JP2969226B2 - 微量水銀の測定方法 - Google Patents
微量水銀の測定方法Info
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る。
るが、一般的に日本工業規格(JIS K0101およびK0102)
で指定されているジチゾン法(比色法)および原子吸光
法が広く用いられている。ジチゾン法は、水銀が弱酸性
の水溶液中でジチゾンと反応して形成する水不溶性の分
子内錯塩を、クロロホルムまたは四塩化炭素により定量
的に抽出し、橙色を呈す抽出液の490nmの吸光度を測定
して分析するものである。一方、原子吸光法は水銀イオ
ンを含む試料溶液に酸性下で塩化第1スズを加えて水銀
イオンを還元し、この溶液をエアレーションにより気化
させ、253.7nmの原子吸光を測定して分析するものであ
る。
広く用いられてきたが、次のような問題点が残されてい
るため、その改善が望まれていた。まずジチゾン法は、
操作が煩雑である上サンプルの必要量が比較的多いた
め、連続システムには適さない。また、原子吸光法と比
較して感度が低く、しかも銀や銅などの妨害成分が比較
的多く誤差が生じやすいため、微量の水銀を測定する方
法としては好ましくない。さらに、クロロホルムや塩酸
ヒドロキシルアミンなどの有害薬品を使用するため危険
が伴う。一方、原子吸光法は比較的多量のサンプルを必
要とするバッチ式操作によるものなので、連続システム
には適さない。また、塩化スズなどの有害薬品を使用す
るため危険が伴うことなどがあげられる。
は、ジチゾン法では100ng、原子吸光法では5ngであると
報告されており、これより微量の水銀を測定する場合に
は、前処理としてサンプルを濃縮していた。しかしなが
らこの濃縮操作は相当の時間を要するため、特に多数の
サンプルを測定する場合には極めて煩わしいものであっ
た。しかも、濃縮の度合いに応じてサンプルの必要量が
増加するため、サンプル量が少ない場合には濃縮できず
測定を断念していた。
元酵素およびNADPHを添加して、溶液中の水銀イオンを
還元し、さらにその水銀イオンと当量のNADPHをNADP+に
酸化することにより、サンプル溶液中におけるNADPHの
量の変化から水銀濃度を定量する方法がある。しかしな
がら、この方法は検出感度が悪いため、微量分析には適
さないとされていた。
しており、これらに起因する水銀汚染は水、大気および
作物などを通じて極微量ずつながら各国に影響を及ぼし
ている。例えば雨水には0.0002ppm、海水には0.0003ppm
程度の水銀が含まれているといわれているが、今後これ
らの濃度が増加する危険性は高く、測定すべきサンプル
の数は極めて多い。しかし従来技術の方法では前述問題
点が未解決であるため、この様な微量水銀の濃度を測定
することが極めて困難である。そこで、雨水や作物など
に含まれる微量の水銀でさえも容易に測ることができる
微量水銀の測定方法の確立は、極めて重要かつ必要なも
のであると考えられる。
サンプルで微量の水銀を連続的に測定することができる
微量水銀の測定方法に関する。
オン還元酵素およびNADPHを所定量添加し、さらにこの
サンプル溶液中にカタラーゼを存在させることにより、
水銀イオンの酸化・還元のサイクリング反応系を確立さ
せたことを特徴とする本発明の微量水銀イオン測定方法
の開発によって解決された。
プル溶液中に水銀イオン還元酵素、NADPH(ニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチドリン酸)およびメルカプ
ト化合物を所定量添加し、これにカタラーゼを共存させ
ることにより、以下の式1に示される反応を確立させ
る。式1の反応とは、水銀イオン還元酵素の触媒により
該溶液中の2価の水銀イオン(Hg2+)が還元されて0価
の水銀(Hg0)となる反応と、この反応過程において還
元される水銀イオン(Hg2+)と当量のNADPHが酸化さ
れ、当量のNADP+および水素イオン(H+)を生成する反
応である。
水銀(Hg0)が、共存させたカタラーゼの触媒により再
び酸化されて2価の水銀イオン(Hg2+)にもどされる再
生反応が起こる。すなわちサンプル溶液中において水銀
イオンの酸化・還元が繰り返されるサイクリング反応系
が確立されているのである。また、このサイクリング反
応系では、1サイクルでサンプル溶液中に含まれる水銀
イオンと当量のNADPHが減少し、当量のNADP+が生成され
ることになる。したがって、このサイクリング反応にお
いては単位時間当たりのNADPHの減少量およびNADP+の増
加量は一定であり、これを時間経過と共に見るとNADPH
は直線的に減少し、NADP+は直線的に増加する。そのた
めNADPHの減少量またはNADP+の増加量から、水銀を定量
することができるのである。なお、NADPH量は、NADPHの
示す蛍光(励起波長340nm、発光波長470nm)の強度測定
により計ることができるが、他の好適な方法で測定して
も何等問題はない。
液中の遊離水銀イオン単独ではなく、そのメルカプチド
であるため、本発明ではサンプル溶液にメルカプト化合
物を添加している。また、本発明者等の実験により該酵
素の活性は、システアミンを用いた場合が最も高く、シ
ステインがこれに次ぐことが明らかとなった。また水銀
イオン還元酵素の存在する菌体をスクリーニングする方
法は[Appl,Environ,Microbial,54,2871〜2873,(198
8)]で述べられている。
測定法である酵素的サイクリング法[Lowry,O.H.et.a
l.,J.Biol.Chem.236,2764(1961)]と同質のものであ
り、測定すべき物質Aの反応系の他に物質Aの再生系を
設け、繰り返し反応に関与させることで増幅を行わせる
というものである。
水銀イオン還元酵素を20nM、カタラーゼを0.1mg/ml前後
で添加するのが最適であった。この条件で微量水銀の測
定を行ったところ検出下限は約10nMHg2+(約2ppbHg)で
あり、200nMHg2+までは蛍光減少速度の相対値と水銀濃
度との間に比例関係が成立した(第1図aおよびb)。
しかし本発明では水銀イオン還元酵素、NADPHおよびカ
タラーゼの添加量およびpHは上記値に限定されるもので
はない。なお、サンプル溶液中に水銀が存在しない場合
でも蛍光強度の減少が多少見られるため、EDTAまたは第
2鉄イオンを添加してバックグラウンドを軽減した。
様の前処理を行うことにより可能である。
かし本発明の範囲は以下の実施例により制限されるもの
ではない。
として、河川水と蒸留水にHgCl2が0、10、20、50およ
び100nMとなるようにそれぞれ添加した。これらの液を
蛍光用石英セル(外寸12.5×12.5×45mm、内寸2.3×7.5
×43mm)に200μずつ採取し、これに0.5mMのNADPH
(ベーリンガーマンハイム社製)、10mMのシステアミ
ン、5mMのEDTAおよび0.1μMの水銀イオン還元酵素を含
む0.5Mのカリウム−リン酸緩衝液(pH=8.0)50μを
加えて蛍光減少速度が安定するまで数分間放置した。放
置後、10mg/mlのカタラーゼ溶液を2.5μ添加し、単位
時間当たりの蛍光強度の減速速度を分光蛍光光度計(日
本分光FP−770型)を用いて測定した。この結果を第2
図に示す。なおセルホルダー中には恒温水を循環さて反
応温度を30℃に保持した。この結果より、第2図に示し
たとおり河川水に含まれる水銀イオンは10μMまでこの
方法により測定可能であった。
A Matrex gel(Amicon社)を使用してアフィニティー
クロマトグラフィー法[J.of Biol.Chem.257,No.5,2498
〜2503,(1982)]により精製したものを使用した。
吸光法を第3図および第4図を用いて示す。
液として、河川水と蒸留水にHgCl2が0、10、20、50お
よび100nMとなるようにそれぞれに添加した。これらの
液を200mlの三角フラスコに各5mlずつ採取し、日本工業
規格(JIS K0102)に規定する方法で前処理を行った
後、フレームレス原子吸光光度計(平沼産業製、MODEL
HG−1)で測定したところ、第3図に示すような結果を
得た。
作成した検量線によって試験溶液のHg濃度を求め、それ
ぞれの相関を第4図に示した。その結果、実施例と比較
例1との間には高い相関性が見られることが確認できた
が、この原子吸光光度計の検出下限はカタログ値によれ
ば5ngであるのに対し、実施例では10nM(200ppb)×200
μ=0.4ngHg2+となり、従来法より10倍程度感度がよ
いことが分かった。
水銀イオン還元酵素を用いた水銀の測定方法により行っ
た水銀測定の結果を示す。
含む緩衝液(pH=7.0〜9.0リン酸緩衝液またはトリスー
塩酸緩衝液)に水銀イオン還元酵素(20nM)およびHgCl
2を加えることにより、2価の水銀イオン(Hg2+)が0
価の水銀(Hg0)に還元されると共に、これと当量のNAD
PHが酸化されてNADP+となるため、NADPHの蛍光強度の減
少量から水銀イオン(Hg2+)の定量を分光蛍光光度計
(日本分光FP−770型)を用いて行った。
0ppb)であり、原子吸光法とほぼ同程度であった。
る検出下限が0.5ngHg2+の超微量分析が可能になった。
また、従来の技術のように還元剤などとして重金属塩や
塩酸ヒドロキシアミン等の有害物質を使用せずに測定が
できるため、環境保全および安全面からみて非常に好ま
しい方法であるといえる。さらに酵素は高い基質特異性
を有しているためHg2+のみに特異的に反応し、他のイオ
ン毎の選択性も高いため他の物質による妨害が著しく減
少した。さらにくわえて水銀イオン還元酵素などを担体
に固定化することによって、半連続的な測定が可能なフ
ローシステムを組むことができるので、これによって各
サンプルの測定時間を大幅に短縮することができる。
適条件のもとで測定を行った場合のNADPHの蛍光減少速
度の相対値とHgCl2のモル濃度との関係を示すグラフで
ある。 第2図は、本発明の実施例におけるNADPHの蛍光減少速
度の相対値とHgCl2のモル濃度との関係を示すグラフで
ある。 第3図は、従来の技術により測定したHg蒸気の253.7nm
における吸光度(相対値)とHgCl2のモル濃度との関係
を示すグラフである。 第4図は、実施例と比較例との相関を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【請求項1】微量の水銀を含有するサンプル溶液に水銀
イオン還元酵素およびNADPHを所定量添加することによ
り、溶液中の2価の水銀イオン(Hg2+)を0価の水銀
(Hg0)に還元すると共に、これと当量のNADPHをNADP+
に酸化させ、これに伴い生じるサンプル溶液中のNADPH
またはNADP+の量の変化を測定して、溶液中の水銀濃度
を定量する方法であって、このサンプル溶液中にさらに
カタラーゼを存在させることにより、還元されて生成し
た0価の水銀(Hg0)が再び2価の水銀イオン(Hg2+)
に酸化され、水銀イオンの酸化・還元が繰り返し行なわ
れるサイクリング反応系が確立されるようにすることを
特徴とする微量水銀の測定方法。
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-
1990
- 1990-10-15 JP JP27585090A patent/JP2969226B2/ja not_active Expired - Fee Related
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