CN101709080A - 抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其制备方法，具体涉及用于抗猪圆环病毒合成肽疫苗的多肽或其聚合物，以及含有该多肽的疫苗及它们的制备方法。所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。由该多肽制成的疫苗可以有效应对猪圆环病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

Description

抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于抗猪圆环病毒合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)是由II型圆环病毒所引起的，临床上以仔猪先天性震颤、断奶仔猪衰竭及皮炎为主要特征的一种传染病，各种日龄的猪均可感染和发病，已给世界养殖业造成了巨大的经济损失。

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)，是圆环病毒中最小的病毒，该病毒粒子直径为17-25nm，是一种二十面体对称、无囊膜、单股环状的DNA病毒。

根据PCV的抗原性和基因组成不同，将其分为两种基因型(或称血清型)，即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系；PCV2具有致病性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PWMS)的主要病原之一。前者基因组为1759bp，后者基因组为1768bp或1767bp。

对PCV-2的基因组分析发现，所有PCV-2分离株的基因组同源性都在95％以上，但与PCV-1的同源性却小于80％，两者差异表现在核苷酸链上的几个部位存在碱基缺失现象。PCV有两个主要的阅读框：ORF1和ORF2，二者长度都大于600bp。ORF1是最大的阅读框，编码病毒的复制蛋白(Rep)，约230-231个氨基酸，其分子量为37kD，与病毒的复制转录有关；位于负链上的ORF2变异性相对较大，编码病毒的结构蛋白(Cap，核衣壳蛋白)，约234个氨基酸，该结构蛋白的抗原性具有型特异性。

据文献报道，PCV2 Cap蛋白的抗原表位主要位于65～87，I13～147，157～183和193～207位氨基酸残基，明确了PCV2的Cap蛋白上存在有PCV2的中和表位和非中和表位，至于具体的表位则有待进一步研究。

通过使用接种过猪圆环病毒PCV2分离株产生的抗血清做ELISA实验，来识别PCV2的ORF2编码蛋白的免疫相关线性B细胞表位。两个PCV2特异性的抗原表位位于69-83和117-131位氨基酸残基。SPF猪对抗原表位117-131(即B-133)的血清抗体效价在感染后6周时是22％，在感染后11周达到100％。而从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪上分离的野毒株血清，8-10周猪产生针对抗原B-133表位的抗体比例为5％，13-14周猪产生针对抗原B-133表位的抗体比例为38％，16-19周猪产生针对抗原B-133表位的抗体比例为62％，20-25周猪产生针对抗原B-133表位的抗体比例为56％，26-31周猪产生针对抗原B-133表位的抗体比例为45％。所有数据证实，抗原表位B-133是PCV2抗体应答一个重要表位。

自1991年首次在加拿大发生断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)以来，在全世界大多数养猪国家均有发生该病的报道(Allan and Ellis，2000a)。由PCV2感染引起的PMWS于2002年在我国各地呈暴发流行(王忠田等，2002)，给国内养猪业造成了巨大经济损失，已成为我国规模化猪场危害养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一(杨汉春，2004)。因此，加强对PCV2感染的控制具有十分重要的实践意义。

目前，对PCV2的控制主要靠加强饲养管理和生物安全措施，而关于免疫防治的研究报道的比较少，生产上更没有可用的疫苗。但是从猪的发病年龄来看，是在仔猪断奶而血中母源抗体水平降低之时，机体低水平的PCV2特异性抗体使仔猪处于易感状态，如果能够通过接种疫苗的方式，诱导机体在母源抗体水平降低而使机体处于易感之前就产生免疫，预防此病则成为可能。

由于该病毒是一种DNA病毒，病毒的变异率低，在世界范围内的致病只有PCV2一型，且该病毒自身有很好的抗原性，能够诱导机体产生高水平的抗体和对该病提供保护作用。但是，由于该病毒分离困难、鉴定困难、加上体外培养PCV2比较困难且病毒滴度较低，所以研究开发安全有效的新型疫苗不失为一条可取的策略。

已有研究表明，表达PCV2 CP(capsid protein核衣壳蛋白)的重组质粒能够激发小鼠的特异性抗体反应(Kamstrup et al.，2004)，这为PCV2DNA疫苗的研究提供了试验依据。Blanchard等(2003)比较了重组PCV2CP与表达CP的重组质粒在SPF猪体内的免疫保护效果，结果显示重组蛋白疫苗和质粒DNA疫苗都能够提供很好的保护性，但重组CP的保护效果比重组质粒更好，同时还表明PCV2 ORF1编码的蛋白免疫原性很弱，不足以诱导机体产生免疫保护性，并且已知重组蛋白疫苗只能激发机体产生体液免疫反应，而不能诱导细胞免疫应答。

相比之下，合成肽疫苗具有安全不散毒，能激发机体全面免疫反应(包括体液和细胞免疫反应)、制备工艺简单、储存运输方便、不受母源抗体干扰等优势，是当今疫苗研究的新方向。

发明内容

因此，本发明的目的在于，提供用于抗猪圆环病毒合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗。

本发明的另一个目的在于，提供一种上述多肽或其多肽聚合物以及上述疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一方面，本发明所提供的一种用于抗猪圆环病毒合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

该PCV2合成肽的设计过程如下：通过对国内PCV2流行毒株的序列测定，研究PCV2主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行PCV2抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受PCV2流行毒株攻击的多肽抗原。

另一方面，本发明提供一种猪圆环病毒病合成肽疫苗，其中包括一种或多种上述的多肽或其多肽聚合物；优选地，所述疫苗包含佐剂。

此外，本发明还提供了上述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：

(1)去保护反应：在15％-30％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；

(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；

(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；

(4)乙酰化反应：使用1.5％-4％(重量/体积)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；

(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；

(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；

(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。

在上述制备方法中，所述裂解试剂的组成具体为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。

本发明还提供了上述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：

(1)用注射用水将多肽稀释至50μg/ml；

(2)在20-28℃条件下，按照多肽溶液∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；

(3)缓慢加入含有多肽溶液，搅拌20-30分钟；

(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。

在上述制备方法中，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。

本发明进一步提供了上述的多肽或疫苗在制备治疗和/或预防猪圆环病毒病的药物中的用途。

针对现有技术在预防PCV2方面的不足，本发明人在研究我国PCV2病毒序列变异规律的基础上，通过计算机分析设计并合成了本发明的多肽，并对这些多肽进行了疫苗安全性和免疫应答试验。结果表明，该疫苗可以有效激发猪的免疫应答，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为免疫和攻毒后血清特异性抗体动态图。

图2为第三次免疫后四周血清中和抗体效价结果图。

图3为ConA刺激后外周血液淋巴细胞的增殖能力结果图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：合成肽疫苗多肽抗原的固相合成

本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本发明的多肽抗原可以通过ABI 433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。

1、合成原料的准备

合成肽疫苗多肽抗原序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ INNO.3所示的氨基酸序列以及(SEQ ID NO.2)₂-K-εK-CONH₂所示氨基酸序列的聚合肽，其中K表示赖氨酸，ε代表在ε氨基有Fmoc保护的赖氨酸。

依据上述多肽抗原序列以及1mmol的合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的Cartridge(装氨基酸的小瓶)中。同样按要求称量RinkAmide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成的肽的名称，批号，反应腔的皮重以及所称取树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到对应的试剂瓶中。

2、合成仪状态的检测

检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N₂是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu-ModuleTest-按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)-按Start-按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。

3、合成肽疫苗多肽抗原的制备

(1)去保护反应：在15％-30％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；

(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；

(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；

(4)乙酰化反应：使用1.5％-4％(重量/体积)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；

(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；

(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂(各组分的体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1)，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；

(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。

实施例2：合成肽疫苗的配制

本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的配制。

用注射用水将多肽溶液分别稀释到50μg/ml，制成抗原水相；将SEPPICMONTANIDE ISA 50V油佐剂经121℃，30分钟灭菌，备用作为油相。在22℃条件下，按照抗原水相与灭菌的油相50V为1∶1的体积比，先将油相加入乳化罐内，100转/分钟慢速搅拌2分钟，缓慢加入水相，加完后搅拌30分钟，再高速9000转/分钟搅拌20分钟，然后静置5分钟，分装后即得抗猪圆环病毒的合成肽疫苗，即具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的合成肽疫苗、具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的合成肽疫苗，具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的合成肽疫苗，以及(SEQ ID NO.2)₂-K-εK-CONH₂所示氨基酸序列的合成肽疫苗。

实施例3：合成肽疫苗的效力试验

本实施例通过以下不同方法对本发明所提供的合成肽疫苗进行效力评价。

将7日龄健康仔猪分成5组，分组情况见表1，每组3头，于左右颈侧部肌肉各注射1ml合成肽疫苗，共肌肉注射3次，每次间隔两周，第3次免疫后4周通过口腔和鼻腔途径感染10^6.22TCID₅₀/ml的PCV2组织毒(BJ-HB株)(中国农业大学惠赠)，每头接种5ml。

表1 试验动物的分组情况及免疫攻毒剂量

分组	注射疫苗	试验动物数(头)	免疫剂量(ml)	攻毒剂量(ml)
					A组	空白对照	3	1	5
B组	SEQ ID NO.1多肽疫苗	3	1	5
					C组	SEQ ID NO.2多肽疫苗	3	1	5
D组	SEQ ID NO.3多肽疫苗	3	1	5
					E组	(SEQ ID NO.2)2-K-εK-CONH2聚合肽疫苗	3	1	5

1)ELISA检测血清特异性抗体反应

为了分析合成肽疫苗免疫和攻毒后各组的抗体反应，分别于免疫前、第1次免疫后14天、第2次免疫后14天、第3次免疫后14和28天，以及攻毒后1、2、3、4、5周采集各组猪的前腔静脉血，分离血清，用ELISA检测血清中的PCV2特异性抗体。

ELISA检测过程主要为：用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释上述合成肽疫苗，至终浓度为0.1μg/ml，包被96孔酶联反应板，100μl/孔，37℃作用2小时后，置4℃过夜；以PBS(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤3次，3分钟/次；每孔加入100μl封闭液(含5％犊牛血清的PBS)，37℃作用1-2小时；甩干酶联板孔内封闭液，加入用封闭液作1∶40倍稀释的待检猪血清及作相同倍数稀释的阴、阳性血清，100μl/孔，37℃湿盒(购自迈晨科技有限公司)内作用45分钟；PBS洗涤3次，3分钟/次；每孔加入100μl工作浓度(1∶800)的HRP-兔抗猪IgG(购自迈晨科技有限公司)，37℃湿盒作用45分钟后洗涤3次，3分钟/次；每孔加入100μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(购自迈晨科技有限公司)，室温避光显色10分钟；每孔加入50μl2mol/LH₂SO₄终止反应，用酶标仪(酶标仪BIO-RAD model 680)测定OD_450nm光密度值，当待检血清样品值OD_450nm值≥0.3时，判定为阳性。

ELISA检测结果见图1，表明合成肽疫苗能够刺激机体产生PCV2特异性抗体。

2)血清中和抗体效价的测定

分别于第3次免疫后4周、攻毒后1周和4周，采取各组猪前腔静脉血，分离血清，以微量平板血清中和试验，结合免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)来测定血清中和抗体效价。

具体过程为：取适量待测血清样品于56℃条件下作用，以灭活补体；将血清作1∶2～1∶64倍比稀释后，与等量的PCV2 BJ-HB株病毒液(含200TCID50)混合，于37℃孵育1小时；将不同稀释度的血清-病毒混合液加至呈40％-50％融合状态的PK15细胞(中国农业大学惠赠)表面(生长旺盛的PK15细胞于24小时前培养于96孔细胞培养板各孔内)，100μL/孔，每个稀释度重复3孔，同时设立不接种病毒的细胞阴性对照和接种病毒的阳性对照；37℃5％CO₂条件下吸附1小时后，加入含2％犊牛血清的RPMI-1640维持液(购自INVITROGEN公司)，于37℃5％CO₂培养箱中培养24-72小时；取出细胞培养板，用PBS洗涤3次，3分钟/次，用含40％丙酮和0.2％BSA的PBS于室温固定10-15分钟；PBS洗涤3次，3分钟/次；将细胞培养板置37℃或于室温干燥30分钟，加入30％H₂O₂和甲醇的混合液(1∶50)，室温作用30分钟；用含0.05％的Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次；加入用含0.05％Tween-20和1％BSA的PBS作1∶20倍稀释的猪抗PCV2阳性血清，于37℃作用1小时；PBST洗涤3次，3分钟/次，加入用含0.05％Tween-20和1％BSA的PBS作1∶100倍稀释的HRP-SPA，于37℃作用1小时；以PBS洗涤3次，加入适量氨乙基咔唑(AEC)显色试剂盒(购自武汉博士德生物技术有限公司)显色2-15分钟，于显微镜下检查并记录红色阳性信号，然后按Reed-Muench法(动物免疫学[M]，中国农业大学出版社，348-349页)计算血清中和效价。

第3次免疫后4周，应用中和试验测定了血清中和抗体效价，结果如图2所示。B、C、D、E组的血清中和抗体效价分别为10^-0.8(1∶6.7)、10^-1.5(1∶29.3)、10^-1.4(1∶26.7)和10^-1.2(1∶20.2)，而在A组(空白对照)全部猪血清中没有检测到中和抗体，表明合成肽疫苗均能够诱导机体产生中和抗体。

3)外周血淋巴细胞增殖试验

分别于第3次免疫后28天，以及攻毒后7、14、21、28和35天采取前腔静脉血，以四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定外周血淋巴细胞增殖性反应。

具体过程如下：将待测血清样品置于肝素抗凝管中，按1∶2的比例小心叠加于孵育至室温的淋巴细胞分离液(购自迈晨科技有限公司)表面，以1500-1800r/分钟水平离心20-30分钟；收集血浆层与淋巴细胞分离液层之间的淋巴细胞层，置于含2％犊牛血清的PRMI-1640试管中，混匀后，以1000r/分钟离心10分钟；弃去上清液，细胞沉淀以含2％犊牛血清的PRMI-1640离心洗涤2次，弃上清液，收集细胞沉淀，加适量含10％犊牛血清的PRMI-1640完全培养液；以1％的台盼蓝染色检查细胞活性，并计数细胞浓度，调整细胞浓度为2.5×10⁶/ml；取细胞悬液加到96孔平底细胞培养板孔内，100μl/孔，每个样品重复3孔；加入100μg/ml的刀豆素ConA(购自Sigma公司)至终浓度为10μg/ml，同时设立不加ConA刺激的阴性对照，均重复3孔；混匀后，于37℃5％ CO₂培养箱中培养48小时；每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，继续于37℃培养箱中孵育4小时；每孔中加入100μl 10％SDS-0.01mol/l盐酸，混匀后于37℃条件下作用30分钟，使紫黑色结晶完全溶解；消除各孔内气泡，测定OD570nm光密度值，分析各组外周血淋巴细胞的增殖能力，以实验孔OD值减去不加ConA刺激的阴性对照孔OD值的平均值代表淋巴细胞的增殖能力。

应用MTT法分别检测了第3次免疫后4周及攻毒后1、2、3、4、5周各组猪外周血淋巴细胞对ConA的刺激反应能力，结果如图3所示，与A组相比，合成肽疫苗免疫组的淋巴细胞对ConA刺激反应在攻毒后7-14天即达到高峰值，并且反应强度高于A组。

综合上述实验结果可知，合成肽疫苗能激发猪的免疫应答和保护性免疫反应。

实施例4：合成肽疫苗的安全性试验

本实施例对本发明所提供的合成肽疫苗进行了安全性实验，具体详述如下。

1)疫苗与试验动物

四批PCV2合成肽疫苗加上空白对照一共设为五组，试验动物为7日龄哺乳仔猪25头、30日龄哺乳仔猪50头，具体分组情况见表2。

表2 疫苗分组情况

分组	注射疫苗	试验动物数(头)
			A组	空白对照	15
B组	SEQ ID NO.1多肽疫苗	15
			C组	SEQ ID NO.2多肽疫苗	15
D组	SEQ ID NO.3多肽疫苗	15
			E组	(SEQ ID NO.2)2-K-εK-CONH2聚合肽疫苗	15

2)最小免疫日龄仔猪一次单剂量接种

取7日龄哺乳仔猪25头，分为5组，每组5头，B、C、D、E组肌肉注射四个批次疫苗，接种剂量2ml/头；A组为空白对照组，剪耳号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1-7天每天测量直肠温度。

3)仔猪单剂量重复接种

取30日龄哺乳仔猪25头，分为5组，每组5头，B、C、D、E组肌肉注射疫苗，接种剂量2ml/头，接种后2周，再用相同剂量免疫一次；A组为空白对照组。剪耳号并称体重后，隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1-7天每天测量直肠温度。试验结束时称体重。

4)仔猪一次超剂量接种

取30日龄哺乳仔猪25头，分为5组，每组5头，B、C、D、E组肌肉注射疫苗，接种剂量4ml/头；A组为空白对照组，剪耳号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1-7天每天测量直肠温度。试验结束时称体重。

5)试验结果

注射4批疫苗后动物的精神状态及食欲良好，均无临床异常反应，体温正常。试验组仔猪体重与对照组仔猪体重无差异，结果如表3所示。

表3 安全性试验结果

分组	注射疫苗	临床异常反应	试验组与对照组体重差异(P＞0.5)
				A组	空白对照	无	——
B组	SEQ ID NO.1多肽疫苗	无	无差异(P＞0.5)
				C组	SEQ ID NO.2多肽疫苗	无	无差异(P＞0.5)
D组	SEQ ID NO.3多肽疫苗	无	无差异(P＞0.5)
				E组	(SEQ ID NO.2)2-K-εK-CONH2聚合肽疫苗	无	无差异(P＞0.5)

从表3中可以看出，四批合成肽疫苗与空白对照组一样，在单剂量、超剂量、多次接种情况下对猪都是安全的。

序列表

<110>中牧实业股份有限公司

<120>抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其制备方法

<130>DIC09110086

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>59

<212>PRT

<213>PCV抗原

<400>1

Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly

1               5                   10                  15

Ile Leu Phe Lys Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile

            20                  25                  30

Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Lys Val Asp His Val

        35                  40                  45

Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr

    50                  55

<210>2

<211>45

<212>PRT

<213>PCV抗原

<400>2

Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly

1               5                   10                  15

Ile Leu Phe Lys Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile

            20                  25                  30

Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr

        35                  40                  45

<210>3

<211>47

<212>PRT

<213>PCV抗原

<400>3

Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly

1               5                   10                  15

Ile Leu Phe Lys His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp

            20                  25                  30

Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu

        35                  40                  45

Claims (8)

1.一种用于抗猪圆环病毒合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.一种抗猪圆环病毒合成肽疫苗，其中包括一种或多种权利要求1所述的多肽或其多肽聚合物。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。

4.一种权利要求1所述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：

(1)去保护反应：在体积比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；

(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；

(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；

(4)乙酰化反应：使用重量体积比为1.5％-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；

(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；

(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；

(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。

6.一种权利要求2或3所述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：

(1)用注射用水将多肽稀释至200μg/ml制得抗原水相；

(2)在20-28℃条件下，按照抗原水相∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；

(3)缓慢加入抗原水相，搅拌20-30分钟；

(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。

8.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的疫苗在制备治疗和/或预防猪圆环病毒病的药物中的用途。

Images