CN103275211B - 从鹿茸冻干粉中提取igf-1的方法 - Google Patents
从鹿茸冻干粉中提取igf-1的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从鹿茸冻干粉中提取IGF-1的方法，属于从鹿茸中提取活性成分的方法。取鹿茸冻干粉加入酸性缓冲液提取，所得的提取液以10-30kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩，分离提纯，冷冻干燥。优点在于以鹿茸冻干粉为原料，采用酸性缓冲液进行提取，产率较其他方法可提高2-4倍。纯化时没有采用目前常用的离子交换树脂和葡聚糖凝胶，而是将小分子药物纯化时常用的反相柱层析法应用于IGF-1的分离纯化中，采用酸性的甲醇-水或乙腈-水系统梯度洗脱，结果得到纯度高于90%的IGF-1产品，与之前的IGF-1产品相比，极大地提高了产品的产率和纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鹿茸冻干粉中提取胰岛素样生长因子-1的方法，属于从鹿茸中提取活性成分的方法。
背景技术
鹿茸作为珍贵的药材始载于《神农本草经》,是鹿科动物梅花鹿（Cervus nipponTemminck）或马鹿（Cervus elaphus linnaeus）的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角（中国药典2005年版一部）,性味甘、咸、温，具有生精补髓,养血益阴,强筋健骨,治一切虚损、耳聋的作用（《本草纲目》）。
鹿茸的纵向生长由软骨内骨化产生,在某些鹿种可以达到每日2cm的生长速度,是动物界最快的器官生长速度。随着现代药理学的不断发展,逐渐从鹿茸中发现存在多种生长因子，鹿茸是一个天然的细胞生长因子库,在其生长过程中,成骨细胞、神经细胞、成纤维细胞及上皮细胞的生长同步进行。鹿茸作为鹿体最活跃的生长点贮存大量的生长因子，如胰岛素样生长因子（Insulin Like Growth Factor，IGF）;表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)；神经生长因子（Nerve Growth Factor）；转化生长因子（Transforming Growth Factor）等，它们是鹿茸临床作用的生物化学基础,在临床治疗方面有广阔的前景(崔昊震,尹明浩.鹿茸生长因子的研究现状[J].延边大学医学学报,2006,29(1):70-72)。
IGF有极强的刺激鹿茸生长的作用,在鹿茸顶部非骨化部位存在大量的IGF-1及其受体，王秋玉，王本祥，论鹿茸生长因子[J].中医药学报.2000,28(6):10-12,早在1994年IGF-1即被证实在体外有促进鹿茸细胞增殖的作用(Sadighi M,Haines SR,Skottner A,et al.Effects of insulin like growth factor-Ⅰ(IGF-1)and IGF-Ⅱon the growthof antler cells in vitro[J].J Endocrinol.1994,143(3):461-469),临床应用与鹿茸传统的强筋骨功效,治疗筋骨萎软、骨折、骨质疏松的临床应用相符合，提示鹿茸在这方面的作用,有可能是与其含有的IGF有关。
IGF-1能够显著地阻断神经元发生凋亡(Kenchappa P，Yadav A，Singh G.Rescueof TNFα-inhibited neuronal cells by IGF-I involves Akt and c-Jun Nterminalkinases[J].JNeurosci Res，2004，76（4）：466-474),调节骨骼肌的生长和修复(Gluckman K，Arrhenius-Nyberg V，Saxerhoh H，et al.The role of insulin insulin-like growth factor-Iand growth hormone in counteracting dexamethasone indueed nitrogen wasting in rats.HoFnl Metab Res，1997,1,20-24)，IGF-1是骨生成的强刺激因子，对破骨细胞的前体细胞分化为破骨细胞有促进作用。糖尿病患者的血浆IGF-1水平都较低，Acerini等人[研究证实IGF-1可辅助胰岛素改善胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）病人的病情。在临床上最具诱人前景的可能是应用IGF-1治疗laron型侏儒症患者。患者由于缺乏功能性的GH受体，从而不能对GH起反应。这类病人的IGF-1水平很低，生长缓慢。研究表明，IGF-1可促进对GH不敏感病人的生长(Mccarty M F.Anabolic effects of insulinon bone suggest a role for chromium picolinate in preservation of bone density.MedHypotheses，1995，45,214)。
传统的鹿茸加工过程中，鹿茸要经过热炸、烘干的步骤，对鹿茸中生长因子等蛋白和多肽活性成分破坏较大，而且目前专利文献中IGF-1的产率都不高，通常在4-8μg/g，还不到0.01‰。
发明内容
本发明提供一种从鹿茸冻干粉中提取IGF-1的方法，以解决目前IGF-1产率低的问题。
本发明采取的技术方案是，包括以下步骤：
（1）鹿茸冻干粉的制备：将在-20℃以下冷冻贮藏的鲜鹿茸，锯成小段，并用切片机切成2-3mm厚的薄片，然后将鹿茸片平铺在表面皿中，在-45℃以下，6pa条件下，进行冷冻干燥48h，经冷冻干燥后的鹿茸片用超低温球磨粉碎机粉碎成300目的粉末，在-20℃下贮存待用；
（2）酸性缓冲液超声波提取：取步骤（1）制备的鹿茸冻干粉一定量称重，加入3-5倍体积的酸性缓冲液提取，低温下超声提取20-40分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述步骤提取，共计提取3次，合并3次的提取液；
（3）浓缩：步骤（2）所得的提取液先以10-30kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩，在冰浴下继以10-30kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩；
（4）分离提纯：反相柱层析法，将步骤（3）所得的浓缩液上反相柱，固定相为C18，洗脱程序为：先以水洗脱，继以含有1%～5%三氟乙酸的甲醇-水1：4洗脱，再用含有1%～5%三氟乙酸的甲醇-水1：1洗脱，收集流出液，合并含有IGF-1的部分；或采用制备型高效液相色谱，色谱柱固定相为C8、C18或C4，流动相洗脱程序为：30分钟内由含有1%～5%三氟乙酸的50%乙腈升至90%乙腈的梯度洗脱，收集含有IGF-1的流出液；
（5）冷冻干燥：将步骤（4）所得含有IGF-1的流出液在-20℃下预冷冻，在-40℃至-60℃下进行冷冻干燥。
本发明步骤（2）所述的酸性缓冲溶液是50mM的磷酸盐缓冲液用Tris-HCl调pH2-3。
本发明采用鹿茸冻干粉为原料，提取鹿茸中胰岛素样生长因子IGF-1。为了提高IGF-1的产率，经过多次实验研究，发现采用酸性缓冲液提取可以提高IGF-1的提取率和提取纯度。同时针对纯化IGF-1目前多采用用离子交换树脂和葡聚糖凝胶，但是产率和纯度不高的情况，研究建立反相柱层析的方法分离纯化IGF-1，结果提高了IGF-1的产率，同时也得到IGF-1纯度高达90%以上的产品，填补了国内外在鹿茸中IGF-1标准品方面的空白，使其能够进一步应用于相关新药的研发。整个工艺相对于国外生产人IGF1-1的工艺相比，具有操作简便，成本低的优点，并且适合工艺放大，进行相关标准品和药品的生产。
本发明的优点在于以鹿茸冻干粉为原料，采用酸性缓冲液进行提取，产率较其他方法可提高2-4倍。纯化时没有采用目前常用的离子交换树脂和葡聚糖凝胶，而是将小分子药物纯化时常用的反相柱层析法应用于IGF-1的分离纯化中，采用酸性的甲醇-水或乙腈-水系统梯度洗脱，结果得到纯度高于90%的IGF-1产品，与之前的IGF-1产品相比，极大地提高了产品的产率和纯度。
具体实施方式
实施例1
将在-20℃以下冷冻贮藏的鲜鹿茸，锯成小段，并用切片机切成2-3mm厚的薄片，然后将鹿茸片平铺在表面皿中，在-45℃以下，6pa条件下，进行冷冻干燥48h；经冷冻干燥后的鹿茸片用超低温球磨粉碎机粉碎成300目的粉末，在-20℃下贮存待用；
称取上述冻干粉500g，加入50mM的pH为2.5的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液2000mL，15℃下超声提取30分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置。药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液2000mL,第三次提取加入缓冲液2000mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以20kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为400ml，在冰浴下继以20kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为80ml；
将上步所得的浓缩液上反相柱，固定相为C18，洗脱程序为：先以水洗脱，继以含有3%三氟乙酸的甲醇-水1：4洗脱，再用含有3%三氟乙酸的甲醇-水1：1洗脱，收集流出液，合并含有IGF-1的部分；50ml为一个流份，以反相高效液相法检测下来的每个流份，合并含有IGF-1的组分，-20℃下预冷冻，
在-50℃下进行冷冻干燥,得到IGF-1为6.1mg，高效液相检测纯度为90%。
实施例2
称取实施例1获得的鹿茸冻干粉500g，加入50mM的pH为3的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液1500mL，15℃下超声提取20分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液1500mL,第三次提取加入缓冲液1500mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以30kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为300ml，在冰浴下继以30kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为60ml；
将上步所得的浓缩液上反相柱，固定相为C18，洗脱程序为：先以水洗脱，继以含有1%三氟乙酸的甲醇-水1：4洗脱，再用含有1%三氟乙酸的甲醇-水1：1洗脱，收集流出液，合并含有IGF-1的部分；50ml为一个流份，以反相高效液相法检测下来的每个流份，合并含有IGF-1的组分，-20℃下预冷冻，
在-40℃下进行冷冻干燥,得到IGF-1为6.0mg，高效液相检测纯度为91%。
实施例3
称取实施例1获得的鹿茸冻干粉500g，加入50mM的pH为2的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液2500mL，15℃下超声提取20分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液2500mL,第三次提取加入缓冲液2500mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以10kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为500ml，在冰浴下继以10kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为100ml；
将上步所得的浓缩液上反相柱，固定相为C18，洗脱程序为：先以水洗脱，继以含有5%三氟乙酸的甲醇-水1：4洗脱，再用含有5%三氟乙酸的甲醇-水1：1洗脱，收集流出液，合并含有IGF-1的部分；50ml为一个流份，以反相高效液相法检测下来的每个流份，合并含有IGF-1的组分，-20℃下预冷冻，
在-40℃下进行冷冻干燥,得到IGF-1为6.3mg，高效液相检测纯度为90%。
实施例4
将在-20℃以下冷冻贮藏的鲜鹿茸，锯成小段，并用切片机切成2-3mm厚的薄片，然后将鹿茸片平铺在表面皿中，在-45℃以下，6pa条件下，进行冷冻干燥48h；经冷冻干燥后的鹿茸片用超低温球磨粉碎机粉碎成300目的粉末，在-20℃下贮存待用；
称取上述冻干粉500g，加入50mM的pH为2.5的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液2000mL，15℃下超声提取30分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置。药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液2000mL,第三次提取加入缓冲液2000mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以20kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为400ml，在冰浴下继以20kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为80ml；
以制备型反相高效液相进行分离，高效液相条件为：C18柱；紫外检测器，波长214nm：流速3mL/min；流动相，含有3%三氟乙酸的乙腈-水系统30分钟内由50%升至90%的梯度洗脱:进样量1ml，收集IGF-1的流出部分，合并，
在-20℃下预冷冻，在-40℃下进行冷冻干燥，得到IGF-1为6.2mg，高效液相检测纯度为96%。
实施例5
称取实施例1获得的鹿茸冻干粉500g，加入50mM的pH为3的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液1500mL，15℃下超声提取20分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液1500mL,第三次提取加入缓冲液1500mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以30kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为300ml，在冰浴下继以30kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为60ml；
以制备型反相高效液相进行分离，高效液相条件为：C4柱；紫外检测器，波长214nm：流速3mL/min；流动相，含有1%三氟乙酸的乙腈-水系统，30分钟内由50%升至90%的梯度洗脱:每次进样量5ml，收集IGF-1的流出部分，合并，
在-20℃下预冷冻，在-40℃下进行冷冻干燥，得到IGF-1为6.6mg，高效液相检测纯度为93%。
实施例6
称取实施例1获得的鹿茸冻干粉500g，加入50mM的pH为2的Tris盐酸-磷酸盐缓冲液2500mL，15℃下超声提取20分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述提取步骤，第二次提取加缓冲液2500mL,第三次提取加入缓冲液2500mL，合并3次提取液，
所得的提取液先以10kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩至体积为500ml，在冰浴下继以10kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩至体积为100ml；
以制备型反相高效液相进行分离，高效液相条件为：C8柱；紫外检测器，波长214nm：流速3mL/min；流动相，含有5%三氟乙酸的乙腈-水系统，30分钟内由50%升至90%的梯度洗脱:每次进样量5ml，收集IGF-1的流出部分，合并，
在-20℃下预冷冻，在-40℃下进行冷冻干燥，得到IGF-1为6.3mg，高效液相检测纯度为91%。
试验例1提取IGF-1的缓冲液pH的选择
精密称取鹿茸冻干粉3g，共计5份，分别加入pH为2、3、5、7、10的50mM磷酸盐缓冲液10mL，进行超声提取，提取液浓缩至1-2mL，加入2倍体积甲醇沉淀大分子蛋白，离心（10000rpm，5min），上清液蒸干，残渣加甲醇200μL定容，吸取10μL，进行高效液相色谱检测，实验结果见表1。
表1不同pH缓冲液对IGF-1的提取量
| pH值 | 2 | 3 | 5 | 7 | 10 |
| IGF-1提取量（μg/g） | 10.4 | 8.6 | 1.5 | 1.3 | 3.1 |
由实验结果可知，在酸性条件下，pH2-3的范围内，鹿茸中IGF-1的提取量可达到碱性条件下的3倍多，酸性条件下提取量远远大于碱性条件下提取量。
Claims (1)
1.一种从鹿茸冻干粉中提取IGF‐1的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)鹿茸冻干粉的制备：将在-20℃以下冷冻贮藏的鲜鹿茸，锯成小段，并用切片机切成2-3mm厚的薄片，然后将鹿茸片平铺在表面皿中，在-45℃以下，6pa条件下，进行冷冻干燥48h，经冷冻干燥后的鹿茸片用超低温球磨粉碎机粉碎成300目的粉末，在-20℃下贮存待用；
(2)酸性缓冲液超声波提取：取步骤(1)制备的鹿茸冻干粉一定量称重，加入3-5倍体积的酸性缓冲液提取，所述的酸性缓冲溶液是50mM的磷酸盐缓冲液用Tris‐HCl调pH2-3，低温下超声提取20-40分钟，减压抽滤，滤液于4℃低温放置，药渣重复上述步骤提取，共计提取3次，合并3次的提取液；
(3)浓缩：步骤(2)所得的提取液先以10-30kDa透析袋进行透析，加入聚乙二醇，浓缩，在冰浴下继以10-30kDa的超滤膜在超滤杯中浓缩；
(4)分离提纯：反相柱层析法，将步骤(3)所得的浓缩液上反相柱，固定相为C18，洗脱程序为：先以水洗脱，继以含有1％～5％三氟乙酸的甲醇-水1：4洗脱，再用含有1％～5％三氟乙酸的甲醇-水1：1洗脱，收集流出液，合并含有IGF‐1的部分；或采用制备型高效液相色谱，色谱柱固定相为C8、C18或C4，流动相洗脱程序为：30分钟内由含有1％～5％三氟乙酸的50％乙腈升至含有1％～5％三氟乙酸的90％乙腈的梯度洗脱，收集含有IGF‐1的流出液；
(5)冷冻干燥：将步骤(4)所得含有IGF‐1的流出液在‐20℃下预冷冻，在‐40℃至‐60℃下进行冷冻干燥。
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