CN101525371A - 一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子(igf-1)的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新的从鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF－1)的方法，包括粉碎、超声波提取、高速离心分离、超滤、离子交换层析、超滤、凝胶色谱纯化、超滤、冷冻干燥等步骤，通过提高粉碎程度，提取效率高，收率超过4000ng/g鲜鹿茸。通过在离子层析过中分别采用不同浓度的NaCl/不同pH值的缓冲溶液梯度洗脱，使得IGF－1和其他组分如杂蛋白分离得更彻底，冻干粉中IGF－1含量可达1500－2000ppm；联用凝胶排阻色谱柱纯化，产品纯度达98％以上，可用于药品。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法，属于从鹿茸提取活性物质的技术领域。
背景技术
鹿茸为梅花鹿或马鹿的尚未骨化的幼角，现代药物化学分析表明，其中存在多种生长因子，其中胰岛素样生长因子(IGF-1)有突出的药理作用。
胰岛素样生长因子(IGF-1)是一类促进细胞生长、具有胰岛素样代谢效应的因子，对机体生长和发育起着重要的调节作用，临床上可以用于治疗糖尿病、骨质疏松、周围神经病变、肌肉萎缩性侧索性神经炎等。
传统的鹿茸加工过程中，鹿茸要经过多次煮炸、烘干等步骤，高温使得其中的胰岛素样生长因子(IGF-1)等活性多肽失去活性从而丧失药效。为了保证活性不丧失，并且高效率提取和纯化胰岛素样生长因子(IGF-1)，现有技术报道了如下方法：
中国专利200410053399.6，报道了一种从鲜鹿茸中提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法，包括切片、低温匀浆、超声波处理、高速离心分离、超滤、冷冻干燥等步骤。由于采用的提取溶剂为去离子水，对胰岛素样生长因子(IGF-1)的提取率很低，不适合工业化生产。
中国专利申请200510015619.0，报道了一种利用pH9～12的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液或稀氨水与稀酸配制而成的碱性溶液为提取剂，通过超声波强化浸提、超滤浓缩、去脂、酸解、离子交换层析、第二次超滤和冷冻干燥等步骤提取鲜鹿茸中的IGF-1等活性多肽的方法。据报道，提取一步中IGF-1的提取率可以达到3200～3500ngIGF-1/g鲜鹿茸，而采用去离子水作提取剂，在相同工艺条件下IGF-1的提取率仅为1000ngIGF-1/g鲜鹿茸以下。相比较而言，该方法提取率有了很大提高，但是依然有待进一步提高。此外提取液还需经过去脂、酸解、离子交换层析、第二次超滤和冷冻干燥等繁琐生物步骤才能得到最终的冻干粉，所得到的冻干粉中IGF-1的含量只达到400-1000ppm。
中国专利申请200510015620.3，公开了一种综合提取鲜鹿茸中活性成分的方法，首先利用超临界CO2萃取鲜鹿茸中脂溶性成分，萃取条件是：萃取温度25～35℃，萃取压力20～60MPa，CO2流速10～25kg/h；然后采用超声波强化浸提、超滤浓缩和冷冻干燥技术提取超临界CO2萃余物中的胰岛素样生长因子IGF-1等活性多肽。该方法采用超临界CO2萃取技术，为提取IGF-1等活性多肽进行了脱脂预处理，但是提取IGF-1时依旧采用和中国专利申请200510015619.0相同的pH9～12的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液进行提取，离心分离后的提取率依然保持3200～3500ng IGF-1/g鲜鹿茸的水平。此外，提取后的提取液，只是直接进行了简单的后处理，即超滤浓缩、冻干，没有经过离子交换层析柱，得到的冻干粉中IGF-1的含量显然低于中国专利申请200510015619.0的400-1000ppm。
现有技术中已报道的方法，提取率还可以再提高，且纯度不高，仅可作为化妆品和保健品的原料，不能满足药用的要求(纯度大于98％)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的新方法，可以克服现有技术的不足，提供更高的提取率，并且最终产物冻干粉具有更高的纯度。
本发明的方法包含如下步骤：
1、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛。
2、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用3-10倍(体积/重量)的pH9-12(优选pH10)的缓冲液进行提取，优选5-9倍，最优选7倍；温度4-30℃，(优选10-25℃，最优选20℃)；时间10-60min，优选15-30min，最优选15-20min；提取1-2次。
3、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液。
4、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为1-100kDa，优选6-20kDa。
5、离子交换层析：将超滤上清液调pH至5-7(优选6.8)，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH5-7(优选6.8)的缓冲液洗脱(优选磷酸盐缓冲液)，再用含0.4-0.6mol/l(优选0.5mol/l)的NaCl的pH 5-7(优选pH6.8)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)，再用含0.7-0.9mol/lNaCl(优选0.8mol/l)的pH 7-8(优选pH7.6)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)梯度洗脱，再用含0.9-1.1mol/l的NaCl(优选1.0mol/l)的pH 8-10(优选9.0)缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰。离子交换层析柱优选CM Sephadex C-50柱。
6、超滤：用1-100kDa(优选6-20k Da)的超滤膜将步骤5得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液。
7、冷冻干燥：将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉，含量IGF-1为1500-2000ppm。总提取率可达4000-4500ng/g鲜鹿茸。
步骤7所得到的冻干粉可以直接作为化妆品和保健品的原料。
如需制备符合药用纯度的产品，可以进一步采用下述步骤提纯：
8、凝胶色谱纯化：将步骤6所得浓缩液，或者步骤7所得到的冻干粉溶于pH 8-10(优选9.0)缓冲溶液中，上凝胶排阻色谱柱，以pH 8-10(优选9.0)缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)洗脱，收集胰岛素样生长因子-1的峰，凝胶排阻色谱柱优选Sephadex G-50。
9、超滤：用1k-100kDa(优选2-6k Da)的超滤膜将步骤8得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液。
10、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉。冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。
上述方法步骤1中所述“鲜鹿茸”，指的是采集鹿茸后6小时内的鹿茸或者采集鹿茸后6小时内就进行冷藏处理的鹿茸，所述时间优选不超过2小时，最优选不超过20分钟；所述“冷藏”指的是0℃以下保存，优选-20℃保存；所诉“粉碎”，除包括常规机械粉碎外，还包括切片、研磨、匀浆或超声波破碎。粉碎程度高，粒度小，提高了提取率，缩短了提取时间，从而提高了提取效率，收率超过4000ng/g鲜鹿茸，大大提高了原料的利用率。
上述方法步骤所述缓冲液，可以是本领域普通技术人员熟知的所述pH值的缓冲液，例如碳酸盐-氢氧化钠缓冲液，碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，各优选的缓冲液种类已在上述描述中说明。
上述各步骤的操作，可以按照本领域普通技术人员熟知的方法进行，优选采用上述参数。
一种优选的从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是包含如下步骤：
(1)、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛；
(2)、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用体积/重量为7倍的pH10的缓冲液进行提取，；温度20℃；时间15-20min；提取2次；
(3)、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液；
(4)、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为6-20kDa；
(5)、离子交换层析：将超滤上清液调pH至6.8，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.5mol/l的NaCl的pH6.8磷酸盐缓冲溶液洗脱，再用含0.8mol/lNaCl的pH7.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用含1.0mol/l的NaCl的pH 9.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰；离子交换层析柱为CM Sephadex C-50柱；
(6)、超滤：用2-6kDa的超滤膜将步骤(5)得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(7)、冷冻干燥：将步骤(6)所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；
(8)、凝胶色谱纯化：将步骤(6)所得浓缩液，或者步骤(7)所得到的冻干粉溶于pH9.0Tris-HCl缓冲溶液中，上凝胶排阻色谱柱，以pH 9.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集胰岛素样生长因子-1的峰，凝胶排阻色谱柱为Sephadex G-50；
(9)、超滤：用2-6kDa的超滤膜将步骤(8)得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(10)、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。
本发明的优点如下：
A、粉碎程度高，提取效率高，收率超过4000ng/g鲜鹿茸。
B、通过在离子层析过中分别采用不同浓度的NaCl/不同pH值的缓冲溶液梯度洗脱，使得IGF-1和其他组分如杂蛋白分离得更彻底，冻干粉中IGF-1含量可达1500-2000ppm；联用凝胶排阻色谱柱纯化，产品纯度达98％以上，可用于药品。
具体实施方式
以下具体实施方式为本发明所述鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法中的优选实施例，仅用于举例说明本发明，并不旨在以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：
取100g鲜鹿茸，在4-10℃下粉碎至可通过80目筛，加入700ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)，超声提取20min，提取温度20℃，提取2次；超声结束后提取液5000r/min离心20min，沉淀加入500ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)，重复上述提取步骤；合并两次离心所得上清液，IGF-1提取率在4000-5000ng IGF-1/g鲜鹿茸。上清液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，IGF-1转移率大于97％；将超滤浓缩液调pH至6.8，加到CM-SephadexC-50阳离子交换柱上，先用0.2mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.5mol/L的NaCl的0.2mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.8mol/L的NaCl的pH7.6的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含1mol/L的NaCl的pH9.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集胰岛素样生长因子-1的部分，将含有IGF-1的洗脱液通过2kDa的超滤膜进行脱盐、浓缩；将浓缩液进行冷冻干燥，即得IGF-1冻干粉。冻干粉中IGF-1含量可达1800ppm。
实施例2：
取100g鲜鹿茸，在4-10℃下粉碎至可通过80目筛，加入700ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)，超声提取20min，提取温度20℃，提取2次，超声结束后提取液5000r/min离心20min；沉淀加入500ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)，重复上述提取步骤；合并两次离心所得上清液，IGF-1提取率在4000-5000ng IGF-1/g鲜鹿茸。上清液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，IGF-1转移率大于97％。将超滤浓缩液调pH至6.8，加到CM-SephadexC-50阳离子交换柱上，先用0.2mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.5mol/L的NaCl的0.2mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.8mol/L的NaCl的pH7.6的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含1mol/L的NaCl的pH9.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集IGF-1的部分，将含有IGF-1的洗脱液加到Sephadex G-50色谱柱上，用pH9.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集IGF-1的部分，将含有IGF-1的洗脱液通过2kDa的超滤膜进行脱盐、浓缩；将浓缩液进行冷冻干燥，即得IGF-1冻干粉。冻干粉中IGF-1纯度为98.3％。
实施例3：
将实施例1所得IGF-1冻干粉溶于pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液，加到Sephadex G-50色谱柱上，用pH9.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集IGF-1的部分，将含有IGF-1的洗脱液通过2kDa的超滤膜进行脱盐、浓缩；将浓缩液进行冷冻干燥，即得IGF-1冻干粉。冻干粉中IGF-1纯度为98.5％。
Claims (3)
1、一种从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是包含如下步骤：
(1)、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛；
(2)、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用体积/重量为3-10倍的pH9-12的缓冲液进行提取，优选pH10的缓冲液，优选5-9倍，最优选7倍；温度4-30℃，优选10-25℃，最优选20℃；时间10-60min，优选15-30min，最优选15-20min；提取1-2次；
(3)、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液；
(4)、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为1-100kDa，优选6-20kDa；
(5)、离子交换层析：将超滤上清液调pH至5-7，优选6.8，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH5-7，优选6.8，的缓冲液洗脱，优选磷酸盐缓冲液，再用含0.4-0.6mol/l(优选0.5mol/l)的NaCl的pH5-7(优选pH6.8)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)，再用含0.7-0.9mol/lNaCl(优选0.8mol/l)的pH 7-8(优选pH7.6)缓冲溶液(优选磷酸盐缓冲液)梯度洗脱，再用含0.9-1.1mol/l的NaCl(优选1.0mol/l)的pH 8-10(优选9.0)缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰；离子交换层析柱优选CM Sephadex C-50柱；
(6)、超滤：用1-100kDa(优选2-6kDa)的超滤膜将步骤(5)得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(7)、冷冻干燥：将步骤(6)所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉。
2、一种如权利要求1所述从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是还包含如下步骤：
(8)、凝胶色谱纯化：将步骤(6)所得浓缩液，或者步骤(7)所得到的冻干粉溶于pH8-10缓冲溶液中，优选9.0，上凝胶排阻色谱柱，以pH 8-10优选9.0缓冲溶液(优选Tris-HCl缓冲液)洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰，凝胶排阻色谱柱优选Sephadex G-50；
(9)、超滤：用1k-100kDa(优选2-6kDa)的超滤膜将步骤(8)得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(10)、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。
3、一种如权利要求1、2所述从鹿茸提取胰岛素样生长因子IGF-1的方法，其特征是包含如下步骤：
(1)、粉碎：取鲜鹿茸，在低温下粉碎，温度4-10℃，过80目筛；
(2)、超声波提取：将粉碎后的鹿茸用体积/重量为7倍的pH10的缓冲液进行提取，；温度20℃；时间15-20min；提取2次；
(3)、高速离心分离：提取液于高速离心机中5000-10000转离心20min，沉淀部分加入2-5倍的缓冲液，重复上述操作，合并两次离心所得上清液；
(4)、超滤：将上清液用膜进行超滤，去除小分子物质和大分子物质，并对上清液进行浓缩，得浓缩液，膜的截留值为6-20kDa；
(5)、离子交换层析：将超滤上清液调pH至6.8，上阳离子交换柱，梯度洗脱，先用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，再用含0.5mol/l的NaCl的pH6.8磷酸盐缓冲溶液洗脱，再用含0.8mol/lNaCl的pH7.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用含1.0mol/l的NaCl的pH 9.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集胰岛素样生长因子IGF-1的峰；离子交换层析柱为CM Sephadex C-50柱；
(6)、超滤：用6-20kDa的超滤膜将步骤(5)得到的胰岛素样生长因子-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(7)、冷冻干燥：将步骤(6)所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；
(8)、凝胶色谱纯化：将步骤(6)所得浓缩液，或者步骤(7)所得到的冻干粉溶于pH9.0Tris-HCl缓冲溶液中，上凝胶排阻色谱柱，以pH 9.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集胰岛素样生长因子-1的峰，凝胶排阻色谱柱为Sephadex G-50；
(9)、超滤：用2-6kDa的超滤膜将步骤(8)得到的胰岛素样生长因子IGF-1洗脱液进行脱盐、浓缩，收集洗脱液；
(10)、冷冻干燥：将步骤9所得浓缩液进行冷冻干燥，得到冻干粉；冻干粉中IGF-1纯度可达98％以上，满足药品原料的要求。
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