CN1031717A - 为非甲非乙型肝炎特异性抗原编码的dna片段，含该dna片段的表达载体，其转化体及生产该抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含感染非甲非乙型肝炎的肝细胞产 生的为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码碱基顺序 的DNA片段，将该DNA片段从该基因启动子下游 克隆切点插入的表达载体，将该表达载体引入宿主所 得的转化体和生产该特异抗原蛋白的方法。该方法 包括制造所述表达载体，用该载体转化宿主，培养该 转化宿主和收集产生的蛋白。

Description

本发明涉及用重组DNA技术生产非甲非乙型肝炎特异性抗原。更确切地说是关于为一种抗原编码的DNA片段，该抗原是在感染了非甲非乙型肝炎的宿主上特异产生的;一个含该DNA片段的表达载体;具有该表达载体的转化宿主以及通过培养该宿主生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法。
在病毒性肝炎中，已发现了甲型乙型肝炎的病毒。因此，可以用免疫学方法诊断这种疾病。
还有另一种与甲型和乙型不同的肝炎，称作非甲非乙型肝炎，它占输血后肝炎的90%以上〔见NIPPON    RINSHO，（Japan    Clinic），35，2724（1977）〕及〔J.Biol，Med，49，243（1970）〕然而，至今尚未确定非甲非乙型肝炎病毒。仅仅知道人类非甲非乙型肝炎病毒也可感染黑猩猩。〔见LancetⅠ，459，（1978）;ibid，463（1978）〕。
很多科研人员主要用感染该病患者的血清寻找与非甲非乙型肝炎有关的抗原-抗体系统。然而，没发现确定的系统。所以只能用所谓排除诊断法诊断非甲非乙型肝炎。即首先鉴定病人的肝炎是否由已知引起肝病的病毒如：CMV，HSV，EBV等感染所致;如果不是，就诊断为非甲非乙型肝炎。这样地诊断非甲非乙型肝炎就需很多时间和劳动。
已从肝细胞感染了非甲非乙型肝炎的人与猩猩提纯出用于直接诊断该种肝炎的特异性抗原蛋白，并提出用对该抗原特异性的单克隆抗体治疗非甲非乙型肝炎（见日本专利公开N.176856/86和56196/86）。
当用该非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白作为诊断试剂时，就需要大量该蛋白。然而，还没有合适的方法从感染了非甲非乙型肝炎的猩猩肝细胞大量纯化这种抗原蛋白。
另一方面，为用核酸杂交方法检测给非甲非乙型肝炎特异抗原编码的基因，进而用重组DNA技术生产对非甲非乙型肝炎特异的抗原，就必须得到为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的基因片段。
本发明人做了极大的努力通过遗传工程技术大量生产这种特异性抗原蛋白，分离到为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的基因片段，该基因片段可用于生产这种抗原。另外，发明人还成功地重组了含该片段的表达载体。从而达到本发明的目的。
本发明的目的之一是提供一种DNA片段，该片段含为感染了非甲非乙型肝炎的宿主细胞中特异性产生的抗原编码的碱基顺序，或含为具有与上述特异抗原等同生理活动的非甲非乙型肝炎特异蛋白抗原编码的碱基顺序。
本发明另一个目的是提供含有该DNA片段的表达载体，该DNA片段插在载体启动子下游的克隆切点。
本发明再一个目的是提供用上述表达载体转化宿主细胞得到的转化体。
本发明还有一个目的是培养该转化体来生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法。
下面将根据附图详述本发明的目的及优点：其中
图1a-1e表示为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的碱基顺序;
图2表示杂交启动子Pac的碱基顺序;
图3a-3c表示下面所述例1中得到的cDNA片段，及用它推算出的氨基酸顺序;
图4a-4c表示含有非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白全长基因序列的cDNA碱基顺序，该cDNA是在下面所述例2中得到的，其中的57-1388碱基序列是为非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白编码的。
图5图解说明组建质粒PCV44H;
图6图解说明组建质粒PCV44B;而
图7图解说明组建质粒PCZ44。
下面将详述本发明。
根据本发明，得到含有为非甲非乙型肝炎感染肝细胞而特异产生的抗原蛋白编码碱基顺序的DNA片段。
本发明的该DNA片段是用下面方法制备的。
首先，感染了非甲非乙型肝炎的人或黑猩猩的肝组织在硫氰酸胍水溶液中均浆，再根据chirgwin等人的方法〔见Biochemist-ry，18    5294-5299（1979）〕，进行氯化铯密度梯度离心，沉淀是分离出的总体RNA。分离后再用苯酚萃取和酒精沉淀纯化总体RNA。
本发明用作肝组织来源的“感染非甲非乙型肝炎的个体（人或黑猩猩），可能包括感染了最近才命名的所谓（D）型肝炎的个体。
已知抗原基因的mRNA一般都具有Poly-A链。因此，可用常规的方法，将总体RNA进行寡（dT）纤维素柱层析，分离出的含Poly（A）的RNA（PolyA+RNA）作为mRNA材料。
然后，根据随机引物方法〔见Y.Ebina等人;Cell，40，747-758（1980）〕从mRNA材料得到相对于PolyA+RNA的cDNA文库：这样，用任何引物如：约6个碱基的引物和反向转录酶可随机合成与该mRNA材料互补的一系列DNA。
用DNA甲基化酶如：EcoRI甲基化酶使cDNA甲基化，从而保护可被相应限制酶，如EcoRI酶切的cDNA中存在的切点。将在两端含有相应限制酶切点的DNA连接子如：EcoRI连接子（CGAATTCG）加入到甲基化的cDNA中，再用限制酶如：EcoRI酶解该cDNA。
将该酶解的cDNA克隆到诸如质粒或入噬菌体的克隆载体中。例如：cDNA可被引入λgtll    DNA的EcoRI切点处，λgtll    DNA是一个表达克隆载体〔R.A.Young等人，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，80，1194-1198（1983）〕。cDNA将被插入λgtll噬菌体的β-gal基因之中。这样，当用该噬菌体转染的大肠杆菌E.Coli生长在含IPTG（异丙基硫代-β-D-吡喃型半乳糖苷）时，由于该噬菌体半乳糖操纵子启动子表达，产生了与β-半乳糖苷酶融合的蛋白，从而容易地证实了cDNA的表达。
根据Tamizawa等人的方法〔见Experimental    Proadures    for    Bacteriophages    P99-174（1970，5，30）Iwanami    Shoten，Japan）然后将并入cDNA的λgtll噬菌体导入E.Coli。再将转染的该微生物培养在含IPTG的培养基中。
用非甲非乙型肝炎特异单克隆抗体，根据免疫筛选法很容易选择出形成的噬菌斑，从而得到所需cDNA。根据日本专利公开No176856/86和56196/86所述方法可制备用于免疫筛选法的单克隆抗体。所用筛选方法，可包括本申请所述的Western吸印技术。
用Tomizama等人方法用免疫筛选试验的阳性噬菌斑繁殖噬菌体。根据T.Maniatis等人方法〔见“Mole-Cular Cloning”，P85，Cold Spring Harbor Laboratory，（1982）〕从生长的噬菌体纯化DNA。再用合适的限制酶如：EcoRI酶解DNA。用Maxam和Gilbert方法〔见Methods in Enzymology，65，499-560（1980）〕可用纯化后酶解的DNA片段测定所需cDNA片段的碱基顺序;或者，将该DNA片段在进一步克隆到M13噬菌体后，再根据二脱氧基方法〔见Sanger等人，Proc，Natl，Acad，Sci.USA，74，5463（1977）〕可测定所需的cDNA片段的碱基顺序。
这样，就得到了为非甲非乙型肝炎特异性抗原编码的cDNA片段。然而，这种DNA片段，通常只作为为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的基因的一部分。
可用下列方法得到全部长度的为非甲非乙肝炎特异抗原编码的cDNA。
以与上述相似的方法提取和纯化PolyA+-mRNA，根据Okayama-Berg载体-引物方法〔见Molecular and Cellular Biology，2，161-171（1982）〕从PolyA+-mRNA中得到cDNA文库。
用任何常规方法，如：D.Hanahan方法〔见J.Mol.Biol，166，557（1983）〕用如上制备的含该cDNA的质粒转化E.Coli。
收集抗氨苄青霉素的转化菌株，根据菌落杂交法用上面提及的DNA片段作探针，进行筛选。最好用链霉-抗生物素蛋白法或用光生物素-核酸和32P-核酸作试剂的缺口转译法制备该探针。
培养筛选出的含有cDNA克隆的菌落。根据Birmboim等人的方法〔见Nucleic Acid Res.，7，1513（1979）〕从培养的菌落中得到质粒DNA，再用合适限制酶酶解之。再根据前述Maxam and Gilbert方法测定所需全长cDNA片段的碱基顺序，或将酶解后DNA克降到M13噬蓄体或PVC12质粒后再用上述Sanger等人的二脱氧基法测定其碱基顺序。
图1表示为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的全长DNA的碱基顺序，其中在碱基下的“一”符号表示相应于与上面每个符号表述的个别碱基互补的碱基。
当然可用于本发明的DNA片段不一定非要含有与图1所示完全一样的碱基顺序。该DNA片段中图1所示碱基序列的部分至少被一个不同碱基取代，或删去或加入一个以上附加碱基，只要求这些不同的DNA片段可为与由图1碱基顺序编码的非甲非乙型肝炎特异抗原有类似生理活性的物质编码。
根据本发明，还提供一种表达载体，上述本发明的DNA片段插入该载体的启动子下游的克隆切点内。
本发明的表达载体含有启动子，其位置使其能控制为上述方法得到的非甲非乙型肝炎特异抗原编码DNA的转录。用于本发明的启动子可是任何能在宿主表达该DNA片段的启动子，最好是控制该片段转录的启动子。
当所用的宿主为大肠杆菌，枯草棒菌等菌株时，本发明的表达载体最好包括一个启动子，一个核糖体结合顺序，一个为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的基因，一个转录终止因子和一个控制启动子的基因。
所用的启动子可以包括从大肠杆菌，噬菌体等得到的启动子，如：色氨酸合成酶操纵子（trp），乳糖操纵子（lac），脂蛋白（lpp），recA，λ噬菌体PL，PR，T5早期基因P25，P26启动子，它们也可以通过化学合成制备。还可包括诸如：tac（trp：lac），trc和图2所示Pac（噬菌体：大肠杆菌）等杂交启动子。
核糖体结合顺序可从大肠杆菌，噬菌体等得到，但最好是人工合成制备的含如：AGGAGG    TTTAA的交感序列的核酸结合顺
SD顺序
序。
可不加任何修饰地将为非甲非乙型肝炎特异抗原编码基因直接使用。最好通过直接位点突变删掉不需要的顺序（非编码区）〔见Biotechnology，July，636-639（1984）〕。
在本发明的表达载体中不总是需要转录终止因子。瞬息载体最好是含不依赖ρ终止因子，如：Lpp终止因子，trp操纵子终止因子，核糖体RNA基因终止因子。
表达载体可从任何常用质粒衍生，最好选用在大肠杆菌或枯草杆菌中自我复制的质粒衍生得来的，如：PBR322或PUB110衍生的质粒。
这些表达所需因子最好从5′端到3′端以下列顺序排列在表达质粒中：启动子，SD顺序，非甲非乙型肝炎特异抗原的结构基因，转录终止因子。控制转录所需遇制物基因，如：抗药基因等标记基因，质粒复制起点都可以任何顺序排列在表达载体中。
可用任何常规方法将表达载体导入宿主，用来转化大肠杆菌〔见Molecular    Cloning，250-253（1982）〕或枯草杆菌〔见Molec，Gen，Genet.，168，111-115（1979）或Proc.Nat.Acad.Sci.USA，44，1072-1078（1958）〕。
可将所得转化体培养在任何常用培养基中，如分子克隆，68-72页（1972）所述方法，对大肠杆菌和枯草杆菌培养温度均为28～42℃。最好为28～30℃，这种温度下不会引起热休克蛋白的表达。
这样生产的所需蛋白可容易地用常规步骤从宿主中分离出来。如：用溶菌酶-表面活性剂或超声破碎使宿主细胞破碎，超速离心收集含所需非甲非乙型肝炎特异抗原的不溶性部分，再将其溶在表面活性剂溶液中如0.01%SDS中，应用单克隆抗体的柱层析纯化（见日本专利公开N.56196/86和176856/86。
当用真核细胞，如：动物细胞，作为宿主时，本发明的表达载体最好如下：
用于在真核细胞表达的载体启动子包括SV4的早期启动子和晚期启动子;脱脂蛋白E和AI基因的启动子;热休克蛋白基因启动子〔见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，7038-7042（1981〕金属巯基组氨酸三甲内盐基因启动子〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，6511-6515（1980）〕;HSV TK启动子;腺病毒启动子，如：Adz大后期启动子（Adz MLP）;倒病毒（retrovivus）的长末端重复区（LTR）等等。最好SV4启动子和金属巯基组氨酸三甲内盐基因的启动子。
本发明的表达载体可含包括5′端剪接结合授体位点，内含子和3′剪接结合受体位点的剪接顺序。在所有剪接结合位点中（外显子-内含子结合位点）中发现有共同的碱基顺序;根据GT/AG规则，任何内含子区总是从授体位点的两个碱基GT开始，终止在受体位点的两个碱基AG处。
本发明的表达载体可含一个以上所述的剪接顺序。这些剪接顺序可位于非甲非乙型肝炎特异抗原结构基因的上游或下游。
这种剪切顺序的例子可包括在家兔β-珠蛋白基因的外显子2和3中发现的剪接顺序〔见Science，26，331（1979）〕。和含金属巯基组氨酸三甲内盐基因启动子，外显子1，2和3及内含子A和B的小鼠金属巯基组氨酸三甲内盐基因的该DNA顺序〔见Proc.Natl.Acad.Sic.USA，77，6513（1980）〕。其5′和3′剪接位点可从同一个或不同的基因得来;如：可用一个顺序，其中腺病毒DNA含有的5′剪接点与Ig可变区基因得来的3′剪接点连接。
本发明的表达载体，在非甲非乙型肝炎特异抗原结构基因的下游含有一个多腺苷位点。多腺苷点的例子包括从SV40DNA，β-珠蛋白基因或金属巯基组氨酸三甲内盐基因得来的该区。本发明也可用β-珠蛋白基因和SV40DNA多腺苷位点的结合区。
本发明的表达载体也还包括一个能用于筛选转化体的显性选择标记。这里可用的选择标记包括使宿主具有MTX（氨甲蝶呤）抗性的DHFR基因;疱疹单纯病毒（HSV）的tk基因，它能选择在HAT培养基中转化的tk-菌株;从大肠杆菌转座子Tn5得来的氨基糖苷3′-磷酸转移酶基因，它使宿主抗3′-脱氧基链霉胺抗生素G418;能从集落生长形态学分辨出的牛血清乳头状瘤病毒基因;和aprt基因。
此外，即使在载体中无选择标记时，也可通过共转化筛选用本发明表达载体转化的动物细胞。为此目的，可用该表达载体和一个质粒或其它含诸如选择标记的基因共转化动物细胞，再通过基因表现型性状选择之。
由于这样的载体可克隆在细菌中，表达载体也还可含一个具有从诸如大肠杆菌等细菌得来的复制起点的质粒片段。该质粒可包括PBR322，PBR327，PML等。
根据本发明，用作表达载体来源质粒的例子包括PkcR〔见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1528（1981）〕，它含SV40早期启动子，剪接顺序和从家兔β-珠蛋白基因得来的多聚腺苷区，从SV40早期区得来的多聚腺苷区和复制起始区及从PBR322得来的抗氨苄青霉素基因;PKCRH2〔见Nature，307，605（1984）〕，其中PKCR的PBR322部分被PBR327片段取代，家兔β-珠蛋白基因外显子3的EcoRI位点转变为HindIII位点;及含BPV基因和金属巯基组氨酸三甲内盐基因的PBPVMT1〔见Proc，Natl.Acad.Sci.USA，80，398（1983）〕。
用本发明表达载体转化的动物细胞可包括CHO细胞，Cos细胞和小鼠L细胞，C127细胞和FM3A细胞。
可通过转染、微注射等方法将本发明表达载体导入动物细胞。最常见的转染法用CaPO4〔见Virologg，52，456-467（1973）〕。
可将导入本发明表达载体所得的动物转化细胞培养在常规的悬液或固体培养基中。常用的培养基为MEM，RPMI1640等。
转化的动物细胞中生产的蛋白可用与上述微生物所用的同样方法被分离和提纯。
如上述，本发明通过将表达载体导入宿主细胞得到转化细胞。
本发明还提供了生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法，包括培养该转化体，收集其产生和积累的抗原。
如前述，当将这种抗原蛋白用作直接诊断试剂时，就需大量非甲非乙型肝炎特异抗原蛋白。本发明的方法使得可能不用感染的猩猩肝细胞大规模低成本地生产该抗原蛋白。在此以前，很难从被非甲非乙型肝炎感染的猩猩肝细胞大量生产该抗原蛋白。
另外，根据本发明为非甲非乙型肝炎病毒特异抗原蛋白编码的DNA片段可用作核酸杂交法测定该抗原蛋白基因的探针。
下面用例子进一步说明本发明，但它们不限制本发明的范围。
例1：制备为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的cDNA片段。
根据硫氰酸胍-氯化锂方法（见Cathala等人，DNA，2，329（1983）〕，从猩猩肝组织制备含Poly（A）的RNA。
取5g被非甲非乙型肝炎感染的猩猩肝组织，立即用液氮冷冻。将冷冻肝放入Waring搅拌机在3，000rpm下搅碎2分钟。将搅拌的肝样品放在100ml缓冲液中〔含5M硫氰酸胍，10mMEDTA，50mMTris-HCl（pH7），8%（V/V）β-巯基乙醇〕用Teflon均浆器用5rpm速度均浆。取20ml缓缓地注入内装10ml5。7M氯化铯溶液的离心管中，在27，000rpm下离心20小时，转头为Hitachi    RPS28-2。收集RNA沉淀，再溶于10ml缓冲液中〔内含0.1%SDS，1mMEDTA，10mMTris-HCl（pH7.5）〕。用苯酚-氯仿萃取RNA，再用酒精沉淀回收。
将所得约3.95mgRNA溶在1ml的缓冲液中（内含10mM    Tris-HCl（pH8.0），1mMEDTA〕，将其在65℃下温育5分钟，再加入0.1ml    5MNaCl。将混液过寡（dT）纤维素柱层析（柱体积0.5ml，P-L    Biochemical）。用含10mM    Tris-HCl（pH7.5）和1mM    EDTA的缓冲液洗脱吸附在柱上的含Poly（A）的mRNA。得到约100μg该mRNA。
将所得Poly（A）+mRNA10μg溶于50μl含20mMTris-HCl（pH8.8），0.1MKCl，12mM MgCl2，2mM MnCl2的RT缓冲液。加入8μg随机引物d（N）6（来自P-L Biochemical）。将所得混液在95℃下加热3分钟使材料变性，再将其逐渐冷却到室温，使随机引物与mRNA退火。向退火后混液加入10mM 4NTP（10μl）和从Takara Shuzo（日本）得到的反向转录酶（225个单位），然后加水，使其总体积至100μl。在42℃下反应1小时。
向反应混液50μl加入2μl 10mM NAP，10μl 10mM 4dNTP，5个单位核酸酶H，1个单位大肠杆菌连接酶，6.3个单位大肠杆菌DNA聚合酶I，及10X T4DNA连接缓冲液10μl;内含0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.1MDTT，60mM MgCl2）使其总体积为100μl，使其在37℃反应1小时，从而合成双链DNA。
用等体积水饱和的苯酚萃取所得双链DNA。加乙醚除去水相中的苯酚，再用酒精沉淀。将所得沉淀溶于含50μl水，10μl 10X T4DNA聚合酶缓冲液（含0.33M Tris-乙酸，pH7.9，0.66M乙酸钾，0.1M乙酸镁，5mM DTT），10μl 10mM 4dNTP，6个单位T4DNA聚合酶的溶液，使其总体积为100μl。使混液在37℃反应1小时，得到具平端的双链DNA，然后用苯酚萃取之，以除去蛋白，再用酒精沉淀纯化之。然后抽气干燥所得DNA。
向该DNA中加入20μl    1mM    EDTA钠盐，20μl5mM    DTT，2μl    100μMS-腺苷基-L-蛋氨酸和0.2μl    1.8mg/ml的EcoRI甲基酶。使其在37℃反应15分钟，从而使DNA片段的EcoRI限制酶切点甲基化。将反应液再在70℃反应15分钟，使酶钝化。
向反应混液以每个合成的DNA加100个分子的量加入3′-磷酸化的EcoRI连接子。再加5μl10xT4DNA连接酶缓冲液（含0.5M Tris-HCl，pH7.5，60mM MgCl2，10mM DTT），5μl 0.1MATP，5个单位的T4DNA连接酶，使总体积至50μl。使反应混液在4℃下反应16小时，再在70℃下加热10分钟，钝化该酶。然后加入10μl 10 xEcoRI缓冲液（含15M Tris-HCl，pH7.5，0.5M NaCl，60mM MgCl2）和100个单位的EcoRI，使其总体积为100μl。然后使其在37℃反应2小时，切掉连接子。再使混液过Bio凝胶A-50柱（0.2cm×32cm，BioRad）。用含10mM Tris-HCl（pH7.5），6mM MgCl2的缓冲液洗脱。除去过剩的EcoRI连接子，从而纯化了在其两端具有EcoRI切点的双链cDNA。
向该cDNA加入10μg用EcoRI切的λgtll DNA，10μl 10xT4DNA连接缓冲液，10μl 0.1M ATP，10个单位的T4DNA连接酶，使总体积至100μl。使混液在4℃反应16小时。从而该双链cDNA片段被插入了λgt11DNA。
用λ噬菌体包装盒（PROMEGA，Biotech）将该DNA引进λ噬菌体颗粒。包装步骤是根据盒的说明书进行。
包装了所述DNA的λgt11噬菌体用来转染大肠杆菌Y1090，形成噬菌斑，该步骤是根据常用的Tomizawa等人的方法（见“Experimental    Procedures    for    Bacteriophages”99-174页，发表于1970年5月30，Iwanam;Shoten日本）。根据下述免疫筛选法从大约200，000个噬菌斑中选出一个阳性克隆。用日本专利公开No176856/86所述方法制备免疫筛选法所用的单克隆抗体。
将用λgt11转染的大肠杆菌Y1090〔R.A.Young等人，见Pro.Natl.Acad.Sci.USA，80，1194-1198（1983）〕在42℃接种到琼脂培养皿上。使转染细胞在42℃生长5小时。将含10mM    IPTG的硝酸纤维滤纸（S&S，BA-83，孔径为0.2μm）盖在细胞上，将其在37℃温育3～4小时。用TBS缓冲液（内含10mM    Tris-HCl，pH7.5，50mM    NaCl）轻轻冲洗硝酸纤维滤纸，再将其浸在含3%白明胶的400ml    TBS缓冲液中，再在40℃下摇荡1小时。将非甲非乙型肝炎特异抗原的单克隆抗体用含1%白明胶的TBS稀释到1/400，将此混液与滤纸一道，以每块滤纸加2ml的比例装入乙烯袋中，室温下反应16小时。用400ml含0.05%吐温20的TBS缓冲液每隔10分钟洗一次，共洗三次该反应混液。用含1%白明胶的TBS，稀释标记的第二抗体，抗一小鼠IgG-PAP（马血红过氧化酶，Biorad）至1/1，000，然后，以每块滤纸2ml的比例将该混液和滤纸一道装入乙烯袋中。室温反应2小时。用400ml含0.05%吐温20的TBS缓冲液每隔10分钟洗一次，共洗三次。将滤纸和4-氮-1-萘酚12mg（BioRad）浸入20ml含过氧化氢的TBS缓冲液使颜色展开。然后用水彻底洗滤纸，再将其放入含水的乙烯袋。将该袋贮藏在黑暗，冷凉的地方。
从而，得到一个阳性噬菌斑。将该噬菌斑被三次分离成单噬菌斑。每一轮都以上述方式进行一次免疫筛选，证实该噬菌斑确实是阳性噬菌斑。
大规模培养该噬菌斑，用其以下列方式分离DNA：将大肠杆菌Y1090在10mlNz培养基（将10g    Nz胺，5g    NaCl，5mM氯化镁溶在1升水中，调pH至7.2）中培养过夜。用该噬菌体转染1ml培养液，（感染多样性值为0.1）。将转染的培养液置于37℃10分钟，然后转移到1升的NZ培养基中。37℃摇荡培养7-8小时，直到细胞溶解。加入5ml氯仿，再摇荡30分钟。将其在6，500rpm离心10分钟，除去细胞残渣。
将29gNaCl和70g聚乙二醇，使其彻底溶在所得上清液中，放置4℃下过液。在6500rpm离心20分钟，收集沉淀。彻底洗净，再溶于20ml TM缓冲液内含10mM Tris-HCl，pH7.5，5mM MgCl2）。再加入10μg/ml的DNA酶I和RNA酶A，使其在37℃反应1小时。加20ml氯仿，搅动。这样，聚乙二醇分散在氯仿层中，然后从水相分离出氯仿。将水层在28，000rpm下离心60分钟，得到噬菌体颗粒沉淀。
将该沉淀溶于1ml的TM缓冲液，在33，000rpm下进行氯化铯密度梯度离心20分钟。所得含噬菌体颗粒（P＝1.45-1.50）的部分在TM缓冲液中透析过夜。以100μg/ml加入蛋白酶K，在37℃下反应1小时。用等体积的水饱和苯酚缓缓萃取DNA。在6，500rpm下离心10分钟，除去水层，将其装入透析管，在水中，4℃下透析过夜。从而得到约5mg    DNA。
用100个单位EcoRI在上述缓冲液100μl中在37℃酶解100μg该DNA，结果发现一个390bp和另一个345bp的cDNA片段插入噬菌体DNA。
将这两个EcoRI片段再克隆到克隆载体PUC11P之中。分别用CAGGAAACAGCTATGAC和AGTCACGACGTTGTA根据二脱氧基法测定这些DNA的碱基顺序。同样地用相应特异的限制酶在其中的BamHI和EcoRV点酶解该cDNA片段，未测定这两个DNA片段之间连接部分的碱基顺序，将所得BamHI-EcoRV    DNA片段插入到质粒PUC119的BamHI和SmaI点之间，用二脱氧基法测定该片段的碱基顺序。
表3表示该cDNA片段的碱基顺序，这是为非甲非乙型肝炎特异抗原编码基因的部分cDNA片段。
例2：制备含全长基因序列的cDNA
如例1所述制备信息RNA，根据“分子克隆”211页所述常规方法用Okayama载体合成cDNA。合成cDNA的步骤如下：
将400μg    PCDV1〔是Okayama和Berg，Mol.Cell.Biol，3，280，（1983）〕和500个单位KPn1（来自TAKARA SHV20，日本）加入300μl的缓冲液中（内含10mMTris-HCl，pH7.5，6mM MgCl2，10mM NaCl），除特殊说明此所有限制酶均为日本TAK ARA SHU20公司制造的。37℃下反应6小时，在其KpnI点酶切该质粒。用苯酚-氯仿萃取后，用酒精沉淀，回收DNA。
将0.25mM的dTTP加入TdT缓冲液（含40mM卡可基酸钠，30mM Tris-HCl，pH6.8，1mM CaCl2，0.1mM二硫苏糖醇）得200μl溶液，将约200μg用KpnI酶切的该DNA加入该溶液。再加入81个单位末端脱氧基核苷酸转移酶（TdT，由P-L Chemicals制造）。37℃下反应11分钟。从而一个Poly（dT）链（大约67个脱氧胸腺苷酸残基）加到PCDVI的KpnI切点3′的端。用苯酚-氯仿萃取后，用酒精沉淀，从反应液中回收到大约100μg加上Poly（dT）链的PCDVTDNA。
将得到的DNA加入150μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），6mM MgCl2，100mM NaCl的缓冲液和360个单位的HpaI。在37℃反应2小时。用琼脂糖凝胶电泳分离反应混液的DNA，回收约3.1Kbp的DNA片段。得到约60μg含Poly（dT）的PCDV1。
将所得DNA溶于含10mM    Tris-HCl（pH8.0），1mM    EDTA的缓冲液500μl，在65℃温育5分钟，在冰中冷却。加入50μl的5M    NaCl后，将其在寡（dA）纤维素柱上层析（Colaborative    Research）。足够长的具Poly（dT）链的DNA被吸附在柱上，然后用含10mM    Tris-HCl（pH8.0），1mM    EDTA的缓冲液洗脱。从而得到27μg附加在Poly（dT）上的PCDV1，下面简称之为载体引物。
连接子DNA是以下列方式制备的：向200μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），6mM MgCl2，50mM NaCl的缓冲液加入约14μg PL1〔见Okayama和Berg，Mol，Lell.Biol.，3，280（1983）〕和50个单位的PstI，37℃反应4小时，在PstI点酶切PL1 DNA。用苯酚-氯仿萃取，再用酒精沉淀反应产物，得到约13μg在PstI点被酶切的PL1 DNA。
向所得DNA（约13μg）加入50μl含dGTP的TdT缓冲液，使dGTP终浓度为0.25mM，再加54个单位的TdT（P-L Biochemicals产品）。在37℃反应13分钟，使（dT）链（约14个脱氧 苷酸残基）连接在PL1的PstI切点的3′端。苯酚-氯仿萃取后，用酒精沉淀回收DNA。
上述所得DNA加入含10mM Tris-HCl（pH7.5），6mM MgCl2，60mM NaCl的100μl缓冲液中，再加80个单位的HindIII。在37℃温育3小时，在HindIII点酶切PL1 DNA。用琼脂糖凝胶电泳分离反应产物。用DEAE纸法〔见Dretzen等人，Anal.Biochem.，112，295（1981）〕回收约0.5Kb的DNA片段。从而得到含寡（dG）链的连接子DNA，下面简称为连接子DNA。
将如例1同样方式制备的上述Poly-（A）+RNA约2μg和载体引物约14μg溶于22.3μl含50mM Tris-HCl（pH8.3），8mM MgCl2，30mM KCl，0.3mMDTT，2mMdNTP（dATP，dTTP，dGTP和dCTD）的缓冲液和10个单位的核酸酶抑制剂（P-L Biochemicals产品）。再加入10个单位反向转录酶（日本，SEIKAGAKU KOGYO制造）。37℃下温育40分钟，合成与该mRNA互补的DNA。用苯酚-氯仿萃取后，酒精沉淀之，回收到连接在RNA-DNA双链的载体引物DNA。
将这样所得含RNA-DNA双链的载体引物DNA溶于20μl含60μM    dCTP和0.2μg    Poly（A）的TdT缓冲液。加入14个单位TdT（P-L    Biochemical出品）后，将混液在37℃温育8小时，将一个具有12个脱氧胞苷酸残基的（dC）链连接到该cDNA的3′端。用苯酚-氯仿萃取反应产物，在酒精沉淀回收连接在（dC）链上的cDNA-载体引物DNA。
将所得含（dC）链的cDNA-载体引物DNA溶在400μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），6mM MgCl2，60mM NaCl的缓冲液，加入20个单位的HindIII。将混液在37℃温育2小时，在HindIII点酶切该DNA。用苯酚-氯仿萃取反应产物，再用酒精沉淀之。从而得到0.5皮摩尔含（dC）链的cDNA-载体引物DNA。
将所得含（dC）链的cDNA-载体引物DNA（0.08皮摩尔）和上述连接子DNA（0.16皮摩尔）溶于40μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），0.1M NaCl，1mM EDTA的缓冲液中。将所得溶液在65℃温育10分钟，再在42℃温育25分钟，然后在0℃放置30分钟。然后将反应混液调至含20mM Tris-HCl（pH7.5），4mM MgCl2，10mM（NH4）2SO4，0.1M KCl和0.1mM β-NAD，使总体积为400μl。
向混液加入10个单位大肠杆菌DNA连接酶（New    England    Biolabs出品）再在11℃温育过夜。通过加必要的试剂将dNTP和β-NAD浓度分别调至40uM和0.15mM，再加5个单位的大肠杆菌DNA连接酶，7个单位的大肠杆菌DNA聚合酶I和2个单位的大肠杆菌核酸酶H。将混液在12℃温育1小时，再在25℃温育1小时。
在上述反应过程中，将含cDNA的重组DNA环化，将RNA-DNA双链的RNA部分用DNA取代，从而生产出含完整双链DNA的所需重组质粒。
用该重组质粒转化常规方法制备的大肠杆菌MC1064感受态细胞。约有50，000个转化体固定在硝酸纤维滤纸上。根据“分子克隆”329页（1982）所述菌落杂交法，用例1所得cDNA片段作探针筛选这些菌落，结果在42℃有三个菌落显示很强的杂交。
用Southern法〔见J.Mol.Biol.，98，503（1975）〕分析这些阳性克隆。得到所需的非甲非乙型肝炎特异蛋白编码基因的全长cDNA。该cDNA的碱基顺序见图4。
含该全长cDNA的表达载体被命名为pCDVCL-I
例3.制备表达载体和转化体，表达特异抗原
Ⅰ.制备表达载体和转化体
1）修饰N-末端（见图5）：
ⅰ）在100μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl，6mM MgCl2的缓冲液中，37℃下用10个单位PVUI酶解5μg PCDVCL-I2小时。将反应混液在75℃下加热15分钟使该酶钝化，再在水中透析、干燥。在40μl含33mM Tris-乙酸（pH7.9），66mM乙酸钾，10mM乙酸镁和0.5mM二硫苏糖醇的缓冲液中，用4个单位的T4DNA聚合酶处理酶解的质粒DNA，再加入2mM4-脱氧三磷酸酯，从而使质粒DNA的3′突出端填平，形成平钝端。将混液在70℃加热10分钟钝化该酶，在水中透析，再干燥。将所得质粒DNA以水溶液形式贮存（50μl）。该质粒DNA片段下面被称为片段I。
ⅱ）另一方面，在100μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl，6mM MgCl2的缓冲液中，37℃下用EcoRI和HindIII（各20个单位）酶解20μgPCDVCL-I2小时。将酶解的质粒DNA在5%丙烯酰胺凝胺上以10V/cm作电泳1.5小时，电泳液含89mMTris，89mM硼酸，2mMEDTA。用0.5%溴化乙锭给凝胶染色，用340nm的紫外光照射，剪下相对较大分子量DNA片段的两个泳带的凝胶。将这两块凝胶用玻璃棒捣碎。悬在4ml含0.5M乙酸铵，10mM乙酸镁，1mM    EDTA，0.1%SDS的DNA萃取缓冲液中，在37℃下静置过夜。然后将其在10，000rpm下离心15分钟除去较大凝胶块，用玻璃纤维过滤。除去小凝胶碎块。再用酒精沉淀三次纯化该DNA，以水溶液形形（约200ul）贮存之。该质粒DNA下面命名为片段II。
ⅲ）用Biosystem    380A型DNA合成仪（日本NIKKAKI公司产品）合成如下所示151个碱基，将被修饰的DNA部分的引物。将合成的DNA在55℃与浓氨水反应，脱保护基，在应用前用反向高压液相色谱纯化之。
Figure 881017582_IMG2
在10ul含50mM Tris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2，5mM二硫苏糖醇的激酶缓冲液中用T4多核苷酸激酶处理合成的引物（150皮摩尔），从而使其5′端磷酸化。
ⅳ）将片段I（0.05皮摩尔），片段II（0.05皮摩尔）和5′-磷酸化引物（45皮摩尔）加入12μl含0.5 NaCl，32.5mM Tris-HCl（pH7.5），40mM MgCl2，5mMβ-巯基乙醇的5X聚合酶-连接酶缓冲液，使总体积为34.8μl。将混液在100℃沸腾3分钟，然后立即将其放置30℃的恒温器内30分钟。再放在4℃下30分钟及冰内10分钟，使其形成异质双链。
向11.6μl含该异质双链的水溶液加入20μl2.5mM的4-脱氧核苷三磷酸，2μl的10mM ATP，2个单位的Klenow酶和0.5个单位的T4DNA连接酶，使混液总体积为20μl。然后使其在16℃反应过夜以环化该DNA。
根据常规方法，用2μl含环状DNA的水溶液转化大肠杆菌HB10l菌株。用常规方法从转化体分离和纯化质粒。再用限制酶HindIII酶解该质粒，在5%丙烯酰胺凝胶上电泳。从而收集到两个分开的片段为所需修饰的变种质粒。由于该变种质粒可能与原始野生型质粒混合，所以该变种质粒可再用来转化大肠杆菌HB101，从而纯化该质粒。
这样就得到了纯化的质粒PCV44H（见图5）。
Ⅱ）修饰C-末端（图6）：
ⅰ）根据Ⅰ）ⅰ）所述同样方式处理15μg的质粒PCDVC-Ⅰ来生产片段Ⅰ。
ⅱ）根据Ⅰ）ⅱ）所述方式再用NcoI和NsiI各5个单位处理20μg质粒PCDVCL-Ⅰ来生产片段Ⅱ。
ⅲ）以Ⅰ）ⅲ）所述同样方式合成下面的引物（46个碱基，再使其5′端磷酸化。
Figure 881017582_IMG3
ⅳ）将上面Ⅱ）ⅰ）到ⅲ）所得片段Ⅰ，Ⅱ和5′-磷酸化的引物用Ⅰ）ⅳ）所述同样方法处理，得到质粒PCV44B。（见图6）
Ⅲ）将为特异抗原编码的CDNA引入表达载体（见图7）：
ⅰ）用20个单位HindIII和20个单位SacI在100μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl，6mM MgCl2的缓冲液H中，37℃下酶切10μg（约3皮摩尔）质粒PCV44H2小时，将反应混液在5%丙烯酰胺凝胶上电泳。分离纯化出467个碱基对的为该特异抗原N端编码的DNA片段。下面该片段命名为N片段。
ⅱ）用20个单位的BylII和SacI在100μlH缓冲液中，37℃酶解10μg（约3皮摩尔）的质粒，PCV44B。将混液在5%丙烯酰胺凝胶上电泳。分离和纯化出为该特异抗原C端编码的836个碱基对的DNA片段，下面将其命名为c片段。
ⅲ）用2个单位HindIII和BylII在20μlH缓冲液中，37℃下酶解2μg（约1皮摩尔）表达载体PUS△H2小时。将反应混液用等体积的水饱和的苯酚萃取，以除去蛋白质，用乙醚再萃取，然后在水中透析以脱盐。再用真空泵浓缩，得到10μl含该表达载体片段HB的水溶液。
ⅳ）将0.5皮摩尔N片段，0.5皮摩尔C片段和0.1皮摩尔的表达载体HB片段混合。在10μl含10mM Tris-HCl（pH7.5），1mM二硫苏糖醇，6mM MgCl2，1mM ATP的缓冲液中，用1个单位的T4DNA连接酶，4℃反应16小时。用常规方法取3μl反应液转化商业上可得到的大肠杆菌JM109感受态细胞。在含20μg/ml氨苄青霉素的L肉汤培养基（每升含细菌用蛋白胨10g，酵母萃取物5g，NaCl10g，琼脂15g）上筛选转化体。得到插入了该特异抗原基因的表达质粒PC244。（见图7）。
B.该特异抗原的表达
将具有PCZ44的大肠杆菌JM109菌株，30℃下在L肉汤中培养过夜。将培养物接种在稀释到1/50的新鲜肉汤培养基中，30℃下摇荡培养2小时。加入IPTG（使其浓度为2mM），再在30℃振荡培养3小时。在6500rpm下离心10分钟以收集细胞。然后再将其悬在含0.9%NaCl，10mM    Tris-HCl（pH7.5）的缓冲液中，贮存之。
C.证实该特异抗原的表达
将上面得到的细胞培养物（0.3ml）以120V电压在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时，电泳液含Tris    3g/l，甘氨酸14.4g/l，0.1%SDS。将凝胶放在硝酸纤维滤纸上，插在滤纸间，以V/cm，在4℃电泳（电泳液含Tris    3g/l，甘氨酸14.4g/l）从而将凝胶中蛋白渗入硝酸纤维滤纸上。用TBS缓冲液〔含10mM    Tris-HCl（pH7.5），50mM    NaCl〕冲洗滤纸，再将其浸在400ml含3%明胶的TBS缓冲液中，40℃下摇荡1小时。使滤纸成块。
向含1%明胶的TBS缓冲液加入稀释1/400的非甲非乙型肝炎特异抗原的单克隆抗体（oD280＝4.3）。将所得混液与纤维滤纸以每块纤维纸2ml的量放入乙烯袋中。室温下使其反应16小时。含0.05%吐温20的400mlTBS缓冲液洗三次，每次10分钟。
向含1%明胶的TBS缓冲液中加以1/1000稀释的标记第二抗体，抗小鼠IgG-PAP。将混液与纤维滤纸以每块滤纸2ml的量加入乙烯袋中。室温下反应2小时，用400ml含0.05%吐温20的TBS缓冲液洗三次，每次10分钟。
将滤纸浸入20ml含12mg4-氯-1-萘酚和过氧化氢的TBS，形成颜色。完全显色后，用水彻底冲滤纸，放入装水的乙烯袋中，贮存在黑暗冷凉处。
上述试验说明与该单克隆抗体反应的蛋白与感染了该肝炎的猩猩肝中得来的该特异抗原的蛋白相同（均为44kd）。从而证实了这种特异抗原是大肠杆菌表达的。

Claims (11)

1、一个DNA片段，它含有为感染了非甲非乙型肝炎，而产生的非甲非乙型特异抗原蛋白编码的碱基顺序。
2、根据权利要求1的DNA片段，所述的肝细胞是从人或猩猩中得到的。
3、根据权利要求1的DNA片段，其中所述对非甲非乙型肝炎特异的抗原蛋白具有下式所示的全部或部分氨基酸顺序：
10
Met  Ala  Val  Thr  Thr  Arg  Leu  Thr  Trp  Leu  His  Glu  Lys  Ile  Leu
20  30
Gln  Asn  His  Phe  Gly  Gly  Lys  Arg  Leu  Ser  Leu  Leu  Tyr  Lys  Gly
40
Ser  Val  His  Gly  Phe  His  Asn  Gly  Val  Leu  Leu  Asp  Arg  Cys  Cys
50  60
Asn  Gln  Gly  Pro  Thr  Leu  Thr  Val  Ile  Tyr  Ser  Glu  Asp  His  Ile
70
Ile  Gly  Ala  Tyr  Ala  Glu  Glu  Gly  Tyr  Gln  Glu  Arg  Lys  Tyr  Ala
80  90
Ser  Ile  Ile  Leu  Phe  Ala  Leu  Gln  Glu  Thr  Lys  Ile  Ser  Glu  Trp
100
Lys  Leu  Gly  Leu  Tyr  Thr  Pro  Glu  Thr  Leu  Phe  Cys  Cys  Asp  Val
110  120
Ala  Lys  Tyr  Asn  Ser  Pro  Thr  Asn  Phe  Gln  Ile  Asp  Gly  Arg  Asn
130
Arg  Lys  Val  Ile  Met  Asp  Leu  Lys  Thr  Met  Glu  Asn  Leu  Gly  Leu
140  150
Ala  Gln  Asn  Cys  Thr  Ile  Ser  Ile  Gln  Asp  Tyr  Glu  Val  Phe  Arg
160
Cys  Glu  Asp  Ser  Leu  Asp  Glu  Arg  Lys  Ile  Lys  Gly  Val  Ile  Glu
170  180
Leu  Arg  Lys  Ser  Leu  Leu  Ser  Ala  Leu  Arg  Thr  Tyr  Glu  Pro  Tyr
190
Gly  Ser  Leu  Val  Gln  Gln  Ile  Arg  Ile  Leu  Leu  Leu  Gly  Pro  Ile
200  210
Gly  Ala  Gly  Lys  Ser  Ser  Phe  Phe  Asn  Ser  Val  Arg  Ser  Val  Phe
220
Gln  Gly  His  Val  Thr  His  Gln  Ala  Leu  Val  Gly  Thr  Asn  Thr  Thr
230  240
Gly  Ile  Ser  Glu  Lys  Tyr  Arg  Thr  Tyr  Ser  Ile  Arg  Asp  Gly  Lys
250
Asp  Gly  Lys  Tyr  Leu  Pro  Phe  Ile  Leu  Cys  Asp  Ser  Leu  Gly  Leu
260  270
Ser  Glu  Lys  Glu  Gly  Gly  Leu  Cys  Met  Asp  Asp  Ile  Ser  Tyr  Ile
280
Leu  Asn  Gly  Asn  Ile  Arg  Asp  Arg  Tyr  Gln  Phe  Asn  Pro  Met  Glu
290  300
Ser  Ile  Lys  Leu  Asn  His  His  Asp  Tyr  Ile  Asp  Ser  Pro  Ser  Leu
310
Lys  Asp  Arg  Ile  His  Cys  Val  Ala  Phe  Val  Phe  Asp  Ala  Ser  Ser
320  330
Ile  Glu  Tyr  Phe  Ser  Ser  Gln  Met  Ile  Val  Lys  Ile  Lys  Arg  Ile
340
Arg  Arg  Glu  Leu  Val  Asn  Ala  Gly  Val  Val  His  Val  Ala  Leu  Leu
350  360
Thr  His  Val  Asp  Ser  Met  Asp  Leu  Ile  Thr  Lys  Gly  Asp  Leu  Ile
370
Glu  Ile  Glu  Arg  Cys  Val  Pro  Val  Arg  Ser  Lys  Leu  Glu  Glu  Val
380  390
Gln  Arg  Lys  Leu  Gly  Phe  Ala  Leu  Ser  Asp  Ile  Ser  Val  Val  Ser
400
Asn  Tyr  Ser  Ser  Glu  Trp  Glu  Leu  Asp  Pro  Val  Lys  Asp  Val  Leu
410  420
Ile  Leu  Ser  Ala  Leu  Arg  Arg  Met  Leu  Trp  Ala  Ala  Asp  Asp  Phe
430
Leu  Glu  Asp  Leu  Pro  Phe  Glu  Gln  Ile  Gly  Asn  Leu  Arg  Glu  Glu
440
Ile  Ile  Asn  Cys  Ala  Gln  Gly  Lys  Lys  ＊＊＊.
4、根据权利要求1的DNA片段，其中的碱基顺序包括下式所示的全部或部分碱基顺序：
10  20  30  40
5′ATG  GCA  GTG  ACA  ACT  CGT  TTG  ACA  TGG  TTG  CAT  GAA  AAG  ATC
3′
50  60  70  80
CTG  CAA  AAT  CAT  TTT  GGA  GGG  AAG  CGG  CTT  AGC  CTT  CTC  TAT
90  100  110  120
AAG  GGT  AGT  GTC  CAT  GGA  TTC  CAT  AAT  GGA  GTT  TTG  CTT  GAC
130  140  150  160
AGA  TGT  TGT  AAT  CAA  GGG  CCT  ACT  CTA  ACA  GTG  ATT  TAT  AGT
170  180  190  200  210
GAA  GAT  CAT  ATT  ATT  GGA  GCA  TAT  GCA  GAA  GAG  GGT  TAC  CAG
220  230  240  250
GAA  AGA  AAG  TAT  GCT  TCC  ATC  ATC  CTT  TTT  GCA  CTT  CAA  GAG
260  270  280  290
ACT  AAA  ATT  TCA  GAA  TGG  AAA  CTA  GGA  CTA  TAT  ACA  CCA  GAA
300  310  320  330
ACA  CTG  TTT  TGT  TGT  GAC  GTT  GCA  AAA  TAT  AAC  TCC  CCA  ACT
340  350  360  370
AAT  TTC  CAG  ATA  GAT  GGA  AGA  AAT  AGA  AAA  GTG  ATT  ATG  GAC
380  390  400  410  420
TTA  AAG  ACA  ATG  GAA  AAT  CTT  GGA  CTT  GCT  CAA  AAT  TGT  ACT
430  440  450  460
ATC  TCT  ATT  CAG  GAT  TAT  GAA  GTT  TTT  CGA  TGC  GAA  GAT  TCA
470  480  490  500
CTG  GAC  GAA  AGA  AAG  ATA  AAA  GGG  GTC  ATT  GAG  CTC  AGG  AAG
510  520  530  540
AGC  TTA  CTG  TCT  GCC  TTG  AGA  ACT  TAT  GAA  CCA  TAT  GGA  TCC
550  560  570  580
CTG  GTT  CAA  CAA  ATA  CGA  ATT  CTG  CTG  CTG  GGT  CCA  ATT  GGA
590  600  610  620  630
GCT  GGG  AAG  TCT  AGC  TTT  TTC  AAC  TCA  GTG  AGG  TCT  GTT  TTC
640  650  660  670
CAA  GGG  CAT  GTA  ACG  CAT  CAG  GCT  TTG  GTG  GGC  ACT  AAT  ACA
680  690  700  710
ACT  GGG  ATA  TCT  GAG  AAG  TAT  AGG  ACA  TAC  TCT  ATT  AGA  GAC
720  730  740  750
GGG  AAA  GAT  GGC  AAA  TAC  CTG  CCA  TTT  ATT  CTG  TGT  GAC  TCA
760  770  780  790
CTG  GGG  CTG  AGT  GAG  AAA  GAA  GGC  GGC  CTG  TGC  ATG  GAT  GAC
800  810  820  830  840
ATA  TCC  TAC  ATC  TTG  AAC  GGT  AAC  ATT  CGT  GAT  AGA  TAC  CAG
850  860  870  880
TTT  AAT  CCC  ATG  GAA  TCA  ATC  AAA  TTA  AAT  CAT  CAT  GAC  TAC
890  900  910  920
ATT  GAT  TCC  CCA  TCG  CTG  AAG  GAC  AGA  ATT  CAT  TGT  GTG  GCA
930  940  950  960
TTT  GTA  TTT  GAT  GCC  AGC  TCT  ATT  GAA  TAC  TTC  TCC  TCT  CAG
970  980  990  1000
ATG  ATA  GTA  AAG  ATC  AAA  AGA  ATT  CGA  AGG  GAG  TTG  GTA  AAC
1010  1020  1030  1040  1050
GCT  GGT  GTG  GTA  CAT  GTG  GCT  TTG  CTC  ACT  CAT  GTG  GAT  AGC
1060  1070  1080  1090
ATG  GAT  CTG  ATT  ACA  AAA  GGT  GAC  CTT  ATA  GAA  ATA  GAG  AGA
1100  1110  1120  1130
TGT  GTG  CCT  GTG  AGG  TCC  AAG  CTA  GAG  GAA  GTC  CAA  AGA  AAA
1140  1150  1160  1170
CTT  GGA  TTT  GCT  CTT  TCT  GAC  ATC  TCG  GTG  GTT  AGC  AAT  TAT
1180  1190  1200  1210
TCC  TCT  GAG  TGG  GAG  CTG  GAC  CCT  GTA  AAG  GAT  GTT  CTA  ATT
1220  1230  1240  1250  1260
CTT  TCT  GCT  CTG  AGA  CGA  ATG  CTA  TGG  GCT  GCA  GAT  GAC  TTC
1270  1280  1290  1300
TTA  GAG  GAT  TTG  CCT  TTT  GAG  CAA  ATA  GGG  AAT  CTA  AGG  GAG
1310  1320  1330
GAA  ATT  ATC  AAC  TGT  GCA  CAA  GGA  AAA  AAA  3′
5′
其中的“-”号代表与上面每个碱基符号互补的一个碱基。
5、一个表达载体，其中将具有含为非甲非乙型肝炎特异抗原编码的碱基顺序的DNA片段插入到该载体启动子下游的克隆切点内。
6、根据权利要求5的表达载体，其中的启动子是可被调节因子控制的。
7、根据权利要求5的表达载体，其中的启动子在微生物中行使其功能。
8、根据权利要求5的表达载体，其中的启动子在真核细胞中行使其功能。
9、用表达载体转化宿主得到的转化体，该表达载体中将一个含为非甲非乙型肝炎特异抗原编码碱基顺序的DNA片段从该载体启动子的下游引入克隆切点。
10、根据权利要求9的转化体，其中所用宿主为大肠杆菌或枯草杆菌。
11、生产非甲非乙型肝炎特异抗原的方法，包括将含为该特异抗原编码碱基顺序的DNA片段从表达载体启动子的下游引入克隆点，将含该DNA片段的表达载体引入宿主，培养该转化载体和收集所生产和累积的抗原。
CN88101758A 1987-03-31 1988-03-31 为非甲非乙型肝炎特异性抗原编码的dna片段，含该dna片段的表达载体，其转化体及生产该抗原的方法 Pending CN1031717A (zh)

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