.5的范围内的VEGF/bFGF。
如本文所用,术语“受试者”包括哺乳类动物,包括人。在一个实施例中,受试者为人类。
根据本发明制备的病毒安全的血小板提取物可用于任何治疗目的。
本发明的提取物适合于任何治疗应用,例如促进受试者受伤组织的愈合。血小板提取物可按原样用于注射到目标区域中或用于静脉内施用;涂到绷带、泡沫、垫子和基质上/施用到其中,和/或可用于与纤维蛋白粘合剂相结合用于局部施用。提取物可从不同的递送剂诸如绷带、垫子、泡沫和基质释放进所需的位置中/释放到所需的位置上。释放剂可由天然和/或合成材料制成。此类材料的实例包括但不限于聚合物、水凝胶、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、藻酸盐、胶原蛋白基质、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)[PHEMA]、琼脂、氧化再生纤维素(ORC)、自组装肽[SAP]、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白以及它们的组合。
据发现,施用包含PVP的与根据本发明获得的血小板提取物混合的纤维蛋白粘合剂具有对活体愈合的显著积极效果:它促进皮瓣附着性,并且加速愈合过程,如利用组织学所示,相比于仅纤维蛋白粘合剂或伪群组(经受相同的皮瓣产生过程,但在皮瓣闭合之前没有施用的任何处理的动物)。
术语“任何治疗性目的”是指在受试者中进行的;用于美容用途、和/或用于任何疾病、障碍或病症的任何治疗或预防性处理。示例性治疗目的包括但不限于改善移植整合;加速内部或外部伤口愈合,即,与未处理的伤口或与其他已知的伤口处理相比使伤口快速地愈合;治疗任何需要刺激血管生成、有丝分裂发生、细胞增殖、中性粒细胞和巨噬细胞、胶原蛋白合成、迁移、伤口收缩、细胞外基质合成、上皮化和趋化性的损伤或病症;需要组织生成、再生或重组、上皮化、形成新血管或血管生成的损伤或病症;减少疤痕形成;降低术后并发症和发病率;愈合软组织,例如皮肤创伤,例如愈合外科皮瓣损伤、切口或溃烂。可通过局部或肠胃外施用本发明所公开的组合物。
血小板提取物可用于多种外科领域,诸如但不限于骨外科(例如,骨修复、关节软骨修复、膝关节成形术、腰椎融合和椎间盘退变);牙外科;牙科学和颌面外科(例如,钛种植体的巩固、上颌窦提升和骨重塑);肌肉、肌腱和韧带修复;面部整形和重建手术;慢性皮肤伤口愈合、皮肤烧伤愈合、眼科学;面神经再生、外周神经修复、中枢神经系统(CNS)修复(脊柱和/或脑外科)、视神经修复、神经压迫综合征修复、颅神经修复、坐骨神经修复;心脏;胃肠手术和减肥手术。可将提取物施用到患者身体部分的表面上。术语“表面”是指可通过裸眼视力看见的外表面以及为生物体内部解剖结构一部分的体内部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈、手、肘、臀、膝盖的皮肤以及其他皮肤部位。体内部分的实例包括但不限于暴露于外部环境的体腔或解剖学开口以及内部器官,诸如鼻孔;嘴唇;耳朵;生殖部位,包括子宫、阴道和卵巢;肺;肛门;脾;肝心肌和胃肠道。表面可为出血或未出血的部位。另选地,可将提取物通过注射,例如真皮内、腹膜内、皮下、鞘内、胸骨内、颅内、肌内和/或静脉内注射施用。也可通过输注施用提取物。
本发明还提供治疗炎症;组织愈合;器官重建和/或组织再生的方法,包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的提取物。
根据本发明的提取物还可用于促进多种类型的细胞例如干细胞的生长、增殖、分化和/或维护。出于这种目的,提取物可单独用于或与纤维蛋白粘合剂结合用于活体和/或离体应用中。在一个实施例中,提取物可与生物相容性植入物一起用于例如活体组织工程,以及离体细胞培养。
术语“治疗有效量”是指预防或治疗(缓解一种症状或所有症状)疾病、障碍或病症所需的剂量。有效量可基于病程响应组合物施用发生的任何变化进行测量。有效剂量可根据受试者的年龄和体重、疾病及其严重性(例如,早期或晚期)以及本领域技术人员可认识到的其他因素而变化。
提取物还可以包含药学上可接受的赋形剂。如本文所用,术语“赋形剂”是指添加到提取物中的惰性物质。通常,赋形剂为用于最终配制药物组合物的材料。可添加赋形剂例如以便确保活性物质在贮存时保持其化学稳定性和/或生物活性,以有助于制造过程和/或出于美观原因例如颜色。所添加的赋形剂通常是安全且无毒的。
根据本发明的血小板提取物可与外科粘合剂结合使用。不同类型的外科粘合剂可与血小板提取物结合使用,包括但不限于生物粘合剂(诸如利用纤维蛋白原和凝血酶组分制成的纤维蛋白粘合剂);合成粘合剂诸如丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯和聚乙二醇(PEG)聚合物;以及例如由生物和合成材料的组合制成的半合成粘合剂诸如明胶-甲醛-间苯二酚(GFR)胶。在本发明的一个实施例中,将血小板提取物与纤维蛋白粘合剂组分结合使用。在本发明的另一个实施例中,将血小板提取物与合成粘合剂一起使用。
如果需要,通过本发明的方法获得的血小板提取物可例如通过冻干、超临界流体技术、喷雾冷冻干燥、喷涂、喷涂的变型诸如利用传统喷床干燥、以及基于溶剂蒸发而没有雾化的其他干燥方法(诸如真空干燥、Xerovacl、泡沫干燥、膜干燥)或喷雾干燥。在干燥之前,可利用冷冻保护剂配制提取物。
术语“冷冻保护剂”是指添加到溶液中以便在冷冻过程中保持活性组分(例如,生长因子、趋化因子、细胞因子和/或营养因子)的化学稳定性和/或生物活性的物质。冷冻保护剂的非限制性实例包括但不限于碳水化合物诸如单糖:包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)、半乳糖和核糖二糖(ribosedisaccharides Disaccharides):蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖,以及二糖寡糖,另一组为多元糖醇:麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨醇、木糖醇和异麦芽糖醇。除了碳水化合物外,也可以将诸如聚乙二醇(PEG)的其他聚合物用作冷冻保护剂,诸如聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)、或氨基酸和多胺。
术语“冻干”通常是指冷冻物质然后降低水浓度(例如通过升华到不支持生物或化学反应的水平)的过程。所得的冻干生物材料可贮存相对长的一段时间。在贮存后,可将冻干材料作为粉末使用或可通过添加各种体积的水溶液而复原。在复原过程中添加的体积可与冻干前溶液的体积相似、更低(导致与原料的体积相比提取物浓缩)或更高(导致与原料的体积相比提取物稀释)。
如果需要,可将血小板提取物保持冷冻或固体例如冻干状态以长期贮存或作为粉末使用。
例如,可将通过本发明的方法获得的血小板提取物保持在例如-18℃或更低温度下的冷冻状态或固体例如冻干状态以长期贮存。还可将血小板提取物例如在2℃至8℃的温度下冷藏。
冻干提取物可作为固体使用或可在使用前在药学上可接受的载体中复原。术语“药学上可接受的载体”是指适于人类施用或适于动物施用的任何稀释剂和/或媒介物。载体可选自本领域已知的任何载体,诸如但不限于盐水、氯化钠溶液、乳酸林格氏溶液(LR)、5%右旋糖的生理盐水溶液以及注射用水。
如果与纤维蛋白粘合剂一起施用,则提取物可在粘合剂组分之一(凝血酶或纤维蛋白原)中复原或可在另一种稀释剂或媒介物中单独复原。
有利的是,冻干循环和制剂可允许提取物例如在纤维蛋白粘合剂中非常快速地复原,例如以便促进需要紧急使用的止血和愈合,因此在该情况下复原有利地在数秒内完成。在本发明的一个实施例中,将白蛋白用在制剂中以允许快速复原。
可浓缩通过本发明的方法获得的提取物。可在任何步骤例如S/D移除步骤之后立即或在稍后步骤实施浓缩。可通过材料渗滤和/或将冻干提取物以与其冻干前的提取物体积相比较低的体积复原来实现浓缩。
本发明提供试剂盒。该试剂盒可包括包含根据本发明的提取物的容器。提取物可处于固体形式,例如冻干的,作为溶液或处于冻结形式。在以固体形式提供提取物的情况下,试剂盒还可包括具有用于复原固体提取物的药学上可接受的载体的容器。试剂盒还可包括用于将提取物注入患者体内的一个或多个注射器和/或注射器针头。试剂盒可包括使用说明。说明可介绍如何将提取物施用给患者。本发明还涉及下述试剂盒,所述试剂盒包括包含纤维蛋白粘合剂、合成粘合剂和/或另一个可能的递送剂的组分的容器;包含本发明的提取物的容器;以及使用说明。任选地,本发明的提取物可在一种纤维蛋白粘合剂组分的容器中。另外,本发明涉及包括包含冻干提取物的容器、包含复原溶液或载体的容器以及使用说明的试剂盒。
纤维蛋白粘合剂组分可由血液组合物制成。血液组合物可以是全血或血液级分,即全血制品,诸如血浆。
在本发明的一个实施例中,纤维蛋白原组分由作为来源于血浆的蛋白质溶液的生物活性组分(BAC)组成,该溶液还可以包含氨甲环酸和精氨酸或赖氨酸或精氨酸与赖氨酸的混合物,或其药学上可接受的盐。BAC可衍生自冷沉淀物,尤其是浓缩的冷沉淀物。
BAC的组合物可包含稳定剂,诸如盐酸精氨酸。通常,BAC中纤维蛋白原的量在约40mg/ml至约60mg/ml的范围内。BAC溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约110mg/ml。盐酸精氨酸的量可为约15mg/ml至约25mg/ml。
任选地,将溶液缓冲到生理相容的pH值。缓冲液可由甘氨酸、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙和作为载体的注射用水组成。甘氨酸可按约6mg/ml至约10mg/ml的量存在于组合物中,柠檬酸钠可在约1mg/ml至约5mg/ml的范围内,氯化钠可在约5mg/ml至约9mg/ml的范围内,并且氯化钙可在约0.1-0.2mg/ml的浓度内。任选地,BAC组分可被稀释成包括3-60mg/ml纤维蛋白原。可例如利用包括甘氨酸、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙和注射用水的溶液来实施稀释。
在一个实施例中,所用的凝血酶组分可介于100-1200IU/ml的范围内。
在将液体纤维蛋白粘合剂制剂施加到期望位置上期间,可以任何期望的比率范围施用包含纤维蛋白原的组分和包含凝血酶的组分。例如,当纤维蛋白原组分的浓度为3-60mg/ml并且凝血酶浓度为约10-1200IU/ml时,两种组分可分别以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1等的比率进行混合。在本发明的一个实施例中,以3∶1的比率施用液体纤维蛋白粘合剂的组分。
在另一个实施例中,将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低至等于或低于15μg/ml,例如5μg/ml或更低的纤溶酶原,例如使用US-B-7,125,569和WO02095019中所述的方法。在这种情况下,不需要向BAC中添加氨甲环酸、抑肽酶或任何其他纤维蛋白溶解溶抑制剂。
还可能的是,纤维蛋白粘合剂包含促进凝块形成的组分,诸如Ca2+、因子VIII、因子VIII、纤粘蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(vWF),它们可作为单独的组分提供或与纤维蛋白粘合剂组分一起配制。
来源于血液组合物的纤维蛋白粘合剂组分通常由感染性粒子纯化而得。纯化程序可通过纳滤、溶剂/洗涤剂处理和/或通过本领域已知的任何其他方法进行。
术语“感染性粒子”是指可在生物有机体细胞中感染或繁殖的微观粒子,诸如微生物或朊病毒。感染性粒子可以是病毒粒子。
根据本发明制备的血小板提取物可与多种细胞类型结合使用,例如成纤维细胞和干细胞例如内皮干细胞,例如HUVEC。细胞类型可根据预期的治疗用途确定。例如,对于椎间盘再生,可使用包含来源于脊索的细胞的细胞组合物。对于诱导血管生成,可以使用内皮干细胞。
以下实例为例示性的,而非限制性的。
实例
材料和方法。
经洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制剂。
根据“Circular of Information for the Use of Human Blood and BloodComponents”(2009年12月)并遵照适用的联邦法令以及FDA和美国卫生部法规采集并加工血小板材料单位(白细胞减除单采血小板单位)。每个单位具有大约200ml的体积。基于FDA法规、要求和指南,从经筛查并发现适合捐献可输注血液组分的单个供体抽取每个单位。所包括的单位仅仅是通过采用经FDA批准的试剂盒和方法发现为针对红血细胞抗体非反应性的并且针对以下病毒阴性的单位:乙肝病毒表面抗原;乙肝病毒核心抗原抗体;丙肝病毒抗体;人类嗜T淋巴细胞病毒1型和2型抗体;人类免疫缺陷病毒1型和2型抗体;HIV-1(通过核酸检测(NAT)技术);HCVRNA(通过NAT);西尼罗河病毒RNA(通过NAT);和梅毒血清学检测。一个单采白细胞减除采集单位中的最低血小板数在“信息通报”中有所规定:≥3.0×1011个(单个全血单位中的血小板数≥5.5×1010)。
将所有单位维持在推荐的输注条件下(参见FDA批准的血液采集、加工和贮存系统的使用说明)直至洗涤步骤。
洗涤程序。
将每个单位按如下方式在无菌条件下洗涤:
1.将每个单位在室温下以4658×g离心6分钟(不使用破碎转子)。在这些温和条件下,避免了细胞的破碎。
2.弃去上清液,将血小板沉淀复溶在200ml无菌对接盐水(dockedsaline)中(一种将液体在封闭系统中的容器之间转移以保持无菌状态的方式)。
3.在步骤1中规定的相同条件下进行第二次离心。
4.弃去盐水,将沉淀的血小板重悬在200ml无菌对接盐水中。
5.将经洗涤和重悬的血小板在-20至-30℃下冷冻。冷冻步骤在从前一步骤起的4小时之内进行。
在血液采集中心(Rock River Valley Blood Center,Rockford,IL/FDA许可证号249)进行白细胞减除单采血小板单位的上文详述的采集和洗涤程序。将最终的WAP袋在制备之日起两个月内提供给实验。单位以干冰冷冻状态接收。
在进一步加工之前,个体冷冻单元(袋)被解冻并且然后混合在一起或冷冻和解冻的同时混合在一起。解冻程序在25℃下进行同时利用连接到RK1顶置式搅拌器(Heidolph Instruments,Germany)的不锈钢推进器以30RPM进行搅拌。
生长因子回收率。
利用特定商业ELISA试剂盒(Quantikine by R&D Systems,MN USA:人类TGF-β1目录号DB100B、人类FGF基本目录号HSFB00D、人类VEGF目录号DVE00、人类PDGF-AB目录号DHD00B、人类PDGF-BB目录号DBB00、以及人类EGF目录号DEG00)检测和测量样品中若干生长因子的浓度。在下面的所有试验中,在将样品上样到色谱树脂(SDR前材料)之前和从树脂(在溶剂和洗涤剂移除之后;SDR后材料)收集样品之后测量裂解物中的生长因子含量,并且计算S/D移除之后生长因子恢复的百分比。
细胞计数。
3T3-Swiss Albino成纤维细胞(ATCC,目录号CCL92)生长作为粘附单层。每2-3天,利用显微镜检查烧瓶的混合情况。
如下进行计数程序:
-对培养基送气。
-利用10ml PBS简单地漂洗细胞层以移除所有血清痕迹。
-每175cm2烧瓶添加5ml Trypsin-EDTA(分别0.05%和0.02%)溶液,并且在倒置显微镜下观察细胞直到细胞层从板平面强行去除(通常在3至5分钟内)。
-添加10ml完整的生长培养基[DMEM;Biological Industries,Israel;目录号01-055-1A),包含4.5g/l葡萄糖并补充了4mM谷氨酰胺(Biological Industries,Israel;目录号03-020-1B)、10%胎牛血清(FCS;HyClone,USA;目录号SH30070.03)、青霉素(100U/ml)/链霉素(0.1mg/ml)/两性霉素(0.25μg/ml)溶液(P/S/A;BiologicalIndustries,Israel;目录号03-033-1B)],并且通过若干次轻轻地向上和向下吸移来分散游离细胞团块/群集直到获得了均一化细胞悬浮液。
-将细胞悬浮液转到50ml管中并且室温下以1000xg在浮桶式转头中离心4分钟。
-丢弃上清液(包含培养基),并且将粒料(包含细胞)再次悬浮于3-10ml上述的新鲜完整的生长培养基中。
-将10μl细胞悬浮液上样在血球计中以用于细胞计数。
增殖测定。
在第1天:
计数细胞(如上文详述),并且利用完整的生长培养基(GM)将细胞稀释到25,000cells/ml的浓度,并且对来自细胞溶液的100μl进行播种,并且允许粘附在96-孔板的行B-G中(最终细胞浓度每个孔2500个细胞)。行A+H保留为空。在37℃下在水套式培养箱中利用5%CO2温育该板24小时。
在第2天:
对生长培养基送气,并且利用饥饿培养基[DMEM,包含利用4mM谷氨酸盐补充的4.5gr/l葡萄糖、1%MEM-EAGLE非必需氨基酸(BiologicalIndustries,Israel;目录号01-340-1B、1%人血清白蛋白(人血白蛋白注射液25,Talecris Biotherapeutics,Germany)和P/S/A(处于上文列出的浓度)](SM)(每次洗涤约100μl/孔)对板粘附细胞洗涤两次,并且将新鲜的100ul/well SM添加到所有孔(行A-H)。在37℃下在水套式培养箱中利用5%CO2温育板24小时。
在第3天:
将10μl未稀释或连续稀释试验材料/提取物(根据给定处理制备)添加到孔(重复三次)并且在37℃下在水套式培养箱中利用5%CO2温育另外的48小时。通过利用饥饿培养基执行6或9次连续的1∶2或1∶3稀释来制备稀释样品。
在第4天:
将10μl细胞增殖测量试剂WST-1(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany;目录号11-644-807;该试剂被设计用于非放射性,细胞群体中利用96-孔-板格式的细胞增殖、生长生存和化学敏感性的分光光度曲线量化)添加到每个孔。在37℃下在水套式培养箱中利用5%CO2的另外的4小时的温育之后,在关闭包含仅培养基的空孔(行A+H)上的器械之后,在ELISA阅读器中以450nm和650nm读取96-孔板。
结果评估。
将由ELISA阅读器在650nm下获得结果从在450nm下每个孔单独获得的结果中减去。通过Prism软件(GraphPad Software,Inc)进一步分析值。为了降低背景读数,将未处理的孔(包括未利用试验材料处理的细胞)获得的结果从相同的96-孔板上所有的孔值中减去。所获得的结果用于绘制s形剂量响应曲线对材料浓度的对数。此外,通过GraphPad Prism软件计算R2拟合,半数有效浓度(EC50)和95%置信区间EC50值。
凝血酶活性。
通过血小板凝聚时间测量利用STart4凝结器械(Diagnostica Stago,Asnières sur Seine,France)来评估凝血酶活性。该分析是EuropeanPharmacopaiea Assay procedure,1997年9月3日,第858页的修改。简言之,通过使凝血酶标准与0.1%纤维蛋白原含量的(Enzyme ResearchLaboratories,IN,USA)纤维蛋白原溶液混合来绘制校准曲线。然后从校准曲线通过它们血小板凝聚时间计算不同的试验样品中凝血酶浓度(浓度是从校准曲线插值的)。在测量之前,试验的提取物样品与凝血酶16IU/ml(Omrix,Israel)1∶1(w/w)混合以达到8IU凝血酶/ml的最终浓度。对于校准曲线,通过使相同的16IU凝血酶/溶液与凝血酶稀释缓冲液(0.4%以三-柠檬酸钠、双水合物、0.9%氯化钠和1%BSA,pH=7.5)按1∶1(w/w)混合来制备8IU凝血酶/ml标准样品。通过使相同的16IU凝血酶/ml溶液与血小板提取物样品(所述样品未经S/D处理并且不包含肝素、LMWH或PVP(如实例1中制备))按1∶1(w/w)混合来制备用于治疗的阳性对照样品。在柱之前或之后,在每个裂解物中测量凝血酶活性。结果相对于对照样品(视为100%凝血酶活性)示出。
下文试验中所利用的PVP。
在下表30中,示出了不同PVP的浓度w/w以及它们对应的以mM为单位的浓度。
PVP通过其K-值、或Fikentscher的粘度系数来表征,所述粘度系数为平均分子量、聚合度和本征粘度的函数。根据欧洲和美国有效处方中的K-值来表达可溶聚乙烯吡咯烷酮等级的平均分子量。
通过将单体连接在一起的聚合反应制备PVP聚合物。通过控制聚合反应的结束来制备不同分子量的PVP。这导致不同类型的PVP,每个均具有其各自的MW范围。存在若干方法来确定PVP的MW。
值得注意的是,K-值和粘度是不可互换的。K-值是从水中的粘度计算的。
在下文的全部实验中,所列出的PVP百分比为w/w或mM。另外,醋酸盐/甘氨酸/HSA百分比以w/w计算。
在下文的所有血小板裂解物中,混合的WAP的同渗容摩为约260-280mOs[通过利用AdvancedTM Micro Osmometer Model 3300(AdvancedInstruments Inc,Norwood,MA,USA)测量]。为了在整个过程中尽可能恒定地保持同渗容摩水平,如果需要,使用NaCl(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)监测缓冲液的同渗容摩并且将其调节到WAP原料的同渗容摩。
实例1:经混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备、利用S/D处 理、与肝素掺混并且经受S/D移除的血小板提取物。
在下述实例中,检查在S/D移除期间通过疏水作用色谱(HIC)的包括未分级的肝素[肝素钠-Fresenius 5000i.u./1ml(注射)Bodene(PTY)Limited,South Africa]对TGF-β1、PDGF-AB、PDGF-BB、bFGF、VEGF和EGF的回收率的影响。测试了肝素,因为已知其会结合某些生长因子。肝素具有大范围的分子量,并且未分级的肝素意味着不存在分子大小的特定更窄范围的隔离或选择。
利用SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)实施S/D移除。SDR HyperD是一种由二氧化硅小球制成的色谱填料,而二氧化硅小球中的孔体积由三维交联疏水性丙烯酸类聚合物填充。SDR HyperD涉及疏水相互作用的混合模式吸附,并与分子排阻效应相关[Guerrier L等人,“Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivatedbiological fluids”.J Chromatogr B Biomed Appl.1995年2月3日;664(1):119-125]。
用2ml树脂填充1cm直径的Bio-Rad柱(小规模试验)。利用从5-12袋(每个袋得自一个供体)获得965-2328g混合洗涤白细胞减除单采血小板(WAP)制备经S/D处理的血小板裂解物样品。将20mM醋酸钠、10mM甘氨酸和0.2%人血清白蛋白(HSA)W/W(来自最终体积溶液)添加到混合WAP中。在下一步中,将1%Triton X-100和0.3%TnBP加入溶液中,然后将溶液在室温(22±2℃)下温育和混合(在滚轴混匀仪上)2小时以进行血小板裂解和抗病毒处理。然后将原液裂解物等分(14ml)到小瓶中,冷冻并且在-80℃下保存直到使用。在使用之前,等分的裂解物在37℃水浴情况下解冻,通过5μm注射器式滤器过滤以移除任何颗粒物并且在滚轴混合器上混合至少5分钟。
在上样经S/D处理的裂解物之前,利用10ml纯化水洗涤具有树脂的填料柱,并且根据裂解物缓冲液在具有或不具有肝素的前提下利用pH为6.8-7.4的10ml醋酸盐-甘氨酸-HSA缓冲液(缩写为“AGA”;浓度如上;在下面的实验中,使用的所有AGA的pH为6.8-7.4)来平衡填料柱。在接下来的步骤中,将10ml经S/D处理的裂解物上样到柱上,除了样品2和4,所述样品2和4在将裂解物上样到柱上之前利用5IU肝素/ml(将50μl肝素添加到50ml血小板裂解物中)进行温育。流速保持为0.4ml/min。在上样柱之前,在室温(22±2℃)下将具有或不具有肝素的样品在滚轴混匀仪上混合20分钟。将残余的S/D处理的裂解物材料(该材料未上样到柱上)转移到1.5ml小瓶内并且保持在-80℃以用于生长因子浓度测量的分析并且被视为上样对照/SDR前材料。
在上样裂解物之后,柱上样有不同缓冲液(如下文表1所示),每种缓冲液均10ml。每种缓冲液包含处于不同浓度的不同配料。在缓冲液的一些中,使肝素与氯化钠/乙醇混合。流速保持为0.8ml/min或低于0.8ml/min。收集、混合上样后并且利用缓冲液洗涤后从柱获得的所有级分,并且将所收集的材料分为1ml等分试样并且保持冷冻在-80℃下直到继续进行生长因子回收率的测量。这种材料被视为SDR后移除材料。
不同生长因子的回收率(相对于SDR前材料的%)示于表2中。
表1:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
表2:根据表1中的样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物中 各种生长因子的回收率(相对于SDR前柱的%)。
表2表示的结果示出,在将材料上样到SDR柱之前利用肝素对经S/D处理的血小板裂解物的温育(处理2和4对处理1和3)导致bFGF的回收率从约53%显著增加到约93%或97%。PDGF-BB的回收率也增加,但是程度较小。
处理2和4(包括在上样到SDR柱之前利用肝素的温育和利用肝素的附加洗涤步骤的组合)导致所得的具有PDGF-AB和PDGF-BB的血小板提取物的显著富集,相比于其中在含肝素缓冲液之前利用不含肝素的缓冲液洗涤柱的处理2,所述富集在通过在上样之后立即利用包含肝素的缓冲液洗涤柱的处理4中得到进一步增加(分别61%和92%的回收率)。
因此,结果示出,S/D移除(例如通过HIC)之前,使经S/D处理的血小板裂解物与肝素的接触可有利地增加某些生长因子例如bFGF和PDGF-BB的回收率。
实例2:在S/D移除之前通过使裂解物与肝素掺混而制备的血小板提 取物对成纤维细胞增殖的影响。
在下面的实例中,检查了在S/D移除之前通过使裂解物与肝素掺混而制备的血小板提取物对3T3-Swiss Albino成纤维细胞增殖的影响。检查了根据表1详述的四个不同步骤制备的四个提取物。结果示于图1中。
细胞增殖结果(图1)示出通过处理2和4(包括在上样到SDR柱上之前利用肝素温育)获得的样品在诱导增殖方面比通过处理1和3(未利用肝素进行温育)获得的样品显著更加有效。通过处理2和4获得的样品分别具有0.99和0.89的EC50,而通过处理1和3获得的样品分别具有2.93和2.4的EC50。
这些结果证明,在S/D移除之前利用肝素温育(这可导致更高的GFs回收率)还提高由成纤维细胞增殖分析反应的生物效能。
实例3:在S/D移除步骤之前使经S/D处理的裂解物与低分子量肝素 混合的影响。
低分子量肝素(LMWHs)为相对于15kDa的未级分肝素具有约4.5kDa的平均分子量的肝素。在临床应用中,LMWH比未级分肝素具有若干药理和实用优点。LMWH已被示为具有与细胞和蛋白质的更特定的结合,具有更长的等离子体半衰期,并且可因此在皮下施用(Hirsh and Raschke,Heparin and low-molecular-weight heparin the Seventh ACCP Conference onAntithrombotic and Thrombolytic Therapy.Chest.2004;126:188S-203S)。
在下面的实例中,检查了HIC S/D移除步骤期间所使用的不同条件对PDGF-AB、PDGF-BB、bFGF、VEGF和EGF的回收率的影响(参见表3中的不同条件)。在本实验中,将依诺肝素(Clexane,Sanofi Aventis)用作低分子量肝素。
制备裂解物并且然后将其上样到SDR柱,如在表3详述的条件下上述的实验中详述的。在上样之前,利用上样裂解物的缓冲液实施平衡。收集、混合上样之后并且利用缓冲液洗涤之后从柱获得的所有级分,然后计算生长因子总回收率。对上述的肝素进行包括利用5IU/ml依诺肝素以相同方式进行温育的处理2。结果在表4中示出。
表3:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
表4:根据表3中的样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物中 各种生长因子的回收率(相对于SDR前柱的%)。
表4表示的结果示出,在S/D移除步骤(处理2对处理1)利用依诺肝素对经S/D处理的血小板裂解物进行温育以及另外的包含依诺肝素的洗涤步骤增加PDGF-AB、PDGF-BB和bFGF的回收率。
然而,在与5IU/ml未级分肝素接触之后(表1中的处理4;上述的实例1)PDGF-BB和bFGF的回收率(分别为92%和97%)比利用5IU/ml依诺肝素(分别为75%和62%)更高。
具有增加的依诺肝素浓度(30IU/ml;数据未示出)的另外的实验在生长因子回收率方面未产生任何显著变化。
实例4:在S/D移除之前通过使裂解物与低分子量肝素掺混而制备的 血小板提取物对成纤维细胞增殖的影响。
在下面的实例中,检查了如实例3所述制备的血小板提取物对细胞增殖的效应。如“MATERIALS and METHODS”中详述,利用3T3-Swissalbino成纤维细胞实施细胞计数和增殖分析。结果示于图2中。
结果(图2)示出,成纤维细胞增殖在利用LMWH温育(样品2/处理2,EC500.05)的样品中比未利用LMWH温育(样品1/处理1,EC500.11)的样品中更高。
这些结果表明,在S/D移除之前利用低分子量肝素温育增加了一些生长因子的回收率(实例3),并且还增加了生物效能。
实例5:在S/D移除之前使血小板裂解物与PVP掺混对生长因子回收 率的影响。
在先前的实例中,在S/D移除之前,使裂解物与未级分肝素和LMWH接触,该未级分肝素和LMWH已知为结合某些生长因子。
在下面的实例中,探索PVP(PVP为具有两亲性特性的完全不同的化合物)在通过HIC柱移除S/D之后对生长因子回收率的影响。
在本实例中,在HIC S/D移除步骤期间或之前测试存在或不存在(对照)添加PVP的情况下不同的S/D移除条件。利用上文列出的商业ELISA试剂盒,检查了以下生长因子的回收率:TGF-β1、PDGF-AB、PDGF-BB、bFGF、VEGF和EGF。测试了两种类型的PVP:具有22.5-27.0的K-值以及30000Da的平均分子量的K25(25,,目录号02286Sigma LifeSciences,Germany);以及K30(具有27.0-32.4的K-值和40000Da的平均分子量的聚乙烯吡咯烷酮K-30,目录号P1454Spectrum chemical mfg corp.USA)。
制备裂解物,并且如实例1详述那样且通过利用表5中详述的S/D移除条件将其上样到SDR柱。在上样之前,利用上样裂解物的缓冲液实施平衡。收集、混合在上样之后以及利用缓冲液1和缓冲液2洗涤之后从柱获得的所有级分,并且计算生长因子回收率。生长因子回收率结果(如上所述进行计算)示于表6中。包括PVP的所有上样样品还以上文所讨论的方式利用PVP温育。
表5:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
表6:根据表5中样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物中各 种生长因子的回收率(相对于SDR前柱的%)。
结果示出,在通过SDR柱移除S/D之前和期间使经S/D处理的血小板裂解物与PVP接触很大程度上影响来自SDR柱的生长因子的回收率。
另外,结果示出,在S/D移除步骤期间,与乙醇和氯化钠混合的PVP比单独的PVP在增加生长因子回收率方面更加有效(对比处理7vs.9,和3vs.5)。
结果还示出,利用更低分子量PVP导致生长因子回收率方面的进一步增加(对比处理3与7)。
可推断出,在使经S/D处理的裂解物经受S/D移除步骤时,可通过在S/D移除步骤之前和/或期间使经S/D处理的裂解物与PVP接触来实现生长因子回收率的增加。
实例6:S/D移除之前和期间所使用的PVP聚合物的分子量对成纤维 细胞增殖的影响。
在下面的实例中,检查了S/D移除之前和期间与经S/D处理的裂解物接触的PVP的分子量对细胞增殖的影响。
使用了根据表5中详述的处理3和7的S/D移除程序(实例5)制备的血小板裂解物样品。
如“MATERIALS and METHODS”中详述,利用3T3-Swiss albino成纤维细胞实施细胞计数和增殖分析。
结果示于图3中。
结果示出,包括PVP K25的样品3(EC50=0.34)具有比包括PVP K30(EC50=1.95)的样品7更高的增殖率。尽管,如实例5所示,得自处理7的生长因子的回收率比得自处理3的生长因子的回收率更高,但是生长因子在处理3中恢复的活性比生长因子在处理7中恢复的活性更加有效。
这些结果表明,为了获得增加的生物效能,可有利地使用低分子量PVP(例如PVP K25)。
实例7:在S/D移除之前和期间不同浓度的PVP对生长因子回收率的
影响
下面的实例目的在于证实前述的结果,前述结果示出在S/D移除步骤期间利用PVP、乙醇和/或氯化钠增加从SDR柱的生长因子回收率。检查了S/D移除期间不同条件的影响,并且按照上文测量了SDR后材料中若干生长因子的回收率(TGF-β1、PDGF-AB、PDGF-BB、bFGF、VEGF和EGF)。
在这些实验中使用了PVP K25(与上文相同)。制备裂解物,并且如上文实例1详述那样利用下面的表7中详述的S/D移除条件来将其上样到SDR柱。在上样之前,利用AGA(如上文的浓度)+0.1%(0.03mM)PVPK25实施平衡。所有样品包含AGA缓冲液(如上文的浓度)中最终浓度0.1%(0.03mM)的PVP K25。在上样之前以上文所讨论的方式利用PVP温育所有上样样品。收集、混合上样之后并且利用缓冲液洗涤之后从柱获得的所有级分,然后计算生长因子回收率。生长因子回收率结果(相对于SDR前材料的%)示于表8中,并且从最高到最低的生长因子总回收率列出。
一个目的是尝试减少最终产品中的PVP。在前述实例所述的一些实验中,利用相对较高的1%PVP最终浓度(实例5)温育样品。在一些情况下,在上样柱以及样品体积(6柱体积)之后,利用相对较低的0.1%PVP浓度洗涤柱。然而,由于按体积来说最大级分为上样的样品(6柱体积),故降低产品中的PVP的最好方法是通过降低待上样的样品中的PVP浓度,例如通过利用最终浓度0.1%(0.03mM)PVP K25而不是1%(0.3mM)PVPK25来温育待上样的样品。。
表7:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
表8:根据表7中的样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物中 各种生长因子的回收率。
*相对于SDR前柱的%。
结果证实了先前的结果,并且示出相比于在S/D移除步骤期间仅与PVP接触相比,在裂解物与PVP(该PVP与乙醇和氯化钠混合)接触时获得了从SDR柱的最高生长因子回收率。
结果还示出,将产品中PVP浓度降低到低于0.5%(0.17mM)是可能的。
实例8:血小板提取物中不同浓度的PVP对成纤维细胞增殖的影响。
以“MATERIALS and METHODS”中利用3T3-Swiss albino成纤维细胞所述的方式检查实例7中制备的样品对细胞增殖的增殖影响。
在该实验中,检查了样品17和19的细胞增殖活性,其示出相当数量的生长因子回收率。两种样品之间的主要差异在于,样品17由包含0.1%(0.03mM)PVP的第二洗涤缓冲液制备而样品19由包含0.5%(0.17mM)PVP的第二洗涤缓冲液制备(参见表7)。这种差异导致具有不同PVP浓度的两种提取物产品。
结果示出,包含低PVP浓度的样品17(由0.1%PVP制备;EC50=2.3)的细胞增殖活性类似于包括更高PVP浓度的样品19(由0.5%PVP制备;EC502.87)的细胞增殖活性。
结果(图4)示出,产品中更高量的PVP不影响增殖水平。
实例9:PVP对凝血酶活性的影响。
下述的实例目的在于检查S/D移除期间利用PVP或肝素制备的血小板提取物是否影响凝血酶活性。
凝血酶为凝结作用的关键酶并且被激活作为凝血级联的第一步骤。凝血酶充当将可溶纤维蛋白原转换成不溶解的纤维蛋白股的丝氨酸蛋白酶,以及催化许多其他凝结作用相关的反应。
肝素和LMWH对血液凝结作用的效应已成为已知的,并且它在医学中主要用于抗凝作用[“Effect of Heparin on Thrombin Inactivation byAntithrombin-III”.Biochem.J.1978;173:869-875]。
通过如上所述的血小板凝聚时间测量来评估凝血酶活性。
表9中所示的结果为相对于对照样品(该对照样品被视为100%凝血酶活性)的。
表9:包含肝素、LMWH或PVP 25的血小板提取物样品的凝血酶活性 (相对于对照样品的%)。
* 相对于对照样品的凝血酶活性(%)。
** 根据实例1中的处理2和4制备。
*** 根据实例3中的处理2制备。
**** 根据实例7中的处理17制备。
结果示出,包含未分级肝素或LMWH的血小板提取物样品具有对离体凝血酶活性的抑制作用,而未检测到包含PVP的提取物样品的抑制作用。
实例10:血小板提取物由混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制 备,利用S/D处理,利用PVP K25温育,并且从SDR柱利用以大规模处理 制备的PVP K25洗涤。
在该实验中,在更大规模上评估S/D移除之前PVP添加物对生长因子回收率的影响(在上述的实验中实施了小规模处理)。在该实验中使用了PVP K25。
如下制备裂解物:利用得自12个袋的2328g混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备血小板裂解物样品。将达到20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的最终浓度,pH为6.8-7.4的255ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液和达到最终体积溶液的0.2%W/W的最终浓度的人血清白蛋白(HSA;TalecrisUSA)添加到混合WAP中。在下一步中,通过在以30RPM混合时向混合样品中缓慢添加1%Triton X-100和0.3%TnBP(w/w)来进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳,将S/D处理分成两个部分。第一,持续搅拌样品30分钟,以5016xg在23-27℃下离心10分钟,并且通过0.45μm过滤器(Sartopore 2,Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)进行过滤。在第二部分,将经过滤的材料倾注到浸在调整为25℃的水浴中的不锈钢反应釜中,并且以30RPM混合另外的2小时以继续在澄清溶液中进行病毒灭活过程。将PVP K25添加到经S/D处理的裂解物至0.1%(w/w)的最终浓度(0.03mM),并且在25℃下温育20分钟同时以30RPM进行搅拌。使用5μmSartopore PP2过滤器过滤样品以移除颗粒物。
接下来,采用以下设备进行了S/D移除:填充了300ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱,结合蠕动泵和UA-6UW/WIS检测器+11型记录仪(ISCO,NE,USA)。利用包含20mM醋酸钠、10mM甘氨酸、0.1%(0.03mM)PVP和0.2%HSA的pH为6.8-7.4的900ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液来平衡柱。将1800ml经S/D和PVP处理的血小板裂解物(包含1620ml血小板材料)上样到柱上,之后是利用包含0.5%(0.17mM)PVP和0.2%HSA的600ml醋酸盐甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)来洗涤柱。之后利用包括12.5%乙醇、1M氯化钠、0.1%(0.03mM)PVP和0.2%HSA的1,200ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液进行洗涤。接着,将柱用300ml纯化水洗涤。提取物包括上样后和利用缓冲液洗涤后从柱混合和收集的所有级分。测量并计算了提取物中的生长因子回收率。
从柱收集了3600ml总体积。使用连续的3和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore 2过滤器(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)对收集的材料进行过滤。
如上所述计算PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、bFGF和EGF的回收率。
表10:S/D移除步骤之后根据上述条件以大规模处理的血小板提取物 中各种生长因子的回收率。
生长因子 | 回收率(%)* |
TGF-β1 | 83 |
PDGF-AB | 73 |
PDGF-BB | 87 |
EGF | 59 |
bFGF | 61 |
VEGF | 76 |
*相对于SDR前柱的%。
表10所示的结果示出,当执行大规模处理时,维持了在使用与乙醇和氯化钠混合的低浓度PVP时从SDR柱的相对较高的生长因子回收率。SDR后提取物中PVP的浓度为0.17%(0.057mM)。
实例11:S/D移除之前或期间通过使裂解物与低浓度的PVP K25接触 以大规模处理制备的血小板提取物对成纤维细胞增殖的效应。
如上文详述使用3T3-Swiss albino成纤维细胞,实施先前的实例中利用PVP K25制备的样品对细胞增殖的影响。将样品的活性(在图5中标记为处理1)与如实例1详述的通过接触肝素制备的裂解物的活性(在图5中标记为处理2)进行对比。
增殖结果示于图5中。
结果示出,以大规模处理制备的血小板提取物样品具有正增殖效应(EC50=0.024),所述正增殖效应高于利用肝素制备的血小板提取物样品的增殖效应(EC50=0.047)。
这些结果证明,如本文所述从大规模SDR柱收集的血小板提取物具有高生长因子回收率,并且因此当以大处理规模实施时具有生物活性。
实例12:在S/D材料移除之前和/或期间利用PVP对SDR后材料中残 余的S/D材料量的影响。
在先前组实验中,示出在S/D移除步骤之前和/或期间使血小板裂解物与PVP、乙醇和/或氯化钠接触时,获得了增加的生长因子回收率。
重要的是证实PVP不降低SDR树脂的S/D结合能力,以确保从裂解物有效地移除S/D。
在以下组实验中,评估了在如实例10中详述的相同条件下S/D(TritonX-100和TnBP)移除的功效。
值得注意的是,血液衍生产品中Triton X-100和TnBP两者可接受的界限为<5ppm。在S/D移除步骤之前(SDR前材料)和之后(SDR后材料)测量Triton X-100和TnBP的浓度。Triton X-100通过反相HPLC和紫外检测器测定,而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。
结果示于下表11中。
表11:根据实例10中详述的条件在S/D移除之前和之后裂解物中的 S/D浓度。
在上述的实验中,在存在浓度高达0.5%(0.17mM)的PVP K25的情况下实施温育/平衡/洗涤。
结果示出,在存在浓度高达0.5%的PVP K25的情况下实施S/D材料移除(在先前实验中发现这对于生长因子恢复性而言为有效的)不影响柱的S/D移除性能。
另外的实验(如实例5中所示以小规模处理实施的),其中在存在浓度为1%(0.3mM)的PVP K25和K30情况下实施温育/平衡/洗涤导致SDR后存在Triton X-100。结果示于下表12中。
表12:根据实例5中详述的条件在S/D移除之前和之后裂解物中的 S/D浓度。
据推断,有利地,在存在低于1%(0.3mM)浓度的PVP K25的情况下实施S/D移除导致S/D移除期间增加的生长因子回收率,并且同时确保S/D从裂解物中有效的移除。
实例13:由WAP制备的、利用S/D处理的、与PVP K25接触的、并 且经受S/D移除的血小板提取物中若干生长因子之间的比率。
下述的实例示出了如本文所公开制备的血小板提取物中若干生长因子之间的比率,并且检查所获得的比率是否相当于原料中的比率,并且是否相当于将样品上样到色谱树脂(SDR前材料)上之前裂解物中的比率。如实例10中所述制备SDR前和SDR后材料(或提取物)。
利用上文所述的特定商业ELISA试剂盒测量了所有三个测试材料(WAP原料、SDR前材料和SDR后材料)中TGF-β1、VEGF、bFGF和PDGF-AB的水平,并且计算了PDGF-AB/TGF-β1;PDGF-AB/VEGF;TGF-β1/bFGF;和VEGF/bFGF之间的比率。生长因子水平和比率分别在下面的表13和14中示出。
表13:WAP原料、SDR前材料和SDR后材料中TGF-β1、VEGF、 bFGF和PDGF-AB的水平。
表14:WAP原料、SDR前材料和SDR后材料中计算出的生长因子比 率。
测试材料 | PDGF-AB/TGF-β1 | PDGF-AB/VEGF | TGF-β1/bFGF | VEGF/bFGF |
WAP原料 | 0.40 | 40 | 1129 | 11 |
SDR前材料 | 0.34 | 43 | 1247 | 10 |
SDR后材料 | 0.30 | 41 | 1698 | 12.4 |
结果示出,S/D移除步骤期间与PVP K25(所述PVP K25与乙醇和氯化钠混合)接触的血小板裂解物导致提取物具有PDGF-AB/TGF-β1;PDGF-AB/VEGF;TGF-β1/bFGF;以及VEGF/bFGF比率,所述比率类似于原料和S/D移除之前的材料中的比率。
可推断出,如本发明所述那样实施S/D移除导致血小板提取物包括类似于S/D移除之前材料的因子比例。
实例14:在S/D移除步骤之前和/或期间通过使裂解物与肝素、硫酸葡 聚糖或PVP K25接触制备的血小板提取物中的生长因子回收率。
下述实例比较了S/D移除步骤期间通过使裂解物与肝素、硫酸葡聚糖或PVP接触制备的不同血小板提取物中的生长因子回收率。如上文详述计算回收率。利用得自10-13个袋的1900-2500g混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备具有肝素的血小板提取物。将209-385ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液添加到最终浓度为20mM的醋酸钠、10mM甘氨酸;将pH为6.8-7.4和0.2%w/w(最终浓度)人血清白蛋白(HSA,Talecris USA)添加到混合的WAP中。通过在以50RPM混合时向混合样品中缓慢添加1%Triton X-100和0.3%TnBP(w/w)来进行S/D处理。首先,将样品连续搅拌30分钟,然后通过20和3μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore 2(SartoriusStedim Biotech S.A.,Aubagne,France)连续过滤。接着,将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中,并以50RPM再混合2小时以继续病毒灭活工艺。
采用以下设备进行了S/D移除:填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱,结合蠕动泵和UA-6UW/WIS检测器+11型记录仪(ISCO,NE,USA)。利用上样样品的相应缓冲液实现平衡。将1800ml经S/D处理的血小板裂解物(包含1620ml血小板材料)上样到柱上,之后利用600ml醋酸盐甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)+0.2%HSA来洗涤柱。600ml含12.5%乙醇、0.5M NaCl、5IU/ml肝素(肝素钠-Fresenium 5000IU/ml,Bodene(PTY)Ltd,South Africa)的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)和0.2%HSA。之后利用包含10%乙醇、1M氯化钠和0.2%HSA的600ml醋酸盐甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)实施的第二洗涤步骤。最后用300ml纯化水洗涤柱。收集和混合洗涤步骤中获得的流过级分和所有级分(约3.6升)。使用连续的3和1.2μmSartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore 2(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)对收集的材料进行过滤。
利用得自10个袋的1800-2050g混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备具有硫酸葡聚糖的血小板提取物。将197-224ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液添加到最终浓度为20mM的醋酸钠、10mM甘氨酸;pH为6.8-7.4)和0.2%w/w(占溶液最终体积的百分比)人血清白蛋白(HSA,Talecris USA)添加到混合的WAP中。通过在以50RPM混合时向混合样品中缓慢添加1%Triton X-100和0.3%TnBP(w/w)来进行S/D处理。为了避免因可能存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳,将S/D处理分成两个部分。首先,将样品连续搅拌30分钟,然后通过20和3μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore 2(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)进行过滤。接着,将过滤后的材料返回到烧杯(浸入调节到25℃的水浴)中,并以50RPM再混合2小时以继续病毒灭活过程。
将硫酸葡聚糖(Sigma-Aldrich,Canada;目录号D4911)添加到样品中达到1%(w/w)的最终浓度,然后在50RPM搅拌下在25℃下温育20分钟。使用5μm Sartopore PP2过滤器过滤样品以移除颗粒物。
接下来,采用以下设备进行了S/D移除:填充了295ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱,结合蠕动泵和UA-6UW/WIS检测器+11型记录仪(ISCO,NE,USA)。将柱用900ml包含1%硫酸葡聚糖和0.2%HSA的醋酸盐-甘氨酸缓冲液平衡。将1800ml经S/D处理和经硫酸葡聚糖处理的血小板裂解物(含1620ml血小板材料)上样到柱上,之后利用具有12.5%乙醇、0.5M NaCl、0.1%硫酸葡聚糖和0.2%HSA的600ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)进行冲洗。之后利用含1%硫酸葡聚糖和0.2%HSA的600ml醋酸盐-甘氨酸缓冲液(与上述浓度相同)进行洗涤。接着,将柱用300ml纯化水洗涤。从柱收集了3000ml总体积。使用3和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore2(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)对收集的材料进行过滤。
如实例10中详述制备具有PVP的血小板提取物。
下面的表15中示出了对比的生长因子回收率。
表15:不同提取物的生长因子回收率。
* 4个独立提取物制剂之间的平均值。
** 6个独立提取物制剂之间的平均值。
*** 相对于SDR前材料的%。
结果示出,与使裂解物与硫酸葡聚糖或肝素接触相比,S/D移除期间制备与PVP K25接触的提取物导致相似的,并且相对于一些生长因子而言甚至优异的(例如PDGF-AB和PDGF-BB)生长因子回收率。
有利地,与一定浓度(数据未示出)的肝素(上述实例所示)和硫酸葡聚糖相比,包含PVP的血小板提取物对离体凝血酶活性不具有抑制作用。
实例15:活体模型中如本文所制备的血小板提取物对皮肤愈合的影 响。
受损血流导致的组织局部缺血是外科皮瓣损伤的主要因素。
在本实验中,改进的McFarlane鼠椎弓根皮瓣模型(McFarlane等人,Plast Reconst Surg(1965)35:177)用于评估如本发明所制备的血小板提取物在促进皮瓣愈合中的能力。
重350-450g的16个雄性Spargue-Dawley大鼠(n=4/处理组)用于本研究。
外科手术:
在手术前一天移除背侧毛发以露出皮肤。手术当天,以一个剂量的丁丙诺啡SQ注射(0.05mg/Kg)和术前抗生素(Enrofloxacin;10mg/Kg)的形式将术前止痛药给予动物。通过异氟烷吸入剂(约1-4%)施用麻醉。利用氯己定和70%异丙醇来准备手术部位。产生大小为约10×3cm的三面矩形背侧全厚度皮瓣。将皮瓣边缘切入在三面上(头部至尾部),使得皮瓣沿尾边缘附接。通过钝性分离抬高皮瓣,并且皮瓣暴露的下面的背侧表面逐渐地滴涂有1.5ml纤维蛋白粘合剂(由包含最终浓度为3mg/ml的人纤维蛋白原和最终浓度为250IU/ml的人凝血酶的BAC2组分制备),所述纤维蛋白粘合剂具有:i)包含PVP的提取物,ii)包含肝素的提取物或iii)注射用水(WFI;如对照组I)。参见提取物和施用材料的制备,以及下面的准确施用程序。将皮瓣放回到施用粘合剂时其解剖位置。
将皮瓣重定位到其正确的解剖位置,靠近皮瓣周围皮肤的边缘,并且在粘合剂发生反应然后形成类似凝胶的稠度所需的初始时期通过施用舒缓压力来避免坏死区。然后利用4-0非吸收性单丝缝合线材料以一致的简单不规则图案将皮瓣切口缝合回其正确的解剖位置。
对照组(称为“对照II”)经受相同的皮瓣产生程序,但不具有皮瓣闭合之前施用到下面的背侧表面的任何处理。
提取物制剂:
检查两种血小板提取物制剂:一个包含PVP(如实例10制备PVP);并且另一个包含肝素(如实例14制备)。然后使两个提取物都经受稳定、巴氏杀菌和通过相对于醋酸盐-甘氨酸缓冲液如下进行渗滤来移除稳定剂的步骤:
在搅拌下(约22℃)将每克提取物样品对应一克蔗糖缓慢添加到提取物材料中,直到蔗糖完全溶解。然后,将溶液升温至37±1℃,并在搅拌和使用0.5N NaOH将pH调节到6.8-7.4的同时将每克提取物材料对应0.11g甘氨酸缓慢添加到溶液中。pH调节进行直到甘氨酸完全溶解为止。之后在37℃搅拌下逐渐添加每克提取物材料对应0.8g蔗糖,直至完全溶解。将蔗糖和甘氨酸添加到溶液中,以用作巴氏灭菌步骤过程中的稳定剂。然后在恒定混合(50RPM)下通过60℃的热处理对溶液进行10小时巴氏灭菌。为了将所得的粘稠溶液(因添加稳定剂而形成)转移到干净的容器中,将其用醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠和10mM甘氨酸,pH为6.8-7.4)稀释直至14,000-14,300g的总重量(约12,000ml)。使用具有2个Omega10kDa滤盒(Pall Corp,Port Washington,NY,USA)的Centramate系统,通过针对醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠,10mM甘氨酸,pH为6.8-7.4)渗滤来将稳定剂从溶液中移除。渗滤步骤如下进行:首先将样品浓缩到1800ml的体积,然后通过逐渐添加缓冲液并将溶液体积保持在1,800±200ml来针对总体积为10,800ml的醋酸盐-甘氨酸缓冲液(20mM醋酸钠,10mM甘氨酸,pH为6.8-7.4)进行渗析。然后将渗析后的溶液浓缩至410-445ml。
对于稳定化,将甘露糖醇以2%w/w的最终浓度添加到溶液中。为了移除聚集的材料,将溶液通过1.2μm Sartopure PP2过滤器和0.45μmSartopore 2过滤器过滤。使用0.2μm Sartopore 2过滤器在无菌条件下进行了无菌过滤。
然后将获得的溶液等分为4ml部分等分到高压消毒玻璃小瓶中,冻干并且在氮气环境和局部真空(0.6Bar)下利用高压消毒橡胶塞密封。
BAC2(包含组分的纤维蛋白原)+提取物的制备;
无菌地打开冻干提取物的瓶盖,并且将1ml无菌注射用水(WFI)缓慢地添加到(没有上下吸移或涡旋,故没有产生泡沫)冻干提取物的小瓶。将盖无菌地戴回小瓶上,并且将小瓶放置在滚轴混匀仪/摇臂上在室温下持续大约5分钟或者直到完全重塑了提取物粉末。
接下来,将2ml BAC2(纤维蛋白粘合剂的纤维蛋白原组分;Omrix Biopharmaceuticals Ltd.;
包含60mg纤维蛋白原/ml,如在中)与包含120mM氯化钠、10mM三柠檬酸钠、120mM甘氨酸、95mM精氨酸盐酸盐、1mM氯化钙的pH为7.0-7.2的18ml BAC2稀释缓冲液无菌地混合(以制成6mg纤维蛋白原/ml)。轻轻地摇动小瓶至少5分钟。
然后,将2ml稀释的BAC2(6mg纤维蛋白原/ml)在没有针头的情况下抽吸到注射器中并且与上述的1ml再水化提取物-肝素混合;提取物-PVP或WFI。将小瓶放置在滚轴混匀仪/摇臂上在室温下大约5分钟直至使用。
测试制品的制备和施用:
将施用装置的黄色的三腔导管顶端在其基座处切割,并且利用16G单腔VenflonTM静脉注射导管(无针头)或其他合适尺寸的导管代替。将小瓶连接器和注射器从装置移除。利用1ml注射器代替3ml注射器中的一个,并且将1ml凝血酶组分(EVICEL纤维蛋白粘合剂;OmrixBiopharmaceuticals Ltd.)从小瓶无菌地向上抽吸直并且抽吸到1ml注射器中。将包含肝素的3ml BAC2+血小板提取物;包含PVP的BAC2+血小板提取物;或BAC2+WFI(如上所述制备)无菌地抽吸到3ml注射器中。
将两个注射器(一个含有1ml凝血酶;并且另一个含有3mlBAC2和提取物或者WFI溶液)放置在蓝色筒形注射器保持器(来自新的施用试剂盒)中,并且将所提供的塑料蓝色端部连接器放置在两个活塞的端部上,以使得可同时施用凝血酶和测试溶液两者。如上所述,总量1.5ml的纤维蛋白粘合剂具有:i)包含PVP的提取物,ii)包含肝素的提取物或iii)注射用水(WFI;如对照组I),将所述1.5ml的纤维蛋白粘合剂以3(在具有和不具有提取物的前提下包含组分的纤维蛋白原):1(凝血酶组分)[1.125ml:0.375ml]的体积比率施用。
施用给鼠的材料中生长因子浓度/ml(利用上述的ELISA试剂盒测量)示于表16中(施用了1.5ml的体积)。
表16:所测试提取物中生长因子浓度。
评估:手术后14天,麻醉动物,然后通过暴露在CO2下实施安乐死。根据下述排名(从最差到最好)评估皮瓣健康(非坏死和软组织)区域与下层组织的粘着性:1-无皮瓣粘着性;2-局部粘着性;和3-接近正常或正常皮瓣粘着性。
多种处理组的得分/等级示于表17中。
表17:用于多种处理组的皮瓣正常显现区域的粘着性等级(标度1-3)。
*FS-纤维蛋白粘合剂。
结果示出,施用与包含PVP的血小板提取物混合的纤维蛋白粘合剂具有与利用包含肝素的血小板提取物施用纤维蛋白粘合剂相似的积极效果,两者相对于仅FS或对照组II而言为优异的。
一旦完成了宏观评估,则收集皮瓣,包括邻近侧向边缘的0.5cm正常皮肤。通过腹侧中线切口移除腹部和胸部脏器。将收集的组织放置到10%中性的缓冲的福尔马林中。在适当固定之后,从尾端部大约每隔2cm截取组织节段,并且指定为区域A-E,如图6所示,以正常组织和皮瓣被包含于每个组织节段内的方式垂直于皮瓣的右侧。处理组织节段(浸润和嵌入石蜡中)并且然后利用切片机(5微米)切割石蜡块。将节段安装在SuperFrost+TM切片上,并且通过组织学和免疫组织化学评估。
苏木精&;伊红着色:嵌入皮肤/伤口节段的石蜡切片在60℃下温育30分钟并且通过利用二甲苯(100%)洗涤切片两次持续5分钟来清蜡,之后再水化,对于每个浓度而言降低DDW(100-70%)中乙醇浓度持续5分钟。利用苏木精使切片着色(准备使用溶液)持续8分钟,用水漂洗,在1%HCl/70%乙醇中浸润几秒,然后利用伊红(在DDW中0.5%)着色6分钟。通过2次快速浸润利用70%乙醇洗涤节段。然后,通过利用95%乙醇洗涤一次持续5分钟、利用纯乙醇洗涤两次持续5分钟以及利用二甲苯(100%)两次持续3分钟来使切片脱水,然后利用Entellan安装培养基(MERCK Darmstadt Germany)进行安装。
免疫组织化学着色:如上所述制备石蜡嵌入皮肤切口的节段切片。利用阻断溶液(10%正常血清)温育切片1小时,之后利用下述第一抗体中的一个在4℃下温育一晚上:针对角蛋白6、角蛋白1、角蛋白14(Covance),PCNA(Santa Cruz)。次日,利用PBS中0.05%Tween洗涤切片,并且利用相应第二生物素缀合抗体(Vector实验室)温育持续1小时。遵循制造说明,利用ABC Elite试剂盒(Vector实验室)实现检测。然后利用水漂洗、利用Mayer苏木精逆向着色30秒,然后利用70%乙醇通过2次快速浸润来洗涤。然后,通过利用95%乙醇洗涤一次持续5分钟、利用纯乙醇洗涤两次持续5分钟以及利用二甲苯(100%)洗涤两次持续10分钟来使切片脱水,然后利用Entellan安装培养基(MERCK Darmstadt Germany)进行安装。
分析标准。
表皮增生:通过H&E着色来确定通过表皮厚度测量的增生响应,其中当在至少一个区域中观察其表皮厚度包含>6有核层时,样品计分为1。在整个节段上观察到6或更少层的情况下样品计分为0。
真皮过度增殖:利用增生核的PCNA着色来评估增生制粒组织,其中在表皮切口区域处计数为每个区域(X40)>10核时,分配分数1。当计数为10或更少核时分配分数0。
上基底角蛋白6:当伤口显示广泛分布的由褐色着色表示的K6着色时,将上基底角蛋白6计分为1。
上基底增殖:未愈合伤口显示伤口间隙处基底层之上的若干层中的增殖细胞,通过PCNA着色观察到。当在至少一个样品区域观察到上基底增殖时,计分为1。在高级愈合时,仅在基底层处观察到增殖,计分为0。
对于所有标记物而言,合在一起,分数零相对于分数1表示更高级的愈合阶段。
图7示出用于来自本研究的四个测试标记物的代表性着色。表皮增生,真皮过度增殖,上基底角蛋白6着色和上基底增殖(左面板)计分为1。代表性区域表示为H&E着色(表皮增生)、PCNA着色(真皮和表皮增殖)和角蛋白6着色。表皮增生面板中的黄色箭头表示表皮厚度。K6面板中的黄色箭头指示K6角蛋白分布,如出现于褐色着色中。红色箭头展示增生细胞的PCNA阳性核。
如表18所示,利用FS+PEX-PVP处理的皮瓣示出比虚假或FS处理的皮瓣(对于4个不同愈合标记物)更高级愈合,即更多分数为0的动物(用于鉴别0和1,参见“方法”)。经FS+PEX-PVP处理的伤口显示了活性伤口的若干特性的显著降低,包括表皮增生的降低、真皮成纤维细胞和表皮角质细胞增殖的降低,并且减弱了角蛋白6着色。降低的增生代表表皮特性降低至正常皮肤。真皮成纤维细胞和上基底角质细胞增殖(通过PCNA着色示出)的减少标记了成熟基质以及真皮和表皮的重塑,并且限制到基部表皮处的单细胞层的角蛋白6着色标记了皮肤特性的归一化。相比之下,对照组(FS)处理的鼠皮瓣显示早期不成熟的愈合阶段。
表18:PEX-PVP中愈合标记物vs.大鼠背侧皮瓣模型中对照处理的比 较。
实例16:从混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备大规模处理 的血小板裂解物制剂,利用S/D处理,利用PVP K12温育、在存在PVP K12的情况下经受SDR柱,利用稳定剂处理、利用超滤/透滤(UF/DF)系统 浓缩并且冻干。
在该实验中,以大规模处理评估S/D移除期间PVP K12添加物对生长因子回收率的影响(参见实例10)。更低分子量的(LMW)-PVP,例如PVPK12,比更高分子量的PVPs(PVP 25)更适于配制肠胃外用药,因为前者允许快速的肾脏代谢而不储存。另外,在一些欧洲国家中,例如德国和奥地利,仅此类具有K-值最高至18的低分子PVP类型被批准用于注射。
利用得自10个袋的1958g混合洗涤的白细胞减除单采血小板(WAP)制备血小板裂解物样品。将最终浓度为20mM醋酸钠、10mM甘氨酸的pH为6.8-7.4的214ml醋酸盐-甘氨酸;(AGA缓冲液)和人血清白蛋白(HSA;Talecris USA,最终浓度为0.2%v/v)添加到混合WAP中。在下一步中,通过分别缓慢地添加最终浓度为1%和0.3%(v/v)的Triton X-100和TnBP来实施S/D处理,同时以30RPM进行混合。为了避免因存在颗粒物而使病毒灭活效果不能达到最佳,将S/D处理分成两个步骤。第一,持续搅拌样品30分钟,以5016×g在23-27℃下离心10分钟,并且通过0.45μm过滤器(Sartopore 2,Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)进行过滤。然后,将经过滤的材料倾注到浸入调整到25℃的水浴不锈钢反应釜中,并且以30RPM混合另外的2小时以在澄清中继续病毒灭活处理。将PVP K12(具有K-值为12和平均分子量为3500Da的聚乙烯吡咯烷酮K12,目录号276142500Acros organics,Germany)添加到达到0.3%(w/w)的最终浓度(即0.857mM)的经S/D处理的裂解物,并且在25℃下温育20分钟同时以30RPM进行搅拌。使用5μmSartopore PP2过滤器过滤样品以移除颗粒物。
接下来,在以下设备上进行了S/D移除:填充了300ml SDR HyperD溶剂-洗涤剂移除色谱树脂(Pall Corp)的XK50液相色谱柱,结合蠕动泵和UA-6UV/VIS检测器+11型记录仪(ISCO,NE, USA)。利用包含0.3%(0.857mM)PVP K12的900mlAGA缓冲液(如上所述)来平衡柱。将1800ml经S/D处理和经PVP处理的血小板裂解物(含有1620ml血小板材料)上样到柱上,之后利用含有0.3%(0.857mM)PVP K12的600ml AGA缓冲液洗涤柱(如上所述)。之后利用含有12.5%乙醇、1M氯化钠和0.3%(0.857mM)PVP K12的600ml AGA缓冲液进行洗涤。收集并混合流过级分和洗涤级分以用于生长因子回收率计算。
从柱收集了3000ml总体积。相继利用3和1.2μm Sartopure PP2过滤器以及0.45μm Sartopore 2过滤器(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)对所收集的材料进行过滤。
如上所述计算PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、EGF和bFGF的回收率,并且示于下面的表19中。
表19:存在(PVP K12或PVP K25)的情况下在S/D移除步骤之后血小 板裂解物中的生长因子回收率之间的比较。
* 与SD前步骤比较
** 对应详细条件,参见实例10。
表19中显示的结果示出,当使用低分子量PVP例如PVP K12时,在存在PVP K25的情况下维持了从SDR柱的生长因子的高回收率。
接下来,将经过滤的材料倾注到浸入调整至25℃的水浴中的不锈钢反应釜中并且以30RPM混合。在病毒热灭活的准备中,以三个步骤实施稳定程序。第一,将100%蔗糖(w/w)以小部分形式添加到材料。一旦蔗糖完全溶解,则将溶液加热至37℃,并且在pH为6.9-7.1的情况下缓慢地添加10%甘氨酸(w/w)。在稳定剂添加物的最后步骤中,添加80%蔗糖(w/w),并且进一步混合直到完全溶解。然后,在59.5-60.5℃下实施热病毒灭活步骤10小时,同时以20RPM进行搅拌。
在病毒灭活步骤结束时,将40%醋酸盐-甘氨酸缓冲液(w/w)添加到溶液,同时在37℃下以30RPM进行混合。然后利用3μm Sartopure PP2过滤器(Sartorius Stedim Biotech S.A.,Aubagne,France)过滤溶液。接下来,利用安装有4个OmegaTM CentramateTM 10kDa滤盒(Pall corp)的CentramateTM UF保持器系统以3个步骤实施浓度和稳定剂移除程序。第一,将材料浓缩到1800ml的最终体积。在第二步骤中,逐渐添加10800ml的醋酸盐-甘氨酸缓冲液,同时将溶液的体积维持在1600至2000ml之间,以便用新鲜缓冲液替换稳定缓冲液。第三,在渗析步骤结束时,将样品浓缩到560ml的最终体积。
将甘露糖醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)添加到材料至2%(w/w)的最终浓度。接下来,相继利用1.2μm Sartopure 300过滤器,0.45μmSartopore 2过滤器和0.2μm Sartopore 2300过滤器(Sartorius Stedim BiotechS.A.,Aubagne,France)过滤材料。然后利用4ml溶液填充80个玻璃小瓶,并且利用Epsilon 2-8D冻干器(Martin Christ GmbH)冷冻干燥。
在S/D移除步骤之前(SDR前材料)和之后(SDR后材料)并且在生产过程(最终)结束时,测量Triton X-100和TnBP的浓度。Triton X-100通过反相HPLC和紫外检测器测定,而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。
结果示于下表20中。
表20:根据上面详述的条件,在S/D移除之前、之后并且在生产过程 结束时裂解物中的S/D浓度。
结果示出,在存在处于0.3%(0.857mM)浓度的PVP K12情况下实施S/D移除(据发现对于生长因子回收率而言可为有效的)导致在SDR后中间体中TnBP的有效移除和Triton X-100的几乎完全移除(小于剩留原料的2%)。在下游处理中移除在柱之后Triton X-100保留在材料中的痕迹。
实例17:上样在S/D移除柱上期间使血小板裂解物与具有不同分子量 处于不同浓度的PVP接触对生长因子回收率的影响。
该实例的目的为调查具有不同分子量处于不同浓度的PVP对S/D移除之后生长因子回收率的影响。
在该实例中,测试不同的S/D移除条件,诸如在HIC S/D移除步骤之前和期间添加四种不同分子量的PVP。通过ELISA确定,检查了以下生长因子的回收率:PDGF-AB、bFGF、VEGF和EGF。
在该实例中使用了PVP K12(具有K-值为12和平均分子量为3500Da的聚乙烯吡咯烷酮K12,目录号276142500Acros organics,Germany),PVPK17(具有平均K-值为17和平均分子量为8000Da的聚乙烯吡咯烷酮K16-18,目录号22746500Acros organics,Germany),PVP K25和PVP K30。
如上面实例5详述制备裂解物并且将其上样到SDR柱上。在表21中详述所有S/D移除条件。在上样之前,利用待上样的裂解物的缓冲液实施平衡。在SDR施用之前以上述的方式还利用PVP温育所有上样的样品。收集、混合上样之后并且利用洗涤缓冲液洗涤之后从柱获得的所有级分,然后计算生长因子回收率。
生长因子回收率结果(如上所述进行计算)示于表22中。
表21:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
处理 | 上样样品 | 洗涤缓冲液 |
1 | 经S/D处理的裂解物+0.3mM PVP K12 | AGA+0.3mM PVP K12 |
2 | 经S/D处理的裂解物+0.4mM PVP K12 | AGA+0.4mM PVP K12 |
3 | 经S/D处理的裂解物+0.9mM PVP K12 | AGA+0.9mM PVP K12 |
4 | 经S/D处理的裂解物+1.7mM PVP K12 | AGA+1.7mM PVP K12 |
5 | 经S/D处理的裂解物+0.2mM PVP K17 | AGA+0.2mM PVP K17 |
6 | 经S/D处理的裂解物+0.3mM PVP K17 | AGA+0.3mM PVP K17 |
7 | 经S/D处理的裂解物+0.8mM PVP K17 | AGA+0.8mM PVP K17 |
8 | 经S/D处理的裂解物+1.5mM PVP K17 | AGA+1.5mM PVP K17 |
9 | 经S/D处理的裂解物+0.2mM PVP K25 | AGA+0.2mM PVP K25 |
10 | 经S/D处理的裂解物+0.3mM PVP K25 | AGA+0.3mM PVP K25 |
11 | 经S/D处理的裂解物+0.4mM PVP K25 | AGA+0.4mM PVP K25 |
12 | 经S/D处理的裂解物+0.1mM PVP K30 | AGA+0.1mM PVP K30 |
13 | 经S/D处理的裂解物+0.3mM PVP K30 | AGA+0.3mM PVP K30 |
14 | 经S/D处理的裂解物+0.4mM PVP K30 | AGA+0.4mM PVP K30 |
表22:S/D移除步骤之后在存在不同MW PVP情况下(表21中的条 件)血小板裂解物中生长因子的回收率。
*相对于SDR前柱材料的%。
结果示出,增加每个PVP的浓度与增加生长因子回收率相关,尤其是对于PDGF-AB和bFGF而言。另外,可观察到增加的生长因子回收率具有处于相同摩尔浓度的增加分子量的PVP:例如,利用0.3mM下的PVPK12、K17、K25或K30分别导致17%,42%,55%和62%的PDGF-AB回收率。
为了评估S/D(Triton X-100和TnBP)移除的功效,在S/D移除步骤之前(SDR前材料)和之后(SDR后材料)测量Triton X-100和TnBP的浓度。通过反相HPLC和紫外检测器测定Triton X-100浓度,而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。
表23:根据上文详述的条件在S/D移除之前和之后裂解物中的S/D浓 度。
结果示出了通过HIC柱的S/D移除步骤期间有效的S/D移除。当移除了所有TnBP时,当利用0.4mM和更高浓度的PVP时,在SDR后材料中发现一些残余的Triton X-100。上文实例16的表20示出,中间材料中的甚至稍微高于该实例所示浓度的残余Triton X-100在下游被移除,从而到达所示的生产过程。
实例18:在S/D移除的不同阶段中使用PVP对生长因子回收率的影 响。
为了识别在PVP施用到S/D移除柱的多步骤过程中在哪个阶段对生长因子回收率具有最大的作用,测试了对于三个S/D移除步骤的PVP添加物的不同混合情况。
在该实例中,利用将0.5%(w/w)(0.63mM)PVP K17添加到血小板裂解物、平衡缓冲液和表24所示的不同混合情况下的洗涤缓冲液,测试了S/D移除步骤期间GF的回收率。
利用ELISA检查了以下生长因子的回收率:PDGF-AB、bFGF、VEGF和EGF。如实例5详述的那样制备裂解物并且将裂解物上样到SDR柱上,以上述的更大规模处理方式,不同的是如表24所示在每个处理中利用平衡缓冲液和洗涤缓冲液。收集和混合流过级分和洗涤级分,并且计算生长因子回收率。
生长因子回收率结果(如上所述进行计算)示于表25中。
表24:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
处理 | 上样样品 | 平衡缓冲液 | 洗涤缓冲液 |
1 | 经S/D处理的裂解物+ | AGA | AGA- |
2 | 经S/D处理的裂解物+ | AGA+ | AGA- |
3 | 经S/D处理的裂解物+ | AGA- | AGA+ |
4 | 经S/D处理的裂解物+ | AGA+ | AGA+ |
5 | 经S/D处理的裂解物- | AGA+ | AGA |
6 | 经S/D处理的裂解物- | AGA+ | AGA+ |
7 | 经S/D处理的裂解物- | AGA- | AGA+ |
+:上样0.5%(0.63mM)的PVP K17。
-:不上样PVP K17。
*相对于SDR前材料的%。
表25:根据表24中的样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物 中生长因子的回收率。根据PDGF-AB回收率以降序来排序结果。
*相对于SDR前材料的%。
在三个样品中,将0.5%PVP K17仅添加到一个步骤:添加到血小板裂解物(处理#1)、添加到平衡缓冲液(处理#5)或添加到洗涤缓冲液(处理#7)。
将PVP K17仅添加到血小板裂解物或添加到平衡缓冲液导致相似的低生长因子回收率,而与两个其他处理相比,将PVP K17仅添加到洗涤缓冲液导致GF回收率的最小改善。
三个另外的处理(处理#2、#3和#6)包括三个条件中的两个条件之间的组合,同时处理#4包括所有三个条件的组合。
结果示出,从HIC柱增加GF回收率的最有效的单个步骤为将PVP添加到平衡缓冲液。此外,利用平衡缓冲液中的PVP与添加到裂解物的PVP的混合实现了最高的GF回收率。
为了评估S/D(Triton X-100和TnBP)移除的功效,在S/D移除步骤之前(SDR前材料)和之后(SDR后材料)测量Triton X-100和TnBP的浓度。Triton X-100通过反相HPLC和紫外检测器测定,而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。
表26:根据上文详述的条件的S/D移除之前和之后的裂解物中的S/D 浓度。
结果示出了通过HIC柱的S/D移除步骤期间有效的S/D移除。当在所有处理中移除了所有TnBP时,当在平衡缓冲液和血小板裂解物两者中使用PVP时,在SDR后材料中发现了一些残余的Triton X-100。然而,在上述的实例16中示出,在下游处理中,移除了中间材料中比该实例所示的浓度更高浓度的Triton X-100。
将PVP添加到平衡缓冲液以及添加到洗涤缓冲液导致高生长因子回收率,而不显著损害通过HIC移除triton X-100的效能。
实例19:在S/D移除之前使血小板裂解物与HPMC掺混对生长因子回 收率的影响。
为了测试其他两亲性聚合物在S/D移除步骤期间通过HIC柱是否可用于改进生长因子回收率,在下述实例中探索羟丙基纤维素(HPMC)。
HPMC为目前广泛用作口腔药剂中的赋形剂和受控递送组分以及用作食品工业中的乳化剂的天然多功能碳水化合物聚合物。
在该实例中,在HIC S/D移除步骤之前和期间测试了两种不同浓度的HPMC(10KDa,目录号423238Sigma-Aldrich,USA)。将没有上样剂情况下的S/D移除用作对照组进行测试。
如上面实例5详述制备裂解物并且将其上样到SDR柱上。为了调查单独的HPMC(没有氯化钠和乙醇)的作用,在该实例中,仅1种15ml体积的缓冲液用于洗涤。所有条件在表27中详述。在上样之前,利用与上样裂解物所用缓冲液相同的缓冲液来实施平衡。收集、混合流过级分和洗涤级分,并且计算生长因子回收率。生长因子回收率结果(如上所述计算)示于表28中。利用HPMC以上面讨论的方式温育包含HPMC的所有上样样品。
利用ELISA检查了以下生长因子的回收率:PDGF-AB、b(碱性)FGF、VEGF和EGF。
表27:S/D移除步骤期间所用样品和条件的详细描述。
处理 | 上样样品 | 洗涤缓冲液 |
1 | 经S/D处理的裂解物 | AGA |
2 | 经S/D处理的裂解物+0.1%(0.1mM)HPMC | AGA+0.1%(0.1mM)HPMC |
3 | 经S/D处理的裂解物+0.3%(0.3mM)HPMC | AGA+0.3%(0.3mM)HPMC |
表28:根据表27中的样品和条件在S/D移除步骤之后血小板提取物 中各种生长因子的回收率。
*相对于SDR前柱的%。
结果示出,在通过SDR柱移除S/D之前和期间使经SD处理的血小板裂解物与/HPMC接触改善了从SDR柱的生长因子的回收率。
另外,结果示出,S/D移除期间更高的HPMC浓度导致增加的生长因子回收率。
在S/D移除步骤之前(SDR前材料)和之后(SDR后材料)测量Triton X-100和TnBP的浓度。Triton X-100通过反相HPLC和紫外检测器测定,而TnBP则通过采用火焰离子化检测器的毛细管气相色谱测定。
结果示于下表29中。
表29:根据上文详述的条件S/D移除之前和之后裂解物中的S/D浓 度。
结果示出,在存在浓度高达0.3%的HPMC情况下实施S/D材料移除(发现这对于生长因子回收率是有效的)未影响柱的S/D移除性能。
表30:PVP和HPMC浓度和MW。
实例20:由WAP制备的、利用S/D处理的、与PVP K12接触的、并 且经受S/D移除的血小板提取物中若干生长因子之间的比率。
下述的实例示出了如本文所公开制备的血小板提取物中若干生长因子之间的比率,并且检查所获得的比率是否相当于原料中的比率,并且是否相当于将样品上样到色谱树脂(SDR前材料)上之前裂解物中的比率。如实例16所述制备SDR前和SDR后材料(或提取物)。
利用上文所述的特定商业ELISA试剂盒在所有三个测试材料(WAP原料、SDR前材料和SDR后材料)中测量TGF-β1、VEGF、bFGF和PDGF-AB的水平,并且计算了PDGF-AB/TGF-β1;PDGF-AB/VEGF;TGF-β1/bFGF;和VEGF/bFGF之间的比率。生长因子水平和比率分别在下面的表31和32中示出。
表31:WAP原料、SDR前材料和SDR后材料中TGF-β1、VEGF、 bFGF和PDGF-AB的水平。
表32:WAP原料、SDR前材料和SDR后材料中计算出的生长因子比 率。
结果示出,S/D移除步骤期间与PVP K12(PVP K12与乙醇和氯化钠混合)接触的血小板裂解物导致提取物具有PDGF-AB/TGF-β1;PDGF-AB/VEGF;TGF-β1/bFGF;和VEGF/bFGF以下比率,该比率相当于原料和S/D移除之前的材料中的比率。
可推断出,如本发明所述那样实施S/D移除导致血小板提取物包括相当于S/D移除之前材料的因子比例。
Claims (40)
1. 一种用于从生物源制备病毒安全生物液体混合物组合物的方法,所述方法包括以下步骤:
提供所述源;
提供两亲性聚合物;
利用溶剂洗涤剂(S/D)处理所述源以允许病毒灭活,并且利用所述两亲性聚合物处理所述源;
通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触来移除所述S/D;以及
收集包含来自HIC的未结合级分的材料;
其中所述方法包括至少再一次正交病毒灭活处理,
从而获得所述病毒安全生物液体混合物组合物。
2. 根据权利要求1所述的方法,其中移除所述S/D省略了油提取的另外的步骤。
3. 根据权利要求1或2所述的方法,其中所述HIC树脂填充在柱中。
4. 根据权利要求所1述的方法,其中所述源包括细胞、细胞粒子和/或细胞器。
5. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述源为血沉棕黄层。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述源包括血小板。
7. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述源为由多个供体混合的富含血小板的级分。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述两亲性聚合物为烃基表面活性剂。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述两亲性聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、以及它们的组合。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述源首先与所述S/D接触,然后与所述两亲性聚合物接触。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中经S/D处理的源中的PVP浓度在约0.01mM至0.9mM的范围内。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中经S/D处理的源中的PVP浓度在约0.01mM至0.3mM的范围内。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中经S/D处理的源中的PVP浓度在约0.025mM至0.3mM的范围内。
14. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中经S/D处理的源中的HPMC浓度在约0.01mM至0.3mM的范围内。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述方法还包括以下步骤:利用包含有机溶剂和/或盐的溶液洗涤所述树脂;收集所述洗涤步骤之后获得的级分,并且与所述未结合级分混合。
16. 根据权利要求15所述的方法,其中所述有机溶剂为乙醇。
17. 根据权利要求15或16所述的方法,其中所述盐为氯化钠。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中所述至少再一次正交病毒灭活处理包括热灭活。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法,还包括浓缩所述材料的步骤。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的方法,还包括干燥所述材料的步骤,从而导致病毒安全生物干燥混合物。
21. 一种用于从生物源制备生物液体混合物组合物的方法,所述方法包括以下步骤:
提供所述源;
提供PVP和/或HPMC;
利用溶剂洗涤剂(S/D)处理所述源以允许病毒灭活,并且利用所述PVP和/或HPMC处理所述源;
通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触来移除所述S/D;以及
收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
22. 一种生物液体混合物组合物,其能够根据权利要求1至21中任一项所述的方法获得。
23. 根据权利要求22所述的组合物,包括在约0.07mM至6mM的范围内的PVP浓度。
24. 根据权利要求22或23所述的组合物,包括在约0.07mM至2mM的范围内的PVP浓度。
25. 根据权利要求22至24中任一项所述的组合物,包括在约0.17mM至2mM的范围内的PVP浓度。
26. 根据权利要求22所述的组合物,包括在约0.07mM至1.5mM的范围内的HPMC浓度。
27. 根据权利要求22至26中任一项所述的组合物,其为富含PDGF-AB、PDGF-BB和/或bFGF的血小板提取物。
28. 一种包含两亲性聚合物的药物组合物;一种选自趋化因子、生长因子、细胞因子、营养因子、以及它们的混合物的血小板衍生蛋白质;以及一种药学上可接受的载体,其中所述两亲性聚合物为浓度在约0.07mM至6mM的范围内的PVP或浓度在约0.07mM至1.5mM的范围内的HPMC。
29. 根据权利要求28所述的组合物,其中所述血小板衍生蛋白质为PDGF-AB、PDGF-BB、bFGF或它们的混合物。
30. 根据权利要求22至29中任一项所述的组合物,其用于组织愈合、器官重建、组织再生和/或治疗炎症。
31. 根据权利要求30所述的组合物,其中所述组织为软组织。
32. 根据权利要求22至29中任一项所述的组合物,其用于局部应用或
肠胃外应用。
33. 一种容器,包括根据权利要求22至29中任一项所述的组合物。
34. 一种试剂盒,包括根据权利要求33所述的容器。
35. 根据权利要求34所述的试剂盒,还包括容器,所述容器包括含纤维蛋白原组分。
36. 根据权利要求34或35所述的试剂盒,还包括容器,所述容器包括含凝血酶组分。
37. 一种用于在有需要的受试者中进行组织愈合、器官重建、组织再生和/或治疗炎症的方法,包括将有效量的根据权利要求22至29中任一项所述的组合物施用到所述受试者。
38. 一种用于从包含S/D的生物源移除溶剂-洗涤剂(S/D)的方法,所述方法包括以下步骤:
提供所述源;
提供两亲性聚合物;
利用S/D和所述两亲性聚合物处理所述源;
通过使经处理的源与疏水作用色谱(HIC)树脂接触来从所述生物源移除所述S/D;以及
收集包含来自HIC的未结合级分的材料。
39. 根据权利要求38所述的方法,其中移除所述S/D省略了油提取的另外的步骤。
40. 一种生物组合物,其能够通过包括权利要求38所述的步骤获得。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1752102A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-03-29 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺 |
CN101969985A (zh) * | 2008-01-07 | 2011-02-09 | 国瑞生医科技股份有限公司 | 可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4789545A (en) | 1986-03-31 | 1988-12-06 | New York Blood Center, Inc. | Removal of lipid soluble process chemicals from biological materials by extraction with naturally occurring oils or synthetic substitutes thereof |
US5213814A (en) * | 1989-04-10 | 1993-05-25 | Cryopharm Corporation | Lyophilized and reconstituted blood platelet compositions |
US5094960A (en) | 1988-10-07 | 1992-03-10 | New York Blood Center, Inc. | Removal of process chemicals from labile biological mixtures by hydrophobic interaction chromatography |
US5525519A (en) * | 1992-01-07 | 1996-06-11 | Middlesex Sciences, Inc. | Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers |
FR2696095B1 (fr) * | 1992-09-30 | 1994-11-25 | Inoteb | Colle biologique à base de protéines coagulables par la thrombine, enrichie en facteurs plaquettaires, sa préparation et son application. |
US6121232A (en) | 1997-01-31 | 2000-09-19 | Omrix Biopharmaceuticals Sa | Stabilized mixture comprising fibrinogen |
EP0856317A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-08-05 | Omrix Biopharmaceuticals S.A. | A stabilized mixture comprising fibrinogen |
ES2355186T3 (es) | 1997-09-05 | 2011-03-23 | Maruho K.K. | Preparaciones de nanocápsulas para tratar enfermedades intraarticulares. |
US6096872A (en) * | 1997-10-14 | 2000-08-01 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Viral clearance process |
ATE248587T1 (de) * | 1999-06-14 | 2003-09-15 | Baxter Int | Mikrosphären mit verzögerter wirkstoffabgabe |
CZ20033097A3 (cs) | 2001-05-21 | 2004-06-16 | Omrix Biopharmaceuticals S.A. | Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků |
JP2005517638A (ja) * | 2001-12-04 | 2005-06-16 | ジェイ.ウールバートン クリストファー | 保存安定性のあるフィブリンシーラント |
US7473678B2 (en) * | 2004-10-14 | 2009-01-06 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Platelet-derived growth factor compositions and methods of use thereof |
GB0710321D0 (en) * | 2007-05-30 | 2007-07-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
EP2281587A1 (de) * | 2009-08-03 | 2011-02-09 | nolax AG | Resorbierbare Polyurethanschaum-Wundabdeckung |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1752102A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-03-29 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺 |
CN101969985A (zh) * | 2008-01-07 | 2011-02-09 | 国瑞生医科技股份有限公司 | 可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FRANK A. HIGHSMITH: "Viral inactivation of vesicular stomatitis virus in normal human serum by cross-linked polyvinylpyrrolidone", 《THE JOURNAL OF INFECTIONS DISEASES》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115477442A (zh) * | 2022-08-16 | 2022-12-16 | 杭州鲲宸环境科技有限公司 | 一种航材园废水处理方法 |
CN115477442B (zh) * | 2022-08-16 | 2023-09-26 | 杭州鲲宸环境科技有限公司 | 一种航材园废水处理方法 |
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