CN103432013A - 一种花青素脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的花青素脂质体的制备方法,它解决了游离花青素稳定性差、生物可利用度低的问题。该方法基于花青素稳定性受pH值影响大的特点,采用了pH梯度结合逆向蒸发的方法首先得到花青素脂质体的混悬液,再通过挤压过膜或循环高压均质,以获得不同粒径范围的花青素脂质体。由于脂质体混悬液不易保存,在脂质体的制备过程中加入冻干保护剂,将混悬液在-65℃下预冷冻后在冷冻干燥机中冻干,得到花青素脂质体的冻干粉。采用本方法制成的花青素脂质体包埋率高达85.88%,根据处理方法不同,可获得粒径范围100~234nm的脂质体。冻干复溶后的包埋率可达82.5%。采用脂质体包埋花青素,可提高花青素在体内的稳定性和生物可利用度。
Description
一、技术领域
本发明涉及天然抗氧化剂花青素的脂质体的制备方法。
二、背景技术
花青素在自然界中的分布广泛,已发现存在于自然界中的花青素有600多种,大量体外研究表明,花青素具有比维生素E等常见的抗氧化剂更高的抗氧化能力,较强的抗炎,抗菌及抑制癌细胞生长能力,因此被认为可以用于降低由氧化性损伤所引起的慢性疾病,如心血病、肿瘤、神经退性疾病、糖尿病的患病风险的作用,这些作用引起了药学、营养学及食品学界的广泛关注和研究。
然而,相比较其它植物黄酮,花青素稳定性差,对温度、pH、光、金属离子等外在因素敏感,尤其受pH值的影响很大,花青素一般在pH1~2以下以2一苯基苯并吡喃型阳离子的结构稳定存在,随着pH值的增加,其主体结构逐渐过渡到查尔酮、醌型碱的结构,稳定性也迅速减小,容易被氧化降解。此外,近年来对花青素体内生物可利用度的研究结果也不容乐观,可能原因有二,一是花青素在生理条件下不稳定,二是其较强亲水性及较大分子量导致其不易被胃肠道吸收。稳定性差和生物可利用率差严重影响了花青素的广泛应用,随着近年来人们对花青素在功能食品、保健食品的应用,期望解决这个问题的心情也越来越迫切。
朱树华等将紫薯花青素与甘薯、小麦和玉米淀粉混合碾磨,再载入明胶胶囊制备得到了紫薯花青素胶囊,但该发明未说明中花青素在体内的稳定性和生物可利用度。如何在提高花青素的稳定性同时提高其生物可利用度一直是个难题。
脂质体是一种磷脂在水相中形成的具有类似生物膜结构的双分子层结构的小囊,最早是由英国学者Bangham在1965年将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。1972年Gregoriadis和Ryman提出用脂质体作为β-半乳糖苷酶载体治疗糖原累积疾病后,此后人们开始研究应用脂质体作为不稳定的药物的包埋使其稳定化和通过脂质体载体控制药物释放。脂质体包埋技术较为成熟,部分脂质体药物已有临床应用。制备脂质体常用的方法有手摇法、超声法、冻干再水化法、表面活性剂去除法、冷冻熔融法、逆向蒸发法和pH梯度法等。逆相蒸发法由于适用于包埋水溶性物质且可制得大单室脂质体的特点,成为包埋黄酮类化合物最常用的方法之一。鉴于一般的脂质体在生理条件(即pH中性)下会比较稳定,而花青素在pH<2时比较稳定,本发明采用pH梯度法、逆向蒸发法两者相结合的方法制备获得花青素脂质体混悬液,大大提高了花青素的稳定性,同时采用加入冻干保护剂进行冷冻干燥,制备得到了花青素脂质体的冻干粉,便于保存和作为食品、医药保健品和化妆品的原料进行使用。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是为了解决游离花青素存在的稳定性差及生物可利用率差的问题,提供了一种花青素脂质体的制备方法。
技术方案
本发明的制备花青素脂质体的方法是通过以下步骤实现的:
(1)成膜:按摩尔比为1:1~5:1的比例称取一定量的磷脂和胆固醇置于梨形烧瓶中,并按1:1~10:1的比例加入氯仿或乙醚等有机溶剂溶解,并在10℃~35℃下通过减压旋转蒸发除去有机溶剂,在瓶内壁上形成一层均匀的浅黄色膜脂;
(2)花青素酸性溶液的配置:将花青素与花青素稳定剂按重量比为20:5-20:1的比例混合,加入pH2的磷酸缓冲溶液溶解。
(3)超声波处理:向形成脂膜的梨形烧瓶中重新加入一定量的乙醚等有机溶剂将膜脂溶解,再按磷脂与花青素的重量比为10:1-50:1加入花青素酸性磷酸盐缓冲溶液,并震荡混合,得混合液;将_混合液短时间歇超声处理3~10min,使其形成外观均匀,且在20min内不发生分层现象的乳状液;
(4)逆向蒸发:上述乳状液置于梨形瓶中,并在15℃~35℃的水浴中,减压旋转蒸发直至有机溶剂去除后形成的凝胶半固态脂质体从瓶底脱落;
(5)水合:向通过逆向蒸发得到的脂质体中加入—定体积的pH为7的磷酸盐缓冲液,室温下震荡5~10min后得粗脂质体混悬液。
(6)粒径控制:将粗脂质体挤压通过0.45μm、0.25μm或0.10μm等不同孔径的滤膜,或循环高压均质,以获得不同粒径范围的花青素脂质体。
(7)冷冻干燥:在上述脂质体悬浮液中按3-20g/100ml加入冻干保护剂,然后放入-65℃下预冷冻24小时后用冷冻干燥剂进行冷冻干燥,得到花青素脂质体的冻干粉。
有益效果
(1)脂质体具有提高芯材稳定性,控制芯材释放,屏蔽不良味道与气味的作用,本发明采用pH梯度结合逆相蒸发法制备花青素脂质体,将花青素包埋在内水相中,降低了花青素受外界环境影响的敏感性,使花青素更加稳定。
(2)脂质体具有靶向性和生物相容性,有利于人体吸收利用,本发明采用脂质体包埋花青素可有效地提高花青素的生物可利用率。
(3)本发明采用pH梯度结合逆相蒸发法制备花青素脂质体,得到了包封率高达85.88%,平均粒径为234nm的花青素脂质体,实现了在提高花青素稳定性同时改善其生物可利用率的技术难题,并且该发明制备工艺简单,具有广泛的应用前景。
(4)通过加入保护剂后进行冷冻干燥,得到花青素脂质体的冻干粉,易于保存运输以及作为食品、功能保健品和化妆品的原料使用。
四、附图说明
图1是应用pH梯度结合逆相蒸发法制备出的花青素脂质体悬浮液;
图2是挤压过0.45μm的膜后的花青素脂质体的粒径分布曲线;
图3是挤压过0.20μm的膜后的花青素脂质体的粒径分布曲线;
图4是挤压过0.10μm的膜的花青素脂质体的粒径分布曲线。
发明的具体实施方式
实施例1:
(1)称取0.0600g的大豆卵磷脂和0.0100g的胆固醇置于梨形烧瓶中,量取12mL的氯仿加入其中将磷脂和胆固醇溶解,25℃旋转蒸发蒸去氯仿,直至瓶内壁上形成一层均匀的浅黄色膜脂;
(2)花青素溶液的制备:将2mg从黑米麸皮中提取的花青素粉末、0.2mg抗坏血酸溶解在2.0ml pH为2.0的磷酸缓冲溶液中;
(3)向梨形烧瓶中加入12mL乙醚将(1)所制得的膜脂溶解,然后将上述花青素磷酸缓冲液在震荡下缓慢加入,得混合液,将该混合液短时间歇超声处理5min,使其形成外观均匀的乳状液;
(4)将上述乳状液在15℃下减压旋转蒸发除去有机相,直至形成凝胶状的半固体从瓶底脱落,得到混悬液;
(5)向(4)的混悬液中加入50mLpH为7的磷酸盐缓冲液,并震荡5min后得粗脂质体,粗脂质体过0.45μm的滤膜,得到包封率为83.48%,平均粒径为221nm的花青素脂质体。
(6)在(5)的脂质体混悬液中加入海藻糖5g,并在-65℃下预冷冻24小时,然后用冷冻干燥机冷冻,得到花青素脂质体粉末。
实施例2:
(1)称取0.1200g的大豆卵磷脂和0.0180g的胆固醇置于梨形烧瓶中,量取26mL的氯仿加入其中将磷脂和胆固醇溶解,25℃旋转蒸发蒸去氯仿,直至瓶内壁上形成一层均匀的浅黄色膜脂;
(2)花青素溶液的制备:将4mg从黑米麸皮中提取的花青素粉末、0.2mg水溶性维生素E溶解在8.0ml pH为2.0的磷酸缓冲溶液中;
(3)向梨形烧瓶中加入26mL乙醚将(1)所制得的膜脂溶解,然后将上述花青素磷酸缓冲液在震荡下缓慢加入,得混合液,将该混合液短时间歇超声处理5min,使其形成外观均匀的乳状液;
(4)将上述乳状液在25℃下减压旋转蒸发除去有机相,直至形成凝胶状的半固体从瓶底脱落,得到混悬液;
(5)向(4)的混悬液中加入100mLpH为7的磷酸盐缓冲液,并震荡5min后得粗脂质体,粗脂质体过0.2μm的滤膜,得到包封率为76.21%,平均粒径为187nm的花青素脂质体。
(6)在(5)所制备的脂质体混悬液中加入海藻糖3g,并在-65℃下预冷冻24小时,然后用冷冻干燥机冷冻,得到花青素脂质体粉末。
实施例3:
(1)称取0.1800g的大豆卵磷脂和0.0300g的胆固醇置于梨形烧瓶中,量取40mL的氯仿加入其中将磷脂和胆固醇溶解,30℃旋转蒸发蒸去氯仿,直至瓶内壁上形成一层均匀的浅黄色膜脂;
(2)花青素溶液的制备:将6mg从黑米麸皮中提取的花青素粉末、1.2mg抗坏血酸溶解在12ml pH为2.0的磷酸缓冲溶液中;
(3)向梨形烧瓶中加入40mL乙醚将(1)所制得的膜脂溶解,然后将上述花青素磷酸缓冲液在震荡下缓慢加入,得混合液,将该混合液短时间间歇超声处理5min,使其形成外观均匀的乳状液;
(4)将上述乳状液在30℃下减压旋转蒸发除去有机相,直至形成凝胶状的半固体从瓶底脱落,得到混悬液;
(5)向(4)的混悬液中加入150mLpH为7的磷酸盐缓冲液,并震荡5min后得粗脂质体,粗脂质体经循环高压均质处理,得到包封率为70.02%,平均粒径为136 nm的花青素脂质体。
(6)在(5)所制备的脂质体混悬液中加入海藻糖5g,并在-65℃下预冷冻24小时,然后用冷冻干燥机冷冻,得到花青素脂质体粉末。
Claims (11)
1.一种花青素脂质体的制备方法,其特征在于应用pH梯度结合逆相蒸发法,并通过挤压过膜或循环高压均质处理,得到不同粒径分布的脂质体。其制备通过以下步骤和工艺条件实现:
(1)成膜:称取一定量的磷脂和胆固醇,用适量的有机溶剂溶解,并在温度为15℃~35℃下减压旋转蒸发缓慢除去有机溶剂,直至瓶内壁上形成一层均匀的浅黄色膜脂;
(2)超声波处理:向梨形烧瓶中重新加入有机溶剂将膜脂溶解,再加入酸性的含有稳定剂的花青素(pH=2.0)溶液震荡混合;将该混合液短时间间歇超声处理,使其形成外观均一的乳状液;
(3)减压旋转蒸发:将梨形瓶置于25℃~35℃的水浴中,旋转蒸发直至凝胶从瓶底脱落;
(4)水合:向(3)中的烧瓶里加pH7.0的磷酸盐缓冲液,室温下震荡后得到内、外水相具有pH梯度差的脂质体粗混悬液;
(5)粒径控制:将上述脂质体初混悬液依次挤压通过0.45μm、0.25μm、0.10μm的滤膜,或用高压均质机均质,得到不同粒径分布(120nm~230nm)的脂质体。
(6)冷冻干燥:将在上述脂质体混悬液加入保护剂,经预冷冻后进行冷冻干燥,得到花青素脂质体的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其中所说的磷脂包括豆磷脂、蛋磷脂及其它可用于食品药品的磷脂中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其中所使用的有机溶剂可以是乙醚,氯仿等弱极性,与水不混溶的溶剂。
4.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,含稳定剂花青素酸性溶液的制备中使用的稳定剂为抗坏血酸、维生素E、小分子酚酸等具有生物活性的花青素稳定剂,花青素溶液的配制采用pH2的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,冻干保护剂包括下列物质的一种或多种:海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等二糖或棉子糖等其它寡聚糖,氯化钠,磷酸盐。
6.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(1)在于通过将磷脂与胆固醇溶液混合并用有机溶剂溶解,再通过缓慢减压蒸发,首先制成一层膜。磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1~1:5。
7.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(2)在于花青素溶于pH为2的含花青素稳定剂的酸性缓冲溶液中,使得制成的花青素脂质体所处内水相为酸性,从而保持了花青素原有的结构和具有足够的稳定性。花青素与稳定剂的重量比为20:1~20:5。
8.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(3)在于磷脂与花青素的质量比为10:1~50:1。
9.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(4)加入pH7.0的磷酸缓冲液水合,冻干保护剂可以溶在该缓冲溶液中,也可以在形成脂质体混悬液后加入。冻干保护剂的加入量为2~30g/100ml。
10.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(4)通过挤压过膜或循环高压均质,形成不同粒径分布范围的花青素脂质体。
11.根据权利要求1所述的花青素脂质体制备方法,其特征(5)经过预冷冻、冷冻干燥,得到花青素脂质体的冻干粉。该冻干粉易于保存,可作为功能保健品、药物和化妆品的原料使用。
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GR01 | Patent grant | ||
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