CN101411698A - 丹参丹酚酸a的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹参丹酚酸A的一种新用途，即在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于50％且小于100％，优选丹参丹酚酸A含量大于等于90％且小于100％，药效机理研究表明，丹参丹酚酸A对内皮细胞障碍具有很好的保护作用。

Description

丹参丹酚酸A的用途

技术领域

本发明涉及中药领域，涉及丹参丹酚酸A一种新用途，具体涉及丹参丹酚酸A在制备治疗内皮细胞功能障碍药物中的应用。

本申请内皮细胞功能障碍包括内皮细胞损伤、内皮细胞增殖、内皮细胞炎症等内皮细胞非生理性的功能障碍；

本申请内皮细胞包括不同器官的血管的内皮细胞。

背景技术

血管内皮是人体的一个重要组成部分，其解剖部位位于一易损伤的功能性界面，成年人约有10¹²个血管内皮细胞，覆盖400—500m²的血管内腔表面，重约1.5kg，相当于肝脏的重量，自从1993年Ross提出内皮功能障碍的概念，完成了对内皮从结构到功能、从生理到病理的认识之后【Ross R.The pathogenesis ofatherosclerosis：a perspective for the 1992s(j)。Nature，1993，362：801—809】，现已证明血管内皮是一个十分活跃的代谢及内分泌器官，其功能众多：1、具有屏障功能；2、具有信息传递与内分泌功能；3、具有转化与灭活功能；4、具有抗凝与抗血栓功能；5、具有调节血管张力的功能；6、对心肌舒缩功能的影响。因此，内皮功能的改变与多种疾病的发生和发展有关，相应对内皮功能障碍具有治疗作用的药物研究，成为新药研究的热点。

现代中医研究，由于正气不足，防御功能减弱，导致内皮细胞易于被外邪损伤，引起功能和结构的障碍，进一步可导致疾病的形成，引起瘀血内停，因而内皮损伤多表现为气虚血瘀证，其修复需以益气活血法为主。当代多个研究发现益气活血中药能够调节骨髓干细胞的生理活性，能够促进骨髓单核细胞在心肌梗死梗死区域归巢、分化、扩增，产生大量新生的心肌细胞及心肌小血管，促进梗死心肌的修复；有文献报道自体骨髓单核细胞抑制联合益气活血中药治疗可以迅速改善下肢缺血患者的局部血液循环，从而改善患者的疼痛及冷感；另有发现益气活血中药能够减轻及治疗骨髓基质细胞的放射损伤。因而，益气活血法对于内皮细胞可能具有潜在的动员作用；但是上述这些研究多基于内皮细胞障碍可能产生的疾病进行初步的研究，没有进行更深一步的研究，特别是中药有效成分对内皮细胞机理研究，还处在起始阶段，因此，针对内皮细胞障碍，将中药有效成分进行深入细致的机理研究，才是中医药走向世界的必经之路。

丹参是活血化瘀类中药中常用的一种，有研究报道丹参对内皮细胞障碍具有一定的保护作用，而这种研究是以丹参脂溶性成分、丹参丹酚酸B为物质基础的，本院申请的专利200610170267.0已经明确论述：丹参中活性最好的成分是丹参丹酚酸A，而丹参丹酚酸A在丹参中含量极低，只有万分之五，采用常规的提取纯化方法，是无法得到丹参丹酚酸A的，只有通过一定的化学反应方法，将丹参丹酚酸转化成丹参丹酚酸A，才能再通过纯化方法得到丹参丹酚酸A，因此，现有技术中【丹参对失血性休克大鼠心肌线粒体内膜损伤的治疗作用，缪明永朱善宏，基础医学与临床.1994，14(5).-48-51】，是以丹参注射液为原料，针对线粒体内皮细胞的研究，不是针对丹参丹酚酸A与内皮细胞进行的研究，而丹参丹酚酸A对内皮细胞是否具有一定的作用，就需要科研人员通过创造性的科学实验才能获得结论。

发明内容

基于上述原因，我们科研人员通过创造性的劳动，以丹参有效成分丹参丹酚酸A为物质基础，针对内皮细胞障碍进行深入的机理研究，发现丹参丹酚酸A对内皮细胞障碍具有很好的治疗作用，而这种深入的机理研究，可以很好的确证丹参中药理作用最好的成分是丹参丹酚酸A，为丹参丹酚酸A药效机理的揭示，为丹参丹酚酸A在临床应用中，提供了确切的、深入的理论基础。

本发明通过以下技术方案实现的。

丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用。

其中丹参丹酚酸A含量大于等于50％且小于100％。

其中丹参丹酚酸A含量大于等于90％且小于100％。

其中丹参丹酚酸A为活性物质制备的药物制剂。

药物制剂为单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液、软胶囊剂、水针剂、粉针剂、输液剂。

其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂单位剂量为5—1000mg。

其中水针剂、粉针剂、输液剂单位剂量为5—500mg。

上述药物制剂的物质基础是丹参丹酚酸A，因此，上述药物制剂对血管内皮细胞功能障碍具有很好的治疗作用。

本申请内皮细胞功能障碍包括血管内皮细胞损伤、内皮细胞增殖、内皮细胞炎症等内皮细胞非生理性的功能障碍。

本申请内皮细胞包括不同器官的血管的内皮细胞。

本申请丹参丹酚酸A根据本院申请的专利200610145453.9、200610170267.0中丹参丹酚酸A的制备方法得到。

一、对血管紧张素II诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

实验方法：人脐静脉内皮细胞系ECV304培养于DMEM培养液中，其中含胎牛血清10％、青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)，置于CO₂培养箱，5％CO₂、37℃、95％湿度下静止培养，2d换液1次。待细胞铺满培养瓶底时，用0.25％胰酶消化传代。按1×10⁵/mL将细胞接种于96孔培养板，每孔200μL。培养24h后，换无血清培养液培养24h。分组：空白对照组(不加药)、Ang II组(1μmol/L)、Ang II(1μmol/L)+丹参酮IIA(10μmol/L)组(加入10μmol/L丹参酮IIA，孵育30min后加入Ang II 1μmol/L)、Ang II(1μmol/L)+丹参丹酚酸A(10μmol/L)组(加入10μmol/L丹参丹酚酸A，孵育30min后加入Ang II 1μmol/L)，各组设6个复孔，继续培养24h后，于光镜下观察细胞形态。MTT法检测ECV304细胞活性，按试剂盒说明测定细胞培养上清液中的NO及NOS含量，流式细胞仪检测细胞凋亡。

结果：

(1)细胞形态观察：倒置显微镜下动态观察可见空白对照组细胞紧密贴壁，呈铺路石状生长。Ang II组可见多数细胞呈圆形，胞膜空泡，核浓缩；Ang II(1μmol/L)+丹参酮IIA(10μmol/L)组可见多数细胞呈圆形，胞膜空泡，核浓缩，Ang II+丹参丹酚酸A组见上述细胞较空白组明显减少。

(2)与空白对照组比较，Ang II组可明显降低细胞活性(P<0.01)，Ang II+丹参丹酚酸A组均可明显抑制Ang II作用，增加内皮细胞的活性，该组细胞活性与正常细胞无明显区别。实验结果见表1：

表1 丹参丹酚酸A对Ang II诱导ECV304内皮细胞的影响

注：与对照组比较^**P<0.01；与AngII组比较##P<0.01；与Ang II+丹参酮IIA组比较％％P<0.01.

二、对大鼠血管内皮早期损伤的保护作用

实验方法：大鼠麻醉后，腹卧固定消毒。内皮损伤组在背部皮下埋置AngII缓释泵，内皮损伤加丹酚酸A组也埋置AngII缓释泵，但在埋泵前3天和埋泵后经尾静脉注射丹酚酸A。Ang II用0.01mol醋酸0.9％氯化钠稀释分装后-80℃保存，AngII释放剂量为200ng/min/kg，每只泵均加入2ml AngII溶液，药物缓释泵释放速度为10μl/h。术后肌注青霉素3d预防感染。分别在埋泵后的第1天、3天、7天和14天，动物麻醉后处死取材口自下而上依次剪开左侧肋软骨，暴露胸腔，剪开心包，右心室抽血(每只动物约可以采血6-8ml)，用作血清学检测用Liang-500型毛细管血粘度测定仪测定血液粘度。取出肾动脉，肝素0.9％氯化钠洗涤数次。2.5％戊二醛前固定2h、1％饿酸后固定1-2h。缓冲液漂洗20min。分别用70％、80％、90％、100％丙酮梯度脱水，每次10min。Epon812包埋、烤箱内45℃(12h)、6O℃(36h)。半薄切片定位，超薄切片于铜网上。醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。PhilipsTECNAI-12型透射电镜观察拍照。

实验结果：

(1)血清学检测发现，与对照组相比，丹参丹酚酸A能够改善血管内皮功能。

(2)电镜观察：肾动脉透射镜观察在内皮损伤组可见到内皮细胞不同程度的充血、肿胀、剥脱，在某些部位还可见到内弹力板的暴露，但丹酚酸A组仅有轻微损伤，提示丹参丹酚酸A具有很好的保护内皮细胞的作用。三、对动脉内皮损伤大鼠血管内膜增生的影响研究

实验方法：用3％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，将动物背位固定在鼠台上，颈部皮肤用碘酒和酒精常规消毒后，剪开皮肤2-3cm，依次分离皮下组织、肌肉，并暴露气管，在气管左侧游离左颈总动脉1-1.5cm，将远心端结扎，近心端用动脉钳闭夹，于颈动脉远端用动脉剪剪一斜口，将导管插入胸主动脉约4-5cm长，反复牵拉5次，第6次插入胸主动脉后注入高渗液0.1mL保留90s，最后拔出导管，结扎左侧颈总动脉，逐层缝合皮下脂肪、肌肉及皮肤切口，碘酒涂擦切口。造模成功后，将大鼠随机分为6组，假手术组、丹酚酸A组(4mg/kg/d)、丹参丹酚酸B对照组(4mg/kg/d)、正常对照组，病理模型组，每组各10只，除正常对照组、病理模型组外，其余各组均手术后经尾静脉连续给药14d。各组于造模后第14天处死动物，模型组第3天处死部分动物。动脉留取时剖开颈部，游离颈总动脉，向心端依次留取胸主动脉损伤血管病理标本1-2cm长，分别放入10％中性甲醛固定备用。将病理标木在10％中性甲醛液中固定24h后，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚5μm)，制成组织切片备检。对病理切片进行常规HE染色，光学显微镜观察受损血管病理组织形态学改变，同时病理科协同采用彩色病理图像分析系统进行图像分析，测定血管内膜厚度。

实验结果：模型组即动脉内皮损伤后大鼠动脉血管形态，血管内膜内皮细胞缺如，管腔内凝血，血管内膜剥脱，血管管壁受损伤后缺损。损伤3d后可见动脉血管内膜被覆内皮细胞，内膜增厚，血管平滑肌细胞增生，血管腔变狭窄。损伤14d后动脉血管内膜被覆内皮细胞，内膜增厚，血管平滑肌细胞增生。丹参丹酚酸B组大鼠动脉血管内膜大部被覆有内皮细胞，内膜呈不均匀增厚，其中5只大鼠动脉内膜无明显增厚，增厚部内膜血管平滑肌增生，中膜层弹力纤维清晰，外膜未见异常。丹酚酸A高剂量组大鼠动脉血管管壁厚薄均匀，内膜被覆完整内皮细胞，内膜无增厚，中膜弹力纤维清晰，平滑肌细胞大小一致，外膜未见异常。四、对主动脉内皮细胞障碍的影响

实验方法：5％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉大鼠后，常规颈部皮肤碘酒和酒精消毒，剪开皮肤约2-3cm长，依次分离皮下组织、肌肉并暴露气管，在气管左侧游离左颈总动脉1-1.5cm，将远心端结扎，近心端用动脉夹钳夹后，于颈动脉远端做一切口，将2F球囊导管插入至腹主动脉，注入0.1ml生理盐水使球囊扩张，然后回拉球囊至左颈总动脉与胸主动脉交叉处，回抽生理盐水后重新送回导管，在3个相隔120°的方向各重复3次共9次，最后拔出导管，结扎左颈总动脉，缝合皮下脂肪及皮肤切口。假手术组不插人球囊导管，其余步骤同上。丹酚酸A组从术前7d至术后14d每日灌胃给药，剂量为20mg/kg/d，丹参丹酚酸B组组从术前7d至术后14d每日灌胃给药，剂量为20mg/kg/d。

取材及处理：术后14天，所有大鼠用5％戊巴比妥钠腹腔麻醉处死，快速开胸，小心取胸主动脉段2cm投于10％福尔马林固定液中，然后脱水、透明、石蜡包埋。

形态学观察：病理切片HE染色。光镜下观察血管内膜增生情况，用计算机图像分析系统测量大鼠胸主动脉段内膜面积、内膜覆盖率、内膜/中膜面积。

实验结果见表2：

表2 大鼠动脉内、中膜测量结果

注：与对照组比较^**P<0.01；与丹参丹酚酸B组比较##P<0.01

四、对家兔动脉血管成形术后胶原合成的影响

实验方法：健康雄性日本大耳兔，随机分为组：损伤组(I组，n＝6)，丹参丹酚酸B(剂量1mg/kg)+丹参酮IIA组(剂量1mg/kg)，丹酚酸A组(剂量1mg/kg)及假手术组(仅结扎右颈外动脉)。前3组均用3.5F球囊导管行右颈总动脉内膜剥脱术。普通饲料喂养，自由饮水。用药组自术后第1d起灌胃给药，直至术后满28d。满28d后处死动物，自心脏取血5mL，取右颈总动脉损伤中段约15mm，用于病理形态学检查。

实验结果见表3：

表3 新生内膜厚度及狭窄百分率

注：与损伤组比较^**P<0.01；与丹参丹酚酸B+丹参酮IIA组比较##P<0.01。

实验结论：通过上述实验表明，丹参丹酚酸A对内皮细胞障碍具有很好的治疗作用，充分说明丹参丹酚酸A具有治疗内皮细胞障碍的新用途。

注：本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。

Claims (7)

1、丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于50％且小于100％。

3、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于90％且小于100％。

4、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A为活性物质制备的药物制剂。

5、根据权利要求4所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中药物制剂为单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂、水针剂、粉针剂、输液剂。

6、根据权利要求5所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂单位剂量为5—1000mg。

7、根据权利要求5所述的丹参丹酚酸A在制备治疗血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中水针剂、粉针剂、输液剂单位剂量为5—500mg。