CN102875679A - 抗血小板膜糖蛋白vi单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本法明提供具有以下性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物：a)与人血小板膜糖蛋白VI(GPVI)特异性结合；b)使血小板活化的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，以及c)通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失。

Description

抗血小板膜糖蛋白VI单克隆抗体
本申请是申请日为2006年4月28日，申请号为200680023088.2的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及血小板膜糖蛋白VI(以下简称为GPVI)的抗体和该抗体的识别区域。
背景技术
血小板在血栓形成、机体防御方面担负着极为重要的作用，已经了解到其生理作用与各种病态相关。特别是血小板在形成止血血栓的功能中受人瞩目，例如，血管内皮细胞受损伤，则血管内皮下的主要基质蛋白-胶原蛋白暴露，血小板与其粘附。接着，来自胶原蛋白的信号激活血小板，最终经由血纤蛋白原使血小板聚集。根据情况，这可能成为血栓栓塞性疾病等病态的原因，因此人们将其作为治疗的目标。
以往，为了治疗或预防由于血小板聚集而导致的血栓形成，使用了阿司匹林、噻氯匹定、GPIIb/IIIa拮抗剂等抗血小板药，其有效性和出血等副作用方面有很多问题，人们希望出现不具有上述问题、具有充分的安全性、以及确实且适当作用的优异的抗血小板药。
存在于血小板膜上的GPVI是血小板的胶原蛋白受体，已经得知其在胶原蛋白的刺激产生的血小板活化中担负中心性作用(参照高山博史，日本血栓止血学会志，2003年，第14卷，第2号，75-81页)。即，Sugiyama等人报道称：自身免疫性血小板减少症患者的血小板中特异性缺失62kDa的膜蛋白，未见胶原蛋白导致的血小板聚集(参照Tateo Sugiyama等5人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页)，并且该患者的血小板中缺失的蛋白质是GPVI，由患者血清纯化的抗体的Fab片段抑制胶原蛋白引发的血小板聚集(参照Tateo Sugiyama等6人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页；以及Masaaki Moroi等4人，Journal of ClinicalInvestigation，美国，1989年，第84卷，第5号，1440-1445页)。
目前，来自自身免疫疾病患者的抗人GPVI自身抗体有Sugiyama等人(参照Tateo Sugiyama等6人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页)或Takahashi等人(参照Hoyu Takahashi等2人，American Journal of Hematology，美国，2001年，第67卷，第4号，262-267页)的报道。但是，在Sugiyama等人的报告中，由患者血浆纯化的抗人GPVI自身抗体具有引发血小板聚集的作用，因此无法直接应用于药物中。Takahashi等人的文献(参照Hoyu Takahashi等2人，American Journal of Hematology，美国，2001年，第67卷，第4号，262-267页)中记载：存在推测为GPVI的约62kDa的蛋白的自身抗体；以及该抗体引发血小板聚集。为了将来自这些患者的抗GPVI抗体作为药物临床应用，必须以稳定的品质大量生产安全性高的抗体，但是工业化生产方法尚未确立。
目前制备的抗GPVI抗体是抗小鼠GPVI单克隆大鼠抗体(参照欧洲专利申请公开公报第1228768号)、以及抗人GPVI单克隆小鼠抗体(参照国际专利申请公开公报第01/00810号和国际专利申请公开公报第02/080968号；Thromb Haemost，2003Jun；89(6)：996-1003)。
识别人GPVI的人单链抗体(scFv：单链Fv)是使用噬菌体展示法等制备的(参照国际专利申请公开公报第01/00810号、国际专利申请公开公报第02/080968号、以及Peter A Smethurst等16人，Blood，美国，2002年，第100卷，第11号，474a页)。这些单链抗体是通过肽接头将人抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结合，是具有来自人的可变区的抗体，但是与细胞所产生的通常的免疫球蛋白相比，通常与抗原的亲和性低，在生物体内的半衰期也短，另外，Smethurst等人的研究中，单链抗体内，关于抑制血小板聚集的克隆(10B12)，对GPVI上的表位进行分析，第59号的赖氨酸(Lys 59)显示具有相关的可能性(参照Hoyu Takahashi等2人，American Journal ofHematology，美国，2001年，第67卷，第4号，262-267页；以及Peter A Smethurst等16人，Blood，美国，2002年，第100卷，第11号，474a页)。
如上所述，目前报道的所有的抗人GPVI抗体都含有上述人自身抗体，具有在体外(in vitro)以单独的抗体活化血小板的作用、和/或引发或促进血小板聚集的作用，因此，给予生物体时可能引起血小板减少。事实上，Nieswandt等人多次报道了在体内(in vivo)使血小板上的GPVI消失的单克隆抗体(JAQ1、JAQ2和JAQ3)，但是各种抗体在给予后都会引发血小板减少。
近年来，有人报道了GPVI的激动剂-胶原蛋白、convulxin和CRP、以及抑制GPVI与胶原蛋白的结合的抗体(9O12.2)可激活血小板，并与其相伴，通过经由金属蛋白酶的切断产生来自血小板的GPVI的释放(Stephens G等5人，Blood.2005Jan 1；105(1)：186-91；GardinerEE等5人，Blood.2004；104：3611-3617；Bergmeier W等7人，ThrombHaemost.2004；91：951-958)。并且还使用9O12.2抗体等推定了GPVI上与胶原蛋白相互作用相关的氨基酸残基(Val34、Leu36)(Lecut C等8人，J Biol Chem.2004；279：52293-52299.)。
高山等人使用自身免疫疾病患者的淋巴细胞克隆抗人GPVI抗体，体外研究了其性质(国际专利申请公开公报第05/007800号)。
但是，目前为止的任何报告中都未公开不激活血小板、和/或不引发生物体内血小板减少、并具有使血小板膜上的GPVI消失的作用的抗体。
发明内容
如上所述，在人们需求安全性高、有效性优异、且容易使用的药物作为抗血小板药的状况下，人们迫切希望能够有可给予生物体的抗GPVI抗体。
本发明的目的在于提供与存在于血小板、例如哺乳类的血小板、具体来说人、猴、大鼠、小鼠血小板，特别是人血小板膜上的糖蛋白GPVI特异性结合的新型抗体，优选单克隆抗体。特别提供可以给予生物体、有效且在血小板减少等副作用方面没有问题的抗GPVI抗体。还提供与GPVI、特别是人GPVI特异性结合、并含有新型的CDR序列的抗体。还进一步提供产生这些抗体的细胞。
本发明人等为解决上述课题，着眼于建立多种产生抗GPVI抗体的小鼠杂交瘤，对它们所产生的抗体的性状进行分析。基于该研究方向进行了深入的研究，结果成功地获得了产生抗体的杂交瘤，该抗体具有与GPVI结合的能力、具有使胶原蛋白导致的血小板聚集的性能降低的活性。又对各抗体的GPVI上的识别区域进行分析，获得了与GPVI的表位有关的有益的信息。还分离该单克隆进行进一步的研究，结果成功地获得了编码该抗体的基因，明确了该抗体的CDR氨基酸的序列为新的序列。又通过基因重组技术制备了重组抗体，完成了本发明。
本说明书中，将杂交瘤(例如克隆F1232-18)所产生的抗体记为F1232-18抗体。
本发明的第一方案是显示特定的功能或特性的、与GPVI例如哺乳类的GPVI、具体来说是人、猴、大鼠或小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合的抗体，优选单克隆抗体(以下分别记为抗人GPVI抗体和抗人GPVI单克隆抗体)或其活性片段或它们的衍生物。具体来说涉及以下：
(1)具有以下性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物：
a)与GPVI、特别是人血小板膜糖蛋白VI(GPVI)特异性结合，
b)使血小板活化的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，以及
c)通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；
(2)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，特别是具有上述(1)的性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们不介导血小板GPVI的释放、特别是伴随血小板活化的经由金属蛋白酶的切断导致的血小板GPVI的释放，通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；
(3)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们介导血小板GPVI的内化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；
(4)(1)-(3)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们介导血小板GPVI的内化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；
(5)(1)-(4)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们通过在生物体内与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；
(6)(1)-(5)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，将它们给予生物体内，通过与血小板接触，使血小板应答胶原蛋白发生聚集的能力降低或缺失；
(7)(1)-(6)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们对于出血时间的延长作用弱；
(8)(1)-(7)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI的解离常数为4×10-8M以下。
上述(1)-(8)的抗体优选为单独不会引发人血小板聚集的抗体。优选的例子有：表6和表11所例举的克隆，优选识别GPVI的环9的抗体或将其与人IgG、更优选人IgG4重组的嵌合抗体或人源化抗体。本发明的抗体还是GPVI、特别是人GPVI与抗体的解离常数(Kd值)优选为10-8M以下，更优选4×10-9M以下的抗体。本发明的抗体或其活性片段或它们的衍生物只要具有与GPVI的结合能力即可，例如也包含嵌合抗体和人源化抗体、Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双链抗体(diabody)、纳米抗体(nanobody)和含有CDR的肽等，以及标记抗体、缀合抗体(conjugated antibody)和抗体融合蛋白等。
本发明的第一方案的抗体等优选与GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合，使胶原蛋白引发的血小板聚集能力特异性降低，但对其它激动剂例如ADP或凝血酶引发的聚集能力没有影响。还优选单独不引发人血小板聚集。该抗体在与抑制胶原蛋白引发的人血小板聚集的浓度或用量同等、优选10倍、更优选100倍、进一步优选1000倍的情况下，单独不会显著引发人血小板聚集。
这里，上述(1)-(8)的抗体只要具有上述特性即可，可以是抑制GPVI特别是人GPVI与胶原蛋白结合的抗体，优选是以10-8M以下、更优选10-9M以下、进一步优选10-10M以下的解离常数(Kd值)抑制GPVI特别是人GPVI与胶原蛋白的结合的抗体。
本发明的抗体未必限定于特定的克隆，具有与本发明的优选例子同样作用的抗体均包含在本发明的范围内。本发明的抗体的作用的有无可通过实施例所示的方法或公知的方法确认。
本发明还包含与优选的抗体在GPVI上的识别区域、结合部位或表位相同或至少部分共通的抗体，例如与GPVI的结合中具有互相竞争关系的抗体均包含在本发明的范围内。与本发明的抗体在识别区域或结合部位上是否有共通性，这可以按照实施例所记载的方法或公知的方法确认。即，本发明可提供在本发明的特定抗体与GPVI结合中参与竞争的抗体。本发明的实施例的竞争试验的分类中，可将表1所例举的被分类为八种类型，优选类型d、e或h，更优选类型d或e的抗体作为本发明的抗体。上述(1)-(8)的抗体的优选例子有：识别GPVI、特别是识别人GPVI的环9的至少一部分的抗体。
本发明的第二实施方案是由新的GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI上的识别区域、结合部位或表位所规定的抗GPVI抗体，优选单克隆抗体。具体来说有以下抗体：
(9)抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们特异性识别含有GPVI、特别是人GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域1的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的结构；
(10)(9)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11的至少一部分为人GPVI的环2的E21、K22和P23，环3的G33及环5的A57、K59和L62，或环4的S43、S44、S45、R46和E48及环5的A57、K59和L62，或者环9的T116、R117、G119和Q122、或环9的T116、R117、G119和Q122及环11的R139；
(11)(9)或(10)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI特别是人GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域1的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9特异性结合；
(12)(1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们识别含有GPVI特别是人GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域1的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的结构；
(13)(1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们特异性识别含有人GPVI结构域1的环2的E21、K22和P23，环3的G33及环5的A57、K59和L62，或环4的S43、S44、S45、R46和E48及环5的A57、K59和L62，或者结构域2的环9的T116、R117、G119和Q122，或环9的T116、R117、G119和Q122及环11的R139的氨基酸序列或GPVI上的结构；
(14)(1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI特别是人GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或结构域1的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9特异性结合。
这里，上述各环的至少一部分例如是在人GPVI中，与不同种GPVI例如猴、小鼠或大鼠GPVI对应的氨基酸残基不同的残基。GPVI、例如人GPVI的模型结构可通过实施例记载的方法推定，各环的结构位置如图1、3和47所示。上述环内，结构域2的环9、环9和环11，以及结构域1的环2，优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9是很重要的本发明的抗体识别区域，优选采用识别它们的抗体。优选的例子有：表6和11所例举的抗体或将它们与人IgG、更优选人IgG4重组所得的嵌合抗体或人源化抗体。
本发明的第二方案的抗体是通过与本发明第八方案的肽和/或第九方案的多肽的结合性来进行分类，或者确认结合区域。即，本发明提供一种抗GPVI抗体，该抗体与本发明第八方案的肽和/或第九方案的多肽内的特定部位的结合性不同，优选降低。具体来说，是与特定的GPVI突变体的结合性、和与人GPVI和/或其它GPVI突变体的结合性显著不同、优选降低的抗GPVI抗体。具体的确认方法、所使用的多肽等、适合的分类和适合的抗体的例子如实施例所示。对本发明的抗体的抗原结合价并没有特别限定，可以是如Fab或scFv等的1价抗体，但从生物体内特别是血液中的稳定性、与GPVI的结合性或作用的强度角度考虑，优选2价以上的多价抗体例如2价、3价、4价或10价的抗体，更优选2价抗体。因此，本发明的第二方案可提供识别GPVI上的特定区域、特别是环9的1价抗体和2价以上的多价抗体例如2价、3价、4价或10价抗体，优选2价抗体。这里，4价抗体的例子有IgA，10价抗体的例子有IgM，但并不限于此。另外，3价抗体生理上并不存在，但是利用具有固有的三聚体化特性的天然或合成肽、例如生腱蛋白(tenascin)分子的结构域(AA 110-139，Swissprot#P10039(鸡)，或Swissprot#P24821(人))，通过化学或基因工程学与1价抗体(scFv或Fab等)结合，可以制备3价抗体(参照日本特表2004-508828号公报)。本发明的第二方案的抗体优选显示第一方案的抗体的特定功能或特性。
本发明的第三方案是含有新的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗GPVI抗体，优选与人IgG、特别是人IgG4重组的嵌合抗体，更优选CDR移植抗体，特别是人源化抗体。具体来说有以下抗体：
(15)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，至少抗体的H链或L链一方的3组CDR、优选抗体H链和L链两者6组CDR含有表8、9、12和13记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体的CDR的氨基酸序列作为分别对应的CDR的氨基酸序列；
(16)抗GPVI抗体的重链或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中分别具有SEQ ID NO.15、16和17的氨基酸序列；SEQ ID NO.18、19和20的氨基酸序列；SEQ IDNO.21、22和23；SEQ ID NO.24、25和26，SEQ ID NO.27、28和29，SEQ ID NO.30、31和32，SEQ ID NO.33、34和35，SEQ ID NO.36、37和38，SEQ ID NO.39、40和41，SEQ ID NO.42、43和44，SEQ IDNO.45、46和47，或SEQ ID NO.48、49和50的氨基酸序列，或者表12记载的任意的克隆的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；
(17)抗GPVI抗体的轻链或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中分别具有SEQ ID NO.51、52和53的氨基酸序列；SEQ ID NO.54、55和56的氨基酸序列；SEQ IDNO.57、58和59，SEQ ID NO.60、61和62，SEQ ID NO.63、64和65，SEQ ID NO.66、67和68，SEQ ID NO.69、70和71，SEQ ID NO.72、73和74，SEQ ID NO.75、76和77，SEQ ID NO.78、79和80，SEQ IDNO.81、82和83，或SEQ ID NO.84、85和86的氨基酸序列，或者表13记载的任意的克隆的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
(18)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中分别具有SEQ ID NO.15、16、17、51、52和53的氨基酸序列，SEQID NO.18、19、20、54、55和56的氨基酸序列，SEQ ID NO.21、22、23、57、58和59的氨基酸序列，SEQ ID NO.24、25、26、60、61和62的氨基酸序列，SEQ ID NO.27、28、29、63、64和65的氨基酸序列，SEQ ID NO.30、31、32、66、67和68的氨基酸序列，SEQ IDNO.33、34、35、69、70和71的氨基酸序列，SEQ ID NO.36、37、38、72、73和74的氨基酸序列，SEQ ID NO.39、40、41、75、76和77的氨基酸序列，SEQ ID NO.42、43、44、78、79和80的氨基酸序列，SEQ ID NO.45、46、47、81、82和83的氨基酸序列，或SEQID NO.48、49、50、84、85和86的氨基酸序列，或者表12和表13记载的任意的克隆的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
(19)嵌合抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链两者的可变区与含有表7或表14记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体所具有的可变区的氨基酸序列作为分别对应的可变区的氨基酸序列的抗人GPVI抗体、特别是人IgG、优选人IgG4重组。第三方案的抗体优选具有第一方案和/或第二方案的抗体等的特性和/或识别区域特异性。
本发明的第四方案是多核苷酸或核酸，该多核苷酸或核酸含有编码第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的至少H链或L链一方的3组CDR、优选H链和L链的6组CDR、或可变区的碱基序列。具体来说有以下多核苷酸或核酸：
(20)多核苷酸，该多核苷酸含有编码第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的H链和/或L链的碱基序列；
(21)(20)的多核苷酸，其中，该多核苷酸含有在表8和9或者表12和13记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体基因中，编码分别对应至少抗体的H链或L链一方的3组CDR、优选抗体H链或L链两者6组CDR的碱基序列；
(22)多核苷酸，该多核苷酸含有在识别表7或表14记载的克隆GPVI环9的抗体的基因中，编码分别对应的至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链两者的可变区的碱基序列；
(23)多核苷酸，该多核苷酸含有编码H链的可变区的SEQ IDNO.280的碱基序列、和编码L链的可变区的SEQ ID NO.284的碱基序列，或者含有编码H链的可变区的SEQ ID NO.282的碱基序列、和编码L链的可变区的SEQ ID NO.284的碱基序列。本发明还提供来自含有特定的小鼠种系抗体基因片段组合的抗体基因的抗人GPVI抗体基因或其重链或轻链可变区基因。即，
(24)抗人GPVI抗体基因或其重链可变区基因，该基因来自抗体重链基因，该抗体重链基因含有表16记载的小鼠种系抗体基因片段VH、DH和JH的任意组合；
(25)抗人GPVI抗体基因或其重链可变区基因，该基因含有上述重链可变区基因中编码CDR氨基酸序列的核苷酸序列；
(26)抗人GPVI抗体基因或其轻链可变区基因，该基因来自抗体轻链基因，该抗体轻链基因含有表16记载的小鼠种系抗体基因片段VL和JL的任意组合；
(27)抗人GPVI抗体基因或其轻链可变区基因，该基因含有上述轻链可变区基因中编码CDR氨基酸序列的核苷酸序列；这里，优选表16记载的小鼠种系抗体基因片段内，各抗体克隆的第一行表示的得分高的片段的组合，例如克隆F1246-1-1的重链基因中，优选VH(3∶3.9)、DH(DSP2.7或DSP2.5)和JH(JH4)的组合。来自上述抗体基因的基因只要其编码的抗体显示同样的抗原特异性，包含该抗体基因本身或伴随有1个碱基以上的突变的基因，该突变可以是天然产生的以及人为导入的任意形式。同时，本发明还提供由抗人GPVI抗体基因或其重链或轻链可变区基因编码的抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，所述基因来自含有特定的小鼠种系抗体基因片段的组合的抗体基因。即，
(28)抗人GPVI抗体或其重链可变区多肽，它们由上述(24)-(25)的抗体基因或其重链可变区基因编码；
(29)抗人GPVI抗体或其轻链可变区多肽，它们由上述(26)-(27)的抗体基因或其轻链可变区基因编码。
本发明进一步提供聚乙二醇(PEG)化的抗GPVI抗体，特别是抗人GPVI抗体，具体来说，提供上述本发明的抗体，优选识别GPVI环9的抗体或其活性片段或它们的衍生物。使PEG与抗体等结合的方法可按照公知的方法(例如参照Roberts M.J等人.Advanced Drugdelivery Reviews 54(2002)459-476)进行，具体如实施例31所述。
本发明的第五方案是产生第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的细胞，或者含有第四方案的多核苷酸的细胞。具体有以下细胞：
(30)产生上述(1)-(19)中任一项的抗体或其活性片段或它们的衍生物的细胞，特别是转化细胞或杂交瘤；
(31)含有上述(20)-(23)中任一项的多核苷酸的细胞，特别是转化细胞或杂交瘤。
本发明的第六方案是制备第一至第三方案的抗体的方法，其特征在于：使用第四方案的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体、或第五方案的细胞。具体来说如下：
(32)第一至第三方案的抗体的制备方法，该方法包括培养上述(30)或(31)的细胞的步骤；以及收集由该细胞产生的单克隆抗体的步骤；
(33)第一至第三方案的抗体的制备方法，该方法包括使用上述(19)-(23)的多核苷酸、含有这些多核苷酸的表达载体、(30)或(31)的任意的细胞的步骤。
本发明的第七方案涉及含有本发明第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物作为有效成分的药物组合物，因此，优选为预防和/或治疗血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的药物组合物。本发明的抗体几乎没有血小板活化作用、血小板聚集作用、血小板减少作用和出血时间延长作用等的副作用，对上述疾病等的预防和/或治疗有效。
本发明的第八方案涉及构成GPVI上的特定结构、特别是环结构的肽，具体来说有：
(34)肽，该肽含有GPVI、特别是人GPVI结构域1的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9，或环9和环11，特别是由上述的任意的氨基酸序列构成的肽。这里，该肽可以含有来自不同种GPVI的氨基酸序列或GPVI以外的多肽、例如Fc的氨基酸序列。
本发明的第九方案是特定的GPVI突变体，例如在氨基酸置换体、种间的结构域置换体、或种间的部分序列置换体，例如环置换体等。优选为将构成图1和图3所示的GPVI的1或2个以上环结构的氨基酸用其它氨基酸或多种类(例如人、猴、小鼠和大鼠)所对应的环的氨基酸置换得到的突变体，具体例子如表4或实施例所述。具体有：
(35)含有SEQ ID NO.137-151的氨基酸序列的多肽。
本发明的第十方案是抗体或其活性片段或它们的衍生物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
a)测定与血小板膜糖蛋白VI(GPVI)、特别是人GPVI的结合性的步骤，
b)测定使血小板活化的作用和/或引发生物体内血小板减少的作用的步骤，以及
c)测定通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步骤。
本发明的第十一方案是抗体表位的推定方法或抗体识别区域的鉴定方法，该方法包括测定第八方案的肽或第九方案的多肽与抗体的反应性、例如结合性的步骤。
本发明的第十二方案是GPVI特异性抗体的制备方法，其特征在于：使用本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等，具体如下：
(36)GPVI特异性抗体、优选本发明的第一至第三方案的抗体的制备方法，其特征在于：将本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等作为免疫用的给予抗原，或者作为体外免疫用抗原使用；
(37)GPVI特异性抗体、优选本发明第一至第三方案的抗体的制备方法，其特征在于：使用本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等作为用于检测或鉴定抗体的抗原。即，将本发明的抗体可识别的GPVI、特别是人GPVI上的氨基酸序列、例如与环结构相对应的氨基酸序列在小鼠GPVI上重组的GPVI重组体本身作为免疫原和/或检测用抗原，可得到可识别相同识别领域的新型抗体。作为人治疗用抗体的更优选的制备方法，有人公开了使用人抗体基因转基因非人动物的方法(WO2002/070648(日本特表2005-504507)、WO2002/043478(日本特表2004-515230))。不同种的GPVI、例如在小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列得到的蛋白质免疫上述转基因动物例如免疫小鼠时，可有效地获得不与GPVI的小鼠氨基酸序列反应，而与插入的人氨基酸序列、优选通过表位进行反应的人抗体。因此，该方法得到的人抗体可用作具有本发明第一或第二方案抗体特征的人抗体，该方法特别有用。
本发明的第十三方案是使用第一至第三方案的抗体，对试样中GPVI进行检测或定量的方法。该方法可以测定血小板上GPVI或体液、特别是血液中GPVI，可应用于疾病的诊断方法，优选伴随有血栓形成的疾病的诊断方法。该方法还可应用于与GPVI相关的治疗的监控，特别是以血小板上的GPVI为指标，对抗GPVI抗体的效果进行预测或判定，或者进行预后的判定等。
附图简述
图1是人可溶解型GPVI和小鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示GPVI的各结构域以及通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。
图2表示GPVI缺失患者的抗体与小鼠抗人GPVI单克隆抗体的竞争试验的结果。YA-Abs-88和YA-Abs-03表示GPVI缺失患者的抗GPVI抗体。
图3是人可溶解型GPVI和大鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示各结构域和通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。
图4表示研究小鼠杂交瘤抗体和嵌合抗体的反应性的结果。
图5表示嵌合抗体和杂交瘤抗体抑制GPVI与胶原蛋白的结合。
图6表示研究抗人GPVI抗体与GPVI突变体的结合特性的结果。
图7表示研究cF1232-37-2与各种hGPVI小鼠环置换体的反应性的结果。
图8表示人血小板和食蟹猴血小板活化作用。通过FACS测定人血小板(A)和食蟹猴血小板(B)的CD62P(P表示选择蛋白表达量)，以平均荧光强度(MFI)表示。
图9表示引发人血小板聚集的作用。
图10表示F1232-37-2对胶原蛋白引发的人血小板聚集的作用。
图11表示F1232-37-2对ADP引发的人血小板聚集的作用。
图12表示对食蟹猴静脉内给予小鼠抗人GPVI单克隆抗体F1232-37-2和F1199-6的试验结果。
图13表示小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo(先体外后体内)试验(单次静脉内试验cF1232-37-2单次静脉内给予试验)的结果。
图14表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验(反复静脉内给予试验)的结果。将0.3mg/kg cF1232-37-2每隔1天给予食蟹猴，测定给予4次时胶原蛋白引发的血小板聚集能力(A)和血小板GPVI量(B)。
图15表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴试验(皮下给予试验)的结果。在对食蟹猴皮下给予cF1232-37-2后，在不同时间采血，测定2μg/mL胶原蛋白引发的血小板聚集能力(A)和血小板GPVI量(B)。
图16表示F1232-37-2Fab抑制胶原蛋白引发的血小板聚集的作用。
图17表示F1232-37-2F(ab’)2的食蟹猴ex vivo试验结果。
图18表示cF1232-37-2双链稳定共表达质粒的构建。
图19表示在COS细胞中表达的cF1232-37-2和在CHO细胞中表达的cF1232-37-2的抗原结合反应性。
图20表示重链可变区的氨基酸序列及其人源化情况。
图21表示轻链可变区的氨基酸序列及其人源化情况。
图22表示人源化抗体与GPVI的结合特异性。
图23表示给予了嵌合抗GPVI抗体的食蟹猴血小板的胶原蛋白引发的聚集能力试验的结果。
图24表示食蟹猴出血时间试验的结果。A：表示静脉内给予依替巴肽5分钟后和给予抗GPVI抗体cF1232-37-2的48小时后血小板的胶原蛋白引发的聚集能力。B：表示将静脉内给予依替巴肽5分钟后和给予抗GPVI抗体cF1232-37-2的48小时后的出血时间与给予各组药物之前的值进行比较的结果。
图25表示抗GPVI抗体导致的血小板GPVI抗原释放的确认试验结果。
图26表示抗GPVI抗体的全抗体以及Fab抗体的PEG化的结果。各泳道表示如下：1：F1232-37-2全抗体；2：F1232-37-2的PEG化反应物；3：PEG化F1232-37-2纯化物；4：F1232-37-2Fab抗体；5：F1232-37-2Fab的PEG化反应物；6：PEG化F1232-37-2Fab纯化物。
图27表示PEG化抗GPVI抗体的GPVI抗原结合活性试验的结果。
图28表示大鼠GPVI基因的核苷酸序列以及由其编码的氨基酸序列。
图29是表示由实施例35得到的rGPVI-Fc融合蛋白的SDS-PAGE结果的图。泳道1表示分子量标记，泳道2表示rGPVI-hFc融合蛋白，泳道3表示rGPVI-mFc融合蛋白。
图30表示研究与GPVI环置换体的结合能力的结果。
图31表示研究抗大鼠GPVI抗体与大鼠血小板的结合能力的结果。
图32表示研究给予了抗大鼠GPVI抗体的大鼠血小板聚集能力的结果。
图33表示实施例40中的GPVI消失的结果。
图34表示研究抗GPVI抗体对胶原蛋白致死模型的效果的结果。
图35表示研究抗GPVI抗体对电刺激引发的动脉血栓模型的效果的结果。
图36是表示CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO的抗原结合评价的图。
图37表示CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO的体外内化的结果。
图38表示CypHer5E标记F1239-6-1的抗原结合评价。
图39表示CypHer5E标记F1239-6-1的体外内化的结果。
图40表示CypHer5E标记F1239-6-1的体内内化的结果。
图41表示cF1232-37-2S/COS的血小板活化评价(CD62P)的结果。
图42表示cF1232-37-2S/COS对于胶原蛋白引发的血小板聚集的抑制作用。
图43是表示cF1232-37-2S/COS的食蟹猴ex vivo试验结果的图。表示通过胶原蛋白引发的血小板聚集能力的结果。
图44是表示研究PEG化F1239-6-1Fab的抗原结合活性的结果图。
图45表示给予高剂量cF1232-37-2下食蟹猴的出血时间。
图46表示实施例50中大鼠出血时间的测定结果。
图47表示人可溶解型GPVI和食蟹猴可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示GPVI的各结构域以及通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。
实施发明的最佳方式
(构成)
本发明的抗体是特异性识别存在于血小板例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠血小板，特别是人血小板上的膜糖蛋白GPVI的抗体。本发明的抗体所识别的GPVI不一定限于血小板上，例如也可以识别巨核细胞的GPVI。这里，本发明中作为对象的GPVI是哺乳类的GPVI，例如有人、猴、大鼠、小鼠GPVI，特别是人GPVI。以下进一步详细说明本发明。本说明书中，氨基酸序列以一个字母标记或以三个字母标记记载。
本发明的抗体可以是多克隆抗体，优选为单克隆抗体。对该单克隆抗体的制备方法没有特别限定，例如可以是杂交瘤产生的单克隆抗体、插入了抗体基因的重组细胞所产生的单克隆抗体、或者通过EBV(埃巴病毒)转化的细胞所产生的单克隆抗体的任意抗体。还可以是含有至少一个本发明的单克隆抗体的抗体的混合物或多克隆抗体、或者多个本发明的单克隆抗体的混合物。本发明的抗体也包含双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明的抗体是与GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合的抗体。本发明的抗体与GPVI、特别是人GPVI的结合可通过公知的方法测定，具体来说有实施例所例举的方法。本发明的抗体中，GPVI、特别是人GPVI与抗体的解离常数(Kb值)为4×10-8M，优选10-8M以下，更优选4×10-9M以下，进一步优选10-9M以下。对测定人GPVI与抗体的解离常数的方法没有特别限定，可按照常规方法进行。例如可使用固定在芯片上的GPVI-Fc，通过BIACORE3000等蛋白质相互作用分析装置测定。还可以使用血小板特别是人或猴血小板，通过公知的方法例如使用RI标记抗体的方法进行测定。具体来说如实施例5和52所示。
本发明的第一方案的抗体通过与血小板接触、特别是在生物体内接触，具有使血小板膜上的GPVI至少部分消失的作用。该作用可在将本发明的抗体与血小板接触一定时间后分离血小板，通过测定其表面上的GPVI表达量来确认。GPVI表达量可通过使用FACS等的常规方法测定，具体方法如实施例所示。本发明的抗体例如以3mg/kg、优选1mg/kg、更优选0.3mg/kg、进一步优选0.1mg/kg的给予量给予，与给予前的值或者对照组的值进行比较，具有使血小板上的GPVI消失20％以上、优选40％以上、更优选60％以上、进一步优选80％以上的作用。
本发明的抗体具有GPVI消失作用，该作用并不介导血小板GPVI的释放、特别是伴随着血小板活化的经由金属蛋白酶切断而导致的血小板释放GPVI，或者，引发该释放作用弱、优选没有显著的引发作用、更优选实质上没有引发作用，是通过与血小板接触使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗体。这里，是否有释放可通过公知的方法(Stephens G等5人，Blood.2005Jan 1；105(1)：186-91；GardinerEE等人.，Blood.2004；104：3611-3617；Bergmeier W等人.，ThrombHaemost.2004；91：951-958.)检测，具体可采用实施例30所述的方法。
本发明的抗体是介导血小板GPVI的内化，通过与血小板接触使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗体或其活性片段或它们的衍生物。这些抗体与引发伴随着血小板活化的经由金属蛋白酶切断而导致的血小板释放GPVI的抗体不同，如下所述，其本身活化血小板的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，优选几乎没有作用是有用的。上述抗体的优选例子是识别GPVI环9的抗体。
根据本发明的抗体，血小板GPVI的内化可通过公知方法确认，优选使用如实施例所示的标记物例如荧光物、优选pH敏感性荧光物的方法，具体来说，用这些标记物直接或间接标记本发明的抗体，由此可以检测抗体所结合的GPVI是否被摄取到血小板内，或者可以测定其摄取量。优选的方法如实施例所示。
本发明的抗体本身活化血小板的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱、优选几乎没有作用。血小板的活化可通过公知的方法测定，可以以血小板表面抗原、优选CD62P的表达量作为指标。例如有以下方法：经过一定时间后，从给予了本发明抗体的生物体中分离血小板，按照常规方法测定其CD62P的表达量的方法；以及将本发明的抗体与从生物体中分离的血小板接触，经过一定时间后通过常规方法测定该CD62P的表达量的方法等。其具体方法如实施例所示。在以CD62P的表达量为指标时，使血小板上的GPVI至少部分消失的给予量或浓度下，本发明的抗体导致的血小板活化的程度是对照血小板的5倍以下、优选2倍以下、更优选1.5倍以下、进一步优选几乎相同程度。
生物体内血小板是否有减少，这可以在将本发明的抗体给予生物体后的不同时间进行采血，按照常规方法测定血小板数，通过与给予前的值或对照个体血小板数进行比较来确认。具体方法如实施例所示。在使血小板上的GPVI至少部分消失的给予量或浓度下，以给予前的值或者对照组的值为100％，本发明的抗体导致的血小板数的变化为50％以上、优选70％以上、更优选90％以上，进一步优选大致相同程度。
本发明的抗体具有使胶原蛋白导致的人血小板聚集能力降低的作用，即，通过给予生物体内并与血小板接触，使血小板应答胶原蛋白并聚集的能力降低或缺失。该作用可如下确认：将本发明的抗体给予生物体内，与血小板接触，然后在不同的时间分离血小板，测定胶原蛋白引发的血小板聚集。这里，血小板聚集可通过公知的方法测定，例如用血小板聚集能力测定装置等，以光透射率为指标，通过计算聚集率来测定，通常以光透射率最大的点的聚集率(以下称为最大聚集率)表示。后述的实施例8等记载的方法中，本发明的抗体在3mg/kg、优选1mg/kg、更优选0.3mg/kg、进一步优选0.1mg/kg的给予量下，与给予前的值或者对照组的值进行比较，具有降低20％、优选40％以上、更优选60％以上、进一步优选80％以上的使血小板的胶原蛋白聚集能力降低的作用。
本发明的抗体优选对于胶原蛋白以外的引发血小板聚集的物质、例如ADP或凝血酶导致的聚集几乎没有影响，在对胶原蛋白聚集能力有影响的给予量或浓度下，最大聚集率优选为对照的80％以上、更优选为对照的90％以上、进一步优选为对照的95％以上。测定抑制胶原蛋白以外的引发血小板聚集的物质导致的人血小板聚集的方法可按照常规方法进行。
本发明的抗体是出血时间延长作用弱、优选没有显著延长作用、更优选实质没有延长作用的抗体。出血时间可通过公知的方法测定，具体可采用实施例28或50所述的方法。本发明的抗体即使给予治疗用量或更多的量、例如0.3mg/kg、优选1mg/kg、更优选3mg/kg、进一步优选10mg/kg的给予量，也实质上不延长出血时间，具体来说，出血时间是给予前的值、正常值或对照组的5倍以下，优选3倍以下，进一步优选2倍以下，特别优选1.5倍以下。上述优选例子可例举识别GPVI、特别是人GPVI环9的抗体。
目前报道的抗人GPVI抗体、包括上述人自身抗体，体外以单独的抗体几乎都具有活化血小板的作用、和/或引发或促进血小板聚集的作用，因此给予生物体时可能引起血小板减少。有报道称：Fab片段等形态不引发血小板聚集，但是也不能完全否定生物体内由于一些原因导致Fab发生交联或聚集，显示出与IgG等同样的动态的可能性。因此，优选的抗GPVI抗体不是抗体的活性片段，而是在完全的抗体分子例如IgG的形态下也不显示上述作用，或者上述作用低。
从生物体内的动态和稳定性来看，自然形态的抗体分子例如IgG等优异。通常，与Fab等片段相比，IgG在血液中半衰期长很多，在血栓形成、特别是伴随有心房纤颤的血栓形成等慢性疾病或需要长时间给予抗体的病态中，优选血液中半衰期长的分子形态、特别是IgG。
本发明的抗体还可以特异性抑制血小板上的GPVI与胶原蛋白的结合。例如，在后述实施例所记载的方法中，本发明的抗体是优选以100μg/mL以下、更优选10μg/mL以下、进一步优选1μg/mL以下、特别优选0.1μg/mL的浓度50％抑制GPVI与胶原蛋白结合的抗体。对测定胶原蛋白与GPVI结合的方法没有特别限定，可按照常规方法进行。
本发明的第二方案是由新的GPVI上的识别区域、结合部位或表位所规定的抗GPVI抗体，优选单克隆抗体。本发明的抗体GPVI上的识别区域等通过公知的方法确认或推定。例如，应用本发明的第十一方案的方法，通过测定与第八方案的肽或第九方案的多肽的反应性来实施。具体方法如实施例所示。例如，在实施例7或实施例18所记载的方法中，可以以反应性或抑制率与对照(例如hGPVI-Fc)比较显著变化、例如为50％、优选30％、更优选10％以下的情况，或者IC50等值显著变化、例如为3倍、10倍、更优选30倍、进一步优选100倍的情况为基准进行确认或推定。确认了GPVI上的识别区域、结合部位或表位的抗体可单独或者通过与其它抗体的组合，用于检测特定的GPVI分子种类，或者用于分析GPVI的结构与功能的关系。
本发明的第三方案涉及含有新的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗人GPVI抗体。
抗体的重链和轻链的N末端一侧存在可变区，分别称为重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。可变区内存在互补性决定区域(CDR)，该部分负责抗原识别的特异性。可变区的CDR以外的部分具有保持CDR结构的作用，被称为构架区(FR)。在重链和轻链的C末端一侧存在恒定区，分别称为重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)。
重链可变区中存在第一互补性决定区域(CDR1)、第二互补性决定区域(CDR2)和第三互补性决定区域(CDR3)三个互补性决定区域。重链可变区中的三个互补性决定区域总称为重链互补性决定区域。轻链可变区中同样存在第一互补性决定区域(CDR1)、第二互补性决定区域(CDR2)和第三互补性决定区域(CDR3)三个互补性决定区域。轻链可变区中的三个互补性决定区域总称为轻链互补性决定区域。
对本发明抗体的CDR序列并没有限定，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的优选组合，VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列的优选组合，以及VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的优选组合如表8和表9以及表12和表13所示。优选含有识别GPVI环9的抗体的CDR氨基酸序列中的任意一个以上、优选H链的三个、更优选全部氨基酸序列的抗体。对CDR以外的氨基酸序列没有特别限定，来自其它抗体、特别是其它种抗体的所谓的CDR移植抗体也包含在本发明的抗体中。其中，优选CDR以外的氨基酸序列是来自人的人源化抗体，根据需要，构架区(FR)可以伴随有1至数个氨基酸残基的附加、缺失、置换和/或插入。人源化抗体的制备方法可采用公知的方法，具体方法如实施例所示。
本发明的抗体VH和VL的氨基酸序列并不受限定，优选的抗体是含有SEQ ID NO.281的氨基酸序列作为VH或SEQ ID NO.285的氨基酸序列作为VL的任意一个以上的抗体，或者是含有SEQ IDNO.283的氨基酸序列作为VH或SEQ ID NO.285的氨基酸序列作为VL的任意一个以上的抗体。
本发明的抗体并不限定为特定的氨基酸序列，在对其活性和/或抗原性没有实质影响的范围内，在本发明的抗体氨基酸序列中，例如允许在可变区、特别是FR部分有1至数个氨基酸残基的附加、缺失、置换和/或插入。
本发明的抗体优选抗体的恒定区含有来自人抗体、更优选人IgG、进一步优选人IgG4的氨基酸序列。
本发明的抗体并不限于特定的分子种类。抗体、即免疫球蛋白的结构含有重链(H链)和轻链(L链)，根据重链的类型(γ、α、μ、δ、ε)分为五个同种型(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)。其中，IgG和IgA重链不同(例如人有γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2)，因此分为亚类(例如人有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。轻链被分为κ或λ的任意型。本发明的抗体的类型、亚型或同种型并不受限定，可以是被分类的即可。优选同种型为IgG的抗体，从没有补体结合性的角度考虑，进一步优选亚类为IgG4的抗体。
本发明的抗体只要具有活性、例如与GPVI的结合能力即可，可以是抗体的片段、特别是活性片段或一部分。这里，抗体的活性片段是具有抗体的至少一种活性、特别是抗原结合活性的片段。例如有：Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双链抗体、sc(Fv)2(例如参照Orita T，Blood.2005；105：562-566)、纳米抗体(例如参照Cortez-Retamozo V.，CancerResearch 64，2853-2857，2004)和含有CDR的肽等。抗体的衍生物是具有抗体的至少一种活性、特别是抗原结合活性的来自抗体的物质，有结合了其它物质的抗体或抗体的活性片段、用其它物质修饰的修饰抗体或其活性片段、或者向抗体的结构特别是氨基酸序列中导入突变的分子。本发明的抗体对其抗原结合价并没有特别限定，可以是Fab或scFv的一价抗体，从在生物体内、特别是血液中的稳定性、与GPVI的结合性或作用强度的角度考虑，优选二价以上的多价抗体，例如二价、三价、四价或十价抗体，更优选二价抗体。
本发明的第四方案提供编码本发明的第一至第三方案的抗体的多核苷酸或核酸。该多核苷酸只要是编码本发明抗体的氨基酸序列即可，没有限定，多核苷酸包含DNA和RNA。
编码本发明抗体的CDR序列的多核苷酸并不受特别限定，编码VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列的碱基序列的优选组合、编码VL CDR1、VL CDR1和VLCDR3氨基酸序列的碱基序列的适当组合、以及编码VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3、VLCDR1、VL CDR1和VL CDR3氨基酸序列的碱基序列的优选组合如表8和表9以及表12和表13所示。
对编码本发明抗体的VH和VL的氨基酸序列的多核苷酸并没有特别限定，优选含有编码VH氨基酸序列的SEQ ID NO.87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109的碱基序列，或者编码VL氨基酸序列的SEQ ID NO.88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110的碱基序列的其中之一，更优选含有两者的碱基序列的多核苷酸，还优选编码VH氨基酸序列的序列号的碱基序列、或编码VL氨基酸序列的序列号的碱基序列的其中之一，更优选含有两者碱基序列的多核苷酸。
编码本发明的抗体恒定区的多核苷酸优选含有来自人抗体、更优选人IgG、进一步优选人IgG4的碱基序列。
通过将含有本发明抗体的核苷酸序列的载体或基因通过转移到细胞中，可以制备产生本发明的抗体的细胞。转移方法可按照公知方法进行，具体方法如实施例所示。
本发明的第五方案提供产生本发明的抗体的细胞。上述细胞的例子有杂交瘤、转化体、或者导入了本发明的抗体基因的基因重组细胞等。产生抗体的杂交瘤具体可例举表6和11所示的克隆。本发明可以提供上述发明的细胞所产生的抗体。
本发明的第八方案和第九方案可提供与GPVI相关的新型肽或多肽。这些肽等可通过公知的方法制备，具体方法如实施例所示。第八方案的肽或第九方案的多肽可作为制备抗GPVI抗体的免疫用的给予抗原、或者检测GPVI抗体的抗原使用。
(制备方法)
本发明的第六方案提供抗体的生产方法。对制备本发明的抗体的方法并没有特别限定，可按照以下的方法制备。即，以人GPVI或其片段或它们的衍生物、例如人GPVI-Fc作为抗原，给予动物例如小鼠，从其末梢血采集淋巴细胞，制备与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤。得到上述制备的杂交瘤所产生的抗体，选择与GPVI具有结合能力、具有第一至第三抗体特性的抗体，得到产生该抗体的细胞。通过培养该细胞可得到本发明的抗体。
本发明的抗体可以制备成使用公知的方法(分别为Nature，312：643，1984；Nature，321：522，1986，之后开发了很多方法)得到的重组人抗体的形式。首先，从产生本发明的抗体的细胞例如淋巴细胞、优选生产抗GPVI单克隆抗体的杂交瘤中获得编码VH或VL的核酸、例如cDNA，确定碱基序列和氨基酸序列。接着，将获得的编码VH和VL的cDNA分别插入到动物细胞用表达载体中，构建人抗体表达载体，导入动物细胞，使其表达，由此制备抗体。其中，所述动物细胞用表达载体含有由同一细胞或另外的人细胞制备的、编码人抗体CH和/或人抗体CL的基因。对导入到动物细胞中的基因的制备方法没有特别限定，可以从来自杂交瘤的基因组DNA或cDNA中获得，也可以通过PCR从杂交瘤的mRNA中获得，还可以通过化学合成获得。
对插入了编码本发明抗体的VH或VL的核酸的载体并没有特别限定，优选使用蛋白质基因等的表达中常用的、特别适合抗体基因表达的载体或高表达用载体。优选的例子有：含有EF启动子和/或CMV增强子的载体，例如有pEF-BOS或者在实施例中使用的载体。通常是分别制备插入了编码VH或VL的核酸的表达载体，对宿主细胞进行共转染，也可以插入到单一的表达载体中。
对导入了表达载体的宿主细胞并没有特别限定，优选蛋白质基因等的表达中常用的、特别适合抗体基因表达的细胞。例如有细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(COS-1、CHO、骨髓瘤细胞等)。
为了工业化生产重组抗体，通常利用可使该抗体稳定高效率生产的重组动物细胞株，例如CHO细胞株。上述重组细胞株的制备、克隆、为了高表达而进行的基因扩增以及筛选可采用公知的方法(例如参照Omasa T.：J.Biosci.Bioeng.，94，600-605，2002等)。在建立稳定高产率动物细胞株的过程中使用了两种启动子，通过利用启动子活性不同的组合、例如活性高的和活性低的，优选通过利用活性相对弱的启动子作为选择标记的表达启动子，可以有效地(选择性地)取得表达性能高的克隆。优选的启动子的组合的例子和具体方法如实施例所示。
重组人抗体的制备中使用的人抗体的恒定区例如可以使用Cγ1或Cγ4作为人抗体重链恒定区，使用Cκ等任意的人抗体的恒定区作为人抗体轻链恒定区。
本发明的抗体内，含有人的氨基酸序列的抗体除了人体内天然存在的抗体之外，也包含含可变重链和可变轻链的组合文库，例如人抗体噬菌体文库和由产生人抗体的转基因动物得到的抗体等。人抗体噬菌体文库是将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中，使Fab、单链抗体等抗体活性片段在噬菌体表面表达的文库。通过对这些文库进行筛选，也可以获得本发明的抗体。这些方法以及其它方法是本领域技术人员所周知的(Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；Winter和Harris，immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward等人，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，同前，(1988)；Hilyard等，Protein Engineering：A practical approach (IRL Press1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，第2版(Oxford University Press1995))。以与固定抗原的基质的结合活性为指标，可以由该文库回收表达具有所需抗原结合活性的抗体活性片段的噬菌体。进一步通过基因工程的方法，可将该抗体的活性片段变换成含有两条完全的H链或两条完全L链的人抗体分子。
本发明除含有两条重链和两条轻链的抗体之外，也包含本发明的抗体的活性片段等。抗体活性片段例如有Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)2，通过接头将抗体的活性片段结合的形式的有：单链抗体(scFv)或二硫键稳定性抗体(dsFv)，含有抗体活性片段的肽例如有：含有CDR的肽。它们可以通过用适当的蛋白分解酶对本发明的抗体进行处理的方法，或者基因重组技术等公知的方法制备。
本发明的抗体为IgM时，本发明的Fab可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白分解酶-胃蛋白酶处理得到；抗体为IgG时，本发明的Fab可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白质分解酶-木瓜水解酶处理得到。或者，将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该载体导入原核生物或真核生物中使其表达，可以制备Fab。
本发明的F(ab’)2可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白质分解酶-胃蛋白酶处理获得。或者将下述Fab’进行硫醚结合或二硫键结合来制备。
本发明的Fab’可以通过将与GPVI特异性反应的F(ab’)2用还原剂二硫苏糖醇处理获得。
本发明的scFv中所含的VH和VL可以使用本发明的杂交瘤所产生的抗体或人抗体的任意一种。本发明的scFv可如下制备：获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备scFv。
dsFv是指将VH和VL中的各一个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基，将所得的多肽经由该半胱氨酸残基间的二硫键结合所得。置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基可按照Reiter等人所示的方法[ProteinEngineering，7，697(1994)]，根据抗体的立体结构预测来选择。本发明的dsFv中所含的VH和VL可以使用来自本发明的第一或第二方案的任意抗体。
本发明的dsFv可如下制备：获取编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备dsFv。
含有CDR的肽是含有H链或L链CDR的至少一个区域以上的构成。多个CDR可以直接或者经由适当的肽接头结合。本发明的含有CDR的肽可如下制备：获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，然后构建编码CDR的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备含有CDR的肽。含有CDR的肽可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成方法制备。
本发明的抗体或活性片段或它们的衍生物也包含例如杂交瘤所产生的抗体、用EBV转化的细胞所产生的抗体、由cDNA表达的重组抗体、或者使放射性同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与这些抗体的活性片段化学结合所得的抗体、或者基因工程学融合的抗体。例如：结合了聚乙二醇等的抗体稳定性等方面应用价值高，是一个优选的例子。还可以通过化学方法[抗体工学入門(金光修著1994年(株)地人書館)]，使放射性元素同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与本发明的抗GPVI抗体或抗体的活性片段的H链或L链的N末端一侧或C末端一侧、抗体或抗体活性片段中适当的取代基或支链、以及抗体或抗体活性片段中的糖链结合来制备。
杂交瘤是指淋巴细胞与来自人、小鼠、大鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合所得的、产生具有所需抗原特异性的单克隆抗体的细胞，可按照公知方法制备。
制备单克隆抗体时，优选考虑与细胞融合时使用的骨髓瘤细胞的配合性来选择。骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞。其中包含来自人的SKO-007、人小鼠杂合骨髓瘤SHM-D33、来自小鼠的P3、P3U1、SP2/O、NS-1，来自大鼠的YB2/0和Y3-Ag1，2，3等骨髓瘤细胞。
制备人抗体时，有以下方法：利用体外免疫导致的淋巴细胞的活化来制备杂交瘤的方法；以及使用重组人抗体基因得到的动物、特别是转基因小鼠，例如KM小鼠制备杂交瘤的方法。(WO2002/070648(日本特表2005-504507)、WO2002/043478(日本特表2004-515230))。向不同种GPVI例如小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列所得的蛋白质在免疫上述转基因动物、例如小鼠时，可以有效地获得不与GPVI的小鼠的氨基酸序列反应，而与插入的人氨基酸序列、优选表位反应的人抗体。因此，由该方法得到的人抗体作为具有本发明第一或第二方案抗体特征的人抗体，是有用的，该方法特别有效。对杂交瘤制备中使用的细胞没有特别限定，在制备人抗体时，优选在杂交瘤制备中使用的多种细胞中的至少一种是来自人的细胞。来自人的细胞可使用末梢血、淋巴结或脾脏等的人淋巴细胞，特别优选确认有自身抗体产生的人的淋巴细胞。
淋巴细胞的活化可通过公知的方法进行。例如优选以下方法：由人的末梢血或脾脏采集B细胞，通过体外免疫方法进行抗原刺激，制备与来自人B细胞的骨髓瘤细胞或来自小鼠的骨髓瘤细胞的杂交瘤的方法；用EBV转化，与小鼠骨髓瘤细胞融合的方法；用PWM等促细胞分裂原刺激，使B细胞多克隆激活并融合的方法(免疫试验操作法I·II、右田俊介等人编集、南江堂)等。
对用于免疫动物的给予抗原、或者用于刺激细胞的抗原没有特别限定。抗原蛋白质的来源动物可以根据抗体的使用目的适当选择，可以是来自天然物的抗原、遗传工程制备的抗原、化学合成的抗原、与其它蛋白质或肽的融合蛋白等均可。例如可以使用血小板、血小板的膜、纯化GPVI、重组GPVI、GPVI-Fc，优选为GPVI-Fc。本发明第八方案的肽或第九方案的多肽适合作为制备抗GPVI抗体的免疫用的给予抗原使用。
活化淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合可按照Milstein等的公知的方法(Methods in Enzymol.，73卷3页)进行。例如有：使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂的方法(单克隆抗体试验操作法入门、安东民卫·千叶丈著、讲谈社)或电融合法等。免疫细胞与骨髓瘤细胞的混合比只要是它们可以融合的比例即可，没有限定，优选相对于活化淋巴细胞，使用1/10量-等量的骨髓瘤细胞。使用PEG(平均分子量1,000-4,000)进行细胞融合的方法中，PEG的浓度没有限定，优选以50％进行。可以添加二甲基亚砜(DMSO)等辅助剂作为融合效率促进剂。融合时通过将加温至37℃的PEG溶液添加到混合的细胞中引发，反应1-5分钟后，添加培养基终止。
由该融合形成的杂交瘤在含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和氨基蝶呤的培养基(HAT培养基)等选择培养基中培养1天-10天，分离未融合细胞。通过所产生的抗体进一步选择所得杂交瘤。选择的杂交瘤可通过公知的极限稀释法形成单一克隆，确立单一克隆性抗体产生杂交瘤。
检测杂交瘤所产生的抗体的活性的方法可以使用公知的方法。这里，抗体的活性的检测分两阶段：第一阶段是检测与GPVI抗原的结合能力，第二阶段是检测抑制GPVI与胶原蛋白结合的活性。第一阶段的活性的检测方法例如有：ELISA法、蛋白质印迹法、放射免疫测定法。第二阶段的活性的检测方法例如有：ELISA法(结合抑制型)、蛋白质相互作用分析法(BIACORE等)、抑制血小板聚集的测定法。第八方案的肽或第九方案的多肽可以作为检测抗GPVI抗体的抗原使用。具体方法如实施例所示。
将建立的杂交瘤按照公知的方法培养，可以从其培养上清中获得单克隆抗体。
抗体的纯化可以采用盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法或亲和柱层析法等公知的纯化方法进行。
抗体的浓度可以通过公知的蛋白质定量方法、例如通过测定280nm下的吸光度来测定。
作为确认本发明的抗GPVI抗体的抗原结合性的方法、或者使用本发明的抗GPVI抗体检测生物试样中GPVI的方法，可以使用荧光抗体法、酶联免疫抗体法(ELISA)、放射线物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法、免疫细胞染色法等免疫组织化学染色法(ABC法、CSA法等)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、上述酶免疫测定法、夹心ELISA法[单克隆抗体试验手册、(講談社サイエンテイフイツク、1987年)；生物化学实验讲座5免疫生化学研究法(東京化学同人、1986年)]等。
(用途)
本发明的抗体是与人GPVI特异性结合的抗体，本发明的抗体、抗体的活性片段、与化学物质结合得到的抗体的修饰物、或者含有它们的混合液的组合物等具有包括人的疾病的预防、诊断和治疗用途，以及检测受检试样、细胞和组织等中的人GPVI的用途等的各种用途。
用途：药物
本发明的抗体与人GPVI结合的特异性高，且单独使用时对人血小板活化和/或促进或引发血小板减少的作用低，因此对于人的疾病、例如血小板活化或聚集、或血管内皮障碍或者动脉硬化反应引起的疾病的预防和/或治疗有效，另外，也可用于血栓或栓塞引起的疾病、例如血栓形成和栓塞等的预防和/或治疗。这些疾病中，不仅包括动脉血栓形成，也包括静脉血栓形成，还包含心房纤颤引发的脑梗塞。
本发明的抗体可以预防和/或治疗的人类疾病或病态具体有：心肌梗塞，血栓溶解疗法时、实施经皮冠状窦内腔扩张术时、施行支撑架时、实施旁路手术时或者实施人工血管时或者这些手术之后的血管内皮肥厚、血管再狭窄、心绞痛或心肌梗塞、心房纤颤或心房扑动，以及上述原因的血栓形成、栓塞或脑梗塞、闭塞性血栓动脉炎、急性动脉闭塞症、闭塞性动脉硬化症或深部静脉血栓形成等，还有脑梗塞(粥样血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、心源性脑梗塞)、一过性脑缺血发作、株网膜下腔出血后的脑血管挛缩、肺血栓、肺栓塞、血管性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、播散性血管内凝血综合征、体外循环时防止血液凝固、全身性红斑狼疮、多发性动脉炎、抗磷脂抗体综合症、紫癜性肾炎、伴随糖尿病的内皮细胞损伤、糖尿病性肾炎、糖尿病性视网膜症、肾栓塞、伴随移植治疗的并发症(肝静脉闭塞症、移植物抗宿主病)等。
对于之前所述的预防和/或治疗对象疾病，本发明的抗体可以单独给予，或者与其它药理活性成分联合使用。所述药理活性成分例如有公知的溶栓剂(例如组织纤溶酶原激活物(t-PA)及其衍生物(包括突变体或所谓的第二代)、尿激酶、链激酶)、或者公知的抗血小板药(例如阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、血栓烷拮抗剂、血栓烷合成抑制剂、GPIIb/IIIa拮抗剂)、公知的抗凝药(例如华法林、肝素、低分子肝素、戊多糖、凝血酶抑制剂、FXa抑制剂、FVIIa抑制剂)等。这里所述的联合使用除了指给予同时含有本发明的抗体和该药理活性成分的合剂之外，也包含将本发明的抗体和该药理活性成分分别制成制剂，在同一时期或者不同时间给予的情况，只要是在患者血液中同时存在即可，其给予形式不限。
含有本发明的抗体以及制剂学上可接受的组合物作为有效成分的药物可使用通常使用的制剂用的载体或赋形剂、其它添加剂，制成例如片剂、注射剂、散剂、栓剂等，对人或其它动物给予。
应用于人时，其给予途径有口服给予、静脉内给予(单次给予、连续输液、间歇输液)、皮下给予、肌内给予、关节内给予、经皮给予、经鼻给予等，通常是口服给予或静脉内给予。本发明的抗体对人的临床给予量可以考虑适用患者的症状、体重、年龄或性别等，适当确定，通常成人每天静脉内给予1-10000mg，优选10-1000mg，可以将其分成一次或多次给予。给予量根据各种条件变动，因此也可能以比上述给予量少的量即足够。
这里，本发明的抗体在识别GPVI方面是共通的，但本发明也包含具有不同机理的各种抗体。例如，直接抑制GPVI与胶原蛋白结合的、或者通过切断GPVI来抑制血小板活化和/或聚集的抗体有望获得比较即时性的效果，因此可能至少在疾病的急性期(例如心肌梗塞时或实施PTCA时或者实施之前或之后立即)有用。上述情况下，优选为了使本发明的抗体与血液中血小板表面的GPVI大部分结合而给予较大量的抗体，例如可以采取单次或分次静脉注射或静脉滴注的形式。另外，将GPVI摄入到内部的抗体可能无法获得即时效果，但是，考虑到人的血小板在血液中的寿命(9-10天左右)以及人抗体在血液中的半衰期(IgG时为数周)，则有望获得持续性的效果，因此，例如可在疾病的慢性期(例如心肌梗塞发病后或实施PTCA后数天-数月)有效。这种情况下，在部分优选完全抑制血液中血小板与胶原蛋白的反应性的程度下，以较长的间隔、例如一个周期为数天-数周，给予使血小板表面的GPVI消失所需量的抗体，例如可单次或分次静脉注射或静脉滴注。因此，优选的方案中，本发明的抗体可以同时具有这些效果。还可以实施将多种有望获得各效果的抗GPVI抗体组合的治疗。
非口服给予的组合物包含通常溶解于可接受的载体、优选水性载体中的免疫球蛋白溶液或它们的混合液。可使用各种水性载体例如水、缓冲水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸、人白蛋白溶液等。这些溶液是无菌的，通常不存在微粒物质。这些组合物可通过常用的熟知的灭菌方法灭菌。为了接近生理学条件，组合物中可以根据要求含有药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。这些制剂中的抗体浓度可在广范围内、即约低于0.005％重量(通常至少为约1％重量)-15或20％重量的大的量范围内变化，主要根据所选择的给予的特定方式，按照溶液容量、粘性等进行选择。
用于制备非口服给予组合物的现实的方法是本技术领域的技术人员所公知或了解的，例如在レミントンズフア-マシユ-テイカルサイエンス(第15版、マツクパブリツシングカンパニ-、イ-ストン、ペンシルバニア、1980)(该引例视为本说明书的一部分)有更为详细的记载。适合灌洗或其它途径的组合物可以根据所需的特定应用来选择。上述药学组合物可包含抗GPVI抗体和在该疾病中常用的其它治疗药。在任何情况下都可以采用单次给予和持续给予。预防性或治疗性的有效量可根据对象疾病、病态和患者的状态等适当确定。
本发明的抗体可以为了储藏而冷冻或冷冻干燥，在使用之前在适当的载体中重新构成。该技术已知对于通常的免疫球蛋白是有效的，可以采用公知的冷冻干燥和重新构成技术。冷冻干燥和重新构成可能导致各种程度的抗体活性损失(例如常用的免疫球蛋白、IgM抗体有产生比IgG抗体更大的活性损失的倾向)，以及在使用水平上，为了补充该损失必须进行调节，这是本领域技术人员应该认识到的。
用途：GPVI检测
使用本发明的抗体或抗体的活性片段检测受检试样中GPVI的方法可包括以下步骤：使受检试样与本发明的抗体或抗体的活性片段接触的步骤；检测与本发明的抗体或抗体活性片段结合的受检试样中GPVI的步骤。可以进一步包括对受检试样中的GPVI进行定量的步骤。可通过检测受检试样中GPVI的方法进行疾病的诊断。特别是可用作人的疾病例如血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的诊断。
使用本发明的抗体检测受检试样中GPVI的方法有：夹心ELISA系、抑制ELISA系、荧光抗体法、免疫组织化学染色法、放射性物质标记免疫抗体法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法等，但并不限于此。作为对象的受检试样并不受限定，可以使用生物试样，有动物、特别是人的体液或组织、细胞和菌体以及它们的提取液、培养上清、涂抹标本和切片，优选血小板或血浆或者血清。
通过测定血小板上的GPVI，可应用于与GPVI相关的治疗的监控，特别是以血小板上的GPVI消失为指标，对抗GPVI抗体的效果进行预测或判定，或者进行预后的判定等。
实施例
通过以下实施例进一步详述本发明，但不应理解为本发明受这些实施例的限定。
实施例1
GPVI胞外区-Fc融合蛋白的制备
A.人GPVI胞外区-小鼠Fc融合蛋白(hGPVI-mFc)的制备
(1)hGPVI-mFc融合蛋白表达质粒的构建
以小鼠基因组DNA作为模板，扩增编码小鼠免疫球蛋白(mIgG2a)重链恒定区各结构域的基因区。即，用以下的引物对进行PCR反应，结果，用mIgG2a-a(SEQ ID NO.152)和mIgG2a-c(SEQ ID NO.154)扩增了CH1结构域，用mIgG2a-b(SEQ ID NO.153)和mIgG2a-e(SEQ IDNO.156)扩增了绞链部分、用mIgG2a-d(SEQ ID NO.155)和mIgG2a-g(SEQ ID NO.158)扩增了CH2结构域、用mIgG2a-f(SEQ ID NO.157)和mIgG2a-h(SEQ ID NO.159)扩增了CH3结构域。接着将上述四种扩增产物混合，使用引物mIgG2a-a和mIgG2a-h进行PCR反应，得到各结构域连接的扩增产物(编码重链恒定区(Cγ2a)的DNA片段)。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体上，然后用限制酶Bam HI和KpnI切取编码小鼠Fc区的DNA片段，制备片段A。另一方面，用限制酶Xba I和Bgl II由pCAGGS-GPVI-Fc质粒切取编码人GPVI胞外结构域的DNA片段，制备片段B。在用Xba I和Kpn I切断制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游，将这些片段连接成片段A+片段B，构建表达hGPVI-mFc(SEQ ID NO.222)的质粒(pTK-2249)。
(2)hGPVI-mFc融合蛋白的表达和纯化
COS-1细胞在加入了10％胎牛血清的DulbeccoMEM培养基中继代，将pTK-2249与转染试剂(FuGENE6，ロシユダイアグノステイツクス制备)以适当量混合，然后滴加到无血清的DulbeccoMEM培养基中，将其与培养液更换，进行转染。在5％CO2存在下、在37℃下培养3天，然后将该培养上清用蛋白A柱(Prosep-A、MILLIPORE)纯化，将所得作为制备抗人GPVI抗体用的抗原。
B.人GPVI胞外区-人Fc融合蛋白(hGPVI-hFc)表达质粒(pTK-2233) 的构建和表达
将具有编码人hGPVI-hFc的基因的质粒(pCAGGS-GPVI-Fc)用限制酶Xba I和Eco T22I切断，制备片段J，用限制酶Eco T22I和Bgl II切断，制备片段K，在表达质粒pEF2cew的EF-1α启动子下游连接成片段J+K，构建hGPVI-mFc表达质粒(pTK-2233)。另外，hGPVI-hFc的表达和纯化与hGPVI-mFc相同。
C.小鼠GPVI胞外区-人Fc融合蛋白(hGPVI-hFc)表达质粒(pTK-2440) 的构建
以小鼠基因组DNA为模板，用表述的引物对进行PCR反应。结果，用mGPVI-h(SEQ ID NO.162)和mGPVI-i(SEQ ID NO.163)得到PCR扩增产物hi，用mGPVI-j(SEQ ID NO.164)和mGPVI-k(SEQ IDNO.165)得到PCR扩增产物jk，用mGPVI-1(SEQ ID NO.166)和mGPVI-m(SEQ ID NO.167)得到PCR扩增产物1m，用mGPVI-n(SEQID NO.168)和mGPVI-o(SEQ ID NO.169)得到PCR扩增产物no，用mGPVI-p(SEQ ID NO.170)和mGPVI-c(SEQ ID NO.160)得到PCR扩增产物pc。将这些扩增产物混合作为模板，再将引物mGPVI-e(SEQ IDNO.161)、mGPVI-q(SEQ ID NO.171)、mGPVI-r(SEQ ID NO.172)、mGPVI-s(SEQ ID NO.173)和mGPVI-c混合，进行PCR反应，得到各片段连接起来的扩增产物。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体上，制备pTK-2437。在pTK-2437的含有小鼠GPVI胞外结构域的基因区5’一侧具有限制酶Nhe I的识别位点，3’一侧具有Bam HI的识别位点，用这些酶切断，制备DNA片段。然后将该片段插入到用限制酶Xda I和Bam HI切断制备的pTK-2233中，构建小鼠mGPVI-Fc表达质粒(pTK-2440)。
D.食蟹猴GPVI胞外区-人Fc融合蛋白表达质粒的构建
(1)食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fc融合蛋白表达质粒的构建
根据已知序列的人GPVI基因信息设计和制备适当的引物对，使用这些人GPVI引物，进行以食蟹猴基因组DNA为模板的PCR反应，确定食蟹猴GPVI基因序列的一部分。接着，以该序列为基础，重新设计和制备食蟹猴用的引物对，用各引物对、以食蟹猴的基因组DNA为模板再次进行PCR反应，用macGPVI-a(SEQ ID NO.174)和macGPVI-b(SEQ ID NO.175)得到扩增产物ab，用hGPVI-d (SEQ IDNO.180)和macGPVI-c(SEQ ID NO.176)得到扩增产物dc，用macGPVI-d(SEQ ID NO.177)和hGPVI-h(SEQ ID NO.182)得到扩增产物dh，用hGPVI-g(SEQ ID NO.181)和macGPVI-g(SEQ ID NO.178)得到扩增产物gg。另一方面，以pTK-2233为模板，通过使用macGPVI-h(SEQ ID NO.179)和IgG1-i(SEQ ID NO.183)的PCR反应，得到扩增产物hi。将以上五种扩增产物混合作为模板，通过macGPVI-a和IgG1-i再次进行PCR。该操作得到的扩增产物含有将食蟹猴GPVI的D1和D2、人D3融合而成的嵌合GPVI基因，用限制酶Nhe I和Bam HI切断后，插入到用限制酶Xba I和Bam HI切断制备的pTK-2233中，构建食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fc融合蛋白(GPVI-FFH-hFc、SEQ ID NO.223)表达质粒(pTK-2462)。
实施例2
抗人GPVI抗体的制备
A.兔多克隆抗体的制备
为了制备抗人GPVI多克隆抗体，对兔进行免疫。即，将20μg实施例1A中制备的hGPVI-mFc在500μL生理盐水中稀释，与500μL弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予2.1-2.2kg的雌性新西兰白兔(北山ラベス)的背部皮下。2周后，再将20μg hGPVI-mFc在500μL生理盐水中稀释，与500μL的弗氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，给予背部皮下。给予结束1周后，由耳静脉采血，按照规定方法分离抗血清，纯化抗体。即，向抗血清中添加硫酸铵，使最终饱和浓度为33％，在4℃下搅拌1小时，然后将析出的沉淀离心。接着将沉淀用Dulbecco磷酸缓冲液(以下记为D-PBS)溶解，用D-PBS透析过夜。过滤透析液，然后供给蛋白A柱(プロセツプA、ミリポア)，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱结合的IgG组分，得到纯化抗体。所得洗脱组分用1M Tris盐酸缓冲液(pH7.0)迅速中和，用D-PBS透析，然后由280nm的吸光度计算蛋白浓度(吸光系数：0.714mg/mL)。以下，将所得抗体记为抗GPVI多克隆抗体。
B.抗人GPVI单克隆抗体的制备
将20μg GPVI-mFc与弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，制成给予抗原。将给予抗原给予雌性ddY小鼠(8周龄、SLC)2次，3天后由淋巴结分离淋巴细胞。将所得淋巴细胞与P3×63-Ag.8.U1(ATTC)混合，然后使用聚乙二醇(PEG1500、Sigma)，按照安东民卫、千叶丈/著“单克隆抗体试验操作入门”(讲坛社，83页)进行细胞融合。通过HAT培养基选择杂交瘤，1周后，用两种方法对产生目标抗体的杂交瘤进行筛选。即，使用了以与在板上固相化的hGPVI-hFc的结合活性作为指标的方法，以及以抑制胶原蛋白与GPVI结合活性为指标的方法。
(1)以结合活性作为指标的杂交瘤的筛选
用D-PBS将由实施例1B制备的hGPVI-hFc稀释为2μg/mL，以50μL/孔添加到免疫板(Maxisorp、NUNC)中。在37℃下反应1小时，然后用离子交换水清洗5次。将含有2％StabilGuard(Surmodics)的D-PBS(pH7.4)以100μL添加到各孔中，进行封闭。接着，将培养上清添加到各孔中，在37℃下反应1小时，然后用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO、P260)用含有10％兔血清的D-PBS稀释为1000倍，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时，然后同样清洗5次，向各孔中添加TMB溶液(BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm的吸光度。结果，选择与hGPVI-hFc反应的细胞，通过极限稀释法(安东民卫、千叶丈/著“单克隆抗体试验操作入门”(讲坛社，97页))进行克隆。8天后同样进行筛选，选择与hGPVI-hFc反应的抗体。
(2)以抑制胶原蛋白-GPVI结合活性为指标的杂交瘤的筛选
用D-PBS将胶原蛋白(Horn)稀释为10μg/mL，以50μL/孔添加到免疫板(Maxisorp、NUNC)中。在4℃下反应过夜，然后用离子交换水清洗5次，用含有5％BSA的D-PBS封闭。接着添加25μL/孔培养上清，再以25μL/孔添加用D-PBS制备成2μg/mL的hGPVI-hFc，在37℃下反应1小时，然后用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(BioMeda)用含有10％山羊血清的D-PBS稀释成1000倍，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时，然后同样清洗5次，将TMB溶液(BioFix)添加到各孔中。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm下的吸光度。选择相对于未添加抗体的孔的吸光度降低50％以上吸光度的孔作为产生抗GPVI抗体的杂交瘤。
结果，通过多次的细胞融合(F编号表示1次)选择了具有抑制胶原蛋白与GPVI的结合活性的杂交瘤。
(3)杂交瘤所产生的抗体的制备
产生抗GPVI抗体的杂交瘤用10％FCS/RPMI-1640培养基(Sigma)培养，然后更换为杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)进行培养，使其产生抗体，使用蛋白A柱(Prosep-rA、ミリポア)，由培养上清中纯化抗体。即，将所得培养上清吸附于预先用D-PBS平衡的蛋白A柱(Prosep-A、Millipore)，将未吸附的蛋白质用D-PBS清洗，然后用25mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱吸附组分。然后用生理盐水进行透析，所得抗体的浓度是使用吸光系数(E1％：1.4)，由280nm的吸光度进行计算。以下，将所得抗体记为抗GPVI单克隆抗体。
实施例3
抗GPVI单克隆抗体的分组
通过将实施例2所得的抗体按照与GPVI的结合特性、即结合区的不同进行分类，使用F1199、F1201、F1202、F1210和F1211各抗体进行竞争测定。首先，按照中根等人的方法(J.Histochem.Cytochem.，22，1084，1974)制备各抗GPVI单克隆抗体的过氧化物酶标记抗体。
接着使用这些过氧化物酶标记抗体进行与各纯化抗体的竞争测定，对抗体进行分类。即，用D-PBS将hGPVI-hFc稀释为2μg/mL，以50μL/孔添加到免疫板中。在37℃下反应1小时，然后用离子交换水清洗5次，向各孔中添加含有2％StabilGuard的D-PBS，进行封闭。接着，将25μL上述标记抗体和25μL各纯化抗体添加到孔中，在37℃下反应1小时，然后用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗5次，用TMB溶液(BioFix)显色。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm的吸光度。
以未添加纯化抗体时的吸光度为100％，计算对各标记抗体的抑制活性，对各纯化抗体进行分类。结果，将与标记抗体(i)、(ii)、(v)、(viii)竞争的抗体分为a组。将与标记抗体(i)、(v)、(vii)竞争的抗体分为b组。将与标记抗体(i)、(ii)、(vii)、(viii)竞争的抗体分为c组。将与标记抗体(iii)、(iV)竞争的抗体分为d组，将与标记抗体(iii)、(iv)、(Vi)竞争的抗体分为e组。还将标记抗体(iii)、(vi)分为f组。未见有规则性的分为g组和h组。g组和h组互相不竞争，因此分为不同的组。因此，可以确认制备的抗GPVI单克隆抗体可以识别GPVI表面上的至少八种区域。
实施例4
供给猴ex vivo试验的抗体的分组
在制备的抗人GPVI单克隆抗体中，按照实施例3的分组方法将与猴GPVI结合并可用于ex vivo试验的抗体进行分组。即，使用实施例3制备的各标记抗体，按照与实施例3同样的方法进行竞争测定，对各抗体进行分类。如表1所示，与实施例3同样可分为至少识别七种区域的抗体组。
表1
Figure BDA00001982169100421
Figure BDA00001982169100431
实施例5
抗GPVI单克隆抗体的解离常数的计算
使用蛋白相互作用分析装置BIACORE3000(BIACORE)测定实施例2中制备的抗GPVI单克隆抗体的解离常数。即，按照手册，将实施例1中制备的GPVI置换体(hGPVI-HHH-hFc和FFH-hFc)与传感芯片中的CM5芯片(BIACORE)结合。接着，将各抗体用HBS-EP缓冲液(BIACORE)稀释，制备由1.25-40nM的稀释系列，用BIACORE3000进行分析。对于每个抗体的结合均用pH1.5的甘氨酸缓冲液(BIACORE)再生芯片。所得结果用评价软件(BIACORE)的二价分析物进行分析，计算解离常数。结果如表2所示。显示本次制作的各抗GPVI单克隆抗体对GPVI-HHH-hFc具有足够的亲和性。
表2
Figure BDA00001982169100432
Figure BDA00001982169100441
实施例6
使用抗GPVI多克隆抗体制备夹心EIA系统
为了制备夹心ELISA系统，将实施例2所得的抗GPVI多克隆抗体与实施例3同样地用过氧化物酶标记。接着制备抗GPVI多克隆抗体固相化板。即，将抗体用D-PBS稀释为10μg/mL，向免疫板(Maxisorp、NUNC)的各孔中添加50μL，在45℃下反应30分钟。接着用离子交换水清洗5次，向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的D-PBS，进行封闭。标准品是将纯化GPVI-hFc用0.1％BSA/D-PBS稀释为0.75、1.5、3.1、6.25、12.5、25、50ng/mL制备。空白使用含有0.1％BSA的D-PBS。测定是首先将板的封闭剂除去，分注50μL制备的标准品和空白，在25℃下反应过夜。将板用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗3次，接着添加50μL用含有10％兔血清、0.1％吐温-20的D-PBS稀释为2μg/mL的过氧化物酶标记抗GPVI多克隆抗体，在37℃下反应。同样清洗5次，然后向各孔中添加TMB溶液(BioFix)，在室温下反应20分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm的吸光度，制作标准曲线。
实施例7
抗GPVI抗体的识别区域的分析
将人GPVI的氨基酸序列的一部分置换成小鼠的氨基酸序列，通过调查抗体反应性的变化来确定抗GPVI抗体的识别区域。即，血小板膜蛋白GPVI的胞外区由免疫球蛋白样区域1、2(可记为结构域1或D1、结构域2或D2)以及粘蛋白样区域(可记为结构域3或D3)三个结构域构成(图1)，由此，制备以各结构域为单位的置换体，进行各置换体与抗GPVI抗体的结合试验。
为了进一步确定抗GPVI抗体识别区域，以氨基酸序列同源性比较高的人NK细胞活化受体Nkp46、Ig-样转录物2(ILT2)的信息为基础，由GPVI免疫球蛋白样区域和PDB(蛋白数据库)登录的蛋白质进行人GPVI的建模，预测可导入氨基酸突变的区域结构(图1)。然后构建这些环区域上的人GPVI与小鼠GPVI的氨基酸置换体表达质粒，进行抗GPVI抗体与各置换体的结合试验。结果，可以确认各抗GPVI单克隆抗体所识别的GPVI各结构域和环区域。本说明书中，将GPVI的结构域或氨基酸置换突变体只标为GPVI置换体。
表3.人可溶解型GPVI结构域1和2区域中各环的氨基酸序列
  环编号   SEQ ID NO.   氨基酸序列
  环1   1   GPLPKP
  环2   2   PSSLVPLEKP
  环3   3   PPGVDL
  环4   4   SSSRYQDQ
  环5   5   PAMKRSLAGR
  环6   6   QNGSLWSLPSDQ
  环7   7   VFAKPS
  环8   8   AQPGPAVSSGGD
  环9   9   TRYGFDQ
  环10   10   KEGDPA
  环11   11   ERWYR
  环12   12   ITVTAAHS
  环13   13   FSSRDPYL
  环14   14   ELVVTG
(1)人GPVI与小鼠GPVI结构域置换体表达质粒的构建
以实施例1中制备的hGPVI-hFc(以下记为GPVI-HHH-hFc，SEQID NO.135)表达质粒(pTK2333)和mGPVI-hFc(以下记为GPVI-MMM-hFc、SEQ ID NO.136)表达质粒(pTK2440)为模板，构建将人GPVI与小鼠GPVI的结构域置换的GPVI置换体表达质粒。
即，为了构建GPVI的结构域1含有小鼠的、结构域2和结构域3含有人的序列的GPVI置换体(以下记为GPVI-MHH-hFc、SEQ IDNO.137)表达质粒，以pTK2440为模板，使用在小鼠GPVI序列的上游设计的有义引物1(表4、SEQ ID NO.184)、和在小鼠GPVI结构域1的C末端一侧15mer连接人GPVI结构域2的N末端一侧15mer得到的反义引物3(表4、SEQ ID NO.186)进行PCR，扩增小鼠GPVI的结构域1的DNA片段(417bp)。接着，以pTK2233为模板，使用在hFc序列上设计的反义引物2(表4、SEQ ID NO.185)、和在小鼠GPVI结构域1的C末端一侧15mer上连接人GPVI结构域2的N末端一侧15mer所得的有义引物4(表4、SEQ ID NO.187)进行PCR，扩增人GPVI结构域2、结构域3、hFc的至N末端一侧的DNA片段(571bp)。然后使用扩增的两个DNA片段、有义引物1、反义引物2进行PCR，扩增连接了小鼠GPVI的结构域1、人GPVI的结构域2、结构域3、hFc的N末端一侧序列的DNA片段(973bp)。将该扩增的DNA片段用限制酶Xba I、BamHI切断，然后插入到pTK2233的XbaI，BamHI位点，构建GPVI-MHH-hFc表达质粒。
GPVI的结构域1含有人的、结构域2含有小鼠的、结构域3含有人的序列的GPVI置换体(以下记为GPVI-HMH-hFc，SEQ IDNO.138)表达质粒，以及GPVI的结构域1和结构域2含有小鼠的、结构域3含有人的序列的GPVI置换体(以下记为GPVI-MMH-hFc，SEQ ID NO.139)表达质粒也按照同样方法，使用在要置换的GPVI的结构域的连接位置分别连接15mer人和小鼠的GPVI序列而制备的有义(表4，SEQ ID NO.191)和反义引物(表4，SEQ ID NO.190)、有义引物1、反义引物2，扩增必要的DNA片段，用限制酶XbaI、BamHI切断后插入到pTK2233的XbaI、BamHI位点，由此构建质粒。本次试验中使用的五种GPVI置换体的氨基酸序列如SEQ ID NO.141-151所示。
(2)将人GPVI的环区域置换为小鼠氨基酸序列的GPVI置换体表达 质粒的构建
将可以作为抗GPVI单克隆抗体识别区域的单一环区域分别置换为对应的小鼠GPVI氨基酸序列，所得GPVI置换体表达质粒如下构建。首先，在人GPVI的环区域L2处置换碱基序列，将人的氨基酸序列置换为小鼠的氨基酸序列，再由置换的碱基制备在上游连接11mer、下游连接13mer人GPVI碱基序列得到的有义引物10(表4)和反义引物9(表4)。接着，以pTK2233为模板，使用有义引物1和反义引物9进行PCR，扩增环区域L2被小鼠的序列置换的人GPVI的N末端一侧DNA片段(215bp)。同样，以pTK2233为模板，使用有义引物10和反义引物2进行PCR，扩增人GPVI的C末端一侧区域连接hFc的N末端一侧序列所得的DNA片段(773bp)，其中人GPVI的环区域L2被小鼠的序列置换。然后使用扩增的两个DNA片段、有义引物1、反义引物2进行PCR，扩增在人的GPVI上连接hFc的N末端一侧序列的DNA片段(958bp)，其中，人的GPVI的环区域L2被小鼠序列置换。将该扩增的DNA片段用限制酶XbaI、BamHI切断，然后插入到pTK2233的XbaI、BamHI位点中，构建将人GPVI的区域L2置换为小鼠GPVI氨基酸序列的GPVI置换体(以下记为hGPVI-mL2-hFc，SEQ ID NO.46)表达质粒。
也按照同样的方法构建了置换其它的环区域的GPVI置换体、hGPVI-mL3-hFc、hGPVI-mL4-hFc、hGPVI-mL5-hFc、hGPVI-mL6-hFc、hGPVI-mL7-hFc、hGPVI-mL8-hFc、hGPVI-mL9-hFc、hGPVI-mL 10-hFc、hGPVI-mL 11-hFc、hGPVI-mL 13-hFc、hGPVI-mL 14-hFc的表达质粒。各GPVI置换体表达质粒的构建中使用的引物序列如表4所示。制备的GPVI置换体的氨基酸序列如SEQ ID NO.47-57所示。
表4.各GPVI置换体表达质粒的构建中使用的引物的组合和扩增区域
Figure BDA00001982169100471
Figure BDA00001982169100481
Figure BDA00001982169100491
(3)GPVI置换体的制备
将实施例7(1)、(2)中构建的GPVI置换体表达质粒和pTK2233、pTK2440按照与实施例1所示方法同样地导入COS-1细胞中，使其表达。
通过蛋白A柱(Prosep-A、ミリポア)，从所得培养上清中纯化目标GPVI置换体。在还原、非还原两种条件下进行SDS-PAGE，用银染确认所得GPVI置换体的纯化度。
(4)与人GPVI和小鼠GPVI的结构域置换体的结合活性
通过将人GPVI结构域置换为小鼠GPVI的结构域，可以确认抗体的识别区域。即，进行GPVI-HHH-hFc、GPVI-MHH-hFc、GPVI-HMH-hFc、GPVI-MMH-hFc和GPVI-MMM-hFc与各抗GPVI单克隆抗体的结合活性测定。
首先，以5μg/mL在板(Maxisorp、Nunc)上固定兔抗人IgG抗体(BAKO)，用2％StabiliGuard(SurModics)封闭。接着除去封闭液，添加用0.1％BSA/PBS稀释的GPVI置换体。在37℃下反应1小时。用含有0.05％吐温-20的0.9％生理盐水清洗，然后在37℃下，用由0.1％BSA/PBS稀释的1％人血清(コスモバイオ)封闭1小时，再用含有0.05％吐温-20的0.9％生理盐水清洗，然后添加用0.1％BSA/PBS稀释为0.5μg/mL的实施例3中制备的过氧化物酶标记抗体，在37℃下反应1小时。最后用含有0.05％吐温-20的0.9％生理盐水清洗，然后用H202/TMB溶液显色，用0.5M硫酸中止反应，然后用450nm的波长测定吸光度。
结果，在F1232-10-2、F1232-21-1、F1201-20、F1232-43-3和F1232-14-2抗体中，与将结构域1置换为小鼠GPVI的GPVI-MHH-hFc、GPVI-MMH-hFc和GPVI-MMM-hFc的结合活性显著降低。由此表明，这些抗体的识别区域存在于GPVI的结构域1。而在F1232-7-1、F1232-19-1、F1232-37-2、F1232-17-1、F1232-18-3、F1232-24-1抗体中，与将结构域2置换为小鼠GPVI的GPVI-HMH-hFc、GPVI-MMH-hFc、GPVI-MMM-hFc的结合活性显著降低，由此推测这些抗体的识别区域存在于GPVI的结构域2。
各抗GPVI抗体的抗原识别区域如表5所示。
(5)与将人GPVI的环区域置换为小鼠的氨基酸序列所得的GPVI置 换体的结合活性
对GPVI-HHH-hFc、hGPVI-mL2-hFc、hGPVI-mL3-hFc、hGPVI-mL4-hFc、hGPVI-mL5-hFc、hGPVI-mL6-hFc、hGPVI-mL7-hFc、hGPVI-mL8-hFc、hGPVI-mL9-hFc、hGPVI-mL 10-hFc、hGPVI-mL 11-hFc、hGPVI-mL13-hFc和hGPVI-mL14-hFc与各抗GPVI单克隆抗体的结合活性进行测定。
通过比较将人GPVI的环区域置换为小鼠的环区域所得的GPVI置换体和人GPVI的结合活性，将抗体的识别区域确定至置换了的环区域。
测定方法与实施例7(4)的方法同样，将实施例3中制备的过氧化物酶标记的抗体用0.1％BSA/PBS稀释至可同时测定各抗体与GPVI-HHH-hFc的亲和性的浓度使用。结果，F1232-10-2、F1232-21-1、F1232-43-3抗体与hGPVI-mL2-hFc，F1232-14-2抗体与hGPVI-mL3-hFc和hGPVI-mL5-hFc，F1201-20抗体与hGPVI-mL4-hFc和hGPVI-mL5-hFc的结合活性降低。F1232-7-1、F1232-37-2、F1232-17-1、F1232-18-3和F1232-24-1抗体与hGPVI-mL9-hFc，F1232-19-1抗体与hGPVI-mL9-hFc和hGPVI-mL11-hFc的结合活性降低。各抗GPVI抗体的抗原识别区域如表5所示。
表5
Figure BDA00001982169100511
●：抗体与置换了各环的GPVI突变体的结合活性降低至与hGPVI-hFc的结合活性的30％以下。
Figure BDA00001982169100521
实施例8
通过食蟹猴ex vivo实验对抗GPVI单克隆抗体的评价
将实施例2中制备的各抗GPVI单克隆抗体以24小时的间隔、以0.3mg/kg和1mg/kg静脉内给予雄性食蟹猴(约6kg)。给予前、初次给予24小时后和48小时后进行采血，测定血小板数、CD62P蛋白(血小板活化标记)的表达量、血小板膜蛋白(GPIIb/IIIa；CD41a和GPVI；CD42a)的表达量、血小板GPVI的表达量和血小板聚集能力(与胶原蛋白和ADP的反应性)。
A.血小板数的测定
使用Sysmex F-820测定采集的加入枸橼酸的血液中的血小板数。在给予了克隆No.F1232-18-3、F1232-10-2、F1232-14-2、F1232-43-3、F1201-20、F1232-37-2的猴中，未见血小板数减少(减少率低于20％，表6中用-表示)。在给予了F1201-18、F1232-17-1的猴中可见血小板数减少的倾向(减少率为20％-40％，表6中用±表示)。而在给予了F1232-7-1、F1232-24-1、F1232-21-1的猴中，可见明显的血小板数的减少(减少率为40％-60％，在表6中用+表示)，特别是在F1232-19-1中尤为显著(减少率为60％以上，表6中用++表示)。
B.CD62P蛋白质的确认
将采集的加入枸橼酸的血液以×100g、25℃离心20分钟，制备富血小板血浆(PRP)。用含有0.5％热灭活FBS和2.5mM EDTA的PBS(以下称为FACS缓冲液)稀释，使PRP的血小板数为1×108细胞/mL，然后用抗人CD62P-PE(BD Biosciences Pharmingen)，通过FACS研究猴血小板上的CD62P蛋白的表达。即，向PRP中添加抗人CD62P-PE，在室温下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板，用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度。结果，在由给予了任何抗GPVI单克隆抗体的猴采血、制备的PRP中，与给予前相比未见CD62P表达的上升(表达诱导低于2倍，表6中用-表示)。
C.CD41a和CD42a蛋白质的确定
猴血小板上CD41a和CD42a蛋白质表达量的测定与CD62P的情形相同，制备PRP，通过分别使用抗人CD41a-FITC (BD BiosciencesPharmingen)、抗人CD42a-PE(BD Biosciences Pharmingen)的FACS分析进行。结果，在由给予了F1232-21-1和F1232-19-1的猴采血、制备的PRP中，可见CD41a和CD42a蛋白质轻度减少(给予1mg/kg后的消失率为30％-70％，表6中用±表示)，但是在由给予了其它抗GPVI单克隆抗体的猴采血、制备的PRP中，对CD41a和CD42a蛋白质的表达未见影响(给予1mg/kg后的消失率低于30％，表6中用-表示)。
D.GPVI蛋白质的确认
猴血小板上的GPVI蛋白质的确认是与CD62P的情形相同，制备PRP，通过使用用荧光色素Af488标记的抗GPVI多克隆抗体的FACS分析进行。结果，在由给予了F1201-18、F1201-20、F1232-37-2的猴采血制备的PRP中，可见GPVI蛋白质的消失(给予1mg/kg后的消失率为70％以上，表6中用+表示)，特别在F1232-7-1、F1232-18-3、F1232-10-2、F1232-21-1、F1232-43-3、F1232-17-1、F1232-19-1中尤为显著(给予0.3mg/kg后的消失率为70％以上，表6中用++表示)。而在由给予了F1232-24-1、F1232-14-2的猴采血、制备的PRP中，可见部分消失(给予1mg/kg后的消失率为30％-70％，表6中用±表示)。
E.血小板聚集能力的测定
使用血小板聚集测定装置(PA-200，聚集分析仪，Kowa)测定胶原蛋白和ADP引发的血小板聚集能力。首先，用生理盐水稀释，使PRP的血小板数为3×108细胞/mL，然后添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，在37℃下温育3分钟。再添加终浓度为2μg/mL的胶原蛋白溶液或终浓度为10μM的ADP溶液，在37℃下温育12分钟。血小板聚集率是通过用PA-200聚集分析仪(Kowa)测定光透射率求出。结果，在由给予了F1232-7-1、F1201-20的猴采血、制备的PRP中，可见胶原蛋白应答性血小板聚集能力的降低(给予1mg/kg后的消失率为70％以上，表6中用+表示)，特别在F1232-18-3、F1232-10-2、F1232-21-1、F1201-18、F1232-43-3、F1232-37-2、F1232-17-1、F1232-19-1中尤为显著(给予0.3mg/kg后的降低率为70％以上，表6中用++表示)。在由给予了F1232-24-1的猴采血、制备的PRP中，可见部分降低(给予1mg/kg后的降低率为30％-70％，表6中用±表示)。而在F1232-14-2中，对血小板的聚集能力几乎未显示影响(给予1mg/kg后的消失率低于30％，表6中用-表示)。
对于ADP应答性的血小板聚集能力，在由给予了F1232-10-2、F1232-21-1的猴采血、制备的PRP中部分降低(给予1mg/kg后的消失率为30％-70％，表6中用±表示)，在由给予了其它抗GPVI单克隆抗体的猴采血、制备的PRP中对血小板聚集未见影响(给予1mg/kg后的消失率低于30％，表6中用-表示)。
实施例9
抗GPVI抗体可变区氨基酸序列的确定
以下给出了确定抗GPVI抗体(克隆No.F1232-7-1)的可变区氨基酸序列的例子，对于其它抗GPVI抗体也通过同样的实验操作确定了其可变区的氨基酸序列。
即，使用RNeasy Micro试剂盒(キアゲン)，从产生目标抗GPVI单克隆抗体的杂交瘤中提取总RNA，用SuperScript III First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒(Invitrogen)合成单链cDNA。以所得单链cDNA为模板，通过小鼠Ig-引物组(Novagen)的PCR扩增可变区，确定碱基序列。起始密码子附近的信息是检索数据库上的序列信息，再设计5’一侧的引物(F1232-7-1重链5’一侧引物：1232H-b(SEQ ID NO.216)、轻链5’一侧引物：1232K-a(SEQ ID NO.218))。而可变区3’一侧的序列则是不改变氨基酸序列，设计了附加有可与人恒定区连接的限制酶识别位点(重链是Nhe I识别序列，轻链为Bsi WI识别序列)的引物(F1232-7-1重链3’一侧引物：1031H-b(SEQ IDNO.217)、轻链3’一侧引物：mIgK-BsiWI(SEQ ID NO.219))。使用上述新型引物再次进行PCR，扩增重链可变区和轻链可变区，使用pT7BlueT载体(Novagen)进行克隆(将具有编码重链可变区的基因片段的质粒称为pTK-2464，将具有编码轻链可变区的基因片段的质粒称为pTK-2466)。接着，按照常规方法确定重链可变区和轻链可变区的碱基序列，给出了该碱基序列(重链可变区：SEQ ID NO.87，轻链可变区：SEQ ID NO.88)以及它们所编码的氨基酸序列(重链可变区：SEQID NO.111，轻链可变区：SEQ ID NO.112)，同时对于F1232-7-1以外的克隆也同样地确定了碱基序列和氨基酸序列(表7)。可变区的氨基酸序列中CDR部分的序列如表8和表9所示。
表7
表8
Figure BDA00001982169100572
序列后括号内的数字表示SEQ ID NO.。
表9
Figure BDA00001982169100573
序列后括号内的数定表示SEQ ID NO.。
实施例10
通过基因重组产生小鼠-人嵌合抗体
制备具有抗原结合活性的、V区来自杂交瘤抗体、即来自小鼠抗体，C区域来自人的抗体(嵌合抗体)。
(1)小鼠-人嵌合抗体表达质粒的构建
抗GPVI抗体(克隆No.F1232-7-1)小鼠-人嵌合抗体表达质粒的构建如下进行。
首先，用限制酶EcoR I和Nhe I切断pTK-2464，制备编码重链可变区的基因片段C。另一方面，将pTK-2232(参照WO2005/7800实施例10)用限制酶Eco 47III和Bam HI切断，制备编码重链恒定区(Cγ4)的基因片段D。在用限制酶EcoR I、Bam HI切断制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游，将这些片段连接成片段C+片段D，构建重链表达质粒(pTK-2468)。
接着，将pTK-2466用限制酶EcoR I和BsiW I切断，制备编码轻链可变区的DNA片段E。另一方面，以HeLa基因组DNA为模板，通过引物BsiWI-hIgK(SEQ ID NO.220)和IgK-e(SEQ ID NO.221)进行PCR，将人轻链恒定区(Cκ)克隆到pT-7BlueT上(pT7-hIgK)。为了从pT7-hIgK上切取人轻链恒定区，用限制酶Bsi WI和Bam HI将pT7-hIgK切断，制备DNA片段F。在用EcoR I和Bam HI切断制备的表达载体pEF2cew的EF启动予下游，将这些片段连接成片段E+片段F，构建各轻链表达质粒(pTK-2474)。
(2)重组小鼠-人嵌合抗体的表达和与GPVI结合活性的确认
构建的小鼠-人嵌合抗体表达质粒的表达和纯化按照与实施例1所示方法同样地进行。即，将目标克隆的小鼠-人嵌合抗体的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染COS-1细胞，在37℃下培养3天，然后将该培养上清用蛋白A柱纯化。所得小鼠-人嵌合抗体用SDS-PAGE确认其纯化度，然后确认与人GPVI和猴GPVI的结合能力。首先，将实施例1中制备的GPVI置换体、hGPVI-hFc或GPVI-FFH-hFc用D-PBS稀释为2μg/mL，在免疫板(Maxisorp、NUNC)中添加50μL/孔。接着在37℃下反应1小时，然后用离子交换水清洗5次，向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的D-PBS，进行封闭。接着将纯化的小鼠-人嵌合抗体添加到各孔中，在37℃下反应1小时，然后用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记抗人轻链K抗体(DAKO)用含有10％兔血清的D-PBS稀释为1000倍，向各孔中加入50μL，在37℃下反应1小时，然后同样清洗5次，向各孔中添加TMB溶液(BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm的吸光度。结果，可确认制作的小鼠-人嵌合抗体与人和猴的GPVI特异性结合。
实施例11
人源化抗体的制备
A.人源化抗体的制备(方法1)
(1)人源化F抗体可变区的计算机建模
为了在人源化抗体中保持高亲和性，按照クイ-ン等人的常规方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029，1989)进行构架区残基的选择。人序列是根据Kabat等人(Sequences of proteins of immunologicalinterest，5th ed.，U.S.Department of Health and Human Services，1991)的κ轻链和重链序列数据库，在小鼠抗GPVI单克隆抗体(克隆No.F1232-7-1)中选择具有高的构架区同源性的序列。并且，通过计算机分析进行最佳的构架区中氨基酸的改变。具体来说，使用计算机程序ENCAD(レビツト、J.Mol.Boil.168*595(1983))或Hommology(アクセルリス公司)、FAMS(SGI公司)等蛋白质建模工具，进行F1232-7-1抗体可变区分子模型的构建。在由抗体数据库得到的人Eu抗体分子模型(Stephen等人，Immunology 85(4)，668-674(1995))中，将F1232-7-1抗体的CDR序列移植到FR中。通过分子最佳化计算或分子动力学计算等的最佳化或模拟分析，在计算机模型上，在CDR和FR与原本的人抗体模型不同的、显示显著接触的FR区，通过进行氨基酸置换，在预想可以使与CDR和FR的接触得到改善的位置上置换为来自小鼠抗体的氨基酸。另外，在人抗体的数据库中、在该位置上只偶尔出现的FR中的氨基酸残基可置换为这些位置的人共有氨基酸。氨基酸置换是否成功可通过实际活性来确认，因此可以制作多种氨基酸置换不同类型的抗体。
(2)人源化抗体的构建
以实施例11A(1)所选择的序列为基础，构建编码含有信号肽、剪接供给信号以及限制位点(例如Eco RI)的氨基酸序列的基因。构建的基因可以制备成将多种合成核苷酸(80个碱基长度左右)重叠。即，使低聚核苷酸配对，退火，通过DNA聚合酶的Klenow片段伸长，得到双链片段。将该片段改性，制成单链，然后同样退火，通过DNA聚合酶的Klenow片段伸长，获得编码全长基因的双链片段。将所得片段通过PCR扩增，纯化后用限制酶(例如Eco RI和Nhe I)切断并纯化。将纯化的片段与含有人IgG4恒定区基因(Cγ4)的由CH1外显子至CH3外显子的基因片段(例如将pTK-2232用Nhe I和Bam HI切断)连接，插入表达载体pEF2cew的EF启动子下游(用Eco RI和Bam HI切断)，构建人源化重链表达质粒。另外，置换的氨基酸数量少时，还可以通过位点专一性突变法将氨基酸突变导入表达质粒中，轻链可变区序列可以与上述同样构建。这种情况下，人Cκ区是从pT7-hIgK中切取，在表达载体pEF2cew的EF启动子下游与轻链可变区序列连接，插入。
为了制备产生抗体的转化体，在将重链和轻链质粒用限制酶切断，形成线性后，使用ヘジ-ンパルサ-(BIORAD)导入小鼠骨髓瘤细胞Sp2-O-ag14(ATCC CRL1581)中。例如将约20μg线性的DNA片段通过360V、25μFD电容的电穿孔仪导入到1×107个细胞中。接着将细胞接种于96孔板，培养2天后，为了选择插入了质粒片段的细胞，添加10％FCS、1×HT(Invitrogen)、0.25mg/mL黄嘌呤、1μg/mL霉酚酸的D-MEM(Sigma)，再培养2周。对培养后上清中的抗体进行分析，选择作为目标的人源化F1232-7-1抗体产生细胞株。即，培养上清中的抗体与固相化的GPVI抗原结合，将结合的抗体用过氧化物酶标记抗人IgG4抗体检测。确认结合了的抗体产生细胞株在含有10％FCS的培养基中培养，直至汇合，更换为无血清培养基(杂交瘤SFM，Invitrogen)。回收培养上清，将培养上清中含有的抗体与蛋白A(Prosep-A、ミリポア)结合，用0.1M甘氨酸盐酸(pH3.0)洗脱。将纯化抗体用PBS-(Sigma)透析，由280nm的吸光度计算抗体浓度(人抗体1mg/mL表示约1.3的吸光度)。
(3)人源化抗体的评价
使用BIACORE系统(BIACORE公司)测定人源化抗体和原有的小鼠抗体与GPVI抗原的结合能力并进行比较。即，按照手册，将BiACORE3000在CM5芯片(BIACORE公司)上纯化，固定hGPVI-mFc。接着，制备用HBS-EP缓冲液(BIACORE公司)稀释得到的抗体稀释系列，注入各样品。将所得数据使用BIACORE的分析程序(BIAEvaluation，BIACORE)进行分析，计算亲和力(Kd)。
B.人源化抗体的制备(方法2)
(1)人源化抗体基因的制备
人源化抗体中，为了使移植的CDR序列保持为具有活性的适当的结构域结构，与原有的FR区的序列一起进行移植的方法较为有效。哪些氨基酸参与了CDR结构域结构的保持，这可以由FR中氨基酸的性质(疏水性、亲水性、酸性、碱性、分子大小等)推定，还可以通过使用计算机的建模来推定。即，使用在シリコングラフイツク上启动的软件QUANTA/CHARMm或者Modeler(モレキユラ-·シユミレ-シヨンズ)进行建模。从登录在Brookhaven蛋白质数据库(PDB)上的人抗体序列检索与F1232-7-1抗体的VH和VL区具有高同源性的抗体的立体结构，根据该结构推定F1232-7-1抗体的立体结构。在推定的立体结构上，选出与重链和轻链的CDR氢键结合的FR区中的氨基酸组(第一组)，再选出与它们氢键结合的FR区中的氨基酸组(第二组)。同样，选择推定通过静电的相互作用或范德华力等能量键与CDR结合的FR区中的氨基酸组(第一组)、以及推定与它们结合的FR区中的氨基酸组(第二组)。这样选择的FR区中的氨基酸组与CDR氨基酸一起移植到人抗体序列上，但当产生在由Kabat等人的分类(Sequences of proteins of immunological interest，5th ed.，U.S.Department of Health and Human Services，1991)或NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)等得到的人抗体序列的可变区氨基酸中不存在的序列时，该氨基酸不移植。根据这样得到的信息，确定移植到人抗体序列VH和VL上的序列，构建在人源化抗体制备中使用的基因。
构建的基因可通过以下的方法制备：将アマシヤム公司的试剂盒(寡核苷酸体外定点突变系统(Oligonucleotide-directed in vitromutagenesis system)version 2)和PCR法的组合的方法；将多种长链合成核苷酸组合扩增的方法；以嵌合抗体的VH或VL基因为模板，使用多种引物扩增后再以这些扩增基因片段为模板，获得全长基因片段的方法。所得扩增基因片段与实施例11A(2)记载的质粒(pTK-2232或pT7-IgK)的恒定区片段连接，插入到表达载体pEF2cew的EF启动子下游，构建人源化抗体表达质粒。制备的质粒按照实施例11A(2)记载的方法导入细胞，得到转化体，同样地制备纯化抗体。还可以与实施例11A(3)同样的进行抗体的评价。
实施例12
GPVI缺失患者的GPVI抗体的抗原结合特性以及小鼠抗人GPVI单 克隆抗体的抗原结合特性
12-1使用人GPVI环置换体对GPVI缺失患者的抗GPVI抗体的抗原 结合特性进行分析
使用各种重组蛋白进行GPVI缺失患者(Tateo Sugiyama等6人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页)血液中含有的抗GPVI抗体的识别结构域分析。将患者特异性纯化抗体和实施例7中的重组人GPVI环置换体混合，在37℃下、在聚丙烯板上反应2小时，然后将混合样品以50μL/孔添加到与实施例2的方法同样地制备的重组hGPVI-hFc固相板中，在37℃下反应1小时。接着，将过氧化物酶标记抗人κ和λ链抗体(DAKO，P130、P129)用含10％兔血清的D-PBS(pH7.4)稀释至1000倍，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时后，与实施例2的方法同样地测定吸光度。测定值与未添加重组人GPVI环置换体时的吸光度进行比较，由吸光度没有降低或者吸光度降低程度较小的环置换体的结果推定GPVI缺失患者自身抗体中所含的抗GPVI抗体的抗原识别部位。
其结果如表10所示。在以ITP发症后早期的患者抗体(#930819)为对象时，如果使用hGPVI-hFc-mL4(将重组人GPVI-hFc环4置换为小鼠的序列，表示蛋白质。以下也同样记载)、hGPVI-hFc-mL5、hGPVI-hFc-mL9、hGPVI-hFc-mL13使用时，其吸光度并未减少。即，了解到作为实验对象的GPVI缺失患者的抗GPVI抗体中含有识别环4、5、9、13的抗体。另一方面，在以长期ITP发病的患者抗体(#021004)为对象时，如果使用hGPVI-hFc-mL9、hGPVI-hFc-mL13时，其吸光度并未减少。即，了解到作为实验对象的GPVI缺失患者的抗GPVI抗体含有可识别环9、13的抗体。
表10    GPVI缺失患者抗体的小鼠环置换体进行的吸收实验
Figure BDA00001982169100631
+：作为吸收抗原添加时，吸光度不降低或者降低小时
-：作为吸收抗原添加时，吸光度的降低与未置换体(hGPVI-hFc)为相同程度时
12-2GPVI缺失患者的抗体与小鼠抗人GPVI单克隆抗体的竞争试验
进行实施例2中制备的小鼠抗GPVI杂交瘤抗体和GPVI缺失患者血液中含有的抗GPVI抗体的竞争实验。即，将来自GPVI缺失患者的抗GPVI抗体以50μL/孔添加到12-1中所述的hGPVI-hFc固相化板中，在4℃下反应过夜。向其中添加过氧化物酶标记小鼠抗GPVI杂交瘤抗体，使吸光度为0.5-1.0，在37℃下反应45分钟，与实施例2的方法同样地测定吸光度。结果，按照与实施例2的方法同样的方法制备的小鼠抗人GPVI单克隆抗体F1199-6和F1232-37-2与GPVI缺失患者血液中所含的抗GPVI抗体竞争。结果如图2所示。
实施例13
结构域2(L9环)特异性抗人GPVI抗体的制备
13-1小鼠抗人GPVI单克隆抗体的制备
将20μg实施例1制备的纯化hGPVI-mFc融合蛋白与Alum(PIERCE)、低聚CpG混合，作为给予抗原。给予ddY小鼠(雌性、8周龄、SLC)，再给予20μg给予抗原。3天后，由淋巴结或脾脏中分离淋巴细胞，按照与实施例2的方法同样的方法进行细胞融合，选择杂交瘤。
1周后，以与实施例7中制备的hGPVI-hFc和hGPVI-mL9-hFc的结合活性作为指标，筛选产生目标抗体的杂交瘤。即，将由实施例1制备的纯化hGPVI-hFc或hGPVI-mL9-hFc用D-PBS(pH7.4)稀释为1μg/mL，以50μL/孔添加到免疫板(Maxisorb、NUNC)中，与实施例2的方法同样地进行固相化。接着，将培养上清添加到各孔中，在室温下反应1小时，然后与实施例2的方法同样地使用过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO、P260)进行反应，测定吸光度。结果，选择产生了与纯化hGPVI-hFc结合(吸光度为1以上)但不与hGPVI-mL9-hFc结合(吸光度为0.5以下)的抗体的细胞，通过实施例2的方法进行克隆。8-10天后，同样地进行筛选，得到了产生L9特异性小鼠抗人GPVI抗体的杂交瘤。与实施例2B(3)同样，培养所得杂交瘤，纯化单克隆抗体。各抗体的亚型使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche)确定。
13-2大鼠抗人GPVI单克隆抗体的制备
以纯化hGPVI-mFc融合蛋白、或者将L9和L11环置换为来自人的序列的大鼠GPVI-mFc融合蛋白(大鼠GPVI-hL9/h11-mFc)(SEQID NO.288)作为给予抗原。大鼠GPVI是以大鼠骨髓RNA为模板，通过使用低聚dT引物的反转录反应合成cDNA，然后再将其作为模板，通过PCR克隆全长基因。PCR中使用的引物对是(mGPVI-a：CCACATAGCTCAGGACTGGG(SEQ ID NO.289)、mGPVI-d：CCAAGTTATTTCTAGGCCAGTGG(SEQ ID NO.290))。将20μg给予抗原与弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，给予Wistar大鼠(雌性，8周龄，SLC)，2周后由淋巴结分离淋巴细胞。与SP2/O-Ag14(ATTC)混合后，按照与实施例2的方法同样的方法进行细胞融合，选择杂交瘤。
1周后，按照上述13-1所述的方法筛选产生目标抗体的杂交瘤。结果，选择产生与纯化人GPVI-hFc结合(吸光度为1以上)但不与将L9置换为小鼠L9的纯化人GPVI-hFc结合(吸光度为0.5以下)的抗体的细胞，按照实施例2的方法进行克隆，得到产生大鼠抗人GPVI抗体的杂交瘤。与实施例2B(3)同样，对所得杂交瘤进行培养，纯化单克隆抗体。各抗体的亚型使用大鼠MonoABID/SP试剂盒(ZYMED)确定。
实施例14
抗GPVI单克隆抗体的特性分析
14-1抗原结合特性
为了分析实施例13中得到的各抗体的特性，调查与人GPVI-hFc的结合、与实施例4的F1232-37-2抗体的竞争、对L9环的特异性。即，与人GPVI的结合是按照实施例2的方法测定对固定化抗原的结合活性。结合活性是将吸光度为0.5-1.0的表示为+，1.0-2.0的表示为++，2.0以上表示为+++。与F1232-37-2的竞争如下进行。即，按照中根等人的方法(J.Histochem.Cytochem.，22，1084，1974)制备过氧化物酶(东洋纺)标记抗体，由使用的抗体量计算抗体浓度。
接着，使用该过氧化物酶标记抗体进行与各纯化抗体的竞争测定。即，将25μL上述标记抗体和25μL各纯化抗体添加到hGPVI-hFc固相化板的孔中，在37℃下反应1小时，然后用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗5次，用TMB溶液(BioFix)显色。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(マルチスキヤンJX、大日本制药)测定450nm的吸光度。结果如表11所示。抑制活性是在比未添加抑制抗体的吸光度抑制了50％以上时表示为+++，抑制30％-50％时表示为++，抑制10％-30％时表示为+。
L9环特异性是按照实施例13的13-1的方法测定，将反应性降低50％以上时判断为+，即，可识别L9环。
Figure BDA00001982169100671
14-2抑制GPVI-胶原蛋白结合的活性
按照与实施例2同样的方法调查抑制实施例13中得到的各抗体的胶原蛋白-GPVI的结合活性。与未添加抗体的孔的吸光度相比吸光度降低50％以上时表示为+++，降低30％-50％时表示为++，降低10％-30％时表示为+(表11)。
14-3解离常数的测定
由实施例14得到的各抗体的解离常数按照与实施例5的方法同样的方法调查。将结果以相对于F1232-37-2的解离常数的相对值的形式表示在表11中。
实施例15
抗GPVI抗体可变区氨基酸的确定(2)
实施例13中制备的抗人GPVI抗体的可变区氨基酸序列按照与实施例9的方法同样的方法确定。对于确定了抗体可变区的碱基序列的克隆，将CDR和可变区碱基序列以及推定的氨基酸序列表示在表12和13以及序列表(参照表14)中。由抗体可变区基因的序列分析结果可见，这些抗体的序列来自多种一定的抗体基因，具有识别人GPVI环9的抗体的抗体库(repertoire)选择性特征。
表12抗GPVI抗体重链的CDR序列
Figure BDA00001982169100681
Figure BDA00001982169100691
表13抗GPVI抗体轻链的CDR序列
Figure BDA00001982169100692
表14抗GPVI单克隆抗体可变区的碱基序列和氨基酸序列
Figure BDA00001982169100693
Figure BDA00001982169100701
实施例16
小鼠/人嵌合抗GPVI抗体的产生(2)
16-1小鼠/人嵌合抗体的产生
将按照与实施例10的方法同样的方法制备的表达质粒按照下述方法导入COS-1细胞中，进行嵌合抗体的暂时性表达。cF1232-18-3(小鼠单克隆抗体F1232-18-3的小鼠/人嵌合化抗体表记为cF1232-18-3。以下，对于其它小鼠单克隆抗体也同样表记)表达是进行重链表达质粒pTK-2471和轻链表达质粒pTK-2475的共转染，对cF1232-43-3、cF1232-10-1或cF1232-37-2，是分别进行pTK-2504和pTK-2514、pTK-2509和pTK-2517或者pTK-2510和pTK-2511的共转染。
将COS-1细胞以2.1×106细胞/层接种于CellSTACK·10培养室(CORNING)中，在37℃下培养4天。除去培养液，然后用D-MEM将细胞清洗2次，然后向每台培养室中添加约1.3L以下的FuGENE/DNA/生产培养基混合液。按照所附的说明书，将2.12mLFuGENE6(ロシユ·ダイアグノステイツクス公司)和各530μg重链表达质粒、轻链表达质粒混合，然后加入到1.3L杂交瘤-SFM(Invitrogen公司)中。添加FuGENE/DNA/生产培养基混合液，然后在37℃的条件下培养3-4天，回收上清。将1.3L杂交瘤SFM培养基重新加入到CellSTACK·10培养室中，再培养3-4天，再次回收上清。小鼠/人嵌合抗体在这些上清中表达，用于以下的纯化。
16-2小鼠/人嵌合抗体的纯化
纯化操作如无特别记载均在4℃下实施。
分别使用具有1μm孔径的capsule cartridge filter(东洋滤纸株式会社)作为预滤器、具有0.22μm孔径的フルオロダインfilter(PALL)作为正式滤器，在室温下，将16-1中制备的cF1232-37-2COS培养液进行澄清化，得到培养上清。将该培养上清吸附于预先用PBS-(Sigma)平衡的rmp Protein A Sepharose Fast Flow(AmershamBiosciences)，将未吸附的蛋白质用PBS-清洗，然后用含有1.5M NaCl的100mM磷酸缓冲液洗脱非特异性吸附的蛋白质。然后将特异性结合的抗体用100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱。测定洗脱液容量，立即添加1/10容量的1M Tris-HCl(pH7.0)，使pH回复至中性。将所得标准品用0.9％NaCl水溶液透析，得到纯化标准品。按照同样的操作纯化cF1232-43-3、cF1232-10-1或cF1232-18-3。
在实施例13中实现克隆的单克隆抗体中，对于F1249-18-2、F1245-7-1、F1246-1-1、F1249-24-1、F1245-4-1、F1249-22-1和F1251-1-1也用同样的方法进行嵌合抗体表达质粒的制备、在COS-1细胞中的表达和纯化。
实施例17
小鼠/人嵌合抗体的抗原结合特性
17-1小鼠/人嵌合抗体的抗原结合活性
使用蛋白相互作用分析装置BIACORE3000(BIACORE)，按照与实施例5同样的方法测定16-2中制备的各嵌合抗体的解离常数。制备的嵌合抗体显示对hGPVI-hFc具有充分的亲和性。
17-2小鼠/人嵌合抗体和对应的小鼠单克隆抗体的抗原结合性比较
为了将小鼠/人嵌合抗体和对应的小鼠单克隆抗体的抗原结合活性进行比较，与实施例14的方法同样，制备过氧化物酶标记F1232-37-2、F1232-18-3、F1232-43-3和F1232-10-1，通过添加这些标记抗体和与固相化hGPVI-hFc结合的反应体系所对应的未标记小鼠/人嵌合抗体的竞争法(实施例14中14-1的方法)，对小鼠单克隆抗体和对应的小鼠/人嵌合抗体与人GPVI的结合活性进行比较，结果如图4所示，两者未见差异。还按照实施例2或实施例14的方法，对各抗体抑制GPVI与胶原蛋白结合的活性进行测定。本实验的结果表明：如图5所示研究的各抗体具有抑制GPVI与胶原蛋白的结合活性。嵌合化抗体和小鼠杂交瘤抗体对于抑制GPVI与胶原蛋白结合的活性是同等的。
17-3抗人GPVI抗体与GPVI突变体的结合特性
以4μg/mL将hGPVI-hFc固定于板上，将按照实施例14的方法进行过氧化物酶标记的F1232-37-2或cF1232-37-2，以及实施例7中制备的hGPVI-hFc、mGPVI-hFc、hGPVI-mL3-hFc，或者按照与实施例1的方法同样的方法制备的hGPVI-K59E-hFc(含有将人GPVI第59号的赖氨酸置换为谷氨酸的一个氨基酸突变的人GPVI胞外区、以及人Fc的融合蛋白)用0.1％BSA/PBS稀释并混合，然后添加到板上，在37℃下反应1小时。反应后使用TMB溶液显色，通过450nm的波长测定吸光度。
本实验的结果表明，过氧化物酶标记的F1232-37-2或cF1232-37-2与hGPVI-hFc的结合受到hGPVI-hFc、hGPVI-mL3-hFc和hGPVI-K59E-hFc的抑制，但并未受到mGPVI-hFc的抑制。在F1232-37-2或cF1232-37-2中该结果同等。另一方面，按照与实施例2的方法同样的方法制备的小鼠单克隆抗体F1199-6中可见到与此不同的现象。即，过氧化物酶标记的F1199-6抗体与hGPVI-hFc的结合受到hGPVI-hFc和hGPVI-mL3-hFc的抑制，但是并不受hGPVI-mFc和GPVI-K59E-hFc抑制。结果如图6所示。
17-4小鼠/人嵌合F1232-37-2抗体的表位分析
为了确认cF1232-37-2抗体的抗原识别部位，进行了GPVI-HHH-hFc、GPVI-MMM-hFc、hGPVI-mL2-hFc、hGPVI-mL3-hFc、hGPVI-mL4-hFc、hGPVI-mL5-hFc、hGPVI-mL6-hFc、hGPVI-mL7-hFc、hGPVI-mL8-hFc、hGPVI-mL9-hFc、hGPVI-mL 10-hFc、hGPVI-mL11-hFc、hGPVI-mL13-hFc、hGPVI-mL14-hFc(以上由实施例7制备)和cF1232-37-2抗体的结合活性测定。
即，通过将人GPVI的环区域置换为小鼠的环区域，在抗体的结合活性与对置换前的人GPVI的结合活性比较有降低时，可以推测抗体的识别区域存在于置换了的环区域。在将小鼠GPVI的环区域置换为人的环区域的置换体中，抗体的结合活性如果恢复，则可推测置换了的环区域是抗体的识别区域，由这两个实验可以确定抗体的反应区域。
测定方法按照17-3的方法进行。
对所得结果进行分析，如图7所示，cF1232-37-2的活性在hGPVI-mL9-hFc中显著降低。由该结果可以认为cF1232-37-2识别环9区域。
实施例18
小鼠抗GPVI单克隆抗体和小鼠/人嵌合抗GPVI单克隆抗体对血小板 的作用
18-1人血小板和食蟹猴血小板活化作用
将由正常人或食蟹猴采集的含枸橼酸血液供给Sysmex F-820，求出血小板数等后，对于人的血液，以170×g、25℃、15分钟；对于猴的血液以115×g、25℃、20分钟进行离心，获得富血小板血浆(PRP)，接着进行1300×g、25℃、15分钟离心，获得贫血小板血浆(PPP)。
接着，将所得PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.33×108细胞/mL，然后添加终浓度为1-10μg/mL的抗体，在37℃下温育30分钟。温育后加入多聚甲醛(终浓度为1％)，在4℃下固定1小时。用含有0.5％热灭活FBS的PBS(以下称为FBS缓冲液)清洗，然后添加抗人CD62P-PE(BECKMAN COULTER)，在室温、避光下静置30分钟。30分钟后用FBS缓冲液清洗血小板，然后用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度，对CD62P的表达进行分析。
如图8所示，F1199-6抗体浓度相关性地活化人血小板或食蟹猴血小板，但是在F1232-37-2抗体中则几乎未见血小板活化作用。另外，cF1232-37-2对人血小板或食蟹猴血小板的作用也同样。对于实施例16中制备的嵌合抗体、cF1249-18-2、cF1245-7-1、cF1246-1-1、cF1249-24-1、cF1245-4-1、cF1249-22-1和cF1251-1-1也按照同样的方法研究对猴血小板的活化作用，结果未见活化作用。在一部分克隆中，未嵌合化的小鼠抗体显示了对猴血小板的活化作用，但是通过嵌合，该作用消失。对实施例2中制备的小鼠单克隆抗体也同样进行研究，抗体均未见人血小板活化作用。
18-2引发人血小板聚集的作用
将按照19-1的方法制备的PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.33×108细胞/mL，添加终浓度为1-10μg/mL的抗体，在37℃下温育5分钟。向其中添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，在37℃下一边温育12分钟一边通过MCMヘマトレ-サ-313M(エム·シ-·メデイカル)测定PRP的光透射率，由此求出血小板聚集。
如图9所示，F1199-6浓度相关性地引发人血小板的聚集，但F1232-37-2和cF1232-37-2则几乎未见引发血小板聚集的作用。
18-3抑制胶原蛋白引发的人血小板聚集的作用
将按照18-1的方法制备的PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.33×108细胞/mL，然后添加终浓度为1-10μg/mL的抗体，在37℃下温育5分钟。向其中添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，再在37℃下温育3分钟，然后添加终浓度为1μg/mL的胶原蛋白溶液，一边在37℃下温育12分钟一边用MCMヘマトレ-サ-313M(エム·シ-·メデイカル)测定PRP的光透射率，由此求出胶原蛋白应答性的血小板聚集。
如图10所示，F1232-37-2和cF1232-37-2浓度相关性地抑制了胶原蛋白引发的人血小板的聚集。
18-4抑制ADP引发的人血小板聚集的作用
将按照18-1的方法制备的PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.33×108细胞/mL，然后添加终浓度为1-10μg/mL的抗体，在37℃下温育5分钟。向其中添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，再在37℃下温育3分钟，然后添加终浓度为5μM的ADP溶液，一边在37℃下温育12分钟一边用MCMヘマトレ-サ-313M(エム·シ-·メデイカル)测定PRP的光透射率，由此求出ADP应答性的血小板聚集。其结果如图11所示。
在F1232-37-2和cF1232-37-2中未见抑制ADP引发的人血小板聚集的作用。
实施例19
抗GPVI抗体的测定系统(EIA)
通过夹心EIA法测定抗GPVI抗体浓度。即，使用按照实施例1同样的方法制备的、具有人GPVI序列的hGPVI-hFc作为固相化蛋白，使用抗人κ轻链HRP(DAKO)作为标记抗体，制备夹心EIA系统。
使用实施例16中制备的抗GPVI抗体作为标准品。将hGPVI-hFc用PBS(pH7.4)稀释为4μg/mL，向各孔中添加50μL NUNC-免疫板Maxisorp(NUNC)。在4℃下反应过夜，用冰水清洗5次，将含有2％StabilGuard(SurModics，Inc.)的PBS(pH7.4)在各孔中各添加100μL，进行封闭。接着以含0.1％BSA的PBS(pH7.4)作为稀释液，制备测定试样和标准品的稀释检样。除去板的封闭剂，向各孔中添加50μL稀释检样，在37℃下反应1小时。反应终止后，用0.05％吐温-20/0.9％氯化钠溶液清洗3次。接着，制备用含有10％兔血清的PBS(pH7.4)稀释的标记抗体，向各孔中添加50μL，在37℃下反应1小时。反应终止后，用0.05％吐温-20/0.9％氯化钠溶液清洗3次，分别向各孔中添加50μL四甲基联苯胺溶液(BioFix)，在室温下反应约10分钟，然后用50μL 1mol/L盐酸溶液中止反应，通过板分光光度计测定450nm的吸光度。
测定猴血浆中GPVI抗体浓度时，使用含有10％猴血浆和10％兔血浆的PBS(pH7.4)作为标记抗体稀释液，同样测定。
实施例20
通过食蟹猴ex vivo试验评价抗GPVI单克隆抗体(2)
实验开始时，首先进行受试食蟹猴的体重测定和给予前的采血。在给予抗GPVI抗体0.5小时-2小时后采血，测定1)血小板数、2)血小板膜蛋白(GPIIb/GPIIIa(CD41a)、GPIX(CD42a))的表达、3)血小板GPVI的表达、4)血小板聚集(与胶原蛋白和ADP的反应性)，进行各抗体的评价。
即，由食蟹猴(雄性，约5kg)的足静脉采血，将所得含枸橼酸血液供给Sysmex F-820，求出血小板数等，然后通过115×g、25℃、15分钟的离心得到富血小板血浆(PRP)，接着，通过830×g、25℃、20分钟的离心得到贫血小板血浆(PPP)。接着，将所得PRP用含有0.5％热灭活FBS和2.5mM EDTA的PBS(以下称为FACS缓冲液)稀释，CD41a的表达是添加抗人CD41a-FITC(BD Biosciences Pharmingen)，CD42a的表达是添加抗人CD42a-FITC(BD Biosciences Pharmingen)，GPVI的表达是添加用荧光色素Af488标记的兔抗GPVI-mFc多克隆抗体和小鼠抗GPVI-mFc单克隆抗体，在室温下、避光下静置30分钟。30分钟后，用FACS缓冲液清洗血小板，用流式细胞仪CYTOMICSFC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度，由此对各膜蛋白的表达进行分析。还使用所得PRP，通过蛋白质印迹法对各膜蛋白的表达进行分析。方法如下。将在猴ex vivo试验中得到的各种PRP用2.5mM EDTA/PBS清洗2次，添加1×样品缓冲液(+β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)、磷酸酶抑制剂鸡尾酒(PIERCE))，使其浓度为0.5×106血小板/μL，在99℃下进行5分钟的热处理。处理的样品用液氮冷冻，在使用之前一直保存在-30℃下。
为了通过蛋白质印迹法对猴PRP中各蛋白质进行分析，首先通过SDS-PAGE进行蛋白质的分离。使用5-20％浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶(ATTO)，每条泳道上加入样品2.5×106血小板，每片凝胶用30mA进行电泳。印迹是按照常规方法，通过半干法转印到低荧光的膜(Immobilon-FL PVDF，MILLIPORE)上。印迹后，用0.1％吐温-20/PBS(TPBS)轻轻冲洗，用BlockAce(大日本制药株式会社)在4℃下封闭一夜。封闭反应后，添加用10％BlockAce/TPBS稀释的一次抗体，在室温下旋转混合1小时，同时进行反应。所使用的一次抗体是抗GPIIIa抗体(抗整联蛋白β3，Santa Cruz)、抗GPVI抗体(以人GPVI合成肽作为抗原的多克隆抗体)、抗GPIX抗体(抗CD42a，Santa Cruz)。一次抗体反应后，用TPBS充分冲洗，然后用TPBS清洗。清洗后，添加用10％BlockAce/TPBS稀释的二次抗体，在室温下旋转混合30分钟，同时进行反应。二次抗体是：对于GPIIIa和GPVI使用抗兔IgsHRP，对于GPIX使用抗山羊Igs HRP(均由DakoCytomation制备)。二次抗体反应后，用TPBS充分清洗，通过EGL Plus(AmershamBiosciences)进行检测。反应后，通过Typhoon9410(AmershamBiosciences)进行发光检测。检测条件是使用荧光模式。通过该模式检测出了EGL Plus发光中间体。使用分析软件ImageQuant5.2对检测出的条带进行表达蛋白质的定量。
另一方面，对于与胶原蛋白和ADP的反应性如下进行。首先，将PRP用PPP稀释，使血小板浓度为3×108细胞/mL，然后添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，在37℃下温育3分钟。再添加终浓度为2μg/mL的胶原蛋白溶液或终浓度为20μM的ADP溶液，在37℃下一边温育12分钟一边通过MCMヘマトレ-サ-313M(エム·シ-·メデイカル)测定PRP的光透射率，由此求出胶原蛋白或ADP应答性的血小板聚集。
20-1小鼠抗人GPVI单克隆抗体的食蟹猴ex vivo试验
以0.3mg/kg静脉内给予小鼠单克隆抗体F1232-37-2和小鼠单克隆抗体F1199-6，给予1天后，可见血小板GPVI量的降低，同时可见血小板对胶原蛋白的应答性降低，该作用在小鼠单克隆抗体F1232-37-2中持续2天以上。
在给予F1199-6的食蟹猴中，给予后可见血小板数减少，但在给予F1237-2的食蟹猴中未见血小板数有大的变动。
结果如图12所示。
20-2小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验
(1)单次静脉内试验
以0.1、0.3、1mg/kg对食蟹猴(雄性)静脉内给予cF1232-37-2。
如图13所示，在给予0.1、0.3、1mg/kg cF1232-37-2的动物中，给予后血小板对胶原蛋白的应答性迅速降低，该作用在给予0.3和1mg/kg的动物中持续了2天以上。另外，在给予0.1mg/kg cF1232-37-2的动物中，给予后2小时左右对胶原蛋白的应答性降低，其作用持续了1天。
20-3小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验
(2)反复静脉内给予试验
每隔1天给予食蟹猴(雄性)cF1232-37-2，共给予4次，按照以下日程进行：在各给予前、各给予的第二天、最终给予的第二天-17天后采血。对于由采血得到的血液，测定1)血小板数、2)血小板膜蛋白GPIIb/GPIIIa(CD41a)、GPIX(CD42a)、GPIIIa(CD61)的表达、3)血小板GPVI的表达、4)对胶原蛋白引发的血小板聚集和ADP引发的血小板聚集的反应性。
初次给予的第二天可见血小板GPVI量的降低和血小板对胶原蛋白的应答性的降低。对胶原蛋白的应答性的降低在给予0.1mg/kg的动物中、在最终给予后持续了2天，在给予0.3mg/kg的动物中、在最终给予后持续了10天以上。图14表示以0.3mg/kg反复给予的试验中食蟹猴血小板的胶原蛋白引发的聚集能力和血小板GPVI、GPIIIa和GPIX的变化情况。该试验中，血小板膜蛋白GPIX(CD42a)、GPIIIa(CD61)的表达量没有大的变化。
20-4小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验
(3)单次皮下给予试验
以0.1、0.3、1mg/kg对食蟹猴(雄性)皮下给予cF1232-37-2，以给予前和给予后不同时间采血得到的血液作为试样，测定1)血小板数、2)血小板膜蛋白(GPIIb/GPIIIa(CD41a)、GPIX(CD42a)、GPIIIa(CD61))的表达、3)血小板GPVI的表达、4)血小板聚集(与胶原蛋白和ADP的反应性)。结果如图15所示。
在皮下给予1mg/kg和0.3mg/kg的动物中，给予3小时后可见血小板对胶原蛋白的应答性降低，给予第二天可见血小板GPVI量的降低。在给予0.3mg/kg的动物中，对胶原蛋白应答性的降低在给予后持续了1周以上，在给予1mg/kg的动物中持续了2周以上。在给予0.1mg/kg的动物中，在给予当天可见对胶原蛋白应答性的降低。另外，血小板膜蛋白(GPIIb/GPIIIa(CD41a)、GPIX(CD42a)、GPIIIa(CD61))的表达量未见大的变化。
实施例21
抗GPVI单克隆抗体的Fab和F(ab’) 2 的制各
21-1小鼠单克隆抗体F1232-37-2的F(ab’) 2 的制备
为了制备小鼠单克隆抗体F1232-37-2的F(ab’)2，使用赖氨酰肽链内切酶对实施例2所得的小鼠单克隆抗体F1232-37-2进行处理。即，向纯化的小鼠单克隆抗体F1232-37-2中添加1/10量的1M Tris缓冲液(pH8.5)，按照抗体∶酶＝30∶1(摩尔比)添加赖氨酰肽链内切酶(WAKO)，在37℃下反应3小时。反应结束时添加TLCK(SIGMA)，使终浓度为30mM。
接着进行F(ab’)2的纯化。首先，为了除去未切断的抗体和Fc部位，将经赖氨酰肽链内切酶处理的抗体供给Prosep rA(Millipore)。再将该未吸附的组分过Superdex75(Amersham)，由此可以除去赖氨酰肽链内切酶，得到F1232-37-2的F(ab’)2。接着，将得到的F(ab’)2用生理盐水(大塚)透析，在丙烯酰胺凝胶上对抗体的纯度进行分析评价，通过牛IgG标准品、通过Bradford法对抗体浓度进行定量。
21-2  F1232-37-2的Fab的制备
为了制备F1232-37-2的Fab，使用木瓜蛋白酶(Wako)对实施例2所得的纯化小鼠单克隆抗体F1232-37-2进行处理。即，将纯化小鼠单克隆抗体F1232-37-2在1mM半胱氨酸、20mM EDTA/D-PBS-(pH7.4)缓冲液中置换，添加木瓜蛋白酶(Wako)，使抗体∶酶＝30∶1(重量比)，在25℃下反应16小时。反应终止时添加碘乙酰胺(Wako)，使终浓度为30mM。
接着进行Fab的纯化。首先，为了除去未切断的抗体和Fc部位，将经木瓜蛋白酶处理的抗体供给Prosep rA(Millipore)。再将该未吸附的组分过Superdex75(Amersham)，由此可以除去木瓜蛋白酶，得到F1232-37-2的Fab。接着，将得到的Fab用生理盐水(大塚)透析，在丙烯酰胺凝胶上分析抗体纯度并评价，通过牛IgG标准品、通过Bradford法对抗体浓度进行定量。
21-3  F1232-37-2抗体的F(ab’) 2 和Fab的抗原结合反应性
使用蛋白相互作用分析装置BIACORE3000(BIACORE)对实施例2中制备的F1232-37-2(全抗体)和21-1以及21-2中制备的F(ab’)2和Fab分别进行解离常数的测定。即，按照使用手册，将实施例1中制备的hGPVI-hFc与传感芯片CM5芯片(BIACORE)结合。接着，将各抗体用HBS-EP缓冲液(BIACORE)制成0-800nM的稀释系列，通过BIACORE3000进行分析。对每个抗体的结合都是通过pH1.5的甘氨酸缓冲液(BIACORE)再生芯片。将所得结果用评价软件(BIACORE)的二价分析物进行分析，对其全抗体和F(ab’)2进行分析，对于Fab是使用1∶1的结合物进行分析，计算解离常数。结果，在以全抗体的解离常数为1时，F1232-37-2抗体的F(ab’)2和Fab的解离常数分别为约0.7和0.6，与全抗体相比显示具有同等的亲和性。
实施例22
抗GPVI抗体Fab的食蟹猴体外试验
按照实施例20的方法，由食蟹猴采血，将制备的PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.33×108细胞/mL，然后添加终浓度为1-100μg/mL的F1232-37-2Fab，在37℃下温育5分钟。向其中添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，再在37℃下温育3分钟，然后添加终浓度为2μg/mL的胶原蛋白溶液，一边在37℃下温育12分钟一边通过MCMヘマトレ-サ-313M(エム·シ-·メデイカル)测定PRP的光透射率，求出胶原蛋白应答性的血小板聚集，结果如图16所示。
F1232-37-2Fab的抑制胶原蛋白引发的血小板聚集的作用比cF1232-37-2弱。
实施例23
抗GPVI抗体F(ab’) 2 的食蟹猴ex vivo实验
将实施例21中制备的F1232-37-2的F(ab’)2以1mg/kg的给予量皮下给予食蟹猴，将给予前和给予后不同时间采血得到的血液作为试样，测定血小板GPVI的表达和血小板聚集能力(与胶原蛋白和ADP的反应性)。
如图17所示，在给予F1232-37-2F(ab’)2的动物中，给予12小时后可见对胶原蛋白的应答性降低，给予第二天可见GPVI表达降低。对胶原蛋白的应答性的降低持续了2天以上。另外，血小板膜蛋白(Fc γRII(CD32)、GPIX(CD42a)、GPIIIa(CD61))的表达量没有大的变化。
实施例24
猴出血时间测定
在测定出血时间时，首先测定食蟹猴的体重，然后确认血液学的参数、凝固系统参数、血小板功能没有异常，皮下给予1mg/kgcF1232-37-2，给予3小时和48小时后进行测定。
向食蟹猴(雄性、2.5-5kg)两侧尾静脉插入注射针，然后测定出血时间。
在给予cF1232-37-2的动物中，与给予前相比，未见明显的出血时间延长。
实施例25
小鼠/人嵌合抗GPVI抗体表达CHO细胞的制备
25-1小鼠/人嵌合F1232-37-2表达质粒的制备
首先，为了提高表达效率，用Eco RI和Nco I将cF1232-37-2重链表达质粒(pTK-2510)切断，将具有Kozak序列(Kozak，M.等人.，J.Mol.BIol.，196，947-950，1987)的片段(有义链5’AATTCGCCGCCACC3’(SEQ ID NO.291)、反义链5’CATGGTGGCGGCG3’(SEQ IDNO.292))插入到启动子与起始密码子之间，构建pTK-2571。同样，对于cF1232-37-2轻链表达质粒(pTK-2511)也插入Kozak序列，构建pTK-2572。
接着，用限制酶Ssp I和Sse 8387I将pTK-2572切断，使所得片段的末端平头，制备轻链表达单元(EF启动子、抗体轻链基因和聚A信号序列)。而pTK-2571用不切断重链表达单元的限制酶Sse 8387I切断后，进行平头处理，将轻链表达单元和标记单元一起插入到该部位，构建在一个载体上具有三个单元的双链稳定共表达质粒。标记单元是在用于扩增基因的小鼠二氢叶酸还原酶(mDHFR)基因上附加适当的启动子/增强子和聚A信号序列得到的基因片段，合成并准备四种(腺病毒启动子、胸苷激酶启动子、SV40启动子/增强子和SV40启动子)的启动子/增强子，结果构建了四种双链稳定共表达质粒(分别为pTK-2550、pTK-2575、pTK-2576和pTK-2577)(参照图18)。
25-2  表达小鼠/人嵌合F1232-37-2的CHO细胞转化株的制备
将实施例25-1构建的表达质粒pTK-2577共转染DHFR基因缺失CHO细胞，建立产生嵌合抗体的转化CHO。即，将用含有HT mediaSupplement(50×)Hybri-Max(Sigma，以终浓度1×使用)和200mM L-谷氨酰胺(Sigma，以终浓度4mM使用)的EX-CELL 325PF CHO(JRHBioscience)进行驯化培养的CHO DXB11进行转染，当天进行离心后，以8×106细胞/150cm2Roux的浓度接种于烧瓶中。使用125μLFuGENE6(ロツシユダイアグノテイクス)，按照FuGENE6所附的说明书制备12.5μg表达质粒pTK-2577，导入到之前的CHO DXB11中。在5％CO2下、在37℃下培养2天，然后回收细胞，用不含HT、含4mM L-谷氨酰胺的EX-CELL 325PF CHO培养基(以下记为EX-CELL(HT-))清洗2次，再次悬浮于EX-CELL(HT-)中。接着，以12,500-50,000细胞/孔向96孔板中接种细胞，在5％CO2、37℃下持续培养，每隔3天或4天将一半的培养基更换为新的EX-CELL (HT-)。约持续培养一个月后，将产生集落的孔内的细胞转移到新的板上，按照实施例19的EIA法测定以培养上清中的CHO细胞为宿主进行表达的cF1232-37-2。将上清中确认有cF1232-37-2/CHO表达的细胞作为产生cF1232-37-2/CHO的转化株。
同样，用cF1232-37-2表达质粒的pTK-2550、pTK-2575和pTK-2576转化CHO DXB11株，按照实施例19的EIA法测定所得重组细胞所产生的cF1232-37-2/CHO。结果如表15所示，根据作为选择标记利用的mDHFR的启动子的种类不同，cF1232-37-2/CHO生产性不同，通过以相对活性较弱的启动子作为选择标记的表达启动子，确认可以得到高表达克隆。
表15
各种cF1232-37-2/CHO表达质粒的转染成绩
  导入质粒   显示1.8mg/L以上的表达量的克隆数/评价克隆数
  pTK-2550   0/552
  pTK-2576   1/352
  pTK-2577   40/352
  pTK-2575   19/352
25-3  使用氧甲蝶呤进行的基因扩增
将26-2所得的表达嵌合抗体的转化CHO株在含有氨甲蝶呤(以下记为MTX)的EX-CELL(HT-)培养基中选择培养，进行基因扩增操作，选择目标嵌合抗体生产量提高的克隆。
即，将实施例25-2所得的转化株悬浮于30或100nM含MTX的EX-CELL(HT-)培养基中，铺于96孔板上。每隔3天或4天将培养基的一半更换为新的30或100nM含MTX的EX-CELL(HT-)，在5％CO2、37℃下持续培养，直至生成集落。通过EIA法确认所得集落的培养上清中的表达量，选择生产量增加的克隆，结果，可得到生产量提高约2-10倍的转化株。将该基因扩增的转化株反复在MTX浓度提高3-10倍的培养基上选择培养，进一步得到生产量增加的克隆。
25-4  通过表达cF1232-37-2的CHO细胞生产cF1232-37-2
将25-3所得的CHO-G32DS25H8细胞克隆以1.5×105细胞/mL接种于100mM含MTX的EX-CELL(HT-)培养基中，在37℃下培养7天。将所得培养上清用于以下的纯化。
25-5  cF1232-37-2/CHO的纯化
如无特别说明，以后的操作均在4℃下实施。
分别使用具有1μm孔径的capsule cartridge filter(东洋滤纸株式会社)作为预滤器、具有0.22μm孔径的フルオロダインfilter(PALL)作为正式滤器，在室温下，将25-4中制备的CHO细胞株培养上清澄清。将澄清后的培养上清吸附于预先用PBS-(Sigma)平衡的蛋白A(rmp Protein A Sepharose Fast Flow，GE Healthcare/アマシヤムバイオサイエンス)，用PBS-清洗未吸附的蛋白质，将非特异性吸附的蛋白质用10×PBS-(Sigma)洗脱。然后将与蛋白A结合的抗体用100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱。测定洗脱液容量，立即添加1/10容量的2M Tris-HCl(pH8.5)，使pH恢复至中性，得到纯化抗体洗脱液。将该纯化抗体洗脱液通过使用アミコンPM10超滤盘(MILLIPORE)进行的超滤进行浓缩，然后用生理盐液(大塚生食注、大塚制药工厂)进行透析，得到最终的纯化抗体溶液。
25-6  cF1232-37-2/CHO的抗原结合反应性
按照与实施例5同样的方法测定cF1232-37-2/CHO与hGPVI-hFc的解离常数。结果，cF1232-37-2/CHO与hGPVI-hFc具有充分的亲和性，与在COS细胞中暂时性表达制备的cF1232-37-2(以下可简称为cF1232-37-2/COS)显示相同程度。
25-7  cF1232-37-2/CHO的反应性确认
为了确认cF1232-37-2/CHO的反应性，以与hGPVI-hFc的结合能力为指标，与通过细胞的暂时性基因表达系统中制备的cF1232-37-2进行竞争试验。测定方法按照实施例17的17-3的方法进行。使用hGPVI-hFc作为固相化蛋白质，相对标记的cF1232-37-2/COS的结合，改变未标记的cF1232-37-2/CHO或cF1232-37-2/COS的浓度并进行添加，确认其竞争活性。结果如图19所示，确认cF1232-37-2/CHO显示与cF1232-37-2/COS同样的反应性。
实施例26
人源化抗人GPVI单克隆抗体的制备
作为再构成人抗体的设计和制备所用的第一候补，从四种小鼠抗GPVI抗体中选择F1232-37-2。将该抗体各可变区的三个CDR置换为来自人骨髓瘤的已知抗体的CDR，设计人源化抗体。重链选择的是NEW(Saul，F等人，J.BIol.Chem.253，585-597)和Eu(Cunningham B等人，Biochemistry 9，3161)，轻链(κ链)是以REI(Epp，O等人，Eur.J.BIochem.45，513-524)和Eu的构架区(以下称为FR)作为受体。设计最初的各氨基酸序列(版本A，图20和21)来作为NEW-HA、Eu-HA、REI-KA和Eu-KA。其中Eu-HA在其FR3和FR4中存在极稀有的序列，因此变更为更常规序列，重新设计版本C(Eu-HC)。接着，从这些氨基酸序列中考虑可以表达上述的基因序列，将全长序列分成几个，合成DNA片段，通过连接酶将各片段连接，得到编码可变区的基因片段。将其通过具有适当的限制酶切位点的引物(参照实施例10)进行扩增，得到了可与人抗体恒定区(重链是IgG4，轻链为κ链)结合的人源化抗体全长基因。再通过将该基因插入到表达载体pEF2cew的EF启动子下游，构建可表达各人源化抗体的质粒，分别为pTK-2560(NEW-HA)、pTK-2632(Eu-HC)、pTK-2561(REI-KA)和pTK-2631(Eu-KA)。
将这些各人源化抗体表达质粒与嵌合抗体表达质粒(重链：pTK-2571，轻链：pTK-2572)组合表达，对产生的抗体是否保持抗原结合活性进行研究。结果，在Eu-HC、REI-KA和Eu-KA中，嵌合抗体或人源化抗体的任意组合均可见表达和结合活性。而在NEW-HA中，在任意组合中均未见表达和结合活性。因此，向NEW-HA的各FR的氨基酸序列中导入突变(由人序列置换为小鼠序列)，制备各种突变体，以及对抗原结合活性进行比较，结果，最终确认向FR1中导入了4处突变的版本NEW-HAN中，人源化抗体分子的表达和与抗原的结合活性得到恢复。
再通过使用环置换GPVI-Fc的竞争测定，可以确认各人源化抗体与原来的嵌合抗体同样，显示结合特异性(图22)。
实施例27
通过食蟹猴ex vivo试验对抗GPVI单克隆抗体的评价(2)
27-1  小鼠/人嵌合抗GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验(2)
(单次静脉内给予试验之2)
将实施例16中制备的嵌合抗体cF1249-24-1或cF1249-22-1以1mg/kg静脉内给予食蟹猴(雄性)。通过实施例20所示的方法实施各种分析。结果，给予两种抗体后均引起了血小板GPVI量的降低，同时使血小板对胶原蛋白的应答性降低，其效果如图23所示，给予cF1249-24-1持续了2天以上，给予cF1249-22-1则持续了6小时。两种抗体对于血小板膜蛋白(GPIIIa(CD61))的表达量均没有大的影响。
实施例28
食蟹猴出血时间测定(2)
首先测定食蟹猴(雄性、2.5-5kg)的体重，然后确认血液学的参数、凝固系统参数、血小板功能没有异常，皮下给予1mg/kgcF1232-37-2。给予前以及给予3小时和48小时后按照下述方法测定出血时间。为了进行比较，以0.03、0.1和0.3mg/kg静脉内给予依替巴肽，给予5分钟后按照同样的方法测定出血时间。按照实施例20的方法测定出血时间测定时胶原蛋白引发的血小板的聚集能力。
向食蟹猴的两侧尾静脉插入注射针，在计时表动作后立即拔出针。以5秒钟的间隔用滤纸吸取从血管中涌出的血液(Advantec，定性滤纸No.2，150mm)，将该操作反复进行，直至血液不附着于滤纸上，将带血痕的滤纸的数量乘以5作为出血时间(秒)。
结果，在依替巴肽给予组中，在抑制了胶原蛋白引发的血小板聚集能力的状况下，可见出血时间显著延长，而在1mg/kg cF1232-37-2皮下给予组中，在抑制了胶原蛋白引发的血小板聚集能力的状况下，与给予前比较，未见显著的出血时间延长(图24)。
实施例29
多价抗GPVI抗体的制备和抗原结合活性
29-1  IgM型抗GPVI抗体表达质粒的制备
1)人μ链恒定区基因的克隆
以HeLa基因组DNA为模板，用引物对(IgM-b和IgM-c)扩增Cμ1区，用引物对(IgM-d和IgM-e)扩增Cμ2区，用引物对(IgM-f和IgM-g)扩增Cμ3区，用引物对(IgM-h和IgM-j)扩增Cμ4区。将各扩增产物混合，作为模板，用引物对(Nae-IgM和IgM-j)再次进行PCR，扩增各区连接在一起的基因片段，TA克隆到pT7-Blue(T)载体中。分析序列，确认为编码人μ链恒定区的基因序列，制成了pT7-IgM(Nae I)。
IgM-b   GGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT(SEQ ID NO.293)
IgM-c   GCAGCTCGGCAATCACTGGAAGAGGCACGT(SEQ ID NO.294)
IgM-d   ACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCCGAGCTGC(SEQ ID NO.295)
IgM-e   TGGCTGTGTCTTGATCGGGGCCACACATGG(SEQ ID NO.296)
IgM-f   CCATGTGTGGCCCCGATCAAGACACAGCCA(SEQ ID NO.297)
IgM-g   TGTGCAGGGCCACCCCCTTGGGCCGGGAGA(SEQ ID NO.298)
IgM-h   TCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACA(SEQ ID NO.299)
IgM-j   GTTGACACGGTTAGTTTGCATGCA(SEQ ID NO.300)
Nae-IgM GCCGGCAGTGCATCCGCCCCAACC(SEQ ID NO.301)
2)嵌合IgM型F1232-37-2表达质粒的构建
首先，将pTK2510(实施例16记载的cF1232-37-2的IgG4型重链表达质粒)用Bam HI和Aor 51HI切断，除去编码γ4链的恒定区的基因片段，得到残留的载体片段(包含表达用EF-1α启动子和cF1232-37-2的可变区)。将pT7-IgM(Nae I)用Bam HI和Nae I切断、得到编码μ链恒定区的基因片段，将其插入到上述载体片段中，构建将cF1232-37-2恒定区的γ4链置换为μ链的嵌合IgM型F1232-37-2表达质粒(pTK-2820)。按照同样的方法，由cF1232-43-3的IgG4型重链表达质粒(pTK-2504)构建嵌合IgM型F1232-43-3表达质粒(pTK-2822)。
3)人J链的克隆和表达质粒的构建
以HeLa基因组DNA为模板，用引物对(IgJ-a和IgJ-d)扩增第1外显子片段，用引物对(IgJ-c和IgJ-f)扩增第2外显子片段，用引物对(IgJ-e和IgJ-h)扩增第3外显子片段，用引物对(IgJ-g和IgJ-j)扩增第4外显子片段。将各基因片段混合，作为模板，用引物对(IgJ-b和IgJ-i)再次进行PCR，得到各区域连接在一起的基因片段，TA克隆到pT7-Blue(T)载体中。分析序列，确认为编码人J链的基因序列，为pT7-IgJ。将pT7-IgJ用Xba I和Bam HI切断，得到编码J链的基因片段，然后插入到位于表达载体(pEF2cew)的EF-1α启动子下游的XbaI和Bam HI位点，构建人J链表达质粒(pTK-2393)。
IgJ-a  CACTCCTTATAGATCACACACCT(SEQ ID NO.302)
IgJ-b  AAGTGAAGTCAAGATGAAGAACC(SEQ ID NO.303)
IgJ-c  CTGTTCATGTGAAAGCCCAAGAAGATGAAA(SEQ ID NO.304)
IgJ-d  TTTCATCTTCTTGGGCTTTCACATGAACAG(SEQ ID NO.305)
IgJ-e  AAACATCCGAATTATTGTTCCTCTGAACAA(SEQ ID NO.306)
IgJ-f  TTGTTCAGAGGAACAATAATTCGGATGTTT(SEQ ID NO.307)
IgJ-g  CCATTTGTCTGACCTCTGTAAAAAATGTGA(SEQ ID NO.308)
IgJ-h  TCACATTTTTTACAGAGGTCAGACAAATGG(SEQ IDNO.309)
IgJ-i  TTAGTCAGGATAGCAGGCATCTG(SEQ ID NO.310)
IgJ-j  AGAGCTATGCAGTCAGC(SEQ ID NO.311)
29-2  IgM型小鼠/人嵌合抗GPVI抗体的制备
将上述29-1中制备的表达质粒与转染试剂(FuGENE6、ロシユダイアグノステイツクス)适量混合，将该混合液滴加到COS细胞培养系统中，进行转染，进行嵌合抗体的暂时性表达。小鼠/人嵌合F1232-37-2的IgM型(以下简称为cF1232-37-2(IgM))的表达是通过重链表达质粒pTK-2820、轻链表达质粒pTK-2474和J链质粒pTK2393的共转染进行，小鼠/人嵌合F1232-43-3的IgM型(以下简称为cF1232-43-3(IgM))的表达是通过重链表达质粒pTK-2822、轻链表达质粒pTK-2514和J链质粒pTK2393的共转染进行。
转染后，在5％CO2-95％空气下、在37℃下培养3天，将该培养上清用60％硫酸铵进行盐析、浓缩，然后通过蛋白L柱(ImmunoPureImmobilized ProteinL、PIERCE)的亲和层析进行纯化。
29-3  IgM型小鼠/人嵌合抗GPVI抗体的抗原结合活性确认
向固定hGPVI-hFc的免疫板(按照实施例2等的方法制备)的各孔中添加cF1232-37-2(IgM)和cF1232-43-3(IgM)，在37℃下反应1小时。用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗，然后将过氧化物酶标记抗人μ链抗体(DAKO，P0322)用含有10％兔血清的D-PBS稀释为2000倍，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时，通过TMB底物进行显色反应，通过板分光光度计(Molecular Devices、Wako)测定450nm的吸光度。结果，确认了cF1232-37-2(IgM)和cF1232-43-3(IgM)两种抗体均与hGPVI-hFc结合。
由实施例18的18-1的方法制备的食蟹猴和人PRP用FACS缓冲液稀释，使血小板浓度为3.75×108细胞/mL。向稀释的PRP中添加上述29-2中制备的cF1232-37-2(IgM)或cF1232-43-3(IgM)，使终浓度为3或4μg/mL，在25℃下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板。接着，添加抗人IgM-FITC(BD Biosciences Pharmingen)，在室温下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板，通过流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度。结果，确认了cF1232-37-2(IgM)和cF1232-43-3(IgM)两种抗体均与食蟹猴和人血小板结合。
实施例30
抗GPVI抗体诱导血小板GPVI抗原消失的作用的确认(体外)
按照实施例18的18-1的方法，由猴全血制备富血小板血浆(PRP)。向制备的PRP中添加ACD-A(酸性枸橼酸盐葡萄糖)，调节至pH为6.5。制备后，以2000 rpm进行离心，使血小板沉淀，然后用HEPES缓冲液(通过ACD-A调节至pH6.5)清洗血小板。然后适量添加HEPES缓冲液(pH7.4)，悬浮血小板。通过Sysmex测定制备的清洗干净的血小板数。
将清洗的血小板加入到微管中，使其浓度为1.5×107PLT/管，向其中分别添加2μL 10mM CaCl2和10mM MgCl2，用PBS定容为18μL。添加2μL 5.0μg/mL Convulxin、cF1232-37-2、cF1249-22-1、cF1249-24-1、cF1249-18-2(各浓度为1mg/mL)并混合，在室温下反应1小时。反应后添加10μL 10mM EDTA，中止反应，然后在15000rpm下、室温下离心1分钟，分离上清与沉淀，向各组分中加入样品缓冲液，在99℃下进行5分钟热处理。将该样品在-30℃下保存，在使用之前解冻使用。
按照实施例20的方法进行SDS-PAGE、蛋白质印迹，进行各样品中GPVI的检测。结果如图25所示，在添加Convulxin组中，反应后的上清中检测出了GPVI抗原，但在添加cF1232-37-2、cF1249-22-1、cF1249-24-1和cF1249-18-2的组中，上清中未检测出GPVI抗原，所评价的抗GPVI抗体未引发GPVI抗原的释放。
实施例31
PEG化抗GPVI抗体的制备和抗原结合活性
31-1  F1232-37-2抗体的PEG化
为了制备F1232-37-2的PEG化抗体，使具有琥珀酰亚胺基的20KD的直链状PEG(NEKTAR)与纯化F1232-37-2反应。即，将纯化F1232-37-2加入到PBS(pH7.4)的缓冲液中，添加抗体∶PEG＝1∶10(摩尔比)，在37℃下反应1小时。
接着进行PEG化抗体的纯化。为了分离未修饰的抗体和PEG化抗体，将进行了PEG化处理的抗体供给阴离子交换柱Q琼脂糖HP(Amersham)。在丙烯酰胺凝胶上分析纯度，进行评价(图26)，以牛IgG为标准品，通过Bradford法(Bio-Rad)计算抗体浓度。
31-2  F1232-37-2Fab抗体的PEG化
为了制备F1232-37-2Fab抗体的PEG化抗体，与上述方法同样地对由实施例21的21-2制备的F1232-37-2Fab抗体进行PEG化。
接着，使用Superdex75(Amersham)进行PEG化的Fab抗体的纯化。在丙烯酰胺凝胶上分析纯度，进行评价(图26)，以牛IgG为标准品，通过Bradford法(Bio-Rad)计算抗体浓度。
31-3  F1232-37-2抗体的抗原结合活性
通过ELISA确认与抗原的结合活性。向固定hGPVI-hFc的免疫板(按照实施例2等的方法制备)的各孔中添加调节成相同浓度的F1232-37-2和F1232-37-2的PEG化抗体，在37℃下反应1小时。用含有0.05％吐温-20的生理盐水清洗，将过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO，P260)用含有10％兔血清的D-PBS稀释为1000倍，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时，然后通过TMB底物进行显色反应，通过板分光光度计(Molecular Devices、Wako)测定450nm下的吸光度。结果表明：F1232-37-2和F1232-37-2的PEG化抗体具有大致同等的结合活性(图27)。
实施例32
抗GPVI抗体的抗体库基因分析
考虑到实施例9和实施例15的抗GPVI单克隆抗体的序列来自多种固定的抗体基因，可以了解到其具有识别人GPVI环9的抗体库选择性特征。抗体基因由种系抗体基因片段(重链的H、D和J，以及轻链的V和J)的组合构成，更多的情况下伴随体细胞突变形成(参照Immunoglobulin Genes 2nd eds.T.Honjo和F.W.Alt，Academic Press，1995等)。因此，以这些抗体的重链可变区的核酸碱基序列和轻链可变区的核酸碱基序列作为查询序列(Query sequence)，以NCBI(国际生物技术信息中心)的Ig种系V基因的数据库作为对象，进行Ig-BLAST检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。结果如表16所示，各抗体的可变区核酸碱基序列与各特定小鼠的种系抗体重链基因H片段、D片段和J片段(VH、DH和JH片段)、以及抗体轻链基因V片段和J片段(VL和JL)显示很高的一致率(Identity％)。表16中，对于各克隆，按照得分高低顺序记载了最高的三个片段。它们的任意一个都可以推定是构成来自各抗体基因的种系抗体基因的片段，其中，对于各克隆，来自由第一行表示的各片段的组合构成的基因的可能性最高。
Figure BDA00001982169100941
Figure BDA00001982169100951
Figure BDA00001982169100961
实施例33
大鼠GPVI基因的克隆
大鼠GPVI基因首先是根据公知的小鼠GPVI基因的信息设计可分别扩增全部外显子的引物(6对)。使用该引物，以大鼠基因组DNA为模板进行PCR，对特异性扩增的基因片段进行测序，连接，由此推定了大鼠GPVI基因序列。接着，根据该序列信息重新设计大鼠GPVI用引物(大鼠GPVI-#a，mGPVI-m)，以来自大鼠骨髓的cDNA(使用低聚dT引物对来自大鼠骨髓的RNA进行反转录合成)为模板进行PCR，扩增全长基因。由凝胶中提取扩增产物，TA克隆到pT7-Blue(T)载体(タカテバイオ)中，然后确定碱基序列。将具有该序列的质粒称为pTK-2478。图28表示大鼠GPVI基因的碱基序列(SEQ ID NO.312)和所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.313)。
表17
Figure BDA00001982169100971
实施例34
大鼠GPVI(D1D2)小鼠GPVI(D3)-小鼠Fc融合蛋白(rGPVI-mFc)等的 制备
rGPVI-hFc融合蛋白表达质粒的构建
以pTK-2478为模板，通过引物对(大鼠GPVI-#a和大鼠GPVI-#t)进行PCR，扩增编码大鼠GPVI的D1和D2(GPVI的胞外区的结构域1和结构域2)的基因片段A。同样以pTK-2440(MD0754JPP05-0268记载于日本特愿2005-348534中)为模板，通过引物对(大鼠GPVI-#s和IgG1-i)进行PCR，扩增编码小鼠GPVI的D3(GPVI胞外结构域，D1和D2以外的区域)的基因片段B。接着，将A和B混合作为模板，通过引物对(大鼠GPVI-#a和IgG1-i)重新进行PCR，得到大鼠GPVI(D1和D2)和小鼠GPVI(D3)连接在一起的基因片段C。将该片段C的5’一侧用Eco RI、3’一侧用Bam HI切断，然后将小鼠Fc区域(mFc)插入到在EF启动子下游具有的质粒(pTK-2299：MD0754JP05-0268记载于日本特愿2005-348534中)的Eco RI和Bam HI位点，构建可以表达rGPVI-mFc融合蛋白的pTK-2483。
表18
Figure BDA00001982169100981
根据公知的人GPVI和小鼠GPVI序列、图1的大鼠GPVI序列、以及人和大鼠GPVI的氨基酸序列的比对(图3)、或人和小鼠GPVI氨基酸序列的比对(图1)所示的各环的氨基酸序列，参考公知的方法(参照WO01/810、WO03/54020、WO2005/7800等)，用与实施例1或实施例33同样的方法制备将mFc置换为hFc的大鼠GPVI-人Fc(rGPVI-hFc)、小鼠GPVI-人Fc(mGPVI-hFc)、人GPVI-人Fc(hGPVI-hFc)、rGPVI-hL2，5-hFc(rGPVI-hFc的环2、5用hGPVI的对应序列置换得到的GPVI突变蛋白)、rGPVI-hL9，11-hFc(rGPVI-hFc的环9、11用hGPVI的对应序列置换得到的GPVI突变体蛋白)以及hGPVI-mL9-hFc(hGPVI-hFc的环9用小鼠GPVI的对应序列置换得到的GPVI突变体蛋白)的各表达质粒。
实施例35
rGPVI-mFc融合蛋白的表达和纯化
使用rGPVI-mFc融合蛋白表达质粒pTK-2483，按照与实施例1同样的方法转染COS-1细胞。3天后回收培养上清，通过蛋白A柱(Prosep-vA、MILLIPORE)层析纯化rGPVI-mFc融合蛋白。将所得的rGPVI-mFc按照规定方法用SDS-PAGE进行分析(图29)。
对rGPVI-hFc、mGPVI-hFc、hGPVI-hFc、rGPVI-hL2，5-hFc、rGPVI-hL9，11-hFc及びhGPVI-mL9-hFc也同样地表达和纯化。
实施例36
抗大鼠GPVI单克隆抗体的制备
将12.5μL Alum(PIERCE)和1mg CpG佐剂与20μg纯化大鼠GPVI-mFc融合蛋白混合，制成100μL，作为给予抗原，分别以各25μL给予ddY小鼠(雌性，8周龄，SLC)的两足足垫(foot pad)内。3天后从髂骨淋巴结分离淋巴细胞，按照与实施例2的方法同样的方法进行细胞融合和杂交瘤的筛选。再选择与纯化大鼠GPVI-hFc蛋白反应的细胞，通过极限稀释法进行克隆。11天后同样地进行筛选，得到了产生与纯化大鼠GPVI-hFc蛋白反应的抗体的克隆17克隆(表19)。
按照与实施例2的方法同样的方法，对这些杂交瘤克隆所产生的抗大鼠GPVI抗体进行纯化。
表19
Figure BDA00001982169101001
实施例37
抗大鼠GPVI抗体的识别区域的分析
按照与实施例7的方法同样的方法对实施例36所得的抗大鼠GPVI单克隆抗体识别结构域进行分析。即，将实施例36中纯化的单克隆抗体分别与rGPVI-hFc、hGPVI-hFc、rGPVI-hL2，5-hFc(将rGPVI-hFc的环2，5置换为hGPVI的序列得到的蛋白)、或者GPVI-hL9，11-hFc(将rGPVI-hFc の环9，11置换为hGPVI的序列所得的蛋白)混合，添加到固定rGPVI-hFc的免疫板上，研究其反应性。结果证明，存在一种添加rGPVI-hL2，5-hFc时吸光度不降低的抗体、即识别环2和/或环5的抗体(F1239-11-1)，还存在三种添加rGPVI-hL9，11-hFc时吸光度不降低的抗体、即识别环9和/或环11的抗体(F1239-4-2、F1239-6-1、F1239-22-2)(图30)。
上述三种抗体(F1239-4-2、F1239-6-1、F1239-22-2)在同样的方法中不与小鼠GPVI-Fc结合。同时考虑到大鼠GPVI与小鼠GPVI的环11的氨基酸序列相同，由此，难以认为环11是重要的识别区域，可以推定上述抗体识别至少含有大鼠GPVI的环9的一部分的结构。
实施例38
抗大鼠GPVI抗体与大鼠血小板的结合能力
将由大鼠腹部主动脉采血的含枸橼酸血以110×g、25℃、10分钟离心，得到富血小板血浆(PRP)。接着，将得到的PRP用含有0.5％热灭活FBS和2.5mM EDTA的PBS(以下称为FACS缓冲液)稀释，添加实施例36中制备的抗大鼠GPVI单克隆抗体(F1239-6-1)，然后在25℃下静置30分钟。30分钟后用FACS缓冲液清洗血小板，然后添加抗小鼠免疫球蛋白抗体-FITC(DAKO)，在25℃下、避光下静置30分钟。30分钟后用FACS缓冲液清洗血小板，然后用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度，由此对抗大鼠GPVI单克隆抗体的结合进行分析。结果显示，F1239-6-1与大鼠血小板结合(图31)。
实施例39
抗大鼠GPVI抗体对血小板的作用
制备正常Wistar大鼠PRP，以CD62P的表达量作为指标，在添加终浓度为1-100μg/mL的F1239-6-1的条件下，按照与实施例18的方法同样的方法，通过FACS对与抗大鼠GPVI抗体F1239-6-1的大鼠血小板活化作用进行评价。大鼠CD62P的检测使用抗大鼠CD62P-PE(Biocytex)。F1239-6-1在各浓度下均不活化大鼠血小板。
实施例40
抗大鼠GPVI抗体的抑制血小板聚集的作用和诱导GPVI消失的作用
以0.01-1mg/kg的用量对雄性SD大鼠皮下给予实施例36中制备的抗大鼠GPVI单克隆抗体。给予6天后采血，以730rpm进行离心，制备富血小板血浆(PRP)。血小板聚集能力(对胶原蛋白和ADP的反应性)是使用血小板聚集测定装置(MCM HEMA TRACER313M、エム·シ-·メデイカル)测定。即，使用由同一大鼠取得的血浆进行稀释，使PRP的血小板数为3×105细胞/μL，然后添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，在37℃下温育3分钟。再添加终浓度为10μg/mL的胶原蛋白溶液或终浓度为20μM的ADP溶液，在37℃下温育12分钟。血小板聚集率通过测定光的透射率求出。结果，在由给予了F1239-6-1(0.3mg/kg)的大鼠采血制备的PRP中，胶原蛋白引发的血小板聚集能力显著降低，但ADP引发的血小板的聚集不受影响(图32)。
将血小板GPVI通过蛋白质印迹法进行分析，结果表明，给予抗大鼠GPVI单克隆抗体3、6和9天后，GPVI蛋白的表达量显著减少，该抗体使GPVI从血小板上消失的作用得到验证(图33)。
实施例41
抗大鼠GPVI抗体对于胶原蛋白致死模型的作用
以0.1、0.3或1mg/kg的用量对雄性SD大鼠皮下给予实施例36中制备的抗大鼠GPVI单克隆抗体F1239-6-1。作为对照，皮下给予等量的生理盐水。给予6天后，以0.8mg/kg的用量静脉内迅速给予胶原蛋白溶液(コラ-ゲンリエ-ジエント“ホルム”(NYCOMED))，然后最多观察15分钟。以呼吸运动停止判定为死亡。以给予后至死亡的时间(分钟)作为存活时间，对于15分钟后仍存活的例子将存活时间定为15分钟。求出各个给予组的死亡数/例数，通过χ2检验(Yukum’s stat light)，检验与生理盐水给予组的差异。每组计算存活时间的平均值和SEM，通过Dunnett的方法(非参数，Yukum’s stat light)检验与生理盐水给予组的平均值的差。结果，F1239-6-1在胶原蛋白致死模型中以0.3mg/kg以上的用量显示有效性(图34)。
实施例42
抗大鼠GPVI抗体抑制麻醉下大鼠动脉血栓模型的血小板聚集的作用
以0.1或0.3mg/kg的用量对雄性SD大鼠皮下给予实施例36中制备的抗大鼠GPVI单克隆抗体F1239-6-1。皮下给予等量的生理盐水作为对照。给予6天后施行氨基甲酸酯麻醉，然后在体温保持装置(BWT-100，バイオリサ-チセンタ-)上以仰卧位固定。将颈部由正中切开，使右颈动脉暴露约1cm，将脉冲多普勒血流量计(型号：PD-20，系统：VF-1，CRYSTAL BIOTEC，プライムテツク)的探针(DBF-10S，同上)安装在颈动脉上，通过多种波动描记装置(365，NEC三荣)在描图纸上记录血流速度。在探针的末梢一侧，将钩针状的双极电极搭在颈动脉上，由电刺激装置(SEN-7103，日本光电)通0.3mA直流电3分钟。用计时表计测从通电开始至血流停止的时间(最长40分钟)。另外，通过数字温度计每隔5分钟计测刺激电极的下游一侧颈动脉的表面温度并记录。按每组计算至血流停止的时间的平均值和SE，通过Dunnett的方法(非参数，Yukum’s stat light)检验与生理盐水给予组的平均值的差。分组统计颈动脉表面温度与直肠温度的差，计算平均值和SE，通过Dunnett的方法(参数，同上)检验各时间点的差异。结果，在抗体给予组中可见用量相关性的动脉闭塞时间延长，0.3mg/kg组与对照组相比可见显著差异(图35)。在颈动脉表面温度的测量中，通电开始15分钟时可见抗体给予组的两组与对照组有显著差异，在20、25和35分钟后，在0.3mg/kg给予组中可见与对照组的显著差异。由以上结果显示，在该模型中，F1239-6-1以0.3mg/kg的用量显示有效性。
实施例43
对CypHer5E标记抗GPVI抗体的分析
使用pH感受性荧光试剂CypHer5E Mono NHS Ester(GEヘルスケアバイオサイエンス)，按照所附的说明书对cF1232-37-2/CHO和作为对照的人IgG4(Calbiochem)进行CypHer5E标记。同样，使用Proset rA(Millipore)从F1239-6-1及其作为对照的正常小鼠血浆中对纯化的小鼠IgG进行CypHer5E标记。各标记抗体的浓度由吸光度测定的结果计算。
43-1  CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO的抗原结合活性
与实施例31-3的方法同样，对hGPVI-hFc，评价未标记和CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO与人GPVI的结合活性。结合检测中，使用用含有0.1％BSA的D-PBS稀释2000倍的人免疫球蛋白κ链抗体(Dako)。结果，CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO与未标记的cF1232-37-2/CHO具有几乎同等的结合活性(图36)。
43-2  使用CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO进行的体外内化评价
将通过实施例18-1的方法制备的猴PRP用PPP稀释，使血小板的浓度为3.7×108细胞/mL。向稀释的PRP中添加CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO或CypHer5E标记人IgG4，使终浓度为50或70μg/mL，在室温下、避光状态下反应1小时。将反应后的试样立即用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)进行测定，评价在血小板中内化的来自CypHer5E标记抗体的荧光强度。在添加CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO的血小板中，观察到来自添加抗体的明确的荧光，但在CypHer5E标记的人IgG4的血小板中，只观察到了与只添加缓冲液的血小板同等程度的荧光。由该结果可以认为，CypHer5E标记cF1232-37-2/CHO在血小板中被内化(图37)。
43-3  CypHer5E标记F1239-6-1的抗原结合活性评价
按照与实施例3的方法同样的方法制备过氧化物酶标记F1239-6-1，通过添加该标记抗体与固相化rGPVI-hFc的结合反应系统所对应的小鼠抗体的竞争法(实施例3的方法)，对过氧化物酶标记F1239-6-1所对应的未标记和CypHer5E标记F1239-6-1对大鼠GPVI的结合活性进行比较。
结果，CypHer5E标记F1239-6-1与未标记F1239-6-1具有几乎同等的结合活性(图38)。
43-4  使用CypHer5E标记F1239-6-1进行的体外内
向用PPP稀释调节至3.7×108细胞/mL的大鼠PRP中添加CypHer5E标记F1239-6-1或CypHer5E标记小鼠IgG，使终浓度为65或75μg/mL，在室温、避光状态下反应1小时。将反应后的试样立即通过流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)进行测定，评价血小板中内化的来自CypHer5E标记抗体的荧光强度。添加了CypHer5E标记F1239-6-1的血小板中，可观察到来自添加抗体的明确的荧光，但在添加了CypHer5E标记小鼠IgG的血小板中，只观察到与只添加缓冲液的血小板同等程度的荧光。由该结果可以认为，CypHer5E标记F1239-6-1在血小板中内化(图39)。
43-5  使用CypHer5E标记F1239-6-1进行的体内内化评价
将CypHer5E标记F1239-6-1或CypHer5E标记小鼠IgG以0.2mg/kg静脉内给予Wistar大鼠，在给予前和给予3小时后实施100μL含枸橼酸血的采血。采集的血液用2.5mM EDTA/PBS稀释，通过流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定，评价血小板中内化的来自CypHer5E标记抗体的荧光强度。另外，相对于1μL采血，添加相当于0.8μg的PE标记F1239-11-1，在室温、避光下静置30分钟。作为PE标记F1239-11-1的同种型对照，还同时制备等量添加PE标记小鼠IgG2aκ抗体的试样。30分钟后，将用2.5mMEDTA/PBS稀释的试样通过流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定荧光强度，对血小板细胞膜表面上的GPVI表达量进行分析。血小板的判定是由前方散射光/侧向散射光的绘图判断。分析中，PE标记小鼠IgG2aκ抗体的检测结果值视为非特异性结合，由PE标记F1239-11-1检测结果值减去上述PE标记小鼠IgG2aκ抗体的检测结果值，计算GPVI表达量变化。在给予CypHer5E标记F1239-6-1中，可观察到来自内化的抗体的明确的荧光强度增加，但如果给予CypHer5E标记小鼠IgG，则未观察到荧光强度增加。另外，血小板细胞膜表面上的GPVI表达量与给予前相比，在给予CypHer5E标记F1239-6-1后大幅减少，在给予CypHer5E标记小鼠IgG后则减少很少。该结果可以认为，CypHer5E标记F1239-6-1与血小板膜表面上的GPVI一起在血小板中内化(图40)。
实施例44
cF1232-37-2S表达质粒的构建
为了使通常的二价抗体cF1232-37-2以含有各一条H链和L链的一价抗体(记载为“cF1232-37-2S”)的形式表达，将重链的绞链部分的两个半胱氨酸残基置换为甘氨酸残基。具体来说，首先，以cF1232-37-2重链表达质粒pTK-2571(实施例25中记载)为模板，通过引物对(IgG4-s，IgG4-m)和(IgG4-r，pEF2ce-27)进行PCR反应。使用少量各反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在确认了各扩增产物为目标片段之后，将两种反应产物混合作为模板，通过引物对(IgG4-m，pEF2ce-27)再次进行PCR反应。在确认了该反应产物为目标片段后，通过凝胶过滤柱进行脱盐处理，通过限制酶Nhe I和Bam HI进行双消化。将消化的产物供给琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中提取目标片段，以此作为片段A。同样，制备实施了限制酶Nhe I和Bam HI双消化处理的pTK-2571的载体部分，作为片段B。将片段A和片段B混合，然后通过连接酶进行连接反应，构建目标cF1232-37-2S重链表达质粒，以此作为pTK-2828。另外，轻链表达质粒pTK-2572没有变更，直接用于表达实验。
IgG4-s    5’GGTGCTGGGCCTGATGGGCCTGGGGGACCA 3’(SEQ ID NO.331)
IgG4-m    5’AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC 3’(SEQ ID NO.332)
IgG4-r    5’TGGTCCCCCAGGCCCATCAGGCCCAGCACC 3’(SEQ ID NO.333)
pEF2ce-27 5’CATCAATGTATCTTATCATGTCT 3’(SEQ ID NO.334)
实施例45
cF1232-37-2S/COS的制备
使用在实施例44中制备的cF1232-37-2S表达质粒pTK-2828，按照与实施例1同样的方法转染COS细胞。分别使用具有0.8μm孔径的capsule cartridge fiter(东洋滤纸株式会社)作为预滤器、具有0.22μm孔径的フルオロダインfilter(PALL)作为正式滤器，在室温下，将得到的含有基因重组F1232-37-2S抗体的COS细胞培养液澄清，得到培养上清。将该培养上清吸附于预先用PBS-(Sigma)平衡的rmpProtein A Sepharose Fast Flow(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)，用PBS-清洗未吸附的蛋白质，将非特异性吸附的蛋白质用含有1.5mM NaCl的100mM磷酸缓冲液洗脱，然后将特异性结合的抗体用100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.7)洗脱。测定洗脱液容量，立即添加1/10容量的1M Tris-HCl(pH8.5)，使pH恢复至中性。将所得标准品用0.9％NaCl水溶液透析，得到cF1232-37-2S/COS纯化标准品。
实施例46
cF1232-37-2S/COS与血小板的结合反应性
将按照实施例18-1的方法制备的食蟹猴和人PRP用FACS缓冲液稀释，使血小板浓度为3.75×108细胞/mL。向稀释的PRP中添加实施例45中制备的cF1232-37-2S/COS，使终浓度为10μg/mL，在25℃下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板。接着添加抗人IgG-FITC(Dako)，在避光下、25℃下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板，用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMANCOULTER)测定血小板的荧光强度。结果确认cF1232-37-2S/COS与食蟹猴和人血小板结合。
实施例47
cF1232-37-2S/COS 对血小板的作用
47-1  cF1232-37-2S/COS对人血小板和食蟹猴血小板的活化作用
按照实施例18-1的方法，在存在终浓度1mM的CaCl2的条件下，以CD62P的表达量作为指标，在向反应液中添加终浓度为1-100μg/mL的cF1232-37-2S/COS的条件下评价cF1232-37-2S/COS对食蟹猴和人血小板的活化作用。
cF1232-37-2S/COS在任何浓度下均不活化人血小板或食蟹猴血小板(图41)。
47-2  cF1232-37-2S的抑制胶原蛋白引发的血小板聚集的作用(体外)
将食蟹猴PRP用PPP稀释，使血小板浓度为3.33×108细胞/mL，然后添加终浓度为1-100μg/mL的cF1232-37-2S，在37℃下温育5分钟。向其中添加终浓度为1mM的CaCl2溶液，再在37℃下温育3分钟，然后添加终浓度为1μg/mL的胶原蛋白溶液，通过在37℃下温育12分钟求出胶原蛋白应答性的血小板聚集。
cF1232-37-2S以100μg/mL的浓度抑制胶原蛋白引发的人血小板的聚集(图42)。
47-3  cF1232-37-2S的食蟹猴ex vivo试验-胶原蛋白引发的血小板 聚集能力-
以3mg/kg向食蟹猴(雄性、约4kg)静脉内给予cF1239-37-2S/COS。给予后采集血小板，研究该血小板的聚集能力。结果，在以3mg/kg静脉内给予cF1239-37-2S的动物中，在给予后6小时以内，对胶原蛋白的应答性降低，其作用持续了2天以上(图43)。
实施例48
F1239-6-1的Fab和PEG化F1239-6-1Fab
48-1  F1239-6-1的Fab的制备
为了制备F1239-6-1的Fab，通过金属内肽酶对纯化F1239-6-1进行处理。即，将纯化F1239-6-1更换到PBS(pH7.4)缓冲液中，添加金属内肽酶，使抗体∶酶＝3000∶1(重量比)，在25℃下反应4小时。反应结束时添加EDTA，使终浓度为30mM。
接着，按照与实施例21-2同样的方法对其进行Fab的纯化和分析。
48-2  F1239-6-1Fab抗体的PEG修饰
为了制备F1239-6-1Fab抗体的PEG化抗体，按照与实施例31-1同样的方法进行上述得到的F1239-6-1Fab抗体。
接着进行PEG化抗体的纯化。为了分离未修饰的抗体和PEG化抗体，将进行了PEG化处理的抗体供给疏水层析Macro-Prep MethylHIC(Bio-Rad)。在丙烯酰胺凝胶上分析纯度进行评价，使用牛IgG作为标准品，通过Bradford法(Bio-Rad)计算抗体浓度。
48-3  PEG化F1239-6-1Fab的结合活性的确认
按照与实施例2的方法同样的方法，通过ELISA法确认F1239-6-1Fab的PEG化抗体与大鼠GPVI的结合活性。结果，F1239-6-1Fab抗体和F1239-6-1Fab的PEG化抗体具有几乎同等的结合活性(图44)。
48-4  PEG化F1239-6-1Fab与食蟹猴和人血小板的结合的确认
在用FACS缓冲液稀释为2.0×108细胞/mL的大鼠PRP中添加实施例48-1、48-2中制备的PEG化F1239-6-1Fab，使终浓度为38μg/mL，在25℃下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板。接着，添加抗小鼠Igs-FITC(Dako)，在避光下、25℃下静置30分钟，然后用FACS缓冲液清洗血小板，用流式细胞仪CYTOMICS FC500(BECKMAN COULTER)测定血小板的荧光强度。结果可以确认PEG化F1239-6-1Fab与大鼠血小板结合。
实施例49
食蟹猴出血时间测定(3)高给予量给予
在测定出血时间时，首先测定食蟹猴的体重，然后确认血液学的参数、凝固系统参数、血小板功能没有异常，皮下给予3.0mg/kg或10mg/kg的cF1232-37-2/CHO，在48小时后按照与实施例28的方法同样的方法测定出血时间。
在给予cF1232-37-2/CHO的动物中，与给予前相比，未见2倍以上出血时间的延长(图45)。
实施例50
大鼠出血时间测定试验
按照体重均匀地分组，对未绝食的SD大鼠(雄性、Crj：CD(SD)IGS，8周)以1mL/kg的容量皮下给予0.3-3mg/kg的F1239-6-1或生理盐水。给予6天后，在切创操作前15分钟时，通过腹腔内给予戊巴比妥(50mg/kg，1mL/kg)进行麻醉。在距离尾部先端5-6cm的背侧，用剃刀避开动脉和静脉制备切创口。将尾的先端12cm下垂，在制作的切创口处以30秒的间隔用滤纸(ADVANTEC，1×3cm)吸附血液，测定直至血液不附着的时间，以此作为出血时间。
对于给予抗体的动物，在任何用量下与给予生理盐水组相比，出血时间并未延长至2倍以上(图46)。作为阳性对照使用的氯吡格雷试验组中，在口服给予后2小时时，在给予了10mg/kg以上的动物中，出血时间延长至5倍以上。氯吡格雷给予组中，在给予后2小时时，给予10mg/kg以上的动物的血小板对胶原蛋白的应答性降低，给予30mg/kg的动物的血小板对胶原蛋白和ADP的应答性降低，在上述中使用的用量均可以认为是通常所使用的有效用量的范围。
实施例追加51
[ 125 I]标记cF1232-37-2/CHO的制备
使用实施例25中制备的cF1232-37-2/CHO，制备[125I]标记cF1232-37-2/CHO。即，将cF1232-37-2/CHO与N-琥珀酰亚氨基-3-(4-羟基-3-[125I]碘苯基)丙酸酯([125I]-Bolton-Hunter试剂-一碘化物)反应，通过凝胶过滤色谱纯化，得到标记抗体。所得标记抗体可通过实施例2的EIA法计算浓度。
实施例52
cF1232-37-2/CHO对人血小板和猴血小板的解离常数的测定
解离常数根据同源竞争结合法计算。即，将清洗后的血小板与一定量的标记抗体和可变量的cF1232-37-2/CHO(未标记抗体)反应，然后测定与血小板结合的标记抗体量，根据添加的标记抗体量和未标记抗体量计算cF1232-37-2/CHO对血小板的解离常数和单位血小板与抗体的最大结合数。各参数的计算采用以下算式。
·总结合量＝Bmax×[Hot]÷([Hot]+[Cold]+KD)+NS
·总结合量：单位血小板与标记抗体的结合数
·Bmax：单位血小板与抗体最大结合数
·[Hot]：标记抗体浓度(M)
·[Cold]：未标记抗体浓度(M)
·KD：解离常数(M)
·NS：单位血小板的非特异结合抗体数
在由从正常人或食蟹猴采血的含枸橼酸血液制备的PRP中添加ACD-A(酸性枸橼酸盐葡萄糖)，调节为pH6.5。将该血小板以2000rpm进行离心，沉淀，然后用HEPES缓冲液(用ACD-A调节为pH6.5)清洗。然后添加适量的HEPES缓冲液(pH7.4)，悬浮血小板，制备清洗的血小板。通过Sysmex F-820(シスメツクス株式会社)测定血小板数，然后用HEPES缓冲液(pH7.4)稀释，使血小板数为6×105细胞/μL。
将稀释的清洗血小板与终浓度为3nM的标记抗体和终浓度为0-1250nM的未标记抗体混合，血小板数为3×105细胞/μL。在冰上培育1小时后，在反应液上覆盖30％蔗糖/HEPES缓冲液(pH7.4)，以12000g离心5分钟，将血小板与未结合的抗体分离。将分离的各组分的放射活性通过γ-全自动计数仪1470WIZARD(株式会社パ-キンエルマ-ジヤパン)测定。数据用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.)进行分析。
分析的结果，对于人血小板，KD＝1.7±0.4×10-8(M)，单位血小板与抗体的最大结合数＝925±254(n＝3，数值均为平均值±S.E)。对于猴血小板，KD＝2.0±0.1×10-8(M)，单位血小板与抗体的最大结合数＝1007±64.4(n＝3，平均值±S.E.)。
产业实用性
本发明的抗体、特别对人的疾病、例如由血小板的活化或聚集、或者血管内皮障碍或动脉硬化性反应引发的疾病的预防和/或治疗有效，也可用作起因于血栓或栓塞的疾病、例如血栓、栓塞或动脉硬化性疾病等的预防和/或治疗。通过使用本发明的抗体检测受检试样中的GPVI的方法，可以进行疾病的诊断。特别是可用于人的疾病、例如血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的诊断。
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Claims (14)

1.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与人GPVI结构域2的环9特异性结合。
2.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与SEQ ID NO.147的氨基酸序列所示的人GPVI突变体的结合活性、和与SEQ ID NO.135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的结合活性相比降低至50％以下，上述人GPVI突变体简称hGPVI-mL9-hFc，上述人GPVI-hFc简称GPVI-HHH-hFc。
3.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与人GPVI的结合受到SEQ ID NO.135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的抑制，但未受到SEQ ID NO.147的氨基酸序列所示的人GPVI突变体的抑制，上述人GPVI-hFc简称GPVI-HHH-hFc，上述人GPVI突变体简称hGPVI-mL9-hFc。
4.权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体为嵌合抗体。
5.权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体为人源化抗体。
6.权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的抗原结合价为1价。
7.细胞，该细胞产生权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段。
8.权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段进行了聚乙二醇化，上述聚乙二醇简称PEG。
9.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的制备方法，其特征在于：使用权利要求7所述的细胞。
10.制备抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的方法，所述方法包括培养权利要求7所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段生产细胞的步骤，和收集由该细胞产生的单克隆抗体的步骤。
11.权利要求9或10所述的方法，其中权利要求7所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段生产细胞为含有：包含编码H链可变区域的SEQ ID NO：280的多核苷酸序列和编码L链可变区域的SEQID NO：284的多核苷酸序列的载体，或者包含编码H链可变区域的SEQ ID NO：282的多核苷酸序列和编码L链可变区域的SEQ ID NO：284的多核苷酸序列的载体的细胞。
12.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1～3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段作为有效成分。
13.用于血栓或栓塞的权利要求12所述的药物组合物。
14.筛选与环9特异结合的、抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的方法，其包括以下步骤：
a)测定与人血小板膜糖蛋白VI的结合性的步骤，上述糖蛋白VI简称GPVI，
b)测定使血小板活化的作用或引发生物体内血小板减少的作用的步骤，以及
c)测定通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步骤。
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