CN103347878B - 丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的式(I)化合物、组合物及方法。本发明也披露含有所述化合物的药物组合物及使用这些化合物治疗HCV感染的方法。

Description

丙型肝炎病毒抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请主张2011年3月25日申请的美国临时申请61/467,602及2011年2月7日申请的美国临时申请61/440,086的权利。
技术领域
本发明大体而言是针对抗病毒化合物，且更特定言的是针对可抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS5A蛋白的功能的化合物、包含所述化合物的组合物及抑制NS5A蛋白的功能的方法。
背景技术
HCV为一种主要的人类病原体，全世界估计有1.7亿人受感染-约为1型人类免疫缺乏病毒感染人数的5倍。这些HCV感染个体中有相当一部分会发展成严重进行性肝脏疾病，包括肝硬化及肝细胞癌。
当前对于HCV的标准护理为利用聚乙二醇化干扰素与利巴韦林的组合，其在实现持续病毒应答方面的成功率并非最佳且会引起许多副作用。因此，明显且长期需要开发解决此未满足的医学需求的有效疗法。
HCV为一种正链RNA病毒。基于推导的氨基酸序列的比较及5'未转译区域中的广泛相似性，已将HCV归类为黄病毒科(Flaviviridaefamily)中的独立属。黄病毒科的所有成员均具有包膜病毒粒子，所述包膜病毒粒子含有通过转译单一不间断的开放阅读框架来编码所有已知病毒特异性蛋白质的正链RNA基因组。
由于缺乏校对能力的所编码的RNA依赖性RNA聚合酶的出错率高，故在整个HCV基因组中，在核苷酸及所编码的氨基酸序列中存在相当大的异质性。已表征至少六种主要基因型，且已描述分布于世界各地的50个以上亚型。HCV的基因异质性的临床显著性已显现在单一疗法治疗期间出现突变的倾向，因此需要使用其它治疗选择。基因型对发病机制及疗法可能存在的调节作用仍难以捉摸。
单股HCVRNA基因组的长度为约9500个核苷酸且具有编码含约3000个氨基酸的单一大型聚合蛋白的单一开放阅读框架(ORF)。在受感染细胞中，此聚合蛋白在多个位点由细胞及病毒蛋白酶裂解以产生结构及非结构(NS)蛋白质。在HCV的情况下，成熟非结构蛋白质(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)的产生由两种病毒蛋白酶实现。认为第一种病毒蛋白酶为金属蛋白酶且在NS2-NS3接合点裂解；第二种病毒蛋白酶为NS3的N末端区域内所含的丝氨酸蛋白酶(本文也称为NS3蛋白酶)且介导NS3下游的所有后续裂解，在NS3-NS4A裂解位点为顺式，而在其余NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点为反式。NS4A蛋白似乎通过充当NS3蛋白酶的辅因子及参与NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位来发挥多种功能。NS3-NS4A复合物的形成是适当蛋白酶活性所必需的，其使得裂解事件的蛋白水解效率增加。NS3蛋白也展现核苷三磷酸酶及RNA解螺旋酶活性。NS5B(本文也称为HCV聚合酶)为RNA依赖性RNA聚合酶，其与复制酶复合体中的其它HCV蛋白(包括NS5A)一起牵涉在HCV基因组的复制中。
需要适用于治疗感染HCV的患者的化合物，其选择性抑制HCV病毒复制。具体地，需要有效抑制NS5A蛋白的功能的化合物。HCVNS5A蛋白描述于例如以下参考文献中：S.L.Tan等人，Virology,284:1-12(2001)；K.-J.Park等人，J.Biol.Chem.,30711-30718(2003)；T.L.Tellinghuisen等人，Nature,435,374(2005)；R.A.Love等人，J.Virol,83,4395(2009)；N.Appel等人，J.Biol.Chem.,281,9833(2006)；L.Huang,J.Biol.Chem.,280,36417(2005)；C.Rice等人，WO2006093867。
Bachand等人于2008年2月21日公开的WO2008/021927中披露适用于治疗丙型肝炎病毒的一系列联苯化合物。本发明的新颖化合物属于WO2008/021927中化学式的定义范围内，但Bachand等人未对其加以披露或描述。令人惊奇地，已发现这些化合物具有使其适用于治疗丙型肝炎病毒的独特属性。
发明内容
在第一方面中，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1选自氢、甲基及氟；
R2选自氢及甲基；
R3及R4各为氢；或
R3及R4与它们所连接的碳原子一起形成环丙基环；及
R5选自氢及甲基。
在第一方面的第一实施方案中，本发明提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为氢。
在第一方面的第二实施方案中，本发明提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为氟。在第三实施方案中，R2、R3及R4各为氢且R5为甲基。
在第一方面的第四实施方案中，本发明提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为甲基。在第五实施方案中，R2、R3及R4各为氢且R5为甲基。
在第二方面中，本发明提供一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
在第三方面中，本发明提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体的组合物。在第三方面的第一实施方案中，所述组合物进一步包含一种、两种或三种具有抗HCV活性的其它化合物。在第三方面的第二实施方案中，所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第三实施方案中，干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素(consensusinterferon)、干扰素α2A、干扰素λ及淋巴细胞样干扰素τ。
在第三方面的第四实施方案中，本发明提供一种包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、药学上可接受的载体及一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助性T细胞应答发生的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、利巴韦林、肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺(amantadine)及金刚乙胺(rimantadine)。
在第三方面的第五实施方案中，本发明提供一种包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、药学上可接受的载体及一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种有效抑制选自以下的靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCVNS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCVNS5A蛋白及IMPDH。
在第四方面中，本发明提供一种治疗患者的HCV感染的方法，其包含向患者给予治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在第四方面的第一实施方案中，所述方法进一步包含在给予式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予一种、两种或三种具有抗HCV活性的其它化合物。在第四方面的第二实施方案中，所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第四方面的第三实施方案中，干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、干扰素λ及淋巴细胞样干扰素τ。
在第四方面的第四实施方案中，本发明提供一种治疗患者的HCV感染的方法，其包含向患者给予治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，且在给予所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助性T细胞应答发生的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺及金刚乙胺。
在第四方面的第五实施方案中，本发明提供一种治疗患者的HCV感染的方法，其包含向患者给予治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，且在给予所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种有效抑制选自以下的靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCVNS4B蛋白，HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCVNS5A蛋白及IMPDH。
在另一个方面中，本发明提供一种以下化合物：
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面中，本发明提供一种以下化合物：
或其药学上可接受的盐。
本发明的其它实施方案可包含两个或两个以上本文所披露的实施方案和/或方面的适当组合。
根据以下所提供的描述，本发明的其它实施方案及方面将显而易见。
本发明化合物也以互变异构体形式存在；因此本发明也涵盖所有互变异构形式。
本文中，本发明的描述应依照化学键合的规律及原理加以解释。
应了解，本发明所涵盖的化合物为适当地稳定用作药剂的那些化合物。
将本说明书中所引用的所有专利、专利申请及参考文献的全部内容并入本文作为参考。在不一致的情况下，以本发明(包括定义)为准。
如本说明书所用，以下术语具有所示含义：
除非上下文另外明确规定，否则本文中所用的单数形式“一”及“所述”包括复数个指示物。
本发明化合物中存在不对称中心。视手性碳原子周围的取代基的构型而定，这些中心由符号“R”或“S”标明。应了解，本发明涵盖所有具有抑制NS5A的能力的立体化学异构形式或其混合物。化合物的各个立体异构体可以合成方式由含有手性中心的可购得的起始物质制备，或通过制备立体异构产物的混合物，随后进行分离，诸如转化成非对映异构体的混合物，随后进行分离或重结晶、色谱技术或经手性色谱柱直接分离来制备。具有特定立体化学构型的起始化合物可购得或可通过在本领域中已知的技术制备及拆分。
本发明的某些化合物也可以可分离的不同稳定构象形式存在。由于围绕不对称单键的限制性旋转(例如由于位阻或环应变)的扭转不对称性可允许分离不同构象异构体。本发明包括这些化合物的各构象异构体及其混合物。
术语“本发明化合物”及等效表述意欲涵盖式(I)化合物及其药学上可接受的对映异构体、非对映异构体及盐。类似地，在上下文允许的情况下，提及中间体意欲包涵其盐。
本发明意欲包括本发明化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。以一般实施例说明，但不加以限制，氢的同位素包括氘及氚。碳的同位素包括13C及14C。经同位素标记的本发明化合物通常可通过本领域技术人员已知的公知技术或通过类似于本文所述的方法，使用适当经同位素标记的试剂替代原本使用的未经标记的试剂来制备。所述化合物可具有多种潜在用途，例如用作测定生物活性的标准物及试剂。在稳定同位素的情况下，所述化合物可具有有利地改变生物学、药理学或药物动力学特性的潜能。
本发明化合物可以药学上可接受的盐形式存在。本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的盐或两性离子形式，其为水或油溶性或分散性，其在合理医学判断范围内适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称，且有效实现其预期用途。所述盐可在化合物的最终分离及纯化期间制备，或分别由适合的氮原子与适合的酸反应来制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡糖酸盐、二氢溴酸盐、二氢氯酸盐、二氢碘酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、萘磺酸盐、烟碱酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐及十一烷酸盐。可用于形成药学上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸及磷酸；及有机酸，诸如草酸、顺丁烯二酸、丁二酸及柠檬酸。
当有可能将治疗有效量的式(I)化合物以及其药学上可接受的盐作为化学原料给药以用于疗法中时，有可能将活性成分呈现为药物组合物形式。因此，本发明进一步提供药物组合物，其包括治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本文所用的术语“治疗有效量”是指足以展现有意义的患者益处(例如：降低病毒量)时的各活性组分的总量。当应用于单独给予的各个活性成分时，所述术语是指所述单独成分。当应用于组合时，所述术语是指产生治疗效应的活性成分的组合量，无论以组合形式给予、连续给予或同时给予。式(I)化合物及其药学上可接受的盐如上所述。载体、稀释剂或赋形剂必须为可接受的，意思是与制剂的其它成分相容且对其接受者无害。根据本发明的另一个方面，也提供一种制备药物制剂的方法，其包括将式(I)化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。本文所用的术语“药学上可接受”是指那些化合物、物质、组合物和/或剂型在合理医学判断范围内适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，且符合合理的益处/风险比，且可有效实现其预期用途。
药物制剂可以每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂形提供。每天每公斤体重约0.01毫克(“mg/kg”)至约250毫克，优选每天每公斤体重约0.05毫克至约100毫克的本发明化合物的剂量为用于预防及治疗HCV介导疾病的单一疗法中的典型剂量。通常，本发明的药物组合物每天将给予约1至约5次，或者以连续输注方式给予。所述给药可用作长期或短期疗法。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的病症、病症的严重程度、给药时间、给药途径、所用化合物的排泄率、治疗持续时间及患者的年龄、性别、体重及健康状况而变化。优选单位剂量制剂为含有如上文所述的日剂量或亚剂量或其合适分剂量的活性成分的那些制剂。可以实质上小于最佳剂量的小剂量的化合物开始治疗。此后，以小幅增量增加剂量直至达到所述情况下的最佳效应。一般而言，化合物最理想地以通常将提供抗病毒有效结果而不引起任何有害或不利副作用的浓度水平给予。
当本发明组合物包含本发明化合物与一种或多种其它治疗剂或预防剂的组合时，所述化合物与其它药剂通常以单一疗法方案中一般所给予剂量的约10%至150%，且更优选约10%至80%的剂量存在。
药物制剂可适于通过任何合适途径给药，例如通过口服(包括含服或舌下)、经直肠、经鼻、局部(包括含服、舌下或经皮)、经阴道或肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或真皮内注射或输注)途径给药。所述制剂可由药剂学领域中已知的任何方法(例如通过将活性成分与一种或多种载体或赋形剂缔合)来制备。优选口服给药或通过注射给药。
适于口服给予的药物制剂可以离散单位形式提供，诸如胶囊剂或片剂；粉剂或颗粒剂；于水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用泡沫剂或气泡剂(whips)；或水包油型液体乳剂或油包水型乳剂。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式口服给予，可将活性药物组分与口服、无毒、药学上可接受的惰性载体(诸如乙醇、甘油、水等)组合。通过将化合物粉碎至适合的精细尺寸且与同样经碾碎的药物载体(诸如可食用碳水化合物，例如淀粉或甘露糖醇)混合来制备粉剂。也可存在矫味剂、防腐剂、分散剂及着色剂。
通过制备如上所述的粉末混合物且填充已成形明胶壳来制造胶囊剂。在填充操作之前，可将诸如胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇的助流剂及润滑剂添加至粉末混合物中。也可添加诸如琼脂、碳酸钙或碳酸钠的崩解剂或增溶剂以改良摄取胶囊剂时药物的可用性。
此外，需要或必需时，也可将适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂及着色剂并入混合物中。适合的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然及合成胶(诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂例如通过以下方法配制：制备粉末混合物，造粒或成块(slugging)，添加润滑剂及崩解剂，及压成片剂。粉末混合物通过以下方法制备：混合适当碾碎的化合物与如上所述的稀释剂或基质且任选与粘合剂(诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶解迟延剂(诸如石蜡)、再吸收加速剂(诸如季盐)和/或吸收剂(诸如膨润土、高岭土或磷酸二钙)。粉末混合物可用粘合剂(诸如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚粘浆(acadiamucilage)或纤维素或聚合物质的溶液)润湿及迫使其通过筛网来造粒。作为造粒的替代方法，可使粉末混合物通过压片机，结果不完全成形的坯块碎解为颗粒。可通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油来润滑颗粒以防止粘附于形成片剂的模具上。接着将经润滑的混合物压成片剂。也可将本发明化合物与自由流动的惰性载体组合及直接压成片剂，不经造粒或成块步骤。可提供由密封虫胶涂层、糖或聚合物质涂层及抛光蜡涂层组成的透明或不透明保护涂层。可将染料添加至所述涂层中以区分不同单位剂量。
口服液体，诸如溶液剂、糖浆剂及酏剂，可制备呈单位剂型以使得给予量含有预定量的化合物。糖浆剂可由化合物溶于适当矫味的水溶液中制备，而酏剂是通过使用无毒媒介物制备。也可添加增溶剂及乳化剂(诸如乙氧化异十八醇及聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(诸如薄荷油或天然甜味剂，或糖精或其它人造甜味剂)等。
适当时，可将用于口服给予的剂量单位制剂微囊化。也可例如通过包衣或包埋颗粒物质于聚合物、蜡等中来制备制剂以延长或持续释放。
式(I)化合物及其药学上可接受的盐也可以脂质体递送系统(诸如单层小微脂粒、单层大微脂粒及多层微脂粒)形式给药。脂质体可由多种磷脂(诸如胆固醇、十八烷胺或磷脂酰胆碱)形成。
式(I)化合物及其药学上可接受的盐也可通过使用单克隆抗体作为与化合物分子偶合的各种载体来递送。所述化合物也可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶合。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或经棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，所述化合物可与适用于实现药物控制释放的一类生物可降解聚合物偶合，所述聚合物例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。
适于经皮给药的药物制剂可以离散贴片形式提供，其意欲与接受者的表皮保持长时间紧密接触。例如，活性成分可通过如PharmaceuticalResearch1986,3(6),318中大致描述的离子导入疗法自贴片递送。
适于局部给药的药物制剂可配制为软膏、乳膏、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油剂。
适于经直肠给予的药物制剂可以栓剂形式或以灌肠剂形式提供。
适于经鼻给予的药物制剂(其中载体为固体)包括粒度例如介于20微米至500微米范围内的粗粉末，其以用鼻吸的方式给予，也即通过自保持贴近鼻子的粉末容器通过鼻腔快速吸入来给予。适用于以经鼻喷雾剂或滴鼻剂形式给予的制剂(其中载体为液体)包括活性成分的水溶液或油溶液。
适于通过吸入给药的药物制剂包括细粒粉剂或雾剂，其可通过各种类型的定剂量加压气溶胶、喷雾器或吹入器产生。
适于经阴道给予的药物制剂可以子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂形式提供。
适于肠胃外给予的药物制剂包括水性及非水性灭菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及使得制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；及水性及非水性灭菌混悬剂，其可包括助悬剂及增稠剂。制剂可在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿及小瓶)中提供，且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临用前添加灭菌液体载体(例如注射用水)。即用型注射溶液及混悬剂可自灭菌粉剂、颗粒剂及片剂制备。
应了解，关于所论述制剂的类型，除以上特定提及的成分以外，制剂也可包括在本领域中公知的其它试剂，例如适用于口服给予的制剂可包括矫味剂。
术语“患者”包括人类与其它哺乳动物。
术语“治疗”是指：(i)防止可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断出患病的患者发生所述疾病、障碍或病症；(ii)抑制疾病、障碍或病症，也即阻止其发展；及(iii)缓解疾病、障碍或病症，也即使疾病、障碍和/或病症消退。
本发明化合物也可与环孢素(cyclosporin)(例如环孢素A或通过类似机制起作用的其它类似物)一起给予。临床试验中已显示环孢素A对HCV具有活性(Hepatology2003,38,1282；Biochem.Biophys.Res.Commun.2004,313,42；J.Gastroenterol.2003,38,567)。
下表1列举可与本发明化合物一起给予的化合物的一些说明性实例。本发明化合物可与其它抗HCV活性化合物在组合疗法中联合或分开给予，或通过将所述化合物组合为组合物来给予。
表1
本发明化合物也可用作实验室试剂。所述化合物可有助于提供用于设计病毒复制分析、验证动物分析系统及结构生物学研究的研究工具，以进一步增强对HCV疾病机制的认识。此外，本发明化合物适用于例如通过竞争性抑制来建立或确定其它抗病毒化合物的结合位点。
本发明化合物也可用以治疗或预防物质的病毒污染且因此降低与所述物质接触的实验室或医务人元或患者的病毒感染风险，所述物质例如血液、组织、手术器械及衣服、实验室器械及衣服，及血液采集或输血装置及物质。
本发明意欲涵盖通过合成过程或通过代谢过程(包括在人类或动物体内(体内)发生的代谢过程或在体外发生的过程)制备的式(I)化合物。
具体实施方式
本申请中所用的缩写(尤其包括随后实施例中的缩写)为本领域技术人员所熟知。一些所用缩写如下：h、hr或hrs为小时；EtOAc为乙酸乙酯；Hex为己烷；DCM为二氯甲烷；DEAD为偶氮二甲酸二乙酯；Ph3P为三苯基膦；Et2O为乙醚；THF为四氢呋喃；LiHMDS为二(三甲基甲硅烷基)氨基锂；Ph为苯基；DIEA或DIPEA或iPr2EtN为二异丙基乙胺；EtOH为乙醇；MeOH为甲醇；DMSO为二甲亚砜；RT或Rt或rt或Rt为室温或保留时间(任选而定)；ON或o/n为过夜；min为分钟；DCM为二氯甲烷；HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；DMF为N,N-二甲基甲酰胺；TFA为三氟乙酸；HOBt或HOBT为羟基苯并三唑；DME为1,2-二甲氧基乙烷；且DMAP为N,N-二甲氨基吡啶。
Cap-1步骤a
将2,6-二甲基-4H-吡喃-4-酮(15g，121mmol)溶解于乙醇(300mL)中且添加10%Pd/C(1.28g，1.21mmol)。于帕尔震荡器(Parrshaker)中，在H2(70psi)下，在室温氢化混合物72小时。反应混合物通过硅藻土衬垫()过滤且用乙醇洗涤。真空浓缩滤液且残余物通过快速色谱(10%至30%EtOAc/Hex)纯化。分离出两种澄清油状级份。最先洗脱的级份为(2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-醇(Cap-1步骤a)与(2R,4s,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-醇(1.2g)的混合物，而稍后洗脱的级份仅对应于Cap-1步骤a(10.73g)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm3.69-3.78(1H,m),3.36-3.47(2H,m),2.10(1H,br.s.),1.88(2H,dd,J=12.05,4.73Hz),1.19(6H,d,J=6.10Hz),1.10(2H,q,J=10.70Hz)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δppm71.44(2C),67.92(1C),42.59(2C),21.71(2C)。
Cap-1步骤b
将DEAD(166mL，330mmol)逐滴添加至Cap-1步骤a(10.73，82mmol)、4-硝基苯甲酸(48.2g，288mmol)及Ph3P(86g，330mmol)于苯(750mL)中的溶液中。检测到放热且在环境温度搅拌所得琥珀色溶液18小时。减压移除溶剂且用Et2O(200mL)研磨残余物以移除氧化三苯基膦(10g)。剩余混合物通过(0%至5%EtOAc/Hex；300g柱×4)纯化。分离出对应于Cap-1步骤b的白色固体(19.36g)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm8.27-8.32(2H,m),8.20-8.24(2H,m),5.45(1H，五重峰，J=2.82Hz),3.92(2H,dqd,J=11.90,6.10,1.53Hz),1.91(2H,dd,J=14.80,2.29Hz),1.57(2H,dt,J=14.65,3.05Hz),1.22(6H,d,J=6.10Hz)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δppm163.81(1C),150.55(1C),135.94(1C),130.64(2C),123.58(2C),70.20(1C),68.45(2C),36.95(2C),21.84(2C)。LC-MS：[M]+C14H17NO5的分析计算值为279.11；实测值为279.12。
Cap-1步骤c
将LiOH(8.30g，347mmol)于水(300mL)中的溶液添加至Cap-1步骤b(19.36g，69.3mmol)于THF(1000mL)中的溶液中，且在环境温度搅拌所得混合物16小时。减压移除THF且再用水(200mL)稀释水层且用EtOAc(3×200mL)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤且真空浓缩。回收具有白色固体的油性残余物。用己烷研磨混合物且通过过滤移除固体，产生对应于Cap-1步骤c的澄清油状物(8.03g)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm4.21(1H，五重峰，J=2.82Hz),3.87-3.95(2H,m),1.72(1H,br.s.),1.63(2H,dd,J=14.34,2.14Hz),1.39-1.47(2H,m),1.17(6H,d,J=6.41Hz)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δppm67.53(2C),64.71(1C),39.99(2C),21.82(2C)。
Cap-1步骤d
在室温将对甲苯磺酰氯(23.52g，123mmol)添加至Cap-1步骤c(8.03g、61.7mmol)及吡啶(19.96mL，247mmol)于CH2Cl2(750mL)中的溶液中且搅拌36小时。由于反应未完成，故减压移除CH2Cl2且再持续搅拌48小时。接着将混合物添加至CH2Cl2(100mL)及水(100mL)中且在环境温度搅拌2小时。分离混合物且用1NHCl水溶液(2×50mL)充分洗涤有机层。接着干燥(MgSO4)有机层，过滤且浓缩。分离出对应于Cap-1步骤d的黄色油状物(14.15g)，其在真空下凝固成灰白色固体。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm7.80(2H,d,J=8.24Hz),7.35(2H,d,J=7.93Hz),4.88(1H，五重峰，J=2.82Hz),3.79-3.87(2H,m),2.46(3H,s),1.76(2H,dd,J=14.50,2.59Hz),1.36(2H,ddd,J=14.34,11.60,2.75Hz),1.12(6H,d,J=6.10Hz)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δppm144.64(1C),134.24(1C),129.82(2C),127.61(2C),77.34(1C),67.68(2C),37.45(2C),21.61(1C),21.57(2C)。LC-MS：[2M+H]+C28H41O8S2的分析计算值为569.22；实测值为569.3。
Cap-1步骤e
在室温，在压力管中将LiHMDS(29.7mL、29.7mmol，1MTHF溶液)添加至Cap-1步骤d(7.05g，24.8mmol)及2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(8.57g，26.0mmol)于甲苯(80mL)中的溶液中，接着在100℃搅拌所得混合物5小时。用水(100mL)淬灭反应混合物，用EtOAc萃取，用水洗涤，经MgSO4干燥，过滤且真空浓缩。残余物通过Biotage(0%至15%EtOAc/Hex；240g柱)纯化且分离出呈外消旋混合物形式的对应于Cap-1步骤e的黄色油状物(8.76g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm7.62-7.71(2H,m),7.30-7.45(11H,m),7.05(2H,dd,J=7.65,1.63Hz),5.13-5.22(2H,m),3.89(1H,d,J=6.78Hz),3.46(2H,双五重峰，J=11.27,5.90,2.01Hz),2.34-2.45(1H,m),1.58-1.66(1H,m),1.34-1.43(1H,m),1.19(3H,d,J=6.02Hz),1.03-1.16(4H,m),0.83-0.97(1H,m)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δppm170.84(1C),170.68(1C),139.01(1C),135.96(1C),135.51(1C),130.04(1C),128.49(2C),128.20(1C),128.09(4C),127.97(2C),127.85(1C),127.67(2C),127.47(2C),72.76(1C),72.46(1C),69.77(1C),65.99(1C),39.11(1C),35.90(1C),35.01(1C),21.74(1C),21.65(1C)。LC-MS：[2M+Na]+C58H62N2NaO6的分析计算值为905.45；实测值为905.42。
Cap-1步骤f
Cap-1步骤f.1        Cap-1步骤f.2
将Cap-1步骤e(8.76g，19.84mmol)溶解于THF(100mL)中且用2NHCl的水溶液(49.6mL，99mmol)处理。在环境温度搅拌所得澄清溶液4小时，接着减压移除THF。剩余水层用EtOAc(3×30mL)萃取且真空浓缩，得到相应粗胺。将残余物吸收于CH2Cl2(100mL)中且添加DIEA(11.8mL，67.6mmol)及氯甲酸甲酯(1.962mL，25.3mmol)。在环境温度搅拌所得溶液2小时。用CH2Cl2(50mL)稀释反应混合物且用水(100mL)及盐水(100mL)洗涤。干燥(MgSO4)有机层，过滤且浓缩。通过(15%至25%EtOAc/Hex；80g柱)纯化残余物。回收得到对应于外消旋Cap-1步骤f的澄清无色油状物(5.27g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 7.32-7.41(5H,m),5.13-5.28(3H,m),4.36(1H,dd,J=8.16,4.64Hz),3.69(3H,s),3.30-3.47(2H,m),2.00-2.16(1H,m),1.52(1H,d,J=12.55Hz),1.33(1H,d,J=12.30Hz),1.15(6H,dd,J=6.02,5.02Hz),0.88-1.07(2H,m)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ ppm 171.39(1C),156.72(1C),135.20(2C),128.60(2C),128.57(1C),128.52(2C),72.77(1C),72.74(1C),67.16(1C),57.81(1C),52.40(1C),38.85(1C),35.56(1C),34.25(1C),21.94(2C)。LC-MS：[M+H]+C18H26NO5的分析计算值为336.18；实测值为336.3。
开发手性方法以在AS-H柱(50×500mm，20 μm)上通过使用20%乙醇作为调节剂分离外消旋混合物(波长=220nm，流速=100mL/min，历时22分钟，溶剂A=0.1%二乙胺的庚烷溶液，溶剂B=EtOH)。分离的两种异构体对应于(S)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸苄酯(Cap-1步骤f.1)(Rt=9.8min，2.2g)及(R)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸苄酯(Cap-1步骤f.2)(Rt=16.4min，2.1g)，且其各呈现与对应混合物相同的分析数据(参见上文)。
Cap-1
在帕尔瓶中将(S)-2-((2R,4r,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸苄酯(Cap-1步骤f.1)(2.2g，6.6mmol)溶解于MeOH(50mL)中，并添加10%Pd/C(0.349g，0.328mmol)。接着将悬浮液置于帕尔震荡器中且用N2吹洗混合物(3次)，置于40psiH2下且在室温震荡15小时。通过硅藻土衬垫()滤出催化剂且减压移除溶剂，产生对应于Cap-1的琥珀色固体(1.6g)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δppm12.74(1H,br.s.),7.35(1H,d,J=6.10Hz),3.85(1H,br.s.),3.53(3H,s),3.35(2H,ddd,J=15.95,9.99,6.10Hz),1.97(1H,br.s.),1.48(2H,t,J=13.28Hz),1.06(6H,d,J=6.10Hz),0.82-1.00(2H,m)。13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δppm176.93(1C),156.72(1C,),72.10(1C),71.92(1C),58.54(1C),51.35(1C),36.88(1C),35.82(1C),34.71(1C),21.90(2C)。注意：Cap-1的绝对立体化学构型是通过由Cap-1及(S)-苯乙醇制备的酯类似物的单晶X射线分析确定。
Cap-2
(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸
Cap-2步骤a
参考文献：S.Danishefsky等人，J.Org.Chem,1982,47,1597。
在氮气下将醚合三氟化硼(3.81mL，30.5mmol)逐滴添加至(E)-(4-甲氧基丁-1,3-二烯-2-基氧基)三甲基甲硅烷(5.0g，29mmol)及乙醛(3.28mL，58.0mmol)于乙醚(100mL)中的经搅拌且冷却(-78℃)的溶液中。在-78℃搅拌反应混合物2.5小时，接着用饱和NaHCO3水溶液(40mL)淬灭，使其升温至室温且搅拌过夜。分离各层且用乙醚(2×50mL)萃取水层。干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤且浓缩，得到黄色/橙色油状物。粗油状物用Horizon(110gSiO2，25%至40%EtOAc/己烷)纯化，产生呈黄色油状的外消旋2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮(Cap-2步骤a)(2.2g)。1HNMR(400MHz,CDCl3-d)δppm7.35(d,J=6.0Hz,1H),5.41(dd,J=6.0,1.0Hz,1H),4.51-4.62(m,1H),2.41-2.57(m,2H),1.47(d,J=6.3Hz,3H)。
Cap-2步骤b
参考文献：Reddy,D.S等人，J.Org.Chem.2004,69,1716-1719。
在0℃且在氮气下将1.6M甲基锂于乙醚中的溶液(20.9mL，33.4mmol)添加至碘化亚铜(I)(4.25g，22.30mmol)于乙醚(30mL)中的经搅拌浆料中。在0℃搅拌反应混合物20分钟，接着经10分钟添加含外消旋2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮(1.25g，11.2mmol)的乙醚(12.0mL)。使反应混合物升温至室温且搅拌2小时。将反应混合物倾入饱和NH4Cl(水溶液)中且搅拌20分钟。溶液用乙醚(4×60mL)萃取且合并的有机物用盐水(约80mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且浓缩，产生呈橙色油状的外消旋(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(Cap-2步骤b)(1.34g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm4.28-4.39(m,2H),2.55(ddd,J=14.1,4.8,1.5Hz,2H),2.24(ddd,J=14.1,6.5,1.5Hz,2H),1.28(d,J=6.3Hz,6H)。
Cap-2步骤c
Cap-2步骤c.1Cap-2步骤c.2
在0℃将硼氢化钠(0.354g，9.36mmol)逐份添加至外消旋(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(Cap-2步骤b)(1.2g，9.4mmol)于MeOH(30mL)中的经搅拌溶液中。在0℃搅拌溶液10分钟，升温至室温且搅拌1小时。将反应混合物倾入饱和NH4Cl(约50mL)中，搅拌20分钟，接着部分浓缩(至约1/2体积)。形成沉淀物，添加水直至均质，接着用DCM(3×60mL)萃取溶液。水层用1NHCl酸化，接着用DCM(3×60mL)萃取。经Na2SO4干燥合并的有机物，过滤且浓缩，形成混浊黄色油状物(1.08g)。将粗油状物溶解于DCM(8.0mL)中，接着添加对甲苯磺酰氯(2.68g，14.0mmol)及吡啶(1.51mL，18.7mmol)，且在室温搅拌反应混合物2.5天。反应混合物用饱和NH4Cl(约60mL)稀释且用DCM(3×30mL)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机相，过滤且浓缩，得到棕色油状物。油状物经Horizon(80gSiO2，10%至25%EtOAc/己烷)纯化，产生呈粘性澄清无色油状的外消旋4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基酯(Cap-2步骤c)(1.63g)。LC-MS保留时间为3.321分钟；m/z284.98[M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna3μC182.0×50mm柱的ShimadzuLC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AVUV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%H2O/10mM乙酸铵且溶剂B为5%H2O/95%MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.81(d,J=8.3Hz,2H),7.36(d,J=8.0Hz,2H),4.81-4.92(m,1H),4.17-4.26(m,1H),3.78-3.87(m,1H),2.47(s,3H),1.91-1.99(m,1H),1.78-1.86(m,1H),1.65-1.72(m,1H),1.46(ddd,J=12.9,9.4,9.3Hz,1H),1.20(dd,J=6.5,4.8Hz,6H)。
使用手性制备性SFC纯化(Chiralpak AD-H制备性柱，30mm×250mm，5μm，含10%1:1EtOH/庚烷的CO2，70mL/min，历时10分钟)，经多次注射将外消旋混合物分离成各个对映异构体，产生4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基酯(Cap-2步骤c.1)(577mg)(第一洗脱峰)及4-甲基苯磺酸(2S,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基酯(Cap-2步骤c.2)(588mg)(第二洗脱峰)。分离出呈澄清无色油状的各对映异构体，其静置时凝固成白色固体。
Cap-2步骤d
Cap-2步骤d.1         Cap-2步骤d.2
在48mL压力管中，将4-甲基苯磺酸(2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基酯(Cap-2步骤c.1)(575mg，2.02mmol)及2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(733mg，2.22mmol)于THF(2mL)及甲苯(10mL)中搅拌。澄清无色溶液用氮气吹洗，接着添加LiHMDS(1.0MTHF溶液)(2.22mL，2.22mmol)，且密封容器且在100℃加热8小时。冷却反应混合物至室温，倾入1/2饱和NH4Cl(水溶液)(约50mL)中且用EtOAc(3×30mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且浓缩，得到橙色粗油状物。油状物经Horizon(40gSiO2，10%至25%EtOAc/己烷)纯化，产生呈橙色油状的含杂质的所需产物(501mg)。此物质经Horizon(25g SiO2，6%至12%EtOAc/己烷)再纯化，产生呈粘性橙色油状的非对映异构体的约1:1混合物(Cap-2步骤d)(306mg)。
使用手性制备性SFC纯化(Chiralcel OJ-H制备性柱，30mm×250mm，5μm，含10%1:1EtOH/庚烷的CO2，在150巴下，70mL/min，历时10分钟)，经多次注射将混合物分离成各个非对映异构体，产生(R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(Cap-2步骤d.1)(124mg)(第一洗脱峰)及(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(Cap-2步骤d.2)(129mg)(第二洗脱峰)。分离出呈粘性黄色油状的各非对映异构体。
(R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(Cap-2，步骤d.1)的分析数据：1HNMR(400MHz,D4-MeOH)δppm7.57-7.61(m,2H),7.41-7.48(m,4H),7.33-7.40(m,7H),7.03-7.08(m,2H),5.22(d,J=12.1Hz,1H),5.16(d,J=12.1Hz,1H),4.09-4.19(m,1H),3.84(d,J=6.8Hz,1H),3.75-3.83(m,1H),2.53-2.64(m,1H),1.58-1.65(m,1H),1.33-1.43(m,1H),1.26-1.32(m,1H),1.24(d,J=7.0Hz,3H),1.10(d,J=6.0Hz,3H),0.98-1.08(m,1H)。LC-MS保留时间为4.28分钟；m/z442.16[M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna3μ C182.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%H2O/10mM乙酸铵且溶剂B为5%H2O/95%MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(Cap-2，步骤d.2)的分析数据：1H NMR(400MHz,D4-MeOH)δppm7.57-7.61(m,2H),7.41-7.50(m,4H),7.33-7.40(m,7H),7.04-7.08(m,2H),5.22(d,J=12.1Hz,1H),5.16(d,J=12.1Hz,1H),4.20(qd,J=6.4,6.3Hz,1H),3.86(d,J=6.5Hz,1H),3.74-3.83(m,1H),2.53-2.64(m,1H),1.60(td,J=12.7,5.6Hz,1H),1.38-1.51(m,2H),1.26(d,J=7.0Hz,3H),1.04(d,J=6.0Hz,3H),0.79-0.89(m,1H)。LC-MS保留时间为4.27分钟；m/z442.17[M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的ShimadzuLC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%H2O/10mM乙酸铵且溶剂B为5%H2O/95%MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
Cap-2步骤e
将(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(二苯基亚甲氨基)乙酸苄酯(Cap-2步骤d.2)(129.6mg，0.294mmol)溶解于THF(2mL)中，接着用2NHCl的水溶液(1.0mL，2.1mmol)处理。搅拌反应混合物2小时，接着在氮气流下浓缩过夜。将粗残余物溶解于DCM(2mL)及DIPEA(0.21mL，1.2mmol)中，接着用氯甲酸甲酯(0.032mL，0.41mmol)处理且在室温搅拌4小时。用水(约2.5mL)稀释反应混合物且用DCM(4×2mL)萃取。合并的有机相在氮气流下浓缩过夜，且残余物用Horizon(4g SiO2，10%至50%EtOAc/己烷)纯化，产生呈无色玻璃状的(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸苄酯(Cap-2步骤e)(56mg)。LC-MS保留时间为3.338分钟；m/z335.99[M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95% H2O/10mM乙酸铵且溶剂B为5%H2O/95% MeOH/10mM乙酸铵。使用LC MicromassPlatform在电喷雾模式下测定MS数据。1H NMR(400MHz,D4-MeOH)δppm7.29-7.42(m,5H),5.28(d,J=12.0Hz,1H),5.09(d,J=12.0Hz,1H),4.10-4.20(m,2H),3.68-3.78(m,1H),3.65(s,3H),2.22-2.36(m,1H),1.42-1.54(m,2H),1.29-1.38(m,1H),1.17(d,J=6.8Hz,3H),1.04(d,J=6.0Hz,3H),0.89-1.00(m,1H)。
Cap-2
将(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸苄酯(Cap-2步骤e)(56mg，0.167mmol)溶解于MeOH(4mL)中，接着用10%Pd/C(12mg，0.012mmol)处理。反应混合物用氮气真空吹洗(4次)，接着用氢气真空吹洗(4次)，且在氢气球下搅拌过夜。反应混合物通过过滤且浓缩，产生呈无色油状的(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸(Cap-2)(41mg)。1HNMR(400MHz,D4-MeOH)δppm4.22(五重峰，J=6.4Hz,1H),4.04-4.11(m,1H),3.78-3.87(m,1H),3.66(s,3H),2.26-2.39(m,1H),1.63(d,J=13.1Hz,1H),1.51-1.60(m,1H),1.42-1.49(m,1H),1.27(d,J=7.0Hz,3H),1.11(d,J=6.3Hz,3H),0.97-1.08(m,1H)。
注意：Cap-2的绝对立体化学构型通过由Cap-2((R)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸)及(S)-1-(萘-2-基)乙胺的差向异构体制备的酰胺类似物的单晶X射线分析确定。
方案-1阐明Cap-2的替代合成。使用所报导的操作的改编实施产生(R)-2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮的前4个步骤(Anderson,K.R等人，Org.Proc.Res.Dev.2010,14,58)。用所报导的操作的改编使(R)-2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮转化成(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(Reddy,D.S.等人，J.Org.Chem.2004,69,1716)。下文提供其它细节。
方案-1
(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丁酸乙酯
在氮气下，在0℃将叔丁基氯二甲基甲硅烷(547g，3.63mol)添加至(R)-3-羟基丁酸乙酯(400g，3.03mol)于DCM(800mL)中的经搅拌溶液中。经20分钟逐份添加咪唑(412g，6.05mol)至反应混合物中，其间混合物变成稠厚白色浆料。再添加DCM(175mL)且使混合物升温至室温且搅拌16小时。通过过滤移除白色固体，用DCM(500mL)冲洗，于水(1L)与DCM(500mL)之间分配，且水层再用DCM(500mL)进一步萃取。滤液与有机层合并且用水(500mL)及盐水洗涤，经MgSO4干燥且过滤。浓缩产物且高真空干燥，产生含有未鉴别杂质的(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丁酸乙酯(777.5g)。粗产物的分析数据与文献中所报导的数据相符。物质未经额外纯化即使用。
(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁酰胺
经60分钟通过套管将2M氯化异丙基镁于THF中的溶液(800mL，1.60mol)逐滴添加至(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丁酸乙酯(131g，532mmol)及N,O-二甲基羟胺/HCl(80g，824mmol)于无水THF(850mL)中的经搅拌溶液中，同时维持内部温度在-30℃与-20℃之间。在-20℃与-10℃之间搅拌悬浮液3小时，且趁冷却时用饱和氯化铵水溶液(400mL)淬灭。使反应混合物于水(200mL)与乙醚(500mL)之间分配，且用乙醚(1L)进一步萃取水相。合并的有机相用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩且高真空干燥，产生(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁酰胺。重复所述反应6次，产生总计717g的物质。分析数据与文献中所报导的数据相符。物质未经额外纯化即使用。
N-亚乙基哌啶-1-胺
相关参考文献参见：(a)Marques-Lopez,E.等人，Eur.J.Org.Chem.2008,20,3457。(b)Corey,E.等人，Chem.Ber.1978,111,1337。(c)Chudek,J.A.等人，J.Chem.Soc.PerkinTrans21985,8,1285。
经60分钟将哌啶-1-胺(754mL，6.99mol)逐滴添加至维持于0℃的乙醛(304mL，5.38mol)中，同时在氮气下搅拌。[注意：添加引起放热。在此规模上，含有哌啶-1-胺的滴液漏斗由于乙醛汽化且在滴液漏斗中凝结而发热]。在0℃1小时且在室温1小时后，在反应烧瓶上装备16英寸回流冷凝器且升温至40℃且搅拌20小时。使反应混合物冷却至室温且于乙醚(700mL)与盐水(300mL)之间分配。有机层用水洗涤且水层用乙醚(2×500mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩且高真空干燥8小时，得到呈黄色油状的(E)-N-亚乙基哌啶-1-胺(772g)(含有杂质)。分析数据与文献中所报导的数据相符。物质未经额外纯化即使用。
(E)-5-((R)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(哌啶-1-基亚氨基)己-3-酮
在0℃在氮气下经40分钟将正丁基锂的己烷溶液(2.5M，644mL，1.61mol)添加至二异丙基胺(245mL，1.72mol)于无水THF(2.3L)中的经搅拌溶液中。在0℃搅拌混合物30分钟，接着逐滴添加(E)-N-亚乙基哌啶-1-胺(203g，1.61mol)于无水THF(100mL)中的溶液。在0℃搅拌反应混合物2小时且使悬浮液冷却至-78℃，且用(R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-N-甲氧基-N-甲基丁酰胺(280.4g，1.073mol)于无水THF(100mL)中的溶液逐滴处理。在-78℃搅拌反应混合物3小时，使其缓慢升温至室温，接着搅拌16小时。使反应混合物于水(600mL)与乙醚(1.5L)之间分配，且用乙醚进一步萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，过滤且浓缩，产生琥珀色油状物。粗油状物通过短柱纯化(于4L烧结玻璃漏斗中的3L硅胶用5%EtOAc/己烷预先平衡，接着将粗油状物溶解于50mL DCM/己烷(1:5)中且装载于硅胶之上，且最终用5%至40% EtOAc/己烷洗脱柱)，产生(E)-5-((R)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(哌啶-1-基亚氨基)己-3-酮。合并含杂质级份，浓缩且用Horizon(300g SiO2，15%至45% EtOAc/己烷)再纯化，产生另外产物(总计230g)。分析数据与文献中所报导的数据相符。物质未经额外纯化即使用。
(R)-2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮
将Amberlyst-15(122g，372mmol)(干燥形式，淡棕色珠粒，Alfa Aesar，储备编号89079或L14146)整份添加至(E)-5-((R)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-1-(哌啶-1-基亚氨基)己-3-酮(121g，372mmol)于无水THF(1.2L)中的经搅拌溶液中。回流混合物2.5小时，冷却，过滤且浓缩，得到琥珀色液体。粗液体通过短柱纯化(将粗产物溶解于30mL5%EtOAc/己烷中且装载于4L烧结玻璃漏斗中的用5% EtOAc/hex预先平衡的1.5L硅胶之上，且柱用5%至50% EtOAc/己烷洗脱)，产生烯酮(R)-2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮。注意：通过小心旋转蒸发移除溶剂(浴温低于或等于环境温度)，但在回收阱中检测到一些所需产物。使用20英寸具有蒸馏头的Vigreux柱浓缩此物质以移除溶剂，且与原始物质合并。总所需产物进一步通过蒸馏纯化以得到无色油状物(17.8g)，其在10mm Hg的沸点为68℃-70℃。旋光度：+212.8，在c=0.46g/100mL CHCl3下。
(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮
在氮气下，经20min将甲基锂的乙醚溶液(1.6M，218mL，349mmol)以每份约10mL逐份添加至碘化亚铜(I)(44.3g，233mmol)于乙醚(350mL)中的冷却至0℃的经搅拌浆料中。在0℃搅拌反应混合物30分钟，接着经30分钟逐滴添加含(R)-2-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮(13.5g，116mmol)的乙醚(150mL)。移除冷浴且使反应混合物升温至室温且搅拌3小时。将反应混合物缓慢添加(经约5分钟)至饱和NH4Cl(水溶液)(约750mL)及冰的经搅拌溶液中。再添加乙醚(约500mL)及水(约150mL)，且搅拌含有灰色沉淀物的溶液过夜。分离各层且水层用乙醚(500mL)及DCM(500mL)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机相，过滤且浓缩(旋转蒸发仪浴温维持于环境温度或低于环境温度)，得到橙色油状物。粗油状物用Horizon(240g SiO2，含1%至4%乙醚的DCM，柱用DCM预先平衡)纯化，产生呈浅黄色油状的(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(13.4g，根据1H-NMR，纯度为86%)。[注意：小心浓缩物质且根据1H-NMR含有10重量%DCM。1H-NMR分析也指示物质受约2.5%由先前反应带入的TBDMSOH及1.6%(2R,6S)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮污染]。产物的分析数据与文献所报导的数据符合，且所述物质未经额外纯化即使用。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ4.41-4.25(m,2H),2.55(ddd,J=14.1,4.8,1.4Hz,2H),2.24(ddd,J=14.1,6.5,1.5Hz,2H),1.28(d,J=6.5Hz,6H)。
2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-吡喃-4(3H,5H,6H)-亚基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯
将氧化亚铜(2.21g，15.4mmol)添加至2-异氰基乙酸乙酯(12.7mL，116mmol)于乙醚(300mL)中的经搅拌溶液中，且剧烈搅拌浆料10分钟。经15分钟添加(2R,6R)-2,6-二甲基二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(15.2g，103mmol，纯度为87%，含有13重量%DCM)于乙醚(100mL)中的溶液，且在室温搅拌反应混合物2小时。冷却反应混合物至0℃且用经约15分钟以每份10mL逐份添加的1MKO-tBu的THF溶液(116mL，116mmol)处理，接着在0℃搅拌1小时。添加乙酸(6.66mL，116mmol)于DCM(60mL)中的溶液，且使反应混合物升温至室温且搅拌2小时。使粗反应混合物于水(约300mL)与乙醚(约300mL)之间分配，且用DCM(300mL)进一步萃取水层。干燥(MgSO4)合并的有机相，过滤且浓缩，得到深红色油状物，其在真空下凝固。粗物质用Horizon色谱(300gSiO2；使用最小量的DCM装载于柱上；用40%至60%EtOAc/己烷洗脱，保持于40%历经4倍柱体积)纯化。所需产物的早期级份也含有目标产物的顺式立体异构型式作为杂质。合并这些含杂质级份，浓缩，得到8.9g浅黄色油状物，用Horizon色谱(240g硅胶；用40%至65%EtOAc/己烷洗脱，保持于40%历经5倍柱体积)再纯化。合并来自两次纯化的所有如TLC所测定具有洁净所需产物的级份，浓缩，产生呈浅黄色固体状的2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-吡喃-4(3H,5H,6H)-亚基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯(18.8g)，受<1%(HPLC)顺式二甲基异构变异体污染。
纯物质的1H-及13C-NMR数据呈现为酰胺旋转异构体的2:1混合物：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(d,J=1.3Hz,0.66H),7.98(d,J=11.5Hz,0.33H),6.71(br.s.,0.66H),6.56(d,J=12.0Hz,0.33H),4.32-4.00(m,4H),3.05(dd,J=14.3,4.3Hz,0.33H),2.92(d,J=5.3Hz,1.33H),2.82(dd,J=14.3,6.5Hz,0.33H),2.62(dd,J=13.9,3.9Hz,0.33H),2.45(dd,J=14.1,3.8Hz,0.66H),2.24(dd,J=13.8,7.3Hz,0.33H),2.14-2.04(m,0.66H),1.37-1.29(m,3H),1.28-1.18(m,6H)。13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ164.5(0.66C),163.9(0.33C),163.8(0.33C),159.3(0.66C),147.5(0.33C),147.0(0.66C),120.3(0.33C),118.6(0.66C),68.1(0.66C),67.8(0.33C),67.4(0.33C),66.8(0.66C),61.1(0.33C),60.9(0.66C),38.2(0.66C),37.4(0.33C),36.2(0.33C),36.0(0.66C),20.5(0.66C),20.1(0.33C),19.5(0.33C),19.2(0.66C),13.8(s,1C)。LC-MS保留时间为1.85分钟；m/z242.45(M+H)+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟。溶剂A为10%乙腈/90%H2O/0.1%三氟乙酸，且溶剂B为10%H2O/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯
在2.5L帕尔氢化容器中，使氮气鼓泡通过2-((2R,6R)-2,6-二甲基-2H-吡喃-4(3H,5H,6H)-亚基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯(17.0g，70.5mmol)于MeOH(480mL)中的溶液10分钟。接着添加(-)-1,2-二((2S,5S)-2,5-二甲基磷杂环戊烷基)乙烷(环辛二烯)-铑(I)四氟硼酸盐(0.706g，1.27mmol)且密封反应容器，用氮气真空吹洗(4次)，接着用氢气真空吹洗(4次)。在60psi氢气下震荡反应溶液3天，自震荡器移出且浓缩，得到深红色油状物。粗油状物用Horizon色谱(300g SiO2，50%至75% EtOAc/己烷)纯化，产生呈浅黄色粘性油状的(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯(17.4g，根据1H-NMR含有5.9重量%溶剂(EtOAc及DCM))。1H-NMR数据指示两种酰胺旋转异构体的10:1混合物。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(s,0.9H),8.01(d,J=11.8Hz,0.1H),6.15(d,J=8.5Hz,0.9H),5.96-5.84(m,0.1H),4.68(dd,J=9.0,5.0Hz,0.9H),4.33-4.17(m,3H),3.87(dd,J=10.2,6.4Hz,0.1H),3.75(dqd,J=11.5,6.0,2.0Hz,1H),2.41-2.29(m,0.9H),2.29-2.19(m,0.1H),1.72-1.28(m,3H),1.28-1.23(m,6H),1.17-1.10(m,3H),1.09-0.96(m,1H)。13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ170.6,160.3,68.1,64.0,61.4,54.2,36.0,33.1,30.6,21.9,16.7,13.9。LC-MS保留时间为1.64分钟；m/z244.25(M+H)+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟。溶剂A为10%乙腈/90%H2O/0.1%三氟乙酸，且溶剂B为10%H2O/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸乙酯
化学式：C13H23NO5
分子量：273.33
在装备有冷凝器的用隔片塞住且用针开孔的1L烧瓶中，于预先平衡的油浴中在52℃加热(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-甲酰氨基乙酸乙酯(17.6g，72.3mmol)于乙醇(409mL)及1.5N HCl(水溶液)(409mL)中的溶液7.5小时。真空移除挥发性组分且使残余物与EtOH(2×50mL)共沸且真空干燥过夜，得到白色泡沫状物。将白色泡沫状物溶解于DCM(409mL)中且经10分钟逐滴添加N,N-二异丙基乙胺(38.0mL，218mmol)，之后也经10分钟逐滴添加氯甲酸甲酯(8.40mL109mmol)。在环境温度搅拌反应混合物4.5小时，接着小心地用1N HCl(100毫升)淬灭。分离各层且有机层依序用1N HCl(50mL)、碱性水溶液(50mL水+2mL饱和NaHCO3)洗涤。干燥(MgSO4)有机层，过滤且浓缩。残余物用(300g SiO2；用最小量氯仿将样品装载于柱上，且用30% EtOAc/己烷洗脱)纯化，产生呈粘性黄色油状的(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸乙酯(13.8g)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.23(d,J=8.8Hz,1H),4.34-4.15(m,4H),3.81-3.72(m,1H),3.70(s,3H),2.35-2.23(m,1H),1.63-1.51(m,2H),1.34-1.27(‘m’和‘t’重叠,J=7.0Hz,1H & 3H),1.25(d,J=6.8Hz,3H),1.14(d,J=6.0Hz,3H),1.11-0.99(m,1H)。LC-MS保留时间为2.89min；m/z296.23(M+Na)+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的ShimadzuLC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟。溶剂A为10% MeOH/90% H2O/0.1%三氟乙酸，且溶剂B为10%H2O/90%甲醇/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
另外注意：以上产物通过SFC色谱(每次注射180mg，处理量为7.2g/h)进一步纯化以移除未鉴别的杂质，之后进行水解步骤。条件：
柱：          ChiralPak AD-H25×3cm,5μ
柱温度：      25℃
流速：        150mL/min
移动相：      CO2/MeOH=93/7
注射体积：    1.0mL(180mg/mL)
注射模式：    叠层式(注射/运行时间(分钟)=1.47/3.0)
检测器波长：  220nm
样品溶剂：    CH3OH/CH3CN=1:1(v/v)
(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸(Cap-2)
经65分钟将含氢氧化锂水合物(8.51g，203mmol)的H2O(270mL)逐滴添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸乙酯(27.7g，101mmol)于THF(405mL)中的经搅拌溶液中，同时维持内部温度<5℃。于冰浴中搅拌反应混合物40分钟，接着于水浴中在室温搅拌5小时。部分浓缩反应混合物以移除THF，接着于水(250mL)与DCM(250mL)之间分配。用1N HCl(205mL)将水层调节至pH=2，接着用乙酸异丙酯(7×250mL)萃取。用盐水(1×600mL)洗涤合并的萃取物，干燥(MgSO4)，过滤且浓缩。所得粘性油状物用甲苯(100mL)及乙醚(75mL)处理，蒸发且真空干燥，得到呈白色泡沫状的Cap-2(25.8g，具有0.33当量甲苯)。手性SFC纯度>99.9%(Chiralpak AD-H(25cm×0.46cm，5μm)，含5%EtOH的CO2，3mL/min，35℃，220nm，100巴)。HPLC纯度为95.6%(柱：Sunfire C8 75mm×4.6mm，ID：2.5μm；40℃；移动相：A=含0.1%甲酸的水；B=含0.1%甲酸的CH3CN)。LC/MS(ES+)228.1(M+H-H2O)+。根据1H-NMR，所述物质含有约0.33当量的甲苯。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29(d,J=8.6Hz,1H),4.46-4.25(m,2H),3.82(dd,J=9.7,5.9Hz,1H),3.74(s,3H),2.46-2.30(m,1H),1.76-1.55(m,2H),1.51-1.35(m,1H),1.29(d,J=6.8Hz,3H),1.18(d,J=6.2Hz,3H),1.18-1.06(m,1H)。13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ174.1,156.7,68.3,64.4,57.5,52.2,35.8,32.6,30.3,21.6,16.7。
实施例1
(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
实施例1步骤a
以上化合物根据文献方案(J.Med.Chem.,2006,49,3520)，纯化作出以下修改而合成：在环境温度自EtOAc/己烷重结晶粗物质，得到呈白色晶体状的实施例1步骤a。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm4.32(br m,1H),3.89(br m,1H),2.40(brm,1H),2.00(m,2H),1.65(m,1H),1.45(s,9H),1.20(d,J=5.6,3H)。LC/MS：[M+Na]+C11H20NO4Na的分析计算值为252.12；实测值为252.21。
实施例1步骤b
向实施例1步骤a(7.12g，31.1mmol)及1,1'-(联苯-4,4'-二基)二(2-溴乙酮)(6.0g，15mmol)于乙腈(100mL)中的混合物中逐滴添加i-Pr2EtN(5.56mL，31.8mmol)，且在室温搅拌反应混合物3小时。真空移除挥发性组分且使残余物于CH2Cl2(100mL)与饱和NaHCO3水溶液(100mL)之间分配。分离有机层且用水及盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且真空浓缩，得到呈白色泡沫状的实施例1步骤b(9.83g)，其未经纯化即用于下一步骤。1HNMR(500MHz,CDCl3)δppm8.01(4H,t,J=7.32Hz),7.73(4H,d,J=6.71Hz),5.18-5.66(4H,m),4.51(1H,t,J=7.17Hz),4.42(1H,t,J=7.32Hz),4.06(1H,d,J=3.36Hz),3.95(1H,d,J=5.19Hz),2.27-2.37(4H,m),2.01-2.17(2H,m),1.67-1.82(2H,m),1.39-1.52(18H,m),1.32(6H,t,J=6.56Hz)。LC-MS：[M+H]+C38H49N2O10的分析计算值为693.34；实测值为693.34。
实施例1步骤c
于压力管中在140℃加热实施例1步骤b(9.83g，14.19mmol)及乙酸铵(10.94g，142mmol)于二甲苯(160mL)中的混合物4小时。真空移除挥发性组分且使残余物于CH2Cl2(140mL)与水(100mL)之间分配。用饱和NaHCO3(100mL)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)且真空浓缩。所得粗物质通过(20%至50% EtOAc/Hex；300g柱)纯化，得到呈浅棕色固体状的实施例1步骤c(4.3g)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 11.73(2H,br.s.),7.83(3H,d,J=7.63Hz),7.62-7.76(5H,m),7.27-7.55(2H,m),4.82(2H,br.s.),3.89(2H,br.s.),2.10(6H,d,J=15.26Hz),1.58-1.89(2H,m),1.11-1.52(24H,m)。LC/MS：[M+H]+C38H49N6O4的分析计算值为653.37；实测值为653.60。
替代操作：在80℃加热实施例1步骤b(157g，227mmol)、乙酸铵(332g，4310mmol)及咪唑(54.1g，795mmol)于甲苯(1.2L)中的混合物1小时，同时用氮气吹洗顶部空间。使温度升至85℃且搅拌反应混合物18小时。移除溶剂且使残余物溶解于DCM(2L)中，用水(1L)及饱和NaHCO3(3L)洗涤，接着干燥(MgSO4)，过滤且浓缩。将残余物溶解于MeOH(4L)中，浓缩至约900mL且在室温静置。在2小时之后，通过过滤收集沉淀的固体，用MeOH洗涤且干燥，产生白色固体。自甲醇重结晶此物质(溶解于4L中，接着减少至约0.9L)且干燥，得到呈白色固体状的实施例1步骤c(99.5g)。来自母液的粗化合物通过硅胶色谱(300gSiO2，20%至50%EtOAc/己烷)纯化，产生呈白色固体状的另外产物(13.0g)。
实施例1步骤d
将4NHCl的二噁烷溶液(8.23mL，32.9mmol)逐滴添加至实施例1步骤c(4.3g，6.6mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液中，且在室温搅拌反应混合物3小时。真空移除挥发性组分，得到呈黄色固体状的实施例1步骤d的盐酸盐(3.6g)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm10.55(2H,br.s.),9.73(2H,br.s.),8.12-8.26(2H,m),8.03(4H,d,J=8.03Hz),7.92(4H,d,J=6.02Hz),5.07(2H,m,J=7.53Hz),3.82(2H,br.s.),2.53-2.65(4H,m),2.27(2H,dd,J=12.42,6.40Hz),1.85-1.99(2H,m),1.45(6H,d,J=6.27Hz)。LC/MS：[M+H]+C28H33N6的分析计算值为453.28；实测值为453.21。
以上脱除保护基的产物的纯度可通过应用以下重结晶操作来提高：在60℃搅拌下经15分钟通过加料漏斗将2-丙醇(242mL)添加至实施例1步骤d(60.5g，HPLC纯度为98.9%)于水(121mL)中的溶液中，同时维持内部温度在50℃与60℃之间。再搅拌溶液5分钟，移除加热套且在环境温度搅拌混合物过夜。通过过滤收集沉淀的固体，用2-丙醇洗涤且在室内真空下干燥过夜，得到HPLC纯度为99.7%的黄色固体(54.4g)(柱：BEH C18150mm(L)×2.1mm(ID)，1.7μm，移动相：A：含0.05% TFA的水；B：含0.05% TFA的ACN)。KF15.3重量%(6.0mol H2O)。
实施例1
将HATU(1.60g，4.21mmol)添加至实施例1步骤d的盐酸盐(1.2g，2.0mmol)、Cap-1(1.01g，4.11mmol)及DIEA(2.1mL，12mmol)于DMF(20mL)中的溶液中，且在室温搅拌所得黄色溶液3小时。混合物用EtOAc(75mL)稀释，且用水(100mL)洗涤。水层用EtOAc(75mL)反萃取，且合并的有机层用50%饱和NaHCO3水溶液(100mL)、水(100mL)及盐水(100mL)洗涤。接着干燥(无水MgSO4)，过滤且浓缩。剩余残余物用CH3OH稀释且进行反相HPLC纯化：溶剂A：5% MeCN/95%水/10nM NH4OAc；溶剂B：95% MeCN/5%水/10nM NH4OAc；柱：Sunfire制备性C18 50mm×300mm 10μ；波长：220nM；流速：150ml/min；梯度：经25分钟0%B至70% B，保持时间为5分钟。真空浓缩，产生呈灰白色泡沫状的(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6S)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯(实施例1)(1.2g)。自EtOAc/石油醚结晶得到无定形灰白色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)(TFA盐)δ7.92(br.s.,8H),7.59(d,J=7.9Hz,2H),5.03(t,J=8.5Hz,2H),4.69-4.60(m,2H),4.00(t,J=8.4Hz,2H),3.55(s,6H),3.36(br.s.,1H),3.33-3.26(m,2H),3.21(br.s.,2H),2.37(br.s.,1H),2.26(d,J=11.3Hz,1H),1.95-1.81(m,3H),1.65(d,J=10.7Hz,2H),1.48(d,J=6.4Hz,6H),1.28-1.23(m,4H),1.10-0.99(m,16H),0.90-0.75(m,4H)。
LC/MS：[M+H]+C50H67N8O8的分析计算值为907.51；实测值为907.8。在以下LC条件下Rt=3.99分钟且均质度指数>95%：柱：Phenomenex-Luna2.0×50mm 3μm；起始B%=0；最终B%=100；梯度时间=10分钟；流速=4mL/Min；波长=220；溶剂A=H2O:ACN 95%:5%并含有10mm乙酸铵；溶剂B=H2O:ACN 5%:95%并含有10mm乙酸铵。
实施例2
(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
将HATU(63.6mg，0.167mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸(Cap-2)(41mg，0.17mmol)及实施例1步骤d的盐酸盐(45.5mg，0.076mmol)于DMF(0.9mL)及DIPEA(0.11mL，0.61mmol)中的经搅拌溶液中。在室温搅拌反应混合物4小时，接着在氮气流下浓缩过夜。将残余物溶解于MeOH中，过滤且通过制备性HPLC(PhenomenexLuna C18(2)100×30mm，10微米；MeOH/水)纯化，得到呈浅黄色固体状的(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯的TFA盐(实施例2)(62.5mg)。1H NMR指示存在旋转异构体的混合物；对于主要旋转异构体：1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ8.02-7.93(m,3H),7.88(brs,7H),5.18(dd,J=10.7,7.2Hz,2H),4.77(五重峰，J=6.6Hz,2H),4.27-4.17(m,2H),4.15(d,J=9.3Hz,2H),3.72-3.66(m,2H),3.67(s,6H),2.72-2.50(m,2H),2.48-2.16(m,6H),1.99(dd,J=12.2,5.6Hz,2H),1.76-1.59(m,2H),1.57(d,J=6.5Hz,6H),1.52-1.40(m,2H),1.30(dd,J=9.7,6.7Hz,2H),1.22(d,J=6.8Hz,6H),1.06(d,J=6.0Hz,6H),0.97(表观四重峰,J=12.0Hz,2H)。LC-MS保留时间为3.84分钟；m/z905.38[M-H]-。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5% MeOH/95% H2O/10mM乙酸铵且溶剂B为5%H2O/95% MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
或者，实施例2可如下制备：
在室温搅拌(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸(Cap-2)(25.1g，91.0mmol)、2-羟基吡啶1-氧化物(10.12g，91mmol)及EDC(19.0g，99.0mmol)于DMSO(400mL)中的混合物1小时。向此溶液中添加实施例1步骤d(盐酸盐；29.2g，41.4mmol)且用水/冰浴冷却所得黄色溶液至10℃。接着将i-Pr2EtN(26.7g，207mmol)添加至反应混合物中，且添加完成后，移除冰浴。在环境温度搅拌反应混合物25.5小时，之后通过倾入冰(1600g)及水(400mL)混合物中淬灭。在环境温度搅拌混合物3小时。经布赫纳漏斗(Bunchner funnel)通过过滤收集白色固体，接着在室内真空下用通过过滤漏斗上方的氮气流干燥过夜，得到湿润固体(124g)。将湿润固体溶解于DCM(500mL)中，用水(3×250mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且浓缩，得到浅棕色固体(39.5g)。将此物质与来自另一批的类似物质合并(总计44.4g)，且通过色谱使用ISCO装置(2×330g硅胶，0%至30%MeOH/DCM)纯化，得到呈棕色固体状的实施例-2(38.1g)，HPLC纯度为98.6%。如下使物质脱色：将43.1g物质溶解于EtOH(500mL)中，接着用活性炭(8.6g)处理。在50℃加热混合物1小时，通过过滤移除活性炭(3层滤纸)且再用EtOH(300mL)冲洗滤饼。蒸发滤液至干燥且用温水浴真空干燥，得到灰白色固体(43.0g)。产物可通过利用SFC规程进一步纯化：
SFC纯化条件：
处理量：      1.2g/h
每次注射量    30mg
柱：          PrincetonCN，25×3cm，5μ
柱温度：      45℃
流速：        200mL/min
移动相：      CO2/[MeOH/DCM=1:1(以v/v计)]=80/20
注射体积：    2.5mL(12mg/mL)
注射模式：    叠层式(注射/运行时间(分钟)=1.5/3.2)
检测器波长：  316nm
样品溶剂：    CH3OH/DCM=1:1(v/v)
实施例3
((3-甲基-联苯-4,4’-二基)二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
实施例3步骤a
在室温向4-溴-2-甲基苯甲酸(10g，46.5mmol)于DMF(150mL)中的溶液中依序添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐(5.44g，55.8mmol)、HOBT(8.55g，55.8mmol)。接着依序添加EDC(10.7g，55.8mmol)、DIPEA(24.4mL，140mmol)且在室温搅拌反应混合物12小时。反应混合物接着用EtOAc(150mL)稀释，用水(3×250mL)及盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且真空浓缩，得到粗实施例3步骤a(9.5g)，其以原样用于下一步骤。1H NMR(CDCl3,δ=7.26ppm,400MHz):δ7.37(d,J=1.6Hz,1H),7.34(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),7.14(d,J=8.0Hz,1H),3.47(s,3H),3.30(s,3H),2.31(s,3H)。LC/MS：[M+H]+C10H13 81BrNO2的分析计算值为260.01；实测值为260.0。
实施例3步骤b
将实施例3步骤a(9.5g，36.8mmol)溶解于乙醚(150mL)中且冷却至0℃。接着经10分钟逐滴添加碘化甲基镁(3.0M乙醚溶液，24.54mL，73.6mmol)。在40℃搅拌反应混合物6小时，接着达到室温且搅拌12小时。反应混合物冷却至0℃，用冰接着用1.5N HCl(50mL)淬灭。分离有机层且水层用甲基叔丁基醚(2×100mL)萃取，经Na2SO4干燥且减压浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶，60至120，EtOAc:石油醚，2:98)纯化，得到呈淡黄色液体状的实施例3步骤b(6.25g)。1H NMR(CDCl3,δ=7.26ppm,400MHz):δ7.55(d,J=8.0Hz,1H),7.41(s,1H),7.40(d,J=8.0Hz,1H),2.55(s,3H),2.50(s,3H)。
实施例3步骤c
将4-乙酰苯基硼酸(5.39g，32.9mmol)添加至含有实施例3步骤b(7.0g，32.9mmol)/MeOH(75.0mL)的密封管中且用氮气吹洗反应混合物10分钟。接着依序添加K2CO3(9.08g，65.7mmol)、Pd(Ph3P)4(1.139g，0.986mmol)，且再用氮气吹洗反应混合物10分钟。将反应混合物加热至75℃维持12小时。接着减压浓缩反应混合物且残余物用EtOAc(100mL)稀释，且用水(2×100mL)、盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。残余物通过combiflash(Silicycle，SiO2，10%至15%EtOAc/石油醚)纯化，得到呈白色固体状的实施例3步骤c(6.5g)。1HNMR(CDCl3,δ=7.26ppm,400MHz):δ8.06-8.04(m,2H),7.81(d,J=8.0Hz,1H),7.72-7.70(m,2H),7.54-7.49(m,2H),2.65(s,3H),2.63(s,6H)。
实施例3步骤d
在10℃将溴(1.12mL，21.8mmol)(用10mL二噁烷稀释)缓慢(经10分钟)添加至实施例3步骤c(2.75g，10.90mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液中，且在室温搅拌混合物2小时。用10%NaHCO3(25mL)淬灭反应混合物且用DCM(50mL)萃取。经Na2SO4干燥有机相且减压浓缩，得到粗实施例3步骤d(5.0g)，其未经纯化即以原样用于下一步骤。LC/MS：[M+H]+C17H15 79/81Br2O2的分析计算值为410.94；实测值为411.0。
实施例3步骤e
在0℃向粗实施例3步骤d(5.1g，12mmol)于乙腈(75mL)中的溶液中依序添加(2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-甲酸(实施例1步骤a)(5.70g，24.9mmol)、DIPEA(8.69mL，49.7mmol)。10分钟后，温度升高至室温且搅拌2小时。接着用EtOAc(100mL)稀释反应混合物，且用10%NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。残余物通过combiflash(Silieyele，SiO2，25%至30% EtOAe/石油醚)纯化，得到呈淡黄色油状的实施例3步骤e(5.8g)。1H NMR(CDCl3,δ=7.26ppm,400MHz):δ8.00(表观bd,2H),7.71(表观d,3H),7.53-7.51(m,2H),5.61-5.34(m,2H),5.29-5.04(m,2H),4.51-4.36(m,2H),4.09-3.91(m,2H),2.59(s,3H),2.35-2.21(m,4H),2.15-2.04(m,2H),1.80-1.63(m,2H),1.47/1.44(s,18H),1.35-1.27(m,6H)。LC/MS：[M-H]-C39H49N2O10的分析计算值为705.35；实测值为705.30。
实施例3步骤f
向实施例3步骤e(5.6g，7.92mmol)于二甲苯(75mL)中的溶液中添加NH4OAc(12.21g，158mmol)，且用氮气吹洗反应混合物10分钟。在130℃加热18小时后，使反应混合物冷却至室温且减压移除挥发性组分。接着用EtOAc(100mL)稀释反应混合物，且用10%NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。残余物通过combiflash(Redi Sep，C-18柱，30%至40%乙腈:10mM碳酸氢铵)纯化，得到呈淡黄色固体状的实施例3步骤f(2.3g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.50ppm,400MHz):δ12.27/12.0/11.77/11.71(s,2H),7.92-7.63(m,5H),7.58-7.47(m,3H),7.24(brs,1H),4.90-4.75(m,2H),3.92-3.84(m,2H),2.54(s,3H),2.20-2.01(m,6H),1.73-1.65(m,2H),1.48-1.12(m,24H)。LC/MS：[M-H]-C39H49N6O4的分析计算值为665.39；实测值为665.4。
实施例3步骤g
向实施例3步骤g(1.55g，2.32mmol)于MeOH(10mL)中的溶液中添加HCl/MeOH(4N，58.1mL)且在室温搅拌2小时。真空移除挥发性组分，且残余物与无水DCM(3×25mL)共蒸发。使所得固体曝露于高真空，得到呈淡黄色固体状的实施例3步骤g的盐酸盐(1.3g)。1HNMR(MeOD,δ=3.34ppm,400MHz):δ8.06(br s,1H),7.98(d,J=8.4Hz,2H),7.90(d,J=8.4Hz,2H),7.86(br s,1H),7.78(brs,1H),7.74(d,J=8.4Hz,1H),7.71(d,J=8.4Hz,1H),5.27-5.20(m,2H),4.04-4.00(m,2H),2.80-2.67(m,4H),2.59(s,3H),2.55-2.46(m,2H),2.15-2.06(m,2H),1.60(d,J=6.4,6H)。LC/MS：[[M+H]+C29H35N6的分析计算值为467.28；实测值为467.2。
实施例3
将HATU(60.5mg，0.159mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-(甲氧羰基氨基)乙酸(Cap-2)(39mg，0.16mmol)及实施例3步骤g的盐酸盐(44.3mg，0.072mmol)于DMF(0.9mL)及DIPEA(0.10mL，0.58mmol)中的经搅拌溶液中。在室温搅拌反应混合物2小时且在氮气流下浓缩过夜。残余物用MeOH稀释，过滤且通过制备性HPLC(Phenomenex LunaC18(2)100×30mm，10微米；MeOH/水，含TFA缓冲液)纯化，得到呈灰白色固体状的((3-甲基-联苯-4,4’-二基)二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯的TFA盐(实施例3)(60.2mg)。1HNMR(400MHz,MeOH-d4)δ8.01-7.84(m,5H),7.78-7.54(m,4H),5.75(d,J=6.0Hz,0.4H),5.19(ddd,J=10.7,6.9,4.0Hz,1.6H),4.84-4.72(m,2H),4.36-4.12(m,4H),3.85-3.58(m,8H),2.69-1.95(m,13H),1.75-1.40(m,10H),1.37-1.02(m,14H),0.96(表观q,J=12.2Hz,2H)。LC-MS保留时间为4.050分钟；m/z461.31[1/2M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的ShimadzuLC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%水/10mM乙酸铵且溶剂B为5%水/95% MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
实施例4
((3-氟-联苯-4,4’-二基)二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
实施例4步骤a
在冰水浴中在0℃向1-(4-溴-2-氟苯基)乙酮(5.0g，23mmol)于二噁烷(150mL)及乙醚(150mL)中的溶液中逐滴添加溴(1.18mL，23.0mmol)。搅拌反应混合物1小时，使其升温至室温且搅拌16小时。使混合物于EtOAc(50mL)与饱和NaHCO3(50mL)之间分配，且有机层用水洗涤且经Na2SO4干燥。真空蒸发挥发性组分，且真空干燥固体过夜，得到呈白色固体状的实施例4步骤a(6.94g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.87-7.79(m,2H),7.62-7.60(m,1H),4.84(s,2H)。
实施例4步骤b
向实施例4步骤a(2.58g，8.72)及(2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-甲酸(2.00g，8.72mmol)于乙腈(50mL)中的溶液中添加DIEA(2.285mL，13.08mmol)，在室温搅拌混合物64小时。真空移除溶剂且使残余物于EtOAc(40mL)与水(30mL)之间分配。有机层用饱和NaHCO3及盐水洗涤，用Na2SO4干燥且真空蒸发，得到呈黄色固体状的实施例4步骤b(3.8g)。1HNMR(CDCl3,400MHz):7.87(m,1H),7.44(m,2H),5.42-5.09(m,2H),4.53-4.40(m,1H),4.10-3.95(m,1H),2.31(m,2H),2.09(m,1H),1.75(m,1H),1.49-1.46(两个单峰，9H),1.33(m,3H)。LC/MS:[M+Na]+C19H24BrNNaO5的分析计算值为466.06；实测值为466.03。
实施例4步骤c
向含有实施例4步骤b(3.8g，8.6mmol)于二甲苯(40mL)中的溶液的压力管中添加乙酸铵(6.59g，86mmol)且对反应容器加盖且在140℃加热6小时。真空蒸发挥发性组分且使残余物于DCM(80mL)与水(50mL)之间分配。分离有机层且用饱和NaHCO3洗涤且用Na2SO4干燥。真空移除溶剂产生红色油状物，通过快速色谱(0%至40% EtOAc/己烷)纯化得到呈棕色固体状的实施例4步骤c(2.3g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.98(表观t,J=8.4Hz,1H),7.65(dd,J=11,1.9Hz,1H),7.45(dd,J=8.3,2,1H),7.36(m,1H),4.85(m,1H),3.90(m,1H),2.15-2.07(m,3H),1.73(m,1H),1.40-1.17(m,12H)。LC/MS：[M+Na]+C19H23 79BrFN3NaO2的分析计算值为446.09；实测值为446.00。
实施例4步骤d
向2-溴-1-(4-溴苯基)乙酮(2.425g，8.72mmol)及(2S,5S)-1-(叔丁氧羰基)-5-甲基吡咯烷-2-甲酸(2g，8.72mmol)于乙腈(50mL)中的溶液中添加DIEA(1.524mL，8.72mmol)，且在室温搅拌混合物16小时。真空移除溶剂且使残余物于EtOAc(40mL)与水(30mL)之间分配。有机相用饱和NaHCO3及盐水洗涤，且用Na2SO4干燥。真空移除挥发性组分，得到呈浅黄色固体状的实施例4步骤d(1.74g)，其未经进一步纯化即使用。1HNMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.95-7.90(m,2H),7.81(m,1H),7.79(m,1H),5.63-5.44(m,2H),4.36(m,1H),3.99(m,1H),2.27(m,1H),2.09(m,2H),1.63(m,1H),1.41-1.37(两个单峰，9H),1.19(m,3H)。LC/MS：[M+Na]+C19H24BrNNaO5的分析计算值为448.07；实测值为448.06。
实施例4步骤e
向含有实施例4步骤d(3.4g，8.0mmol)于二甲苯(40mL)中的溶液的压力管中添加乙酸铵(6.15g，80mmol)，且在140℃加热混合物6小时。真空移除挥发性组分，使残余物小心于DCM(60mL)与饱和NaHCO3(30mL)之间分配，且分离有机层且用Na2SO4干燥。真空移除溶剂，得到红色固体，通过快速色谱(5%至50%EtOAc/己烷)纯化得到呈浅棕色固体状的实施例4步骤e(2.65g)。1HNMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.73-7.71(m,2H),7.59-7.50(m,3H),4.80(m,1H),3.89(m,1H),2.10(m,3H),1.71(m,1H),1.40-1.17(m,12H)。LC/MS：[M+Na]+C19H24BrN3NaO2的分析计算值为428.09；实测值为428.07。
实施例4步骤f
向实施例4步骤e(2.64g，6.50mmol)及4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-联(1,3,2-二氧硼杂环戊烷)(3.30g，13.0mmol)于二噁烷(40mL)中的溶液中添加乙酸钾(1.594g，16.24mmol)。混合物通过用氮气鼓泡除气10分钟，添加Pd(Ph3P)4(0.375g，0.325mmol)且再继续除气15分钟。接着密封反应容器且在80℃加热16小时。真空蒸发挥发性组分且使残余物于DCM(100mL)与半饱和NaHCO3(50mL)之间分配。分离有机层，用Na2SO4干燥且真空蒸发，得到红色粗油状物，通过快速色谱(10%至90%EtOAc/己烷)纯化。获得呈黄色泡沫状的实施例4步骤f(2.7g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.77(d,J=8.3Hz,2H),7.64-7.53(m,3H),4.80(m,1H),3.88(m,1H),2.09(m,3H),1.73(m,1H),1.43-1.08(m,24H)。LC/MS：[M+H]+C25H37BrBN3O4的分析计算值为454.29；实测值为454.23。
实施例4步骤g
向含有实施例4步骤f(2.70g，5.96mmol)及实施例4步骤c(2.30g，5.42mmol)于DME(70mL)中的溶液的压力管中添加水(17.50mL)及碳酸氢钠(2.27g，27.1mmol)。混合物通过用氮气鼓泡除气15分钟，且添加Pd(Ph3P)4(0.313g，0.271mmol)且再继续除气15分钟。密封反应容器且在80℃加热15小时。真空蒸发溶剂且使残余物于DCM(100mL)与水(50mL)之间分配。分离有机层，用Na2SO4干燥且真空移除挥发性组分，且所得红色粗固体通过快速色谱(30%至100%EtOAc/己烷)纯化。获得呈黄色固体状的实施例4步骤g(1.95g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):8.10(m,1H),7.87-7.71(m,4H),7.61-7.55(m,3H),7.37(m,1H),4.85(m,2H),3.91(m,2H),2.11(m,6H),1.76(m,2H),1.42-1.08(m,24H).LC/MS：[M+H]+C35H48FN6O4的分析计算值为671.37；实测值为671.35。
实施例4步骤h
向实施例4步骤g(1.95g，2.91mmol)于二噁烷(10mL)中的悬浮液中添加4NHCl的二噁烷溶液(9.72mL，320mmol)，且在室温搅拌混合物6小时。添加甲醇(1mL)且继续搅拌1小时。真空移除挥发性组分且真空干燥残余物过夜。取得呈黄色固体状的实施例4步骤h的盐酸盐(1.7g)。1HNMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):10.34/10.29/9.43/9.08(4个宽单峰，约4H),8.16(t,J=8.3Hz,1H),8.10(brs,1H),8.00(d,J=8.3Hz,2H),7.92(d,J=8.3Hz,2H),7.78-7.72(m,3H),4.99-4.89(m,2H),3.80(m,2H),2.53-2.42(m,4H),2.25(m,2H),1.87(m,2H),1.44(d,J=6.5,3H),1.43(d,J=6.5,3H)。LC/MS：[M+H]+C28H32FN6的分析计算值为471.27；实测值为471.17。
实施例4
将HATU(59.4mg，0.156mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸(Cap-2)(38.3mg，0.156mmol)及实施例4步骤h的盐酸盐(43.8mg，0.071mmol)于DMF(0.9mL)及DIPEA(0.10mL，0.57mmol)中的经搅拌溶液中。在室温搅拌反应溶液2小时且在氮气流下浓缩过夜。将残余物溶解于MeOH(3mL)中，过滤且通过制备性HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30mm，10微米；MeOH/水，含TFA缓冲液)纯化，得到呈灰白色固体状的((3-氟-联苯-4,4’-二基)二(1H-咪唑-4,2-二基((2S,5S)-5-甲基-2,1-吡咯烷二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯的TFA盐(实施例4)(67.2mg)。1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ8.10-7.84(m,7H),7.77-7.69(m,2H),5.78-5.71(m,0.4H),5.19(td,J=10.6,7.2Hz,1.6H),4.83-4.74(m,2H),4.36-4.12(m,4H),3.85-3.62(m,8H),2.72-1.95(m,10H),1.76-1.40(m,10H),1.35-1.02(m,14H),0.96(表观q,J=12.2Hz,2H)。LC-MS保留时间为4.031min；m/z463.28[1/2M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%水/10mM乙酸铵且溶剂B为5%水/95%MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
实施例5
(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((1R,3S,5R)-5-甲基-2-氮杂二环[3.1.0]己-3,2-二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
实施例5步骤a
以上酯是根据Tetrahedon Letters,2003,3203-3205中所述的操作，由(S)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-甲酯制备成非对映异构混合物。
实施例5步骤b
经10分钟向实施例5步骤a(4.75g，18.5mmol)的冷却(-50℃)甲苯(45mL)溶液中逐滴添加三乙基氢化硼锂(19.20mL 1M THF溶液，19.20mmol)。添加休尼格氏碱(Hunig's base)(13.6mL，78mmol)且搅拌10分钟；添加呈固体状的DMAP(0.122g，0.997mmol)，搅拌15分钟；且经15分钟逐滴添加三氟乙酸酐(2.98mL，21.1mmol)，移除冷却浴，且继续搅拌4小时，同时使其升温至室温。反应混合物用水(50mL)、饱和NaCl(30mL)洗涤，且真空浓缩有机相。所得粗物质用快速色谱(8%至60% EtOAc/己烷)纯化，得到呈黄色油状的实施例5步骤b(2.85g)。1H NMR(CDCl3,400MHz):6.36(s,0.5H),6.25(s,0.5H),4.70-4.57(m,1H),3.78(s,3H),2.96(m,1H),2.54(m,1H),1.70(s,3H),1.50(s,4.5H),1.44(s,4.5H)。
实施例5步骤c
实施例5步骤c.1     实施例5步骤c.2
经20分钟将二乙基锌(1.1M甲苯溶液、59.1mL，65.0mmol)逐滴添加至实施例5步骤b(5.23g，21.7mmol)的冷却(-23℃)甲苯(60mL)溶液中且搅拌10分钟。经10分钟逐滴添加氯碘甲烷(9.44mL，130mmol)，且在-21℃搅拌反应混合物16小时。将饱和NaHCO3(60mL)添加至反应混合物中，移除冷却浴，且搅拌混合物10分钟。接着过滤，且用甲苯(50mL)洗涤滤饼。分配滤液，且用Na2SO4干燥有机层，且真空浓缩。所得粗物质用快速色谱(2%至10%EtOAc/己烷)纯化，得到实施例5步骤c.1(第一洗脱物；无色油状物；2.88g)及实施例5步骤c.2(第二洗脱物；无色油状物；1.01g)。相对立体化学指定是基于NOE研究进行。实施例5步骤c.1：1H NMR(CDCl3,400MHz):4.65-4.52(m,1H),3.72(s,3H),3.28-3.17(m,1H),2.44-2.32(m,1H),2.16-2.10(m,1H),1.51-1.42(两个单峰，9H),1.24(s,3H),1.07(m,1H),0.69-0.60(m,1H)。实施例5步骤c.2：1H NMR(CDCl3,400MHz):4.0(m,1H),3.76(s,3H),3.32-3.16(m,1H),2.43(m,1H),2.01(m,1H),1.44(s,9H),1.35(s,3H),0.76-0.66(m,2H)。
实施例5步骤d
实施例5步骤d.1      实施例5步骤d.2
向实施例5步骤c.1(2.88g，11.3mmol)于乙醇(20mL)中的溶液中添加LiOH(0.324g，13.5mmol)于水(10.00mL)中的溶液，且在室温搅拌反应混合物6小时。真空移除大部分挥发性组分且使残余物于水(20mL)与乙醚(20mL)之间分配。于冰水浴中冷却水层，用1N HCl酸化至pH值范围2，且用EtOAc(30mL，4次)萃取。用Na2SO4干燥合并的有机相且真空蒸发，得到呈粘性固体状的实施例5步骤d.1(2.55g)。1H NMR(CDCl3,400MHz):4.64(m,1H),3.25(表观s,1H),2.70-2.40(m,1H),2.14(m,1H),1.54-1.44(m,9H),1.27(s,3H),1.10-0.80(m,1H),0.67(m,1H)。实施例5步骤d.2是由实施例5步骤c.2类似地制备。1HNMR(CDCl3,400MHz):4.13(表观brs,1H),3.06(表观brs,1H),2.55/2.41(重叠表观brs,2H),1.51(s,9H),1.27(s,3H),0.76(表观t,J=5.6Hz,1H),0.60(表观brs,1H)。
实施例5步骤e
向实施例5步骤d.2(1.09g，4.52mmol)及1,1'-(联苯-4,4'-二基)二(2-溴乙酮)(0.869g，2.19mmol)于乙腈(40mL)中的悬浮液中添加DIEA(0.789mL，4.52mmol)，且在室温搅拌混合物4小时。真空移除挥发性组分且使残余物于EtOAc(70mL)与水(50mL)之间分配。有机层用饱和NaHCO3(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，真空蒸发且真空干燥，得到呈白色泡沫状的实施例5步骤e(1.54g)。1H NMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):8.13(d,J=8.3Hz,4H),7.99(d,J=8.5Hz,4H),5.70-5.54(m,4H),4.17(m,2H),3.13-3.11(m,2H),2.58-2.46(m,2H),2.19(m,2H),1.42-1.37(两个单峰，18H),1.24(s,6H),0.76-0.70(m,4H)。LC/MS：[M+Na]+C40H48N2NaO10的分析计算值为739.32；实测值为739.52。
实施例5步骤f
向含有实施例5步骤e(1.54g，2.15mmol)于二甲苯(40mL)中的溶液的压力管中添加乙酸铵(1.656g，21.48mmol)，且对容器加盖且在140℃加热5小时。真空移除挥发性组分且使残余物小心于DCM(50mL)与水(50mL)之间分配，同时添加足够饱和NaHCO3溶液，以便在分配结束时水相为中性或碱性。用Na2SO4干燥有机层，真空蒸发且所得粗物质通过快速色谱(10%至100%EtOAc/己烷)纯化，得到呈棕色固体状的实施例5步骤f(0.65g)。1HNMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):7.84-7.65(m,8H),7.55-7.54(m,1.7H),7.32-7.30(m,0.3H),4.60(m,2H),3.20(m,2H),2.48-2.43(m,2H),2.12(m,2H),1.45-1.07(m,24H),0.77(m,2H),0.69(m,2H)。LC/MS：[M+H]+C40H49N6O4的分析计算值为677.38；实测值为677.45。
实施例5步骤g
向实施例5步骤f(0.65g，0.960mmol)于二噁烷(5mL)中的溶液中添加4NHCl的二噁烷溶液(5.84mL，192mmol)，且在室温搅拌混合物6小时。真空移除挥发性组分，且真空干燥过夜，得到呈棕色固体状的实施例5步骤a的盐酸盐(0.6g)。1HNMR(DMSO-d6,δ=2.5ppm,400MHz):10.5-10(br s,约3.2H),7.99(br s,2H),7.95(d,J=8.5,4H),7.85(d,J=8.5Hz,4H),4.76(m,2H),3.18(m,2H),2.61-2.46(m,4H;与溶剂信号重叠),1.35(s,6H),1.30(m,2H),0.82(表观brt,J=7.1,2H)。LC/MS：[M+H]+C30H33N6的分析计算值为477.28；实测值为477.22。
实施例5
将HATU(68.2mg，0.179mmol)添加至(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸(Cap-2)(44mg，0.18mmol)及实施例5步骤g的盐酸盐(50.8mg，0.083mmol)于DMF(0.8mL)及DIPEA(0.12mL，0.67mmol)中的经搅拌溶液中。在室温搅拌反应溶液3小时且在氮气流下浓缩过夜。将残余物溶解于MeOH(约2.5mL)中，过滤且通过制备性HPLC(Phenomenex Luna C18(2)100×30mm，10微米；MeOH/水，含TFA缓冲液)纯化，得到呈黄色固体状的(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基((1R,3S,5R)-5-甲基-2-氮杂二环[3.1.0]己-3,2-二基)((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯的TFA盐(实施例5)(49.5mg)。1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ7.93(s,2H),7.90-7.82(m,8H),5.02(t,J=8.5Hz,2H),4.48(d,J=8.0Hz,2H),4.26-4.18(m,2H),3.80-3.71(m,2H),3.68(s,6H),3.60(d,J=3.3Hz,2H),2.77(dd,J=13.4,9.2Hz,2H),2.28(dd,J=13.1,7.8Hz,4H),1.56-1.44(m,6H),1.42(s,6H),1.25(d,J=6.8Hz,6H),1.09(d,J=6.0Hz,6H),1.06-0.91(m,6H)。LC-MS保留时间为3.900分钟；m/z466.29[1/2M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为5%MeOH/95%水/10mM乙酸铵且溶剂B为5%水/95%MeOH/10mM乙酸铵。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
实施例6
(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基(2S)-2,1-吡咯烷二基((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯
将HATU(81mg，0.212mmol)添加至4,4'-二(2-((S)-吡咯烷-2-基)-1H-咪唑-5-基)-1,1'-联苯的盐酸盐(WO2008/021927中制备)(56.2mg，0.099mmol)及(S)-2-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-((甲氧羰基)氨基)乙酸(Cap-2)(52mg，0.21mmol)于DMF(1.0mL)及DIPEA(0.14mL，0.79mmol)中的经搅拌溶液中。在室温搅拌反应溶液3小时，接着在氮气流下浓缩。将残余物溶解于MeOH(约5mL)中，过滤且通过制备性HPLC(Phenomenex LunaC18(2)100×30mm，10微米；MeOH/水，含TFA缓冲液)纯化，得到呈浅黄色固体状的(联苯-4,4’-二基二(1H-咪唑-4,2-二基(2S)-2,1-吡咯烷二基((1S)-1-((2R,6R)-2,6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)-2-氧代-2,1-乙二基)))二氨基甲酸二甲酯的TFA盐(实施例6)(83mg)。1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ7.96(s,2H),7.91-7.84(m,8H),5.26(t,J=7.5Hz,2H),4.24-4.09(m,6H),3.93-3.84(m,2H),3.74-3.68(m,2H),3.67(s,6H),2.63-2.55(m,2H),2.39-2.12(m,8H),1.57(d,J=11.0Hz,2H),1.51-1.41(m,2H),1.32-1.25(m,2H),1.22(d,J=7.0Hz,6H),1.05(d,J=6.0Hz,6H),0.98(表观q,J=12.3Hz,2H)。LC-MS保留时间为1.660分钟；m/z879.8[M+H]+。经装备有Phenomenex-Luna 3μ C18 2.0×50mm柱的Shimadzu LC-10AS液相色谱仪使用SPD-10AV UV-Vis检测器在220nM检测器波长下记录LC数据。洗脱条件采用：流速：0.8mL/min，梯度：100%溶剂A/0%溶剂B至0%溶剂A/100%溶剂B，梯度时间：4分钟，保持时间：1分钟，及分析时间：5分钟，其中溶剂A为10%乙腈/90%水/0.1%三氟乙酸且溶剂B为10%水/90%乙腈/0.1%三氟乙酸。使用LC Micromass Platform在电喷雾模式下测定MS数据。
生物活性
在本发明中使用HCV复制子分析，且如共同拥有的PCT/US2006/022197及O'Boyle等人，Antimicrob Agents Chemother.2005年4月;49(4):1346-53中所述制备、进行及验证。也如商业来源(Apath.com)所描述，使用结合有荧光素酶报导体的推荐分析方法。
使用HCV新型复制子细胞及于NS5A区中含有抗性取代的复制子细胞，测试当前所述的化合物族群。测出所述化合物对含有突变的细胞的抑制活性相对于针对野生型细胞的相应抑制效力具有不同程度的降低。因此，本发明化合物可有效抑制HCV NS5A蛋白的功能，且应理解为其组合形式如同先前在申请PCT/US2006/022197及共同拥有的WO04/014852中所述有效。应了解本发明化合物可抑制多种HCV基因型。表2显示本发明的代表性化合物针对HCV基因型1b野生型、HCV基因型1bLV/YH双重抗性突变体、HCV基因型1a及基因型-1aYH单抗性突变体的EC50(有效50%抑制浓度)值。
本发明化合物可通过NS5A抑制作用外加其它机制或通过不同于NS5A抑制作用的机制来抑制HCV。在一个实施方案中，本发明化合物抑制HCV复制子且在另一个实施方案中，本发明化合物抑制NS5A。本发明化合物可抑制含有NS5A序列的多种变异体的多种HCV基因型。
大鼠中静脉内及口服单次给药药物动力学研究
在雄性斯普拉格-道利鼠(Sprague-Dawley rat)(260g至310g)中表征实施例1至实施例6及化合物-A(WO2008/021927)的药物动力学特征(参见表2)。在这些研究中，两组动物(每组N=3)分别通过经颈静脉的静脉内(IV)输注方式(2mg/kg，经10分钟)或通过口服管饲方式(5mg/kg)接受含于100% PEG400或90:5:5PEG400:乙醇:TPGS的媒介物中的化合物。口服给药组中的大鼠禁食过夜。在给药后0.17(仅IV组)、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8及24小时连续取得血液样品。自颈静脉收集血液样品(约0.3mL)至含有K3EDTA的试管中，接着在4℃(1500xg至2000xg)离心获得血浆。血浆样品储存于-20℃直至通过LC/MS/MS分析。
开发一种依序利用液相色谱分离法及串联的质谱检测法(LC/MS/MS)的生物分析方法，用于分析大鼠血浆中化合物。使用所选反应监测法进行检测。在四偶极(quadrupole)1中选择代表前体(M+H)+物质的离子，且用N2碰撞解离，产生特定产物离子，随后通过四偶极3监测。制备雄性大鼠血浆中的标准曲线，且以与测试样品相同的方式处理，产生定量数据。
使用无房室法，通过Kinetica计算药物动力学参数值。计算中不使用低于定量下限(LLOQ)的值。使用线性梯形法则计算曲线下面积(AUC)。
表2

Claims (20)

1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1选自氢、甲基及氟；
R2选自氢及甲基；
R3及R4各为氢；或
R3及R4与它们所连接的碳原子一起形成环丙基环；及
R5选自氢及甲基。
2.如权利要求1的化合物，或其药学上可接受的盐，其中R1为氢。
3.如权利要求1的化合物，或其药学上可接受的盐，其中R1为氟。
4.如权利要求3的化合物，或其药学上可接受的盐，其中：
R2、R3及R4各为氢；及
R5为甲基。
5.如权利要求1的化合物，或其药学上可接受的盐，其中R1为甲基。
6.如权利要求5的化合物，其中：
R2、R3及R4各为氢；及
R5为甲基。
7.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
8.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
9.一种组合物，其包含如权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体。
10.如权利要求9的组合物，其进一步包含一种、两种或三种具有抗HCV活性的其它化合物。
11.如权利要求10的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。
12.如权利要求11的组合物，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、干扰素λ及淋巴细胞样干扰素τ。
13.如权利要求10的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助性T细胞应答发生的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺及金刚乙胺。
14.如权利要求10的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种有效抑制下述靶标的功能，以治疗HCV感染，所述靶标选自：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
15.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者中的HCV感染的药物中的用途。
16.如权利要求15的用途，其还包括在给予如权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予一种、两种或三种具有抗HCV活性的其它化合物。
17.如权利要求16的用途，其中所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。
18.如权利要求17的用途，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、干扰素λ及淋巴细胞样干扰素τ。
19.如权利要求16的用途，其中所述其它化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助性T细胞应答发生的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺及金刚乙胺。
20.如权利要求16的用途，其中所述其它化合物中的至少一种有效抑制下述靶标的功能，以治疗HCV感染，所述靶标选自：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCV NS5A蛋白及IMPDH。
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