CN103005157A - 一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊及其制备方法，其组分为：30-40%的益生菌和60-70%的益生元；所述益生菌由40-50%的丁酸梭状芽孢杆菌和50-60%的乳酸芽孢杆菌组成的混合物；所述的益生元由60-70%的啤酒酵母多糖和30-40%的硫酸化啤酒酵母多糖组成的混合物。本发明生产出来的新型微囊合生素饲料用添加剂同时发挥益生菌和益生元的双重作用，具有提高饲料利用率，促进动物生长，增强机体的抵抗力和免疫力的显著作用，产品质量稳定，安全、无毒副作用，无残留，无污染，有利于人身健康和环境保护。
Description
技术领域
本发明涉及一种饲料添加剂，具体涉及一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊及其制备方法。
背景技术
抗生素长期以来一直在动物生产中发挥着巨大作用，它可有效地治疗和预防动物疾病发生，但是抗生素的持续使用会造成细菌耐药性和动物产品药物残留等诸多问题，因此寻求和开发绿色、无污染、无残留的饲料添加剂替代抗生素饲料添加剂，已成为当前饲料行业研究的热点。
合生素（synbiotics）又称合生元，由Gibson（1995）首先提出。它是指益生菌（Probiotics）与益生元（Prebiotics）结合使用的生物制剂，其特点是同时发挥益生菌和益生元的作用。合生素的使用效果相当于或优于抗生素，而其成本低于抗生素等抗菌药物，并且不存在药物残留的问题。合生素(synbiotics)作为微生态调节剂，既可发挥益生菌的生理特性，又可选择性地增加益生菌数量，使益生菌的作用更显著持久。它是微生态调节剂今后发展的主要方向。目前，大多数微生态活菌剂存在以下问题:益生菌制剂中活菌含量低，生产成本高；益生菌是厌氧菌，易受外界环境因素影响，常温下货架寿命短，以及经过胃液能够进人肠道的益生菌存活率低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊及其制备方法，提高益生菌存活率，延长合生素中益生菌的货架寿命，稳定性好，安全、无毒副作用。
本发明采用的技术方案如下：
一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊，其组分为：30-40%的益生菌和60-70%的益生元；所述益生菌由40-50%的丁酸梭状芽孢杆菌和50-60%的乳酸芽孢杆菌组成的混合物；所述的益生元由60-70%的啤酒酵母多糖和30-40%的硫酸化啤酒酵母多糖组成的混合物。
新型高效合生素肠靶向微球胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）益生菌的制备
①乳酸芽孢杆菌的制备
乳酸芽孢杆菌培养基为：酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖 6g、MgSO4·7H2O 1g、MnSO4 0.05g、K2HPO4 2g，蒸馏水1L，PH=7.0-7.2，灭菌条件为120-125℃，20-30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有乳酸芽孢杆菌培养基的试管中，35-38℃恒温静置厌氧培养20-24h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按乳酸芽孢杆菌培养基的3-5%的比例将一级种子菌接种到乳酸芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按乳酸芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至20L，于110-120℃下高温蒸汽灭菌20-30min，待其冷却至35-40℃，按乳酸芽孢杆菌种培养基体积的5-10%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度35-45℃，发酵时间20-30h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在2500-3000r/min转速下离心15-20min，去上清液，每千克湿菌体中加入10-20g海藻糖作为保护剂，再加入200-300g大孔淀粉进行吸附，搅拌均匀，在-35～-40℃下预冻1-2h，然后在真空度10.00-12.00Pa条件下干燥25-30h，粉碎研磨成粉末，备用；
②丁酸梭状芽孢杆菌的制备
丁酸梭状芽孢杆菌培养基为：酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖 10g、牛肉浸膏3g、硫酸铵1g、NaCl2g、磷酸氢二钾4g、碳酸氢钠1g、MnSO4 0.2g%、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO3 1g、蒸馏水1L，PH=6.8-7.0，灭菌条件为120-130℃，20-30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有丁酸梭状芽孢杆菌培养基的试管中，36-38℃恒温静置厌氧培养20-24h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的4-6%的比例将一级种子菌接种到丁酸梭状芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至22L，于110-120℃下高温蒸汽灭菌20-30min，待其冷却至35-40℃，按丁酸梭状芽孢杆菌种培养基体积的8-12%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度35-45℃，发酵时间32-40h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在2500-3000r/min转速下离心15-20min，去上清液，用20-30%的牛乳汁作为保护剂将菌泥洗出，然后将其与含有明胶的包被液混合，均质包被，冷冻干燥，研磨成粉末，备用；
③啤酒酵母多糖的提取
先对啤酒酵母泥进行预处理：用蒸馏水清洗，真空抽滤，再进行第二次水洗，放置0.5-1 h后，倒掉上清液，离心，加入两倍酵母泥体积的0.5%碳酸氢钠洗涤1-2 h，再水洗两次，离心，弃上清液得到干净的酵母。根据其含水量折算成干酵母重量,加入适量的水和食盐使酵母和食盐浓度均为8-10%，将溶液置于高压均质机中,在温度110-120℃、高压60-70MPa的条件下均质2-3次，冷却、高速离心，保留上清液，浓缩至原体积的1/4-1/5，：以95%乙醇作沉淀剂，沉淀10-12h，乙醇与上清液的体积比为2-3:1，沉淀用丙酮洗涤2次，用乙醚洗涤1次，最后将沉淀在30-40℃下干燥12-16h，即得啤酒酵母多糖；
④硫酸化修饰酵母多糖
按质量比2.0-4.0:1称取三氧化硫和啤酒酵母多糖于反应釜中，加入20-30 mL吡啶溶解，开动搅拌机，溶解后，在60-70℃水浴反应2-3h，反应结束后冷却至室温，将反应液侵入蒸馏水中，用2.5 mol/L NaOH调节pH值至7-8，离心弃不溶物，加入4-5倍体积的95%乙醇沉淀多糖析出沉淀，将沉淀溶于水，用蒸馏水透析36-48 h，浓缩，冷冻干燥，得硫酸化酵母多糖；
⑤合生素肠靶向微球胶囊的制备
采用流化床包膜法：将经冷冻干燥后的干菌粉与酵母多糖、硫酸化酵母多糖混合，然后将混合后的干粉加入流化床中，通过向上运动的热空气进行加热，物料保持良好的悬浮状态，选择海藻酸钠作为粘合剂通过喷雾系统喷入进行微囊制粒，密闭包装，避光保存。
本发明的有益效果：
本发明采用高压均质法破酵母细胞壁提取酵母多糖，工艺简便，原料低廉易得，生产成本低，对环境污染较小，适合于工业化生产；采用三氧化硫－吡啶法对酵母多糖进行硫酸化修饰后，增强了原来多糖的生物活性，提高饲料利用率，促进动物生长，提高动物抵抗力，增强机体的抵抗力和免疫力具有显著作用，也有效抑制动物体内病原菌和增强了动物机体抗病毒能力，解决长期困扰畜禽行业病毒疾病的预防问题。本发明生产出来的新型微囊合生素饲料用添加剂同时发挥益生菌和益生元的双重作用，具有提高饲料利用率，促进动物生长，增强机体的抵抗力和免疫力的显著作用，产品质量稳定，安全、无毒副作用，无残留，无污染，有利于人身健康和环境保护。
具体实施方式
实施例1：合生素肠靶向微球胶囊的制备
一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊，其组分为：40%的益生菌和60%的益生元；所述益生菌由50%的丁酸梭状芽孢杆菌和50%的乳酸芽孢杆菌组成的混合物；所述的益生元由70%的啤酒酵母多糖和30%的硫酸化啤酒酵母多糖组成的混合物。
新型高效合生素肠靶向微球胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）益生菌的制备
①乳酸芽孢杆菌的制备
乳酸芽孢杆菌培养基为：酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖 6g、MgSO4·7H2O 1g、MnSO4 0.05g、K2HPO4 2g，蒸馏水1L，PH=7.2，灭菌条件为121℃，30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有乳酸芽孢杆菌培养基的试管中，38℃恒温静置厌氧培养22h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按乳酸芽孢杆菌培养基的4%的比例将一级种子菌接种到乳酸芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按乳酸芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至20L，于115℃下高温蒸汽灭菌30min，待其冷却至35℃，按乳酸芽孢杆菌种培养基体积的8%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度40℃，发酵时间25h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在3000r/min转速下离心15min，去上清液，每千克湿菌体中加入12g海藻糖作为保护剂，再加入240g大孔淀粉进行吸附，搅拌均匀，在-35℃下预冻1.5h，然后在真空度10.26Pa条件下干燥30h，粉碎研磨成粉末，备用；
②丁酸梭状芽孢杆菌的制备
丁酸梭状芽孢杆菌培养基为：酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖 10g、牛肉浸膏3g、硫酸铵1g、NaCl2g、磷酸氢二钾4g、碳酸氢钠1g、MnSO4 0.2g%、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO3 1g、蒸馏水1L，PH=7.0，灭菌条件为124℃，30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有丁酸梭状芽孢杆菌培养基的试管中，36℃恒温静置厌氧培养24h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的5%的比例将一级种子菌接种到丁酸梭状芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至22L，于120℃下高温蒸汽灭菌20min，待其冷却至40℃，按丁酸梭状芽孢杆菌种培养基体积的10%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度42℃，发酵时间38h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在2500r/min转速下离心20min，去上清液，用25%的牛乳汁作为保护剂将菌泥洗出，然后将其与含有明胶的包被液混合，均质包被，冷冻干燥，研磨成粉末，备用；
③啤酒酵母多糖的提取
先对啤酒酵母泥进行预处理：用蒸馏水清洗，真空抽滤，再进行第二次水洗，放置1 h后，倒掉上清液，离心，加入两倍酵母泥体积的0.5%碳酸氢钠洗涤2 h，再水洗两次，离心，弃上清液得到干净的酵母。根据其含水量折算成干酵母重量,加入适量的水和食盐使酵母和食盐浓度均为8%，将溶液置于高压均质机中,在温度120℃、高压65MPa的条件下均质3次，冷却、高速离心，保留上清液，浓缩至原体积的1/5，：以95%乙醇作沉淀剂，沉淀12h，乙醇与上清液的体积比为3:1，沉淀用丙酮洗涤2次，用乙醚洗涤1次，最后将沉淀在35℃下干燥15h，即得啤酒酵母多糖；
④硫酸化修饰酵母多糖
按质量比3.0:1称取三氧化硫和啤酒酵母多糖于反应釜中，加入25 mL吡啶溶解，开动搅拌机，溶解后，在60℃水浴反应3h，反应结束后冷却至室温，将反应液侵入蒸馏水中，用2.5 mol/L NaOH调节pH值至7.5，离心弃不溶物，加入4倍体积的95%乙醇沉淀多糖析出沉淀，将沉淀溶于水，用蒸馏水透析42 h，浓缩，冷冻干燥，得硫酸化酵母多糖；
⑤合生素肠靶向微球胶囊的制备
采用流化床包膜法：将经冷冻干燥后的干菌粉与酵母多糖、硫酸化酵母多糖混合，然后将混合后的干粉加入流化床中，通过向上运动的热空气进行加热，物料保持良好的悬浮状态，选择海藻酸钠作为粘合剂通过喷雾系统喷入进行微囊制粒，密闭包装，避光保存。
实施例2：合生素肠靶向微球胶囊贮存期试验
将实施例1制得的合生素肠靶向微球胶囊装入药瓶中，封口烫蜡，分别在4℃冰箱、25℃室温、加速实验37℃和相对湿度75%(RH75%)下恒温贮存，分别测定不同时间下胶囊中总菌数和贮存一年后胶囊中3种细菌的含量，结果见表1、2。
表1 在不同温度下合生素肠靶向微球胶囊活菌数变化
表2 在不同温度下贮存1年后合生素肠靶向微球胶囊中2种细菌的含量
由表1和表2可知，两种细菌在不同温度下经一年贮存存活率分别为:4℃时为87.8%，25℃时为77.4%，37℃时仅为61.5%；乳酸芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌两种种菌活菌比例4℃时为1.12:1，25℃时为1.11:1，37℃时为1:2.1。
实施例3：模拟人工胃液和肠液实验
取4粒胶囊，各取1粒置盛有100mL模拟人工胃液的250mL锥形瓶中，在温度为37℃的恒温水浴震荡器上的150r/min震荡溶解，在4h内每隔0.5h取样一次，中和酸度，取经快速混匀的人工胃液检测其存活率和活菌数，取均值以分析在人工胃液中溶解情况，结果见表3。
表3 合生素在人工胃液中溶解情况
由表3可知，在人工胃液中，在2h内活菌存活率达到78.2%，总活菌为1.76x1010cfu·g-1。从1.5h起存活率下降缓慢，是因为在37℃下益生元与益生菌联用，产生一定协调作用增强了益生菌竞争优势。
Claims (2)
1.一种新型高效合生素肠靶向微球胶囊，其特征在于，其组分为：30-40%的益生菌和60-70%的益生元；所述益生菌由40-50%的丁酸梭状芽孢杆菌和50-60%的乳酸芽孢杆菌组成的混合物；所述的益生元由60-70%的啤酒酵母多糖和30-40%的硫酸化啤酒酵母多糖组成的混合物。
2.一种如权利要求1所述的新型高效合生素肠靶向微球胶囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）益生菌的制备
①乳酸芽孢杆菌的制备
乳酸芽孢杆菌培养基为：酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖 6g、MgSO4·7H2O 1g、MnSO4 0.05g、K2HPO4 2g，蒸馏水1L，PH=7.0-7.2，灭菌条件为120-125℃，20-30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有乳酸芽孢杆菌培养基的试管中，35-38℃恒温静置厌氧培养20-24h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按乳酸芽孢杆菌培养基的3-5%的比例将一级种子菌接种到乳酸芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按乳酸芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至20L，于110-120℃下高温蒸汽灭菌20-30min，待其冷却至35-40℃，按乳酸芽孢杆菌种培养基体积的5-10%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度35-45℃，发酵时间20-30h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在2500-3000r/min转速下离心15-20min，去上清液，每千克湿菌体中加入10-20g海藻糖作为保护剂，再加入200-300g大孔淀粉进行吸附，搅拌均匀，在-35～-40℃下预冻1-2h，然后在真空度10.00-12.00Pa条件下干燥25-30h，粉碎研磨成粉末，备用；
②丁酸梭状芽孢杆菌的制备
丁酸梭状芽孢杆菌培养基为：酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖 10g、牛肉浸膏3g、硫酸铵1g、NaCl2g、磷酸氢二钾4g、碳酸氢钠1g、MnSO4 0.2g%、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO3 1g、蒸馏水1L，PH=6.8-7.0，灭菌条件为120-130℃，20-30min；
第一步：取斜面上菌种接种入装有丁酸梭状芽孢杆菌培养基的试管中，36-38℃恒温静置厌氧培养20-24h，得到一级种子菌，取出放入冰箱保存；待用；
第二步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的4-6%的比例将一级种子菌接种到丁酸梭状芽孢杆菌培养基内，得到二级种子菌；
第三步：按丁酸梭状芽孢杆菌培养基的成分比例称取各成分，倒入微生物发酵罐内，加水至22L，于110-120℃下高温蒸汽灭菌20-30min，待其冷却至35-40℃，按丁酸梭状芽孢杆菌种培养基体积的8-12%的比例加入二级种子菌，搅拌均匀，进行发酵培养，发酵温度35-45℃，发酵时间32-40h；
第四步：从微生物发酵罐内取出发酵液，待其冷却至常温后，在2500-3000r/min转速下离心15-20min，去上清液，用20-30%的牛乳汁作为保护剂将菌泥洗出，然后将其与含有明胶的包被液混合，均质包被，冷冻干燥，研磨成粉末，备用；
③啤酒酵母多糖的提取
先对啤酒酵母泥进行预处理：用蒸馏水清洗，真空抽滤，再进行第二次水洗，放置0.5-1 h后，倒掉上清液，离心，加入两倍酵母泥体积的0.5%碳酸氢钠洗涤1-2 h，再水洗两次，离心，弃上清液得到干净的酵母；根据其含水量折算成干酵母重量,加入适量的水和食盐使酵母和食盐浓度均为8-10%，将溶液置于高压均质机中,在温度110-120℃、高压60-70MPa的条件下均质2-3次，冷却、高速离心，保留上清液，浓缩至原体积的1/4-1/5，：以95%乙醇作沉淀剂，沉淀10-12h，乙醇与上清液的体积比为2-3:1，沉淀用丙酮洗涤2次，用乙醚洗涤1次，最后将沉淀在30-40℃下干燥12-16h，即得啤酒酵母多糖；
④硫酸化修饰酵母多糖
按质量比2.0-4.0:1称取三氧化硫和啤酒酵母多糖于反应釜中，加入20-30 mL吡啶溶解，开动搅拌机，溶解后，在60-70℃水浴反应2-3h，反应结束后冷却至室温，将反应液侵入蒸馏水中，用2.5 mol/L NaOH调节pH值至7-8，离心弃不溶物，加入4-5倍体积的95%乙醇沉淀多糖析出沉淀，将沉淀溶于水，用蒸馏水透析36-48 h，浓缩，冷冻干燥，得硫酸化酵母多糖；
⑤合生素肠靶向微球胶囊的制备
采用流化床包膜法：将经冷冻干燥后的干菌粉与酵母多糖、硫酸化酵母多糖混合，然后将混合后的干粉加入流化床中，通过向上运动的热空气进行加热，物料保持良好的悬浮状态，选择海藻酸钠作为粘合剂通过喷雾系统喷入进行微囊制粒，密闭包装，避光保存。
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