CN103018082A - 重金属回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂 - Google Patents

重金属回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重金属回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂。具体地，本发明提供一种抑制待测体间的重金属回收率的偏差的重金属回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂。制备待测体和能够与重金属螯合的螯合剂的混合液，在巯基的掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物，并且通过回收所述络合物来回收所述待测体中的重金属。由此能够抑制待测体间的回收率的偏差并回收重金属。所述螯合剂优选1，5-二苯基-3-硫卡巴腙(双硫腙)，所述掩蔽剂可以使用N-乙基马来酰亚胺、碘代乙酰胺、碘乙酸等。

Description

重金属回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂
相关申请的交叉引用
本申请主张2011年9月22日申请的日本申请特愿2011-207905、2012年8月21日申请的日本申请特愿2012-182467为基础的优先权，其中记载的全部内容合并与此。
技术领域
本发明涉及重金属的回收方法以及其中使用的重金属回收用试剂。
背景技术
已知汞、镉、铅、砷等重金属在人体中蓄积并对健康产生不良影响。因此，尿等生物试样、水等饮品食品试样中的重金属的分析是重要的。
重金属的分析中，一般作为前处理，从试样中去除杂质，分离重金属，然后对所述分离的重金属进行分析。所述前处理通用溶剂提取。所述溶剂提取是利用与重金属结合的螯合剂的极性并基于对于水性介质和有机介质的分配系数的差异来将试样中的重金属提取到所述有机介质中的方法。提取之后，通过使所述有机介质蒸发，还能够浓缩所述重金属。作为具体例，例如，JIS规定了双硫腙法，该方法在酸性条件的水性介质中将不溶性的1，5-二苯基-3-硫卡巴腙(以下也称“双硫腙”)作为所述螯合剂使用(参见汞分析手册(水銀分析マニュァル)环境省 平成16年3月、特许第2969226号)。所述双硫腙法首先在酸性条件下混合所述双硫腙和所述尿等液体待测体(或称“待测物”)，从而在所述混合液中形成所述双硫腙和所述液体待测体中的重金属的络合物。接着，向所述混合液中添加四氯化碳或氯仿等有机介质。这样，所述络合物由于对于水性介质和有机介质的分配系数不同，而被提取到所述有机介质中。通过回收该有机介质，能够从所述液体待测体以所述络合物的状态回收重金属。另外，如果使所述有机介质蒸发，还能够浓缩重金属。
但是，本发明人明确了在用这样的方法回收重金属的情况下虽在相同条件下进行处理但待测体间回收率存在偏差的问题。因为待测体间回收率存在偏差，因此在定量回收重金属的情况下，定量结果的可靠性有可能不充分。
发明内容
因此，本发明目的在于提供一种抑制待测体间的重金属回收率的偏差的重金属回收方法。
为了达到所述目的，本发明的重金属回收方法的特征在于，包括：
络合物形成步骤，制备待测体和能够与重金属螯合的螯合剂的混合液，并在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物；以及
重金属回收步骤，通过回收所述络合物来回收所述待测体中的重金属，
在所述络合物形成步骤中，在巯基的掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述络合物。
本发明的重金属分析方法的特征在于，包括：通过所述本发明的重金属回收方法从待测体中回收重金属的重金属回收步骤；以及分析所述重金属的分析步骤。
本发明的重金属回收用试剂的特征在于，包含能够与重金属螯合的螯合剂和巯基的掩蔽剂。
根据本发明，通过在所述掩蔽剂的存在下，形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物，能够抑制上面所述那样的待测体之间的回收率的偏差。另外，关于回收率低的待测体，例如也可能提高回收率。因此，能够进行可靠性更加优异的重金属分析。因此，本发明例如在针对源自生物体的待测体的临床检查、环境试验等中是极其有用。
具体实施方式
本发明人针对从待测体中回收重金属，为了阐明待测体间的回收率的偏差的原因，进行了锐意研究。其结果，发明人获得了如下见解：待测体中，尤其是对于源自正在接受用于排出生物体内蓄积的重金属的解毒疗法的患者的待测体，回收率的偏差显著，而且回收率低。所述解毒疗法一般是为了排出生物体的重金属而施与螯合剂的方法，作为所述螯合剂，例如使用内消旋-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)等。因此，本发明人推测：所述DMSA由于具有巯基，因此源自所述待测体的DMSA的巯基与从外部添加的双硫腙竞争待测体中的重金属，其结果是，待测体中的重金属不能充分地与双硫腙形成络合物，回收率降低。因此，在形成双硫腙等螯合剂与所述重金属的络合物时，实际上，当并用了巯基的掩蔽剂时，实现了抑制待测体间回收率的偏差、提高回收率的效果。
本发明不仅能够应用于前述那样的源自正接受所述解毒疗法的患者的待测体，而且也能够应用于源自健康人的待测体。在源自生物体、食品和环境等的待测体中，例如由于大量存在作为氨基酸的半胱氨酸等、含巯基化合物，因此由于这些化合物也会产生与所述DMSA相同的影响。因此，我们理解为：通过使用所述掩蔽剂，也能够消除可能基于与DMSA同样的原因而由这些含巯基化合物产生的待测体间的回收率的偏差。此外，本发明并不限制于这些推定。
<重金属的回收方法>
如前所述，本发明的重金属回收方法的特征在于，包括：络合物形成步骤，制备待测体和能够与重金属螯合的螯合剂的混合液并在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物；以及重金属回收步骤，通过回收所述络合物来回收所述待测体中的重金属；在所述络合物形成步骤中，在巯基的掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述络合物。
本发明的特征在于，在所述掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物，其他的构成和条件无任何限制。
在本发明的回收方法中，回收目标重金属无特别限制。所述重金属例如可举出Bi(铋)、Hg(汞)、Cd(镉)、Pd(钯)、Zn(锌)、Tl(铊)、Ag(银)、Pb(铅)等。待测体中的所述重金属的形态无特别限制，例如可以是重金属的单体，也可以是重金属的合金，也可以是含有重金属的化合物。所述含有重金属的化合物例如可以是含有重金属的有机化合物，也可以是含有重金属的无机化合物。在所述重金属为Hg的情况下，例如可以是有机汞，也可以是无机汞。本发明的回收方法中，回收目标重金属例如可以是一种，也可以是两种以上。本发明的回收方法例如也可以从所述待测体中通过一次的回收处理同时回收两种以上的重金属。
在本发明的回收方法中，所述待测体无特别限制。所述待测体例如可以举出源自生物体的待测体、源自环境的待测体、化学物质、医药用品等。所述化学物质例如可以举出试剂、农药或化妆品等。所述源自生物体的待测体无特别限制，可举出尿、血液、毛发、脐带等。所述血液待测体例如可举出红细胞、全血、血清、血浆等。其中，优选尿待测体。所述源自环境的待测体无特别限制，例如可举出生物、食品、水、土壤、大气/空气等。所述生物待测体例如可以是鱼贝类等动物或者植物等。所述食品待测体例如可以举出生鲜食品或加工食品等。所述水待测体例如可以举出饮用水、地下水、河水、海水、生活排水等。
所述待测体例如从处理容易的角度来说优选液状的待测体(液体待测体)。所述待测体例如可以将未稀释液直接用作液体待测体，也可以将悬浮、分散或者溶解在介质中的稀释液用作液体待测体。在所述待测体为固体的情况下，例如，可以将所述悬浮、分散或者溶解在介质中的稀释液用作液体待测体。以下将所述介质称为稀释介质。所述稀释介质无特别限制，例如可以举出水、缓冲液等。所述缓冲液无特别限制，例如可以举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥缓冲液、各种Good缓冲液等。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
在本发明中，“掩蔽”是指使SH基的反应性失活的意思。例如，能够通过SH基的化学修饰来进行。所述掩蔽剂无特别限制，例如，可以使用公知的掩蔽剂，包括所谓的SH抑制剂。所述化学修饰无特别限制，例如可举出烷基化、加成到活性双键、烯丙基化、与二硫键的交换反应、氧化、氰化、硫醇化等。
所述掩蔽剂例如可以使用从由选自下述结构式(1)～(3)所组成的组中的至少一种结构式表示的化合物。用下述结构式(1)～(3)表示的化合物例如可以使用任一种，也可以并用两种以上。
Figure BSA00000783255000051
在所述结构式(1)中，R表示氢、烷基、苯基或者苄基。在所述结构式(2)中，R表示氢、烷基、苯基或苄基，X表示卤素。在所述结构式(3)中，R表示氢、烷基、苯基或苄基，X表示卤素。
所述烷基无特别限制，例如可以举出直链状或者分枝状的烷基或芳香族烷基。所述烷基的碳数例如为1～7，优选为1～6，更优选为1～2，进一步优选为2。所述直链状或者分枝状的烷基例如可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。所述烷基中，例如氢可以被取代，也可以未被取代。
所述苯基、苄基中，例如氢可以被取代，也可以未被取代。所述卤素例如可以举出氟、氯、溴、碘等。
用所述结构式(1)表示的掩蔽剂，例如可举出马来酰亚胺、N-甲基马来酰亚胺、N-乙基马来酰亚胺、N-苯基马来酰亚胺、马来酰亚胺基丙酸等，优选N-乙基马来酰亚胺。用所述结构式(1)表示的化合物例如可以是任一种，也可以并用两种以上。
所述结构式(2)所表示的掩蔽剂例如可举出碘代乙酰胺等卤代乙酰胺等，优选碘代乙酰胺。所述结构式(2)所示的化合物例如可以均为一种，也可以并用两种以上。
所述结构式(3)所示的掩蔽剂例如可举出作为作为卤乙酸等的碘乙酸等，优选碘乙酸。所述结构式(3)所示的化合物，例如可以为任一种，也可以并用两种以上。
在本发明的回收方法中，所述螯合剂例如优选含有含硫基团的螯合剂。所述含硫基团为含有硫原子的官能团。所述含硫基团例如优选硫酮基。所述硫酮基无特别限制，例如可以举出硫卡巴腙基、缩氨基硫脲基、硫卡巴二腙(チオカルバジァゾン)基、硫脲基、氨基硫脲基和红氨酸(ルベァメ一卜)基。
硫卡巴腙基
缩氨基硫脲基
Figure BSA00000783255000062
硫卡巴二腙基
Figure BSA00000783255000063
硫脲基
Figure BSA00000783255000071
氨基硫脲基
Figure BSA00000783255000072
红氨酸基
所述螯合剂例如优选下述结构式(4)表示的螯合剂。
Figure BSA00000783255000074
在所述结构式(4)中，R1和R2分别表示苯基。即，所述结构式(4)所示的螯合剂为含有硫卡巴腙基的螯合剂，为1，5-二苯基-3-硫卡巴腙(双硫腙)。所述结构式(1)例如也可以是盐。
所述苯基中，例如氢可以被取代。在取代的情况下，所述氢例如可以被取代成卤素、钠和钾等碱金属等。
在发明的回收方法中，如前所述，所述螯合剂优选为含有含硫基团的螯合剂。所述含硫基团例如可以举出硫酮基，所述含有含硫基团的螯合剂例如可以举出含有从包括硫卡巴腙基、缩氨基硫脲基、硫卡巴二腙基、硫脲基、氨基硫脲基和红氨酸基的组中选择的至少一种基团的螯合剂。作为所述螯合剂的具体示例，例如可以例示下述的螯合剂。本发明中，这些螯合剂仅为示例，本发明不限于这些记载。
(a1)含有硫卡巴腙基的螯合剂
例如，1，5-二(2-萘基)硫卡巴腙
(a2)含有缩氨基硫脲基的螯合剂
例如，丙酮缩氨基硫脲、丙酮苯乙酮缩氨基硫脲
(a3)含有硫卡巴二腙基的螯合剂
例如，二苯基硫卡巴二腙
(a4)含有硫脲基的螯合剂
例如，1-乙酰基-2-硫脲、脒基硫脲(グァニルチオ尿素)、1，3-二(二甲氨基丙基)-2-硫脲、四甲基硫脲、N，N’-二乙基硫脲、N，N’-二异丙基硫脲、N，N’-丁基硫脲、1，3-二(二甲氨基丙基)-2-硫脲、N-烯丙基-N’-二(2-羟乙基)硫脲、N，N’-二(2-羟乙基)硫脲、二乙酰基硫脲、苯基硫脲、N，N’-二苯基硫脲、单-邻-甲苯基硫脲、N，N’-二-邻-甲苯基硫脲、苯酰硫脲
(a5)含有氨基硫脲基的螯合剂
例如，苯基氨基硫脲(苯基チオセミカルバジド)，4-苯基氨基硫脲(4-フエニルチオセミカルバジド)、4-甲基氨基硫脲、氨基硫脲
(a6)含有红氨酸基的螯合剂
例如二硫代草酰胺(红氨酸)
在所述络合物形成步骤中，所述待测体、所述螯合剂乙基所述掩蔽剂的添加顺序无特别限制。作为具体例，例如可以在将所述掩蔽剂添加到所述待测体中之后，再添加所述螯合剂，也可以将所述掩蔽剂和所述螯合剂同时添加到所述待测体中。
所述混合液中所述待测体的浓度无特别限制，例如为0.1～100μg/L的范围。在所述混合液中，未稀释的待测体的浓度优选为所述范围。
所述混合液中所述掩蔽剂的浓度无特别限制，例如为5～30mg/mL的范围，优选为10～20mg/mL的范围。
在所述混合液中，所述掩蔽剂和所述待测体的混合比例无特别限制，例如，相对于1mL所述待测体，所述掩蔽剂为5～30mg的范围，更优选为10～20mg的范围。
所述混合液中的所述螯合剂的浓度无特别限制，例如为0.1～0.3mg/mL的范围。
在所述混合液中，所述螯合剂和所述待测体的混合比例无特别限制，例如，相对于1mL所述待测体，所述螯合剂优选为0.1～0.3mg的范围。
所述重金属回收步骤无特别限制，只要回收所述络合物即可。所述重金属例如可以作为所述络合物被回收，也可以进一步从回收的所述络合物中游离，作为单体的重金属回收。
以下举例说明本发明的回收方法，但是本发明不限于这些实施方式。
(1)第一实施方式
第一实施方式的回收方法是使用所述结构式(4)所示的螯合剂作为所述螯合剂并通过水性溶剂回收重金属的示例。
本实施方式的回收方法中，所述络合物形成步骤包括下述(1A)步骤，所述重金属回收步骤包括下述(1B)步骤和下述(1C)步骤。
(1A)络合物形成步骤，在所述螯合剂能够在水性溶剂不溶解的pH条件下，制备所述待测体和所述螯合剂的混合液，在所述掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物；
(1B)络合物回收步骤，从所述混合液中回收所述络合物；
(1C)络合物溶解步骤，在碱性条件下，将回收的所述络合物溶解于水性介质，回收重金属。
根据本实施方式，通过利用由于pH条件的不同而引起的所述螯合剂对水性介质的溶解性的差异，能够实质上不使用有机介质简便地回收重金属。另外，根据本实施方式，能够提高重金属的回收率和重金属的浓缩率。
(1A)络合物形成步骤
所述络合物形成步骤在所述螯合剂能够在水性溶剂中不溶解的pH条件下，制备所述待测体和所述螯合剂的混合液，在所述掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物。以下将“所述螯合剂能够在水性溶剂中不溶解的pH条件”也称为“不溶解pH条件”。
在所述不溶解pH条件下，所述螯合剂能够维持在所述混合液中不溶解的状态。因此，在所述待测体中存在重金属的情况下，在所述混合液中，所述螯合剂和所述待测体中的重金属形成络合物。所述螯合剂优选在所述混合液中例如为全部未溶解的状态，但是也可以是一部分所述螯合剂溶解了的状态。在后者的情况下，例如，即使一部分螯合剂溶解了，只要能够与所述重金属形成络合物的量的螯合剂以未溶解的状态存在于所述混合液中即可。
在所述络合物形成步骤中，所述不溶解pH条件无特别限制。所述不溶解pH条件例如可以举出酸性条件(pH5以下)、中性条件(pH6～7)、碱性条件(pH超过7且小于等于8)。所述不溶解pH条件例如其上限为pH8，优选的是pH6.8，更优选的是pH4，进一步优选的是pH3，尤其优选的是pH2。所述不溶解pH条件的下限无特别限制，例如优选pH1。所述不溶解pH条件例如可以根据使用的所述螯合剂的种类而适当设定。
含有所述螯合剂和所述待测体的所述混合液只要实质上是水性介质即可。所述水性介质为非有机介质，即表示所谓的水性的液体。“实质上为水性介质”例如表示除了完全的水性介质之外，也可以是含有微量的有机介质(所谓有机溶剂)的水性介质。
当与所述待测体混合时，所述螯合剂的形状无特别限制，例如可以是干燥状态(或者也称固体状态)，也可以是液体状态。在后者的情况下，所述螯合剂优选是分散在所述螯合剂不溶解的非有机介质中的所述螯合剂的分散液。以下，将分散所述螯合剂的所述非有机介质称为“分散介质”。所述分散介质例如是所述不溶解pH条件的非有机介质(水性介质)。在所述不溶解pH条件为酸性条件的情况下，所述分散介质例如可以举出酸及其水溶液、所述酸性条件的缓冲液。在所述不溶解pH条件为碱性条件的情况下，例如可以举出碱及其水溶液、所述碱性条件的缓冲液。在所述不溶解pH条件为中性条件的情况下，所述分散介质例如可以举出水、中性的水溶液、所述中性条件的缓冲液，此外，还可以举出前述的酸及其水溶液、所述酸性条件的缓冲液、碱及其水溶液、所述碱性条件的缓冲液等。
所述酸无特别限制。例如可以举出盐酸、硫酸、醋酸、硼酸、磷酸、柠檬酸等。所述酸的水溶液例如可以举出将酸用水或者缓冲液酸稀释了的溶液。用于稀释酸的所述缓冲液无特别限制，可以使用前述那样一般的缓冲液。所述酸的水溶液中，所述酸的浓度无特别限制，例如为大于0且小于等于1N，优选0.01～0.1N。所述酸性条件的缓冲液无特别限制，例如可以举出柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Good缓冲液等。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
所述中性水溶液无特别限制，例如可以举出生理盐水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。所述中性条件的缓冲液无特别限制。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
所述碱无特别限制，例如可以举出氢氧化钠、氢氧化钾等。所述碱性的水溶液例如可以举出将碱用水或缓冲液稀释的溶液。用于稀释所述碱的所述缓冲液无特别限制，可以使用前述的一般的缓冲液。所述碱性的水溶液中，所述碱的浓度无特别限制，例如为大于0且小于等于7×10-3N。所述碱性条件的缓冲液无特别限制，例如可以举出Tris-NaOH、Tris-HCl、碳酸缓冲液、Good缓冲液等。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
所述待测体和所述螯合剂的混合方法无特别限制。所述待测体和所述螯合剂例如可以举出下述(x)～(z)等混合方法的示例。
(x)将预先调节至所述不溶解pH条件的所述待测体和所述螯合剂混合。
(y)将预先调节至所述不溶解pH条件的所述螯合剂和所述待测体混合。
(z)将所述不溶解pH条件的非有机介质与所述螯合剂以及所述待测体混合。
所述(x)～(z)中，所述掩蔽剂例如可以预先与所述螯合剂混合，也可以预先与所述待测体混合，也可以预先与所述非有机介质混合。所述掩蔽剂例如可以混合至调节至所述不溶解pH条件下之前的所述待测体和所述螯合剂中的任一者中，也可以混合至调节至所述不溶解pH条件之后的所述待测体和所述螯合剂的任一者中。
所述(x)中，例如通过将调节至所述不溶解pH条件的所述待测体和所述螯合剂混合，能够制备所述不溶解pH条件的所述混合液，在所述混合液中，能够形成所述络合物。此时，例如调节所述待测体的pH，以使通过其与所述螯合剂混合而制备的所述混合液变为所述不溶解pH条件。
在所述不溶解pH条件为酸性条件的情况下，例如将所述待测体调节至所述酸性条件的方法无特别限制。所述调节例如可以通过向所述待测体中添加酸性试剂来进行。所述酸性试剂例如可以举出酸及其水溶液、所述酸性条件的缓冲液等。所述酸无特别限制，例如可以举出盐酸、硫酸、柠檬酸、硼酸、磷酸、醋酸等。所述酸的水溶液例如可以举出将酸用水或缓冲液稀释的溶液。用于稀释酸的所述缓冲液无特别限制，能够使用前述的一般的缓冲液。在所述酸的水溶液中，所述酸的浓度无特别限制，例如为0.01～5N。所述酸性条件的缓冲液无特别限制，例如可以举出柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Good缓冲液等。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
在所述不溶解pH条件为碱性条件的情况下，例如将所述待测体调节至所述碱性条件的方法无特别限制。所述调节例如可以通过向所述待测体中添加碱性试剂来进行。所述碱性试剂例如可以举出前述那样的碱及其水溶液、所述碱性条件的缓冲液等。
在所述不溶解pH条件为中性条件的情况下，例如将所述待测体调节至所述中性条件的方法无特别限制。可以根据所述待测体的本来的pH条件，例如添加所述酸性试剂、碱性试剂或中性试剂来进行。所述中性试剂例如可以举出前述那样的水、中性水溶液、所述中性条件的缓冲液。
所述(y)中，例如，通过混合所述待测体和调节至所述不溶解pH条件的所述螯合剂，能够制备所述不溶解pH条件的所述混合液，能够在所述混合液中形成所述络合物。此时，例如可以调节所述螯合剂的pH，以使通过其与所述待测体混合而制备的所述混合液为所述不溶解pH条件。
将所述螯合剂调节至所述不溶解pH条件的方法无特别限制。作为具体例，通过将干燥状态的所述螯合剂分散到所述螯合剂不溶解的非有机介质中，来获得调节至所述不溶解pH条件的所述螯合剂的分散液。分散所述螯合剂的所述非有机介质例如可以使用前述的分散介质，与所述酸性试剂、所述碱性试剂、所述中性试剂等相同。
所述干燥状态的所述螯合剂例如优选冷冻干燥品或者减压干燥品，因为在非有机介质中的分散性优异。这些干燥品的制造方法无特别限制，例如通过将所述螯合剂混合到有机介质中之后，将该混合液冷冻干燥或者减压干燥而获得。所述有机介质无特别限制，例如可以使用t-丁基醇、2-丙醇等。
所述(z)中，例如通过混合所述不溶解pH条件的非有机介质与所述螯合剂以及所述待测体，能够制备所述不溶解pH条件的所述混合液，并能够在所述混合液中形成所述络合物。此时，例如调节所述非有机介质的pH，以使通过其与所述螯合剂以及所述待测体混合而制备的所述混合液变为所述不溶解pH条件。
所述不溶解pH条件的非有机介质例如可以使用前述的所述酸性试剂、所述碱性试剂或所述中性试剂等。
所述螯合剂和所述待测体的混合方法无特别限制，例如可以为颠倒混和、振荡、超声波等现有方法。
在所述混合液中，除了所述螯合剂、所述待测体和所述掩蔽剂之外，可以含有其他成分。所述其他成分无特别限制，例如可以为氧化剂、还原剂等。所述氧化剂例如可以用于提高所述螯合剂和所述重金属的络合物形成反应的反应性。所述还原剂例如可以在所述混合液中含有过量的氧化剂的情况下，用于去除所述过量的氧化剂。
形成所述络合物的处理条件无特别限制，处理温度例如为室温，处理时间例如为30秒～10分钟。
(1B)络合物回收步骤
所述络合物回收步骤从所述混合液中回收在所述络合物形成步骤中形成的络合物。
如前文所述，在所述不溶解pH条件下，所述螯合剂能够维持非溶解的状态。因此，所述螯合剂与所述重金属的络合物也以非溶解的状态存在于所述混合液中。因此，在该络合物回收步骤中，回收存在于所述混合液中的未溶解的所述络合物。此外，所述掩蔽剂由于存在于所述混合液的液体组分(fraction)中，因此能够在该络合物回收步骤中去除。
所述络合物的回收方法无特别限制，例如可以采用分离固体和液体的公知的方法。所述回收方法例如有离心分离处理、过滤处理、沉淀处理、膜分离处理、吸附处理、冷冻干燥处理等处理方法。所述回收的处理条件无特别限制，例如可以根据络合物的种类和量而适当设定。在通过所述离心分离处理进行所述络合物的回收的情况下，例如，可以举出离心加速度：19,600～29,400m/s2(2,000～3,000×g)的范围、温度：4℃～室温的范围、时间：1～10分钟的范围的条件。在所述离心分离之后，例如通过去除上清液，能够回收所述络合物。在通过所述过滤处理进行所述络合物的回收的情况下，例如，使用的过滤器无特别限制，可以是滤纸、粉末滤纸、膜过滤器等。在所述过滤处理之后，可以将未通过所述过滤器的组分作为所述络合物回收。
(1C)络合物溶解步骤
所述络合物溶解步骤中，在碱性条件下，将所述回收的络合物溶解在水性介质中来回收重金属。
所述螯合剂在所述碱性条件下溶解。因此，通过在碱性条件下，将所述回收的络合物混合在水性介质中，能够将所述螯合剂以所述络合物的状态下溶解于所述水性介质。将所述络合物被溶解的所述水性介质也称为络合物水溶液。所述络合物在所述水性介质中例如优选完全溶解，但也可以是一部分所述络合物以非溶解的状态残存。所述不溶解的络合物例如优选检出限以下。
在所述络合物溶解步骤中，所述碱性条件无特别限制。所述碱性条件的下限例如优选pH9，更优选pH11。所述碱性条件的上限无特别限制，例如优选pH12。所述碱性条件例如可以根据使用的所述螯合剂的种类而适当设定。此外，在所述络合物形成步骤的不溶解pH条件为碱性条件的情况下，所述络合物溶解步骤中的所述碱性条件优选为高于前者的pH。
所述络合物的溶解方法无特别限制。例如可以通过将预先调节至所述碱性条件的所述水性介质添加到所述络合物中来溶解所述络合物，也可以通过在将所述络合物添加到所述水性介质之后将所述混合液调节至所述碱性条件，来溶解所述络合物。
所述碱性条件的调节方法无特别限制。所述调节例如可以使用碱性试剂。所述碱性试剂例如有碱及其水溶液、所述碱性条件的缓冲液等。所述碱无特别限制，例如有氢氧化钠、氢氧化钾等。所述碱的水溶液例如可以是将碱用水或缓冲液稀释的溶液。用于稀释所述碱的所述缓冲液无特别限制，可以使用前述的一般的缓冲液。所述碱的水溶液中，所述碱的浓度无特别限制，例如为0.1～1N。所述碱性条件的缓冲液无特别限制，例如有Tris-NaOH、Tris-HCl、碳酸缓冲液、Good缓冲液等。所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L。
所述络合物和所述水性介质的混合方法无特别限制，例如有颠倒混和、振荡、超声波等现有的方法。
所述水性介质相对于所述络合物的添加量无特别限制。所述水性介质的添加量例如优选添加能够溶解回收的所述络合物的量。另外，所述水性介质的添加量例如优选为比所述待测体的液量少的量。由此，例如能够获得浓度比所使用的所述待测体高的重金属含有液。即，能够获得较之所述待测体浓缩了重金属的重金属含有液。所述水性介质的添加量相对于所述待测体的液量，例如为1/2～1/100的范围，优选1/10～1/50的范围，更优选1/50。
在本实施方式中，所述重金属回收步骤在将所述络合物溶解在水性介质中之后，还可以包括分解所述络合物中的所述螯合剂的步骤。通过如此分解所述螯合剂，能够从所述络合物中回收单体的所述重金属。所述螯合剂的分解方法无特别限制，例如可以举出灰化等公知的方法。所述灰化例如可以举出湿式灰化或干式灰化。所述湿式灰化例如可以根据汞分析手册(环境省、平成16年3月)来进行。
以下，关于本实施方式，以将所述不溶解pH条件设为酸性条件、将所述双硫腙用作所述螯合剂、将尿待测体用作所述待测体来回收重金属汞的方法为例进行说明。这些仅为示例，并不用于限制本发明。
首先，将所述掩蔽剂添加到所述尿待测体中，制备待测体混合液。
所述尿待测体的量无特别限制，例如为1～100mL的范围，优选1～20mL的范围，更优选5～10mL的范围。添加所述掩蔽剂以便在每1mL所述尿待测体中例如达到前述的浓度。
所述待测体混合液例如可以放置预定时间，所述处理温度例如为室温，处理时间例如为30秒～10分钟的范围。
接着，通过添加所述酸性试剂，将所述待测体混合液的pH调节至所述酸性条件。所述酸性试剂的添加量无特别限制，每1mL所述尿待测体，例如为1～10μL的范围。所述酸性试剂例如优选盐酸水溶液，其当量浓度例如为1～8N的范围。
将冷冻干燥品的双硫腙加入试管中，然后添加经所述pH调节后的所述待测体混合液。每1mL所述尿待测体，所述双硫腙例如为0.1～0.3mg，优选为0.3mg。此时，添加了所述双硫腙的所述混合液的pH例如为1～4，优选为1～2。
将制备的所述混合液放置预定时间，形成所述双硫腙和所述尿待测体中的汞的络合物。所述处理温度例如为室温，处理时间例如为30秒～10分钟。
接着，将所述混合液提供至离心分离，分离为含有络合物的沉淀物和上清液。去除所述上清液，向所述试管内的所述络合物中添加碱性试剂。然后，使所述络合物溶解于所述碱性试剂中。
所述碱性试剂的添加量无特别限制，每1mL所述尿待测体，例如为10～200μL的范围，优选为20～100μL的范围，更优选为20μL。所述碱性试剂的pH例如为9～12，优选为11～12。所述碱性试剂例如优选氢氧化钠水溶液，其当量浓度例如为0.1～1N的范围，优选为0.4N。
如此，能够以络合物的状态回收溶解于水性介质的汞。另外，通过对所述络合物例如实施湿式灰化等，还能够使所述络合物中的所述双硫腙分解，仅回收汞。另外，作为示例记载了汞的回收，但本发明不限于此。
(2)第二实施方式
第二实施方式的回收方法为如下示例：作为所述螯合剂使用所述结构式(4)所示的螯合剂和下述结构式(5)所示的螯合剂，通过水性介质来回收重金属。本实施方式只要不特别指出，可以援引所述第一实施方式的记载。
在本实施方式中，将所述结构式(4)所示的螯合剂称作第一螯合剂，将下述结构式(5)所示的螯合剂称作第二螯合剂。
Figure BSA00000783255000171
所述结构式(5)所示的第二螯合剂为内消旋-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)。以下，也将所述第二螯合剂称为DMSA。
本实施方式的回收方法中，所述络合物形成步骤包括下述(2A)步骤，所述重金属回收步骤包括下述(2B)～(2D)步骤。
(2A)步骤，其为制备所述待测体和所述第一螯合剂的混合液、并在所述掩蔽剂的存在下在所述混合液中形成所述第一螯合剂和所述待测体中的重金属的第一络合物的第一络合物形成步骤，并且在所述第一螯合剂在水性介质中能够不溶解的pH条件下，制备所述混合液；
(2B)第一络合物回收步骤，从所述混合液中回收所述第一络合物；
(2C)步骤，其为制备所述第一络合物和所述第二螯合剂的水溶液的混合液并在所述混合液中形成源自所述第一络合物的重金属和所述第二螯合剂的第二络合物的第二络合物形成步骤，并且所述第二螯合剂的水溶液为所述第一螯合剂能够不溶解的pH条件；
(2D)第二络合物回收步骤，通过从所述混合液中回收溶解了所述第二络合物的液体组分来回收重金属。
(2A)第一络合物形成步骤
所述第一络合物形成步骤是制备所述第一螯合剂和待测体的混合液并在所述掩蔽剂的存在下在所述混合液中形成所述第一螯合剂和所述待测体中的重金属的第一络合物的步骤。在所述第一络合物形成步骤中，所述混合液在所述第一螯合剂在水性介质中能够不溶解的pH条件下制备。以下，也将“所述第一螯合剂在水性介质中能够不溶解的所述pH条件”称作“第一pH条件”。所述第一pH条件为所述第一实施方式中的“不溶解pH条件”，在本实施方式中，能够援引所述第一实施方式的记载。
所述第一络合物形成步骤(2A)是所述第一实施方式中的所述(1A)步骤，在本实施方式中能够援引所述第一实施方式的记载。
(2B)第一络合物回收步骤
所述第一络合物回收步骤从所述混合液中回收所述第一络合物形成步骤中形成的第一络合物。
所述第一络合物回收步骤(2B)是所述第一实施方式中的所述(1B)步骤，本实施方式中，能够援引所述第一实施方式的记载。
(2C)第二络合物形成步骤
所述第二络合物形成步骤是制备所述第一络合物和所述第二螯合剂的水溶液的混合液并在所述混合液中形成源自所述第一络合物的重金属和所述第二螯合剂的第二络合物的步骤。在所述第二络合物形成步骤中，所述第二螯合剂的水溶液为所述第一螯合剂能够不溶解的pH条件。以下，将“所述第一螯合剂能够不溶解的pH条件”也称作“第二pH条件”。
在所述混合液中，所述第二螯合剂为溶解了的状态，所述第一络合物能够维持未溶解的状态。并且，当所述混合液中存在所述第一络合物和所述第二螯合剂时，虽机理不明，但形成所述第一络合物的所述重金属的全部一部分从所述第一络合物解离，并与所述第二螯合剂结合，形成所述第二螯合剂和所述重金属的所述第二络合物。
所述第二pH条件例如是所述第二螯合剂能够溶解于水性介质、并且所述第一螯合剂不能溶解于水性介质的pH条件。在所述第二络合物形成步骤中，所述第二螯合剂水溶液的pH条件、所述水溶液与所述第一络合物的混合液的pH条件优选均为所述第二pH条件。
所述第二pH条件例如可以举出非碱性条件，具体可举出酸性条件(pH1～3)、弱酸性条件(pH4～5)、中性条件(pH6～7)。所述第二pH条件的上限无特别限制，例如为pH6.8，优选pH6，更优选为pH4。所述第二pH条件的下限无特别限制，例如为pH2，优选为pH3，更优选为pH4。所述第二pH条件例如可以根据所述第一螯合剂和所述第二螯合剂的种类等适当设定。
所述第二螯合剂水溶液例如只要所述第二螯合剂溶解于水性介质即可。所述第二螯合剂在所述水溶液中例如优选处于全部溶解的状态，但也可以是部分溶解的状态。在后者的情况下，所述第二螯合剂例如只要有能够与源自所述第一络合物的所述重金属形成络合物的量存在于所述水溶液中即可。
所述第二螯合剂水溶液例如可以通过将水性介质调节到所述第二pH条件之后将所述第二螯合剂溶解而制备，也可以将所述第二pH添加到水性介质之后，将该混合液调节至所述第二pH条件，溶解所述第二螯合剂来制备。
在前者的情况下，作为所述第二螯合剂的DMSA由于是強酸性的，因此溶解所述第二螯合剂的所述水性介质例如优选所述碱性试剂。通过在所述碱性试剂中溶解所述第二螯合剂，能够制备所述第二pH条件、优选的是所述非碱性条件的所述水溶液。所述碱性试剂的pH无特别限制，下限例如为8，优选为9，更优选为10，上限例如为12，优选为11。所述碱性试剂无特别限制，例如优选所述碱性水溶液，更优选碱性缓冲液。所述碱性水溶液例如可以举出磷酸三钠水溶液等。所述碱性缓冲液例如可以举出磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good缓冲液等。所述水溶液和所述缓冲液的浓度无特别限制，例如为10～100mmol/L，优选为100mmol/L。
在后者的情况下，所述水性介质无特别限制，例如能够使用水、水溶液、缓冲液等。并且，例如在将所述水性介质和所述第二螯合剂混合之后，调节至所述第二pH条件即可。所述调节方法无特别限制，例如能够适当使用所述酸性试剂、所述碱性试剂、所述中性试剂等。
所述第二螯合剂水溶液中所述第二螯合剂的浓度无特别限制，例如为5～20mg/mL，优选为10～20mg/mL。
所述第一络合物和所述第二螯合剂水溶液的混合方法无特别限制，例如可以举出颠倒混和、振荡、超声波等现有的方法。
在所述混合液中，所述第二螯合剂水溶液的添加量无特别限制。所述第一络合物形成步骤中使用的每1mL所述待测体，所述第二螯合剂水溶液的添加量例如优选10～200μL，更优选20～100μL，进一步优选20μL。另外，在所述混合液中，所述第一络合物和所述第二螯合剂的添加比例无特别限制。在所述第一络合物形成步骤中使用的所述第一螯合剂和在所述第二络合物形成步骤中使用的所述第二螯合剂的比例(重量比)例如为1∶0.3～1∶40，优选1∶7～1∶40，更优选1∶10～1∶40。
所述第二螯合剂水溶液相对于所述第一络合物的添加量无特别限制。所述第二螯合剂水溶液的添加量例如优选比使用的所述待测体的液量少的量。由此，例如能够获得比使用的所述待测体更高浓度的含重金属的液体。即，能够获得较之所述待测体重金属被浓缩了的含重金属的液体。所述第二螯合剂水溶液的添加量相对于所述待测体的液量，例如为1/2～1/100的范围，优选1/10～1/50的范围，更优选1/50。
所述混合液中，除了所述第一络合物和所述第二螯合剂水溶液之外，也可以含有其他成分。所述其他成分无特别限制，例如可以举出前述那样的氧化剂、还原剂等。
所述第二络合物形成的处理条件无特别限制，处理温度例如为室温，处理时间例如为30秒～10分种的范围。
(2D)第二络合物回收步骤
所述第二络合物回收步骤中，通过从所述混合液中回收溶解了在所述第二络合物形成步骤中形成的第二络合物的液体组分来回收重金属。
如前所述，在所述第二pH条件下，所述第二螯合剂处于溶解在所述混合液中的状态，因此所述第二螯合剂和所述重金属的第二络合物也以溶解的状态存在于所述混合液中。另一方面，所述第一螯合剂处于可不溶解于所述混合液的状态，因此以非溶解状态存在于所述混合液中。因此，在第二络合物回收步骤中，通过回收溶解了所述第二络合物的液体组分来回收所述重金属。所述第二络合物在所述混合液中优选全部溶解，但一部分的所述第二络合物也可以处于非溶解的状态。所述非溶解的第二络合物例如优选在检出限以下。
所述液体组分的回收方法无特别限制，例如可以采用分离固体和液体的公知方法。所述回收方法例如可以援引所述第一实施方式的(1B)步骤中的回收方法的示例。例如，在使用所述过滤器进行过滤处理的情况下，在所述过滤处理之后，将通过了所述过滤器的组分作为所述液体组分回收。
在本实施方式中，所述重金属回收步骤可以在回收所述液体组分之后，还包括分解所述第二络合物中的所述第二螯合剂的步骤。通过如此分解所述第二螯合剂，能够从所述第二络合物中以单体形式回收所述重金属。所述第二螯合剂的分解方法无特别限制，例如可以举出灰化等公知的方法，能够援引所述第一实施方式的记载。
以下，关于本实施方式，以将所述第一pH条件设为酸性条件、将所述第二pH条件设为弱酸性～中性条件、并将所述双硫腙用作所述第一螯合剂、将所述DMSA用作所述第二螯合剂、将尿待测体用作所述待测体来回收重金属汞的方法为例进行说明。这些仅为示例，并不用于限制本发明。
与所述第一实施方式同样地进行：向所述尿待测体中添加掩蔽剂，调节所得到的待测体混合液的pH，向所述调节pH后的待测体混合液添加双硫腙、形成双硫腙和待测体中的汞的络合物。
并且，与所述第一实施方式同样地将所述混合液提供至离心分离，分离成含有第一络合物的沉淀物和上清液。去除所述上清液，向所述试管内的所述第一络合物中添加所述DMSA水溶液。由此，在所述第一络合物和所述DMSA水溶液的混合液中形成所述第二络合物。
所述DMSA水溶液例如可以将所述DMSA溶解到碱性水溶液中来制备。所述碱性水溶液例如优选磷酸三钠水溶液，浓度例如为10～100mmol/L，pH例如为9～12。在所述DMSA水溶液中，所述DMSA浓度例如为5～20mg/mL。所述DMSA溶液的pH例如为2～6的范围，优选为4～6的范围，更优选为4。
所述DMSA水溶液相对于所述第一络合物的添加量无特别限制，每1mL所述尿待测体，例如为10～200μL的范围，优选为20～100μL的范围，更优选为20μL。所述第一络合物和所述DMSA溶液的混合液的pH例如为2～6的范围，优选为4～6的范围，更优选为4。
接着，将所述混合液提供至离心分离，分离出溶解了第二络合物的上清液与沉淀，并回收所述上清液。
如此，能够回收以所述第二络合物的状态溶解在液体组分中的汞。另外，通过对所述第二络合物实施例如湿式灰化等，还能够使所述第二络合物中的所述DMSA分解，仅回收汞。此外，作为示例记载了汞的回收，但本发明不限定于此。
(3)第三实施方式
第三实施方式是将下述结构式(6)所示的螯合剂用作第二螯合剂并通过水性介质回收重金属的例子。本实施方式只要不特别指出，能够援引所述第二实施方式的记载。
Figure BSA00000783255000221
在所述结构式(6)中，
R3表示碳数为1或2的烷基或氨烷基，或者不具有R3，Y表示
Figure BSA00000783255000222
所述第二螯合剂例如可以举出下述结构式(6-1)所示的硫普罗宁(N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸)、下述结构式(6-2)所示的DMPS(1，2-二巯基-1-丙磺酸钠)、下述结构式(6-3)所示的半胱氨酸(2-氨基-3-巯基丙酸)等。所述第二螯合剂例如可以是具有所述结构式(6)的化合物的水合物。另外，第二螯合剂也可以是其互变异构体或立体异构体。所述异构体例如可以举出例如几何异构体、构象异构体等。所述第二螯合剂例如可以使用市售品。所述硫普罗宁例如可以从关东化学(株)、东京化成工业(株)、和光纯药工业(株)等为主的多个公司获得，所述DMPS例如可以从以和光纯药工业(株)等为主的多个公司获得，所述半胱氨酸例可以从以Nacalai Tesque(株)为主的多个公司获得。所述第二螯合剂可以使用一种，也可以并用两种以上。
本实施方式的回收方法除了使用所述结构式(6)所示的第二螯合剂之外，只要不特别指出，就能够援引所述第二实施方式的记载，具体而言，可以与所述(2A)～(2D)步骤同样地进行。
在所述(2C)步骤的第二络合物形成步骤中，制备所述第一络合物与所述第二螯合剂的水溶液的混合液，在所述混合液中，形成源自所述第一络合物的重金属和所述第二螯合剂的第二络合物。
在所述(2C)步骤中，第二pH条件例如是所述第二螯合剂能够溶解于水性介质、并且所述第一络合物不能溶解于该水性介质的pH条件。在所述第二络合物形成步骤中，所述第二螯合剂水溶液的pH条件、所述水溶液和所述第一络合物的混合液的pH条件优选均为所述第二pH条件。所述混合液只要不溶解所述第一螯合剂，可以是任何pH。
所述第二pH条件例如可举出非碱性条件，具体可举出酸性条件(pH1～3)、弱酸性条件(pH4～5)、中性条件(pH6～7)。所述第二pH条件无特别限制，上限例如为pH6.8，优选为pH6，更优选为pH4。所述2pH条件的下限无特别限制，例如为pH4，优选为pH3，更优选为pH2，进一步优选为pH1。作为所述第二pH条件例如可以根据所述第一螯合剂和所述第二螯合剂的种类等适当设定。
所述第二螯合剂水溶液例如只要水性介质中溶解有所述第二螯合剂即可。所述第二螯合剂在所述水溶液中例如优选处于全部溶解的状态，但也可以是部分溶解的状态。在后者的情况下，所述第二螯合剂例如只要有能够与源自所述第一络合物的所述重金属形成络合物的量存在于所述水溶液中即可。
所述第二螯合剂水溶液例如可以在将水性介质调节至所述第二pH条件之后溶解所述第二螯合剂来制备，也可以在向水性介质中添加所述第二螯合剂之后，将其混合液的pH调节至所述第二pH条件来溶解所述第二螯合剂来制备。
在前者的情况下，溶解所述第二螯合剂的所述水性介质无特别限制，例如可以使用水、水溶液、缓冲液等。并且，例如在将所述水性介质调节至所述第二pH条件之后再溶解所述第二螯合剂即可。所述调节方法无特别限制，例如能够适当适用所述酸性试剂、所述碱性试剂、所述中性试剂等。
在后者的情况下，所述水性介质无特别限制，例如可以使用水、水溶液、缓冲液等。并且，例如在将所述水性介质和所述第二螯合剂混合之后调节至所述第二pH条件即可。所述调节方法无特别限制，例如能够适当适用所述酸性试剂、所述碱性试剂、所述中性试剂等。
所述第二螯合剂水溶液中的所述第二螯合剂的浓度无特别限制，例如为15～300mg/mL，优选75～150mg/mL。在本实施方式中，从溶解性特别优异的角度来说，所述第二螯合剂优选所述硫普罗宁、所述DMPS、所述半胱氨酸。例如，所述第二螯合剂水溶液中的所述第二螯合剂的浓度越高，能够用源自所述第一络合物的重金属和所述第二螯合剂形成越多的第二络合物，能够进一步提高重金属的回收率。
以下，关于本实施方式，以将所述第一pH条件设为酸性条件、将所述第二pH条件设为弱酸性～中性条件、使用所述双硫腙作为所述第一螯合剂、使用所述DMPS作为所述第二螯合剂、使用尿待测体作为所述待测体，来回收重金属汞的方法为例进行说明。这些仅为示例，并不用于限制本发明。
与所述第一实施方式同样地进行：向所述尿待测体中添加掩蔽剂，调节所获得的待测体混合液的pH，向所述调节pH之后的待测体混合液中添加双硫腙，形成双硫腙和待测体中的汞的络合物。
然后，与所述第一实施方式同样地将所述混合液提供至离心分离，分离成含有第一络合物的沉淀物和上清液。去除上清液，向所述试管内的所述第一络合物中添加所述DMPS水溶液。由此，在所述第一络合物和所述DMPS水溶液的混合液中形成所述第二络合物。
所述DMPS水溶液例如可以将所述DMPS溶解到介质来制备。所述介质例如可以举出磷酸三钠水溶液、硝酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等，浓度例如为10～100mmol/L。所述介质的pH无特别限制，只要是不溶解双硫腙的范围即可。所述DMPS水溶液中，所述DMPS浓度例如为5～20mg/mL。所述DMPS溶液的pH例如为2～6范围，优选为4～6的范围，更优选为4。
所述DMPS水溶液相对于所述第一络合物的添加量无特别限制，对于每1mL所述尿待测体例如为10～200μL的范围，优选为20～100μL的范围，更优选为20μL。所述第一络合物和所述DMPS水溶液的混合液的pH例如为2～6的范围，优选为1～3的范围，更优选为1。
接着，将所述混合液提供至离心分离，分离成溶解了所述第二络合物的上清液和沉淀，回收所述上清液。
如此，能够回收以所述第二络合物的状态溶解在液体组分中的汞。另外，通过对所述第二络合物例如实施湿式灰化等，还能够分解所述第二络合物中的所述DMPS，仅回收汞。此外，作为示例记载了汞的回收，但本发明不限于此。另外，在本例中，以作为所述第二螯合剂使用所述DMPS的情况为例，但例如在使用所述硫普罗宁、半胱氨酸等作为所述第二螯合剂的情况下也能够与本例同样地回收重金属。
(4)其他实施方式
在本发明的回收方法中，所述重金属回收步骤例如除了使用所述各实施方式中的水性介质进行回收之外，还可以是用有机介质提取所述络合物的方法。在这种情况下，例如，所述重金属回收步骤可以按照日本工业规格(JIS)K0101和K0102等指定的双硫腙法(比色法)和原子吸光法来进行。
<重金属的分析方法>
如前所述，本发明的重金属的分析方法的特征在于，包括：通过所述本发明的回收方法从待测体中回收重金属的重金属回收步骤；以及分析所述重金属的分析步骤。所述重金属回收步骤可以引用所述本发明的回收方法。
所述分析步骤无特别限制，例如可以根据分析目标重金属的种类等适当选择。所述重金属的分析例如通过光学测定、GC-ECD(气相色谱-电子捕获型检测器)、电化学测定(例如，溶出伏安法等)、质谱装置等进行。通过所述光学测定而进行的分析例如通过使用光学分析仪器等测定吸光度、透过率、反射率等而进行。所述光学分析仪器例如可以举出原子吸光光度计、可见光吸光光度计等。所述重金属的分析例如可以是定性分析，也可以是定量分析。
本发明的分析方法例如还可以包括测定值的校正步骤。所述校正步骤例如能够根据测定值与待测体中的重金属浓度的相关关系来校正分析结果的测定值。所述相关关系例如能够通过对于重金属浓度已知的标准待测体通过所述本发明的回收方法回收样品、并对所述样品的测定值与所述标准待测体的重金属浓度进行绘图而求出。所述标准待测体优选为重金属的稀释系列。通过如此进行校正，能够进行可靠性更高的定量。
所述重金属的分析例如可以对前述的络合物进行分析，也可以从所述络合物分离所述重金属，并对所述重金属单体进行分析。在后者的情况下，所述重金属回收步骤如前所述优选包括分解所述络合物中的所述螯合剂的步骤，即从所述络合物分离所述重金属的步骤。
<重金属回收用试剂>
如前所述，本发明的重金属回收用试剂是所述本发明的回收方法中使用的试剂，如前所述其特征在于，包含能够与重金属螯合的螯合剂和巯基掩蔽剂。本发明的重金属回收用试剂的特征在于包含所述螯合剂和所述掩蔽剂，其他的构成和条件无特别限制。所述螯合剂和所述掩蔽剂例如能够援引所述本发明回收方法。
<重金属回收用试剂盒>
本发明的重金属回收用试剂盒是一种在所述本发明的回收方法中使用的试剂盒，其特征在于，包含能够与重金属螯合的螯合剂和巯基的掩蔽剂。本发明的重金属回收用试剂盒的特征在于包含所述螯合剂和所述掩蔽剂，其他的构成和条件无特别限制。所述螯合剂和所述掩蔽剂例如能够援引所述本发明的回收方法。所述螯合剂和所述掩蔽剂例如可以分别收纳在单独的容器中，也可以以混合或者未混合的状态收纳在同一容器中。
所述重金属回收用试剂盒除了所述螯合剂和所述掩蔽剂之外，例如也可以含有其他试剂。所述其他试剂无特别限制，例如可以举出前述的氧化剂、还原剂等。
<待测体的前处理方法>
本发明的待测体的前处理方法是一种供于所述本发明的回收方法的待测体的前处理方法，其特征在于，在形成待测体中的重金属和能够与重金属螯合的螯合剂的络合物之前，向所述待测体中添加巯基的掩蔽剂。本发明的前处理方法能够援引所述本发明的回收方法中的所述络合物形成步骤的记载。
本发明的重金属分析方法除前述的方式之外，还可以举出以下所示的第二方法。本发明的第二分析方法包括：络合物形成步骤，制备待测体和能够与重金属螯合的螯合剂的混合液，在所述混合液中，形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物；以及分析步骤，通过所述络合物的检测来分析所述重金属，在所述络合物形成步骤中，在巯基的掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述络合物。
所述螯合剂例如能够使用在与所述重金属形成了络合物的状态下能够检测到但在未与所述重金属形成络合物的状态下无能检测到的螯合剂。根据该螯合剂，例如不论是否回收所述络合物，都能够通过检测所述络合物来间接检测构成所述络合物的重金属。本发明的第二分析方法例如不需要通过所述络合物的回收而进行的所述重金属回收步骤。
在本发明的第二分析方法中，所述螯合剂例如可以举出前述双硫腙。所述双硫腙和重金属的络合物的检测方法无特别限制，可以采用公知的方法，能够通过测定吸光度等光学信号来进行检测。在本发明的第二分析方法中，所述络合物形成步骤能够援引全部前述内容。
本发明的第二待测体的前处理方法是一种供于所述本发明的第二分析方法的待测体的前处理方法，其特征在于，在形成待测体中的重金属和能够与重金属螯合的螯合剂的络合物之前，向所述待测体中添加巯基的掩蔽剂。
实施例
接着说明本发明的实施例。另外，本发明不限于下述的实施例。
[实施例1]
(1)待测体的制备
向从健康人采集的尿待测体(n＝3)中添加氯化汞(II)以达到10μg/L，作为待测体A。另外，将从作为体内重金属的排出疗法施与了一次内消旋-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)的患者采集的尿待测体(n＝3)作为待测体B、C、D使用。
(2)螯合剂的制备
将双硫腙(Fluka公司制)溶解在t-丁基醇(Nacalai Tesque公司)中，将该溶液全部注入到PP制的15mL锥形管(Nunc公司制)中。对所述溶液进行冷冻干燥。
(3)从待测体中回收汞
向5mL的所述待测体A～D中溶解作为掩蔽剂的N-乙基马来酰亚胺(NEM)，使之分别达到0、12.5、25mmol/L，并在室温下静置15分钟。由此，用所述NEM掩蔽了所述待测体中所含的含巯基化合物。向添加了所述NEM之后的待测体A～D中，分别添加5N的盐酸(Nacalai Tesque公司制)，将pH值调节到约1～2。
将所述调节pH之后的待测体全部添加到含有作为所述螯合剂的所述双硫腙的试管中，在室温下振荡5分钟，由此混合所述待测体和所述双硫腙，形成所述双硫腙和汞的络合物。之后，将所述试管离心分离(19,600m/s2(2000×g)、20℃、10分钟)，分离成含有所述络合物的沉淀和上清液。
将所述上清液湿式灰化，分解有机物。所述湿式灰化按照汞分析手册(环境省，平成16年3月)来进行。然后，针对所述灰化后的汞回收样品，通过原子吸光光度计(商品名MERCURY ANALYZER、日本Instruments(株)制)，来对所述上清液中所含的汞量进行定量。从双硫腙添加前的待测体中的汞量(X)中减去所述上清液中所含的汞量，计算出添加双硫腙之后的待测体中的汞量(Y)。此外，所述添加双硫腙之前的待测体中的汞量(X)是指，针对与前述同样地制备的调节pH之后的各待测体，不混合双硫腙，而同样地湿式灰化而定量的汞量。
Y＝X-上清液中所含的汞量(ng)
X：添加双硫腙之前的待测体中的汞量(ng)
Y：添加双硫腙之后的待测体中的汞量(ng)
然后，将双硫腙添加之前(吸附前)的待测体中的汞量和双硫腙添加之后(吸附后)的待测体中的汞量代入下述式(1)中，求得汞的回收率(％)。
回收率(％)＝100×Y/X(1)
X：添加双硫腙之前的待测体中的汞量(ng)
Y：添加双硫腙之后的待测体中的汞量(ng)
下述表1中，示出关于各待测体的NEM浓度和回收率的关系。在下述表1中，“吸附前”是指添加双硫腙之前的待测体中的已知汞量，“吸附后”是指通过添加双硫腙而回收的汞回收样品的回收汞量。如下述表1所示，在NEM浓度为0mmol/L的情况下，健康人的待测体A的回收率为83.53％，而施与DMSA的患者的待测体B～D的回收率分别为87.83％、37.54％、69.50％，从作为排出疗法施与了DMSA的患者采集的待测体之间，产生了回收率的偏差。与此相对，通过向所述待测体B～D中添加NEM作为掩蔽剂，实施掩蔽处理，回收率与NEM浓度相关地提高，显著消除了待测体之间的回收率的偏差，能够实现健康人的待测体A同等程度的回收率。
表1
Figure BSA00000783255000301
如此，例如在待测体中含有DMSA等含巯基的化合物的情况下，当通过与双硫腙形成络合物来回收汞时，待测体之间产生回收率的偏差，但是根据本发明可知，通过用掩蔽剂进行处理，减轻了待测体之间的回收率的偏差，能够提高汞的回收率。
[实施例2]
(1)待测体的制备
从健康人采集的尿待测体(n＝1)作为待测体a。另外，将向所述待测体a中添加DMSA达到0.2mmol/L之后的样品，作为待测体b(n＝1)。将从施与一次DMSA的患者采集的尿待测体(n＝1)作为待测体c。另一方面，向所述各待测体a～c中，分别混合氯化汞(II)(和光纯药工业公司制)以达到1ppm，作为待测体a1、b1和c1。以下，将待测体a～c称为未添加汞的待测体，将待测体a1～c1也称为添加汞的待测体。
(2)掩蔽试剂的制备
向精制水中添加NEM以使NEM最终浓度达到50mmol/L，制备NEM溶液，将其作为掩蔽试剂1。
(3)比色试剂
向精制水中添加硝酸和月桂醇硫酸钠，制备混合液，将其作为比色试剂2。在所述比色试剂2中，硝酸的最终浓度为0.13N，月桂醇硫酸钠的最终浓度为0.9％。另外，在乙醇中溶解双硫腙以使最终浓度达到0.024mmol/L，制备双硫腙溶液，将其作为比色试剂3。
(4)从待测体中回收汞
将所述待测体a～c和a1～c1的6个待测体分别取0.49mL放置到单独的容器中。然后，向所述容器中混合0.01mL的所述掩蔽试剂1之后，在室温下静置15分钟，由此通过NEM进行前处理。接着，向所述容器中，混合0.03mL的所述比色试剂2。然后，向所述容器中，添加0.02mL所述比色试剂3，在添加时(0秒)和从添加起30秒之后，测定波长490nm处的吸光度。然后，从30秒后的吸光度中减去0秒的吸光度，将该值作为各待测体a～c、a1～c1的信号值。
求出所述添加了汞的待测体(a1、b1、c1)和所述未添加汞的待测体(a、b、c)的信号值之差(Δ)。然后，针对所述信号值之差(Δ)，将添加了汞的待测体a1和未添加汞的待测体a的信号值之差(Aa1-a)作为100％，计算相对值(％)作为回收率。
另外，作为比较例，除了替代所述NEM的掩蔽试剂1，使用精制水0.01mL之外，同样地求出信号值、信号值的差(Δ)和回收率。
下述表2中示出其结果。如下述表2所示，在前处理中使用精制水的比较例中，与源自未添加DMSA的健康人的待测体a和a1相比，关于添加了DMSA的待测体b和b1、以及源自施与了DMSA的患者的待测体c和c1，回收率显著降低。与此相对，在前处理中使用了NEM的实施例中，关于添加了DMSA的待测体b和b1、以及源自施与了DMSA的患者的待测体c和c1，也显示出75％以上的优良的回收率。
表2
Figure BSA00000783255000311
如此，例如在待测体中含有DMSA等含巯基化合物的情况下，在以与双硫腙的络合物的形式回收汞时，待测体之间产生回收率的偏差，但是根据本发明，通过用掩蔽剂进行的处理，能够减轻待测体之间的回收率的偏差。
[实施例3]
(1)待测体的制备
向从健康人采集的尿待测体中添加DMSA以达到0.2mmol/L。
(2)螯合剂的制备
与所述实施例1同样地，制备双硫腙的螯合剂。
(3)从待测体中回收汞
除了向5mL的所述待测体中分别溶解作为掩蔽剂的碘乙酸或碘代乙酰胺以达到12.5mmol/L之外，与所述实施例1同样地使用螯合剂进行汞的回收并求出回收率。另外，作为比较例，除了将所述待测体在室温下静置15分钟而不溶解所述掩蔽剂之外，与所述实施例1同样地使用螯合剂进行汞的回收并求出回收率。
下述表3中示出其结果。如下述表3所示，在向待测体中溶解碘乙酸或碘代乙酰胺来作为掩蔽剂的情况下，与不使用掩蔽剂的比较例相比，回收率提高了。
表3
Figure BSA00000783255000321
[实施例4]
(1)待测体的制备
从作为体内重金属的排出疗法施与了一次内消旋-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)的患者采集尿待测体。
(2)螯合剂的制备
与所述实施例1同样地制备双硫腙的螯合剂。
(3)从待测体中回收汞
除了向5mL的所述待测体中溶解作为掩蔽剂的NEM以达到12.5mmol/L之外，与所述实施例1同样地使用螯合剂进行汞的回收，并求出回收率。另外，作为比较例，除了将所述待测体在室温下静置15分钟而不溶解所述掩蔽剂之外，与所述实施例1同样地使用螯合剂进行汞的回收并求出回收率。
下述表4中示出其结果。如下述表4所示，在向待测体中溶解NEM来作为掩蔽剂的情况下。与不使用掩蔽剂的比较例相比，回收率提高了。
表4
Figure BSA00000783255000331
[实施例5]
(1)制备待测体和螯合剂
与所述实施例4同样地制备待测体和双硫腙的螯合剂。
(2)第二螯合剂的制备
将硫普罗宁(关东化学(株)制)作为第二螯合剂溶解在0.1mol/L硝酸水溶液中以达到500mmol/L，制备硫普罗宁水溶液。
(3)从待测体中回收汞
与所述实施例4同样地形成所述络合物，去除上清液。然后，向所述试管内的所述沉淀全部中添加作为所述第二螯合剂的硫普罗宁水溶液，在室温下振荡5分钟，由此混合所述络合物和所述第二螯合剂水溶液，在所述混合液中，形成所述汞和所述硫普罗宁的络合物(第二络合物)。将所述试管进行离心分离(19,600m/s2(2000×g)、20℃、10分钟)，分离成溶解了所述第二络合物的上清液和沉淀。回收所述上清液，将其作为汞浓缩样品。
将所述汞浓缩样品湿式灰化，分解有机物。所述湿式灰化按照汞分析手册(环境省、平成16年3月)来进行。然后，针对所述灰化后的汞浓缩样品，通过原子吸光光度计(商品名MERCURY ANALYZER、日本Instruments(株)制)来定量汞浓度。另外，对于未添加双硫腙的螯合剂、掩蔽剂和第二螯合剂的述待测体，也同样地通过所述原子吸光光度计来对汞浓度进行定量。然后，作为比较例，除了将所述待测体在室温下静置15分钟而不溶解所述掩蔽剂之外，也同样地使用双硫腙的螯合剂和第二螯合剂对汞浓度进行定量。
将所述汞浓缩样品的汞浓度(XC)和溶液量(XV)、以及所述待测体的汞浓度(YC)和溶液量(YV)代入下述式(2)中，求出汞的回收率(％)。
回收率(％)＝100×(XC×XV)/(YC×Yv)(2)
下述表5中，示出其结果。如下述表5所示，在待测体中溶解了掩蔽剂的情况下，与不使用掩蔽剂的比较例相比，回收率提高了。
表5
Figure BSA00000783255000341
[实施例6]
(1)待测体的制备
与所述实施例4同样地制备待测体。
(2)螯合剂的制备
将双硫腙0.15mg(Fluka公司制)在研钵中粉砕后使用。
(3)第二螯合剂的制备
与所述实施例5同样地制备第二螯合剂。
(4)从待测体中回收汞
向4mL的所述待测体中分别溶解NEM、马来酰亚胺或N-甲基马来酰亚胺(NMM)作为掩蔽剂以达到12.5mmol/L之后，在室温静置15分钟。由此，用所述掩蔽剂掩蔽所述待测体中所含的含巯基化合物。
向所述待测体中，添加作为所述螯合剂的所述双硫腙，添加柠檬酸(无水)(岸田化学公司制)/柠檬酸三钠·2水和物(和光纯药工业公司制)缓冲剂，以使最终浓度达到100mM，在室温下振荡20分钟，由此混合所述待测体和所述双硫腙，形成所述双硫腙和汞的络合物。之后，将所述待测体和所述双硫腙的混合物全量加入到带玻璃纤维滤纸的过滤容器中之后，离心过滤，分离成含有所述络合物的沉淀和滤液。
向所述沉淀中，添加作为所述第二螯合剂的硫普罗宁水溶液，在室温下静置15分钟，由此混合所述络合物和所述第二螯合剂水溶液，在所述混合液中，形成所述汞和所述硫普罗宁的络合物(第二络合物)。在与前述相同的条件下对所述过滤容器离心过滤，分取溶解了所述第二络合物的滤液。回收所述滤液，将其作为汞浓缩样品。
除了将所述汞浓缩样品湿式灰化之外，与所述实施例1同样地求出汞的回收率。另外，对于所述汞浓缩样品，也与实施例5同样地通过所述原子吸光光度计来对汞浓度进行定量。然后，作为比较例，除了将所述待测体在室温下静置15分钟而不溶解所述掩蔽剂之外，同样地使用双硫腙的螯合剂和第二螯合剂，求出汞的回收率，并且对汞浓度进行定量。
在下述表6和表7中示出其结果。如下述表6和表7所示，在待测体中溶解了掩蔽剂的情况下，与不使用掩蔽剂的比较例相比，回收率提高了。
表6
Figure BSA00000783255000351
表7
Figure BSA00000783255000352
[实施例7]
(1)待测体的制备
向从健康人采集的尿待测体(6份待测体，各n＝1)中，添加氯化汞(II)达到10μg/L，作为待测体A～F。
(2)螯合剂的制备
将双硫腙0.04mg(Fluka社製)在研钵中粉碎后使用。
(3)从待测体中回收汞
向1mL的所述待测体A～F中，分别溶解N-甲基马来酰亚胺(NMM)作为掩蔽剂以达到0、12.5mmol/L，将该溶液全部注入聚丙烯(PP)制的15mL锥形管(Nunc公司制)中之后，在室温下静置15分钟。由此，用所述NMM掩蔽所述待测体中所含的含巯基化合物。向所述添加NMM之后的待测体A～F中分别添加柠檬酸-柠檬酸3钠缓冲液达到100mmol/L，将pH调节到约2～3。
向所述调节pH之后的待测体中添加双硫腙，在室温下振荡20分钟，由此混合所述待测体和所述双硫腙，形成所述双硫腙和汞的络合物。之后，将所述试管进行离心分离(186，200m/s2(19000×g)、20℃、5分钟)，分离成含有所述络合物的沉淀和上清液。
将所述上清液与实施例1同样地进行湿式灰化，对所述上清液中所含的汞量进行定量，求出汞的回收率(％)。
下述表8中示出NMM浓度和汞的回收率的关系。在下述表8中，“吸附前”是指添加双硫腙之前的待测体中的已知汞量，“吸附后”是指通过添加双硫腙而回收的汞回收样品的回收汞量。如下述表8所示，在NMM浓度为0mmol/L的情况下，待测体A～F的回收率分别为85.05％、72.37％、83.35％、67.94％、87.05％、74.18％，在待测体之间产生了回收率的偏差。与此相对，通过向所述待测体A～F中添加NMM作为掩蔽剂以实施掩蔽处理，回收率提高，改善了待测体之间的回收率的偏差。
表8
Figure BSA00000783255000361
如此，例如在待测体中含有DMSA等含巯基化合物的情况下，在通过与双硫腙形成络合物来回收汞时，待测体之间产生回收率的偏差，但可知根据本发明，通过用掩蔽剂进行处理，能够减少待测体之间的回收率的偏差，提高汞的回收率。
综上所述，根据本发明，通过在所述掩蔽剂的存在下，形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物，能够如前所述，抑制待测体之间的回收率的偏差。另外，对于回收率低的待测体，例如也能够提高回收率。因此，能够进行可靠性更加优异的重金属分析。因此，本发明例如在针对源自生物体的待测体的临床检查、环境试验等中是极其有用。
本发明可以在不脱离其精神或实质特点的情况下以其他形式实现。本申请中公开的实施例旨在作为说明在各个方面考虑并且并非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书指出，并且权利要求的含义之内以及权利要求的等价范围之内的所有改变均包含在内。

Claims (18)

1.一种重金属回收方法，其特征在于，包括：
络合物形成步骤，制备待测体和能够与重金属螯合的螯合剂的混合液，并在所述混合液中形成所述待测体中的重金属和所述螯合剂的络合物；以及
重金属回收步骤，通过回收所述络合物来回收所述待测体中的重金属，
在所述络合物形成步骤中，在巯基的掩蔽剂的存在下，在所述混合液中形成所述络合物。
2.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述络合物形成步骤包括向所述待测体中添加所述螯合剂和所述掩蔽剂的步骤。
3.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述络合物形成步骤包括在添加所述掩蔽剂之后向所述待测体中添加所述螯合剂的步骤。
4.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述掩蔽剂由选自下述结构式(1)～(3)所组成的组中的至少一个结构式表示：
Figure FSA00000783254900011
在所述结构式(1)～(3)中，R表示氢、烷基、苯基或苄基，在所述结构式(2)和(3)中，X表示卤素。
5.根据权利要求4所述的回收方法，其中，所述结构式(1)的掩蔽剂为马来酰亚胺、N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺，所述结构式(2)的掩蔽剂为碘代乙酰胺，所述结构式(3)的掩蔽剂为碘乙酸。
6.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述螯合剂为含有含硫基团的螯合剂。
7.根据权利要求6所述的回收方法，其中，所述含硫基团为硫酮基。
8.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述螯合剂为1，5-二苯基-3-硫卡巴腙。
9.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述待测体为源自生物体的待测体。
10.根据权利要求1所述的回收方法，其中，所述重金属为选自Bi、Hg、Cd、Pd、Zn、T1、Ag和Pb所组成的组中的至少一种。
11.一种重金属分析方法，包括：
通过权利要求1所述的重金属回收方法从待测体中回收重金属的重金属回收步骤；以及
分析所述重金属的分析步骤。
12.一种重金属回收用试剂，用于权利要求1所述的重金属回收方法中，所述试剂的特征在于，包含能够与重金属螯合的螯合剂以及巯基的掩蔽剂。
13.根据权利要求12所述的试剂，其中，所述掩蔽剂由选自下述结构式(1)～(3)所组成的组中的至少一个结构式表示：
Figure FSA00000783254900031
在所述结构式(1)～(3)中，R表示氢、烷基、苯基或苄基，在所述结构式(2)和(3)中，X表示卤素。
14.根据权利要求13所述的试剂，其中，所述结构式(1)的掩蔽剂为马来酰亚胺、N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺，所述结构式(2)的掩蔽剂为碘代乙酰胺，所述结构式(3)的掩蔽剂为碘乙酸。
15.根据权利要求12所述的试剂，其中，所述螯合剂为含有含硫基团的螯合剂。
16.根据权利要求15所述的试剂，其中，所述含硫基团为硫酮基。
17.根据权利要求12所述的试剂，其中，所述螯合剂为1，5-二苯基-3-硫卡巴腙。
18.一种待测体的前处理方法，所述待测体供于权利要求1所述的重金属回收方法，所述前处理方法的特征在于，
在形成待测体中的重金属和能够与重金属螯合的螯合剂的络合物之前，向所述待测体中添加巯基的掩蔽剂。
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