CN103044961A - 一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，用下述方法制成：在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和500-600克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，反应，降温，将反应液在搅拌下倒入蒸馏水中，加入氯化钠使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入生理盐水中，用三乙胺、二甲胺或三乙醇胺调pH值至中性，用高剪切均质机分散，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。应用本发明的酞菁蓝水溶液进行动物心肌缺血再灌注模型染色，目标边界清晰，目标区染色均匀，非目标区亦不会被染料污染，水溶解度高，可实现性强，可靠性高，提高酞菁蓝利用效率，效果好。

Description

一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液

技术领域

本发明涉及一种动物模型染料。

背景技术

现在用的伊文斯蓝为动物模型染色中一直沿用的经典蓝色染料，水溶性，灌注后能与血浆蛋白牢固结合，不进入细胞内液，浸染迅速，但摘取实验动物心脏及切片时很容易导致非缺血区残余染料浸染缺血区。《Refined approach for quantification of in vivoischemia-reperfusion injury in the mouse heart》（Am J Physiol Heart Circ Physiol2009）首次提出了酞菁蓝过滤液取代依文斯蓝应用于实验动物心肌缺血再灌注模型染色，染色效果明显优于依文思蓝。其制备方法是将酞菁蓝粉末溶于生理盐水，过滤后得到5%的酞菁蓝过滤液，但是此法很难避免微小颗粒对冠脉微血管的机械性堵塞，影响真实边界的呈现，且制备产率低。本实验组曾分别应用生理盐水、生理盐水+十二烷基硫酸钠溶解酞菁蓝，最终均只得到5%的酞菁蓝溶液。酞菁蓝本身是一种艳绿光蓝色棒状晶体，不溶于水、醇及其他常见溶剂，仅溶于浓硫酸呈橄榄色溶液，稀释后可析出蓝色悬浮体；而酞菁蓝粉末直接应用高剪切乳化剂分散，所得粉末会很快聚集成块状物。其难溶性和分散后易聚集性是现实动物实验染色中应用酞菁蓝的最大障碍。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，用下述方法制成：

在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和500-600克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，在120-130℃保温反应8-12小时，降温至20-30℃，将反应液在搅拌下倒入800-1200克蒸馏水中，加入氯化钠250-300克使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入50-100克生理盐水中，用三乙胺、二甲胺或三乙醇胺调pH值至中性，用高剪切均质机分散60分钟，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

应用本发明的一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液进行动物心肌缺血再灌注模型染色，缺血区与非缺血区分界清晰，非缺血区染色均匀，缺血区亦不会被染料污染，水溶解度高，可实现性强，可靠性高，提高酞菁蓝利用效率，效果好。

附图说明

图1为利用本发明的酞菁蓝水溶液对动物心肌缺血再灌注模型染色。

黑色箭头指向的灰白色区域为缺血区(即未被酞菁蓝或伊文斯蓝浸染区),白色箭头所指的黑色区域为非缺血区(即被酞菁蓝或伊文斯蓝浸染区)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，用下述方法制成：

在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和550克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，在125℃保温反应10小时，降温至25℃，将反应液在搅拌下倒入1000克蒸馏水中，加入氯化钠280克使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入90克生理盐水中，用三乙胺调pH值至中性，用型号CGJB60-70的高剪切均质机分散60分钟，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

实施例2

一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，用下述方法制成：

在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和500克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，在120℃保温反应12小时，降温至30℃，将反应液在搅拌下倒入1200克蒸馏水中，加入氯化钠300克使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入100克生理盐水中，用二甲胺调pH值至中性，用型号CGJB60-70高剪切均质机分散60分钟，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

实施例3

一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，用下述方法制成：

在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和600克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，在130℃保温反应8小时，降温至20℃，将反应液在搅拌下倒入800克蒸馏水中，加入氯化钠250克使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入50克生理盐水中，用三乙醇胺调pH值至中性，用型号CGJB60-70高剪切均质机分散60分钟，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

实验证明，用基它型号的高剪切均质机也可以过到相似的效果。

酞菁蓝BGS分子式：C₃₂H₁₆N₈Cu

结构式：

通过浓硫酸向酞菁蓝分子中引入磺酰基(-SO3H)，经过磺化反应，除了增加产物的水溶性和酸性外，还可以使产品具有表面活性。

磺化目的：赋予磺化铜酞菁酸性、水溶性、表面活性剂和对纤维蛋白等的亲和力

盐析反应：氯化钠适量使磺化铜酞菁沉淀。磺化物溶于水，而加盐可减小磺化物的溶解度。

用三乙胺与磺化铜酞菁发生中和反应。

高剪切均质机可以迅速将残余微粒破碎成0.1μm-2μm的微粒。可使磺化铜酞菁与三乙胺反应生产的物质在短时间内完成微粒化、乳化、搅拌、调匀、分散。最终可得到酞菁蓝溶液。由于毛细血管是极细微的血管，管径平均为6-9μm，故经上述处理后的酞菁蓝微粒足以通过毛细血管而不造成栓塞。由于前期的一系列处理，也大大增加了其水溶性，比酞菁蓝粉末直接乳化得到分散微粒后再溶于水的酞菁蓝过滤液，浸染效果要更稳定，酞菁蓝利用率也较之大大提高。

药效实验：

雄性Wistar大鼠30只，体重（260±10g；），依次分成三组，第1组为硫磺素S-酞菁蓝过滤液-TTC染色组、第2组为硫磺素S-伊文斯蓝溶液-TTC染色组、第3组为硫磺素S-酞菁蓝水溶液-TTC染色组。

用0.4%戍巴比妥钠（40mg/kg）对大鼠腹腔麻醉，气管插管，接呼吸机、心电图。采用胸外结扎法，Y形线结扎左冠状动脉，诱导缺血1h后，剪断结扎线，完成再灌注。缺血时，心肌局部变暗，活动减弱，心电图ST-T呈明显上抬。再灌注时，心肌局部搏动恢复，心电图有不同程度的坏死性Q波及ST段回落。再灌注2h后，对第1组大鼠自右颈总动脉逆向注入质量浓度为1%的硫磺素S水溶液0.5mL，再次结扎冠状动脉，再经右颈总动脉注入质量浓度为5.0%的酞菁蓝过滤液0.8mL（以0.9%的生理盐水为溶剂）；

对第2组大鼠自右颈总动脉逆向注入质量浓度为1%的硫磺素S水溶液0.5mL，再次结扎冠状动脉，再经右颈总动脉注入质量浓度为2.0%的伊文斯蓝溶液0.8mL（以0.9%的生理盐水为溶剂）；

对第3组大鼠自右颈总动脉逆向注入质量浓度为1%的硫磺素S水溶液0.5mL，再次结扎冠状动脉，再经右颈总动脉注入质量浓度为2.0%的酞菁蓝水溶液0.8mL(本发明实施例1制备)；

染色均匀后取出心脏，自结扎线以下，水平切成约2mm的薄片，荧光显微镜下观察无复流区域并采集图像，然后将缺血区心肌片置于0.5％TTC(氯化三苯四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride）,美国Sigma公司，用0.9%的生理盐水溶解的，pH=7.4）溶液中避光孵育（37℃）15min，采集图像，IPP软件分析并计算无复流和梗死心肌面积。TTC浸染后,自各组大鼠中随机选择一只大鼠,其心肌切片染色图像见图1。

实验证明，实施例2或实施例3制备的一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，也具有与实施例1制备的一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液相似的结果。

Claims (1)

1.一种用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液，其特征是用下述方法制成：

在带有搅拌的容器中，加入10克酞菁蓝粉末和500-600克发烟硫酸，开启搅拌并缓慢升温，在120-130℃保温反应8-12小时，降温至20-30℃，将反应液在搅拌下倒入800-1200克蒸馏水中，加入氯化钠250-300克使磺化铜酞菁沉淀析出，过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼加入50-100克生理盐水中，用三乙胺、二甲胺或三乙醇胺调pH值至中性，用高剪切均质机分散60分钟，得到用于动物模型染色的酞菁蓝水溶液。

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