CN103012594A - 一种运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSNs)一种用途，即将其用于运载猪圆环病毒抗原PCV2GST-ORF2表位蛋白，这种纳米载体颗粒的直径为100～200nm，本发明同时公开多孔结构的空心球状硅纳米颗粒承载PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，即将具有所述的硅纳米颗粒溶于磷酸缓冲液中，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分吸咐蛋白。相关实验表明，用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒作为猪圆环病毒抗原表位蛋白载体，可以实现猪圆环病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠体内缓慢释放，持续刺激机体产生免疫应答的效果。

Description

一种运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体及应用

技术领域

本发明涉及一种运载特定蛋白的载体，特别是一种可以运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体。

背景技术

在基础研究和临床实验中均需要使用某种载体来运载化学药品或特定的蛋白，本领域的工作者仍在尝试寻找这一类的高效的运载工具。

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病原之一，PCV2基因组编码11个阅读框架，其中了解比较清楚的ORF 1由945个碱基组成，编码参与病毒复制A的Rep蛋白；ORF2由705个碱基组成，编码病毒主要结构蛋白Cap，其在病毒感染诱导的免疫反应中起重要作用。研究表明，Cap蛋白中含有中和抗原表位，在对Cap和Rep蛋白的免疫原性比较中发现，Cap蛋白为主要免疫原，而Rep蛋白仅有微弱的免疫原性，因此，ORF2已成为目前构建PCV2重组疫苗的首选靶基因。

近年来，研究者尝试用生物可降解材料制作的微粒，如藻酸盐微粒、聚乳酸微粒、脂质体微粒等包裹并投递蛋白疫苗，初步研究发现微粒载体的应用可减少免疫次数，产生佐剂效应，增强免疫效果，提高免疫覆盖率。但研究也发现，用这些微粒做载体时，抗原包裹过程中所使用的有机溶剂会导致承载的蛋白质抗原变性而失活，而且这类微粒由于其粒径小，比表面积大，易于粘接与团聚，其次这类微粒的稳定性及抗原释放速率机制以及微粒的粒径大小、均匀程度、表面形态等参数均难以或还不清楚，这些缺点也限制了这类载体作为蛋白疫苗运载系统的广泛应用。

具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSN)是一类具有多种优势的纳米材料，这些优势包括无毒的自然属性、良好的表面穿透性、比表面积大、可调的孔结构、良好的物理化学稳定性以及可修饰的化学表面等，这些特性使中空多孔硅纳米颗粒(HMSN)成为运载多种化学物或药物的最佳载体。

发明内容

本发明提供硅纳米颗粒的用途，本发明的第二个目的是提供这种纳米颗粒承载猪圆环病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法。

本发明所述的多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSNs)用途是将其用于运载猪圆环病毒抗原表位蛋白，而这种纳米载体颗粒的直径为100～200nm；更进一步讲，本发明所述的运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米颗粒载体可在制备猪圆环病毒疫苗中应用。

本发明所述的纳米载体在承载PCV2GST-ORF2表位蛋白时是将具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中配制成多孔结构的空心球状硅纳米颗粒的悬液，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，室温下充分搅拌，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分吸咐蛋白。

本发明的纳米载体承载PCV2GST-ORF2表位蛋白的最佳方法是：所配制的多孔结构的空心球状硅纳米颗粒悬液的浓度为10mg/mL，然后在10mL悬液中加入0.5mg的PCV2GST-ORF2蛋白，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分进行吸咐PCV2GST-ORF2蛋白。

本发明用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSN)承载PCV2GST-ORF2表位蛋白，HMSN作为载体可有效防止蛋白酶对承载蛋白制剂的降解并使承载的蛋白缓慢释放，从而达到持久免疫刺激的效果，为提高疫苗的效力提供条件。

相关实验表明，用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒作为猪圆环病毒抗原表位蛋白载体，充分利用利用了空心球状硅纳米颗粒具有的高承载量和控释特性，可以实现猪圆环病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠体内缓慢释放，持续刺激机体产生免疫应答的效果。相关的实验表明，与直接以PCV2GST-ORF2表位蛋白免疫小鼠相比，承载了PCV2GST-ORF2表位蛋白的HMSN能够诱导持续的抗体免疫反应和较强的细胞免疫反应，而这种缓释特性在蛋白疫苗载体应用中的具有明显的优势。

附图说明

图1为本发明所使用的中空多孔硅纳米颗粒的电镜图，其中：(a)为扫描电镜图，(b)为透视电镜的图，图中的纳米粒的直径大约为100～200nm。

图2为SDS-PAGE和western-bloting对纯化GST-ORF2-E蛋白的鉴定，图中：A图为纯化蛋白洗脱后的SDS-PAGE图，其中：.Lane 1：为第一次洗脱；Lane 2为：第二次洗脱；Lane 3为第三次洗脱；B为用GST单克隆抗体对纯化蛋白的鉴定，其中：Lane 1为纯化蛋白，Lane 2为pGEX-4-T-1空载体对照。

图3为中空多孔硅纳米颗粒(HMSNs)吸附结合蛋白的规律曲线，其中标记圆点的线、标记三角的线及标记菱形的线分别代表吸附浓度为1、5、10mg/mL的HMSNs。

图4为HMSNs体外控释蛋白的规律曲线。

图5为小鼠血清抗体效价的ELISA检测。

图6为T淋巴细胞增值实验。

图7为T淋巴细胞亚群，其中图7的上图为CD4+分布，下图为CD8+分布。

图8为小鼠血清的INF-γ的ELISA检测。

具体实施方式

1)合成中空多孔硅纳米颗粒(HMSNs)

本发明中应用的HMSN合成方法如文献Guo H，Qian H，Sun S，Sun D，Yin H，Cai X，Liu Z，Wu J，Jiang T，Liu X.Hollow mesoporous silica nanoparticles forintracellular delivery of fluorescent dye.Chem Cent J.2011，5(1)：1中所述。具体步骤如下：取14mL无水乙醇和26.5mL去离子H₂O混合，搅拌使其混匀并加入0.5mLTEOS和0.08g CTAB，随后加入0.5mL 25％的氨水并在室温条件下持续搅拌3h。将混合好的乳浊液8000～10000rpm/min离心10～15min，弃去上清，用去离子水洗沉淀3次。将沉淀取出置于马弗炉中200℃煅烧6h然后再600℃煅烧6h后得产物粉末。将合成好的粉末状HMSN溶解到0.01M PBS(pH7.4)中，以扫描电镜和透视电镜观察其颗粒形态。从电镜图片可见所合成的纳米颗粒为中空球形颗粒，直径大小约为200nm，表面为疏松多孔结构，其结构见图1。

2)PCV2GST-ORF2表位蛋白的表达和纯化

本发明采用的融合蛋白PCV2GST-ORF2表位蛋白的诱导表达及纯化如文献Sun SQ，Guo HC，Sun DH，Yin SH，Shang YJ，Cai XP，Liu XT.Development andvalidation of an ELISA using a protein encoded by ORF2antigenic domain ofporcine circovirus type 2.Virol J.2010，7：274.中所述，具体方法为将阳性克隆菌以1∶100接种于LB培养基(100μg/mL ampicillin)，于37℃摇培(250rpm/min)直至菌液的OD600nm值介于0.6-0.8，以IPTG(终浓度0.1M)诱导表达，37℃摇培3h后收菌，PCV2GST-ORF2融合蛋白应用MagnetGST^TM GlutathioneParticles(Promega)进行纯化。对洗脱得到的PCV2GST-ORF2融合蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白纯化效果良好，大小约29KDa，参见图2。

3)HMSNs承载PCV2GST-ORF2表位蛋白

将HMSNs溶于PBS(pH 7.0)中，配制成HMSNs悬液(1，5and 10mg/mL)，将这不同浓度的悬液(10mL)分别加入0.5mg PCV2GST-ORF2蛋白，在室温下持续搅拌(250rpm/min)，分别收集30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h、32h不同时间段的样品(500μL)，10000rpm离心5min，用Micro BCA^TM protein assaykit(Pierce，Rockford，IL)检测上清中经吸附所剩余的蛋白含量。经检测可以发现，HMSNs吸附蛋白主要在最初的1h之内，随着时间的增加吸附速度急剧下降，在经过4h的吸附之后HMSNs结合蛋白的量已经接近饱和。比较三个不同浓度的HMSNs吸附蛋白的情况发现，10mg/mL的HMSNs对PCV2GST-ORF2蛋白的吸附最理想，其最大载量为150μg/mL，参见图3。

4)PCV2GST-ORF2表位蛋白自HMSNs的缓释规律

将承载有PCV2GST-ORF2蛋白的1mL HMSNs(10mg/mL)溶于20mL PBS(pH7.4)中，超声使悬液变均一，分装到10个2mL的管中在4℃下进行释放，并在不同的时间(8h、24h、72h、108h、240h、320h、380h、480h)收取样品，10000rpm离心5min，用Micro BCA^TM protein assay kit(Pierce，Rockford，IL)检测经HMSNs吸附上清中所剩余的蛋白量。结果显示，HMSNs对蛋白的释放可以分为三个阶段：在最初的8小时，蛋白释放速度很快，随后释放速度趋于平缓，到400h时蛋白的释放基本终止，上清中蛋白的含量不再有明显的变化，参见图4。

5)HMSNs/PCV2GST-ORF2表位蛋白小鼠免疫方案

将21只4周龄的BALb/c鼠分为3组，第一组用HMSNs/PCV2GST-ORF2表位蛋白免疫，第二组直接用PCV2GST-ORF2蛋白免疫、第三组用PBS悬浮的HMSNs颗粒作为对照进行免疫。首先在免疫前对所有小鼠进行断尾采血，在免疫后第二周开始每周对各组小鼠进行采血收集血清检测抗体水平及其INF-γ。其中第2、4、6周每组各随机收取1只小鼠断颈处死，取其脾脏分离淋巴细胞进行淋巴细胞增值实验，同时取一部分淋巴细胞用流式细胞仪分析淋巴细胞亚群CD4+、CD8+分布情况。

6)抗体效价的ELISA检测

将96孔板(Nunc Maxisorp)用100μL 0.05M碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释的PCV2GST-ORF2融合蛋白4℃包被过夜。PBST清洗3次，孔板用含5％脱脂奶粉的PBST(150μL)37℃封闭1h。PBST清洗3遍后，待检小鼠血清及阳性阴性猪血清分别用含1％脱脂奶粉PBST按1∶100稀释后，每孔100μL加于封闭孔板中，于37℃孵育1h。PBST清洗3次后，HRP标记的二抗(Sigma)用含1％脱脂牛奶的PBST按1∶20000稀释并每孔100μL加于封闭孔板中，于37℃孵育1h.PBST清洗3次后，50μL底物溶液(OPD，Sigma)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μL 2N H₂SO₄加于各孔终止颜色反应，于490nm检测光密度(OD值)。结果显示，和只用PCV2GST-ORF2表位蛋白免疫的小鼠相比，HMSNs/PCV2GST-ORF2蛋白免疫组的抗体水平持续升高，免疫后第三周达到了最高峰，直至免疫后第五周降至和PCV2GST-ORF2蛋白免疫组相同的抗体水平。而PCV2GST-ORF2蛋白免疫组的抗体水平自免疫后第二周即达到最高水平，到免疫后第三周即开始显著下降。这说明HMSNs有明显的蛋白缓释作用，从而使缓释的蛋白能够持久的刺激动物机体产生抗体，参见图5。

7)T-淋巴细胞增殖实验

分别在2、4、6周随机收取1只小鼠将其脱颈处死，然后放入酒精中浸泡5min消毒，无菌取脾，加入1mL无血清1640培养液于200目铜网上研磨，用无血清RPMI 1640培养液冲洗铜网，将研磨获得的脾细胞悬液加入装有2mL淋巴细胞分离液的离心管中，4℃2500r/min离心10min，用长针头吸出淋巴细胞层放入新离心管中，用无Ca²⁺、Mg²⁺HankS液洗两次并以RPMI 1640培养液混匀，细胞计数后，以含10％FBS的RPMI 1640培养液稀释成10⁷/mL浓度。将稀释好的淋巴细胞悬液加入96孔细胞板中(100μL/孔)，每个样品设4复孔，每孔加入GST-ORF2蛋白特异性刺激物10μg，同时以不加刺激物的淋巴细胞为对照，培养板在含5％CO₂的37℃恒温培养箱培养72h后，加入20μL MTS/PMS混合试剂(CellTiter 96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay，Promega)，于37℃培养4h，用酶标仪检测波长为490nm的光密度值。计算刺激指数(stimulation index，SI)。SI＝PCV2刺激孔的平均OD490nm-未刺激组的平均OD490nm/未刺激组的平均OD490nm-空白1640培养液组的平均OD490nm。结果显示，HMSNs/PCV2GST-ORF2表位蛋白免疫组小鼠的淋巴细胞经特异的PCV2GST-ORF2蛋白刺激后，T-淋巴细胞的增值效果高于其他两个免疫对照组，并且到第四周时显著升高，而其他实验组的细胞免疫水平基本没有显著变化，到免疫后第六周，HMSNs/PCV2GST-ORF2刺激的淋巴细胞免疫水平虽然降低，但依旧高于其他实验组，这与抗体效价的变化规律基本一致，这说明HMSNs作为疫苗载体，不仅能够持续刺激机体产生细胞免疫应答。而且其诱导产生的细胞免疫水平能够较其他实验组持续较长时间，这进一步证实了HMSNs作为疫苗载体的缓释特性，参见图6。

8)T-淋巴细胞亚群分布检测

取脾脏分离淋巴细胞，用预冷的PBS调整细胞浓度至6×10⁶个/mL。各取100μL分别加入APC标记的抗鼠CD4+、PE标记的抗鼠CD8+单克隆抗体(APC、PE均购自BD公司)，混匀后置于4℃避光30min，以预冷的PBS洗两遍，4℃2000r/min离心5min，弃上清，沉淀用350μL预冷的PBS重悬，用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群。T-淋巴细胞亚群CD4+、CD8+增值分布的结果显示，HMSN/PCV2GST-ORF2表位蛋白复合物能够刺激机体产生细胞免疫应答，而且其T淋巴细胞反应更倾向于CD8+细胞亚群，参见图7，但这种倾向和刺激CD4+细胞亚群的免疫反应没有明显差异。

9)INF-γ的检测

取采自第2、4、6周的小鼠血清，每组随机取3个样，将其用稀释液R(1×)1∶50稀释。采用mouse IFN-γ预包被ELISA kit(Dakewei)检测小鼠IFN-γ，根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。操作步骤如下：①分别将稀释后的细胞因子标准品加入标准品孔，样品加至样品孔(100uL/well)，并以稀释液R(1×)设置空白孔。②加入稀释后的生物素化的抗体(50uL/well)震荡混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min。③弃去孔内液体，以1×washing buffer洗板(300uL/well)，重复4次，每次拍干。④加入稀释后的Streptavidin-HRP(100uL/well)，盖上封板膜，37℃温育30min。⑤弃去孔内液体，以1×washingbuffer洗板(300uL/well)，重复4次，每次拍干。⑥加入TMB显色(100ul/well)，37℃避光温育5-30min之间。⑦迅速加入Stop solution(100uL/well)终止反应。⑧终止后10分钟内，用检测波长(measurement wavelength)450nm读值。结果显示HMSN/GST-ORF2蛋白免疫组小鼠的IFN-γ含量明显高于其他组两个是实验组，说明HSMN作为疫苗载体能够诱导机体产生显著的细胞因子反应，参见图8。

本发明首次采用HMSN纳米颗粒作为猪圆环病蛋白疫苗的载体，使承载到纳米颗粒上的病毒免疫原蛋白缓慢释放，从而获得持久的抗原刺激和长时间的免疫持续期，为PCV2的新型疫苗及疫苗载体的开发应用提供新的思路，并为HMSN用于疫苗载体提供了实证。

Claims (4)

1.一种具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒用于运载猪圆环病毒抗原表位蛋白，这种纳米载体颗粒的直径为100～200nm。

2.权利要求1所述的运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的蛋白载体承载猪圆环病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，其特征在于将具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中配制成多孔结构的空心球状硅纳米颗粒的悬液，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，室温下充分搅拌，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分吸附蛋白。

4.根据权利要求3所述的蛋白载体承载猪圆环病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，其特征在于所配制的多孔结构的空心球状硅纳米颗粒悬液的浓度为10mg/mL，然后在10mL悬液中加入0.5mg的PCV2GST-ORF2表位蛋白。

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