ES2923677T3

ES2923677T3 - Novedosos anticuerpos anti-GPVI humanos y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2923677T3
Application number: ES16750775T
Authority: ES
Inventors: Philippe Billiald; Martine Jandrot-Perrus
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13; Universite Paris Saclay; Acticor Biotech SAS; Universite Paris Cite
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13; Universite Paris Saclay; Acticor Biotech SAS; Universite Paris Cite
Priority date: 2015-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2022-09-29
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: BR112018002382A8; BR112018002382A2; WO2017021539A3; SI3331553T1; RU2018107409A3; JP7076082B2; JP2022025033A; WO2017021539A2; CA2994629A1; NZ739560A; US20200384106A1; LT3331553T; CN108289939B; RU2018107409A; HRP20220910T1; IL257323B1; JP7277689B2; IL257323B2; DK3331553T3; EP4091628A1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-GPVI humanos humanizados y usos de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Novedosos anticuerpos anti-GPVI humanos y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a novedosos anticuerpos anti-glicoproteína VI humana y a los usos de los mismos para tratar enfermedades cardiovasculares.

Antecedentes de la invención

Los accidentes coronarios y cerebrovasculares agudos son actualmente una de las principales causas de muerte en el mundo. Además, la incidencia global de recurrencia y muerte en el período posterior al tratamiento de 6 meses después de un síndrome coronario agudo sigue siendo del 8-15%.

En el caso del síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST, el tratamiento mecánico con angioplastia coronaria e introducción de una cánula intraluminal es muy eficaz para restaurar urgentemente el flujo arterial coronario, pero no evita la morbilidad/mortalidad de aproximadamente el 15 % de los pacientes en los próximos 6 meses. Los tratamientos trombolíticos, que se basan en asociaciones de fármacos fibrinolíticos, anticoagulantes y antiagregantes a largo plazo, producen resultados aún menos alentadores. De hecho, a pesar de las mejoras en el tratamiento médico de la trombosis, la morbilidad/mortalidad a los 6 meses es similar a la observada para el síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST.

En cuanto a los accidentes cerebrovasculares isquémicos, los tratamientos son todavía muy limitados debido a la atención generalmente tardía de la mayoría de los pacientes y al riesgo hemorrágico de los tratamientos antitrombóticos actualmente disponibles.

Por lo tanto, todavía existe una necesidad clínica de mejorar los tratamientos para las enfermedades cardiovasculares, y especialmente de nuevas moléculas con características mejoradas en comparación con las moléculas disponibles. El reto a afrontar es obtener moléculas con excelente eficacia sobre la trombosis patológica pero sin riesgo de sangrado.

Para responder a este requisito, el objetivo debe tener un papel más importante en la formación de trombos que se producen en un vaso enfermo que en la hemostasia fisiológica necesaria para limitar el sangrado en un vaso sano. Este es el caso de la glicoproteína VI plaquetaria que se ha demostrado en animales que juega un papel en la trombosis experimental incluyendo accidente cerebrovascular, el remodelado vascular y que es crítica en la aterotrombosis.

A diferencia de los antagonistas de la integrina aIIbp3, que se utilizan actualmente en el tratamiento de la trombosis e inhiben la fase de activación plaquetaria final, es decir, la agregación plaquetaria, y de los antagonistas del reclutamiento de plaquetas (inhibidores del receptor de ADP P2Y12 y aspirina), la GPVl está implicada en varias etapas de la formación del tapón plaquetario: iniciación a través de la interacción con la pared vascular lesionada, amplificación a través de la activación plaquetaria inicial que conduce a la secreción de agonistas secundarios, la activación de integrinas y de actividad procoagulante plaquetaria, crecimiento y estabilización a través de la interacción con fibrina (Mammadova et al., Blood 2015). Por lo tanto, los antagonistas de GPVI pueden prevenir no solo la agregación plaquetaria, sino también la liberación de agonistas secundarios, así como la secreción de factores de crecimiento y citoquinas que dan como resultado el desarrollo de lesiones vasculares. Finalmente, la expresión de GPVI se limita a plaquetas y megacariocitos, y por lo tanto representa una diana perfectamente específica para el tratamiento antitrombosis.

Por lo tanto, se desarrollaron antagonistas de GPVI para tratar enfermedades cardiovasculares.

Los documentos WO 2001/000810 y WO 2003/008454 ambos describen una proteína recombinante GPVI soluble que es una proteína de fusión entre el dominio extracelular de GPVI y un dominio Fc de Ig humana. Esta proteína GPVI recombinante soluble compite con la GPVI plaquetaria por la unión del colágeno. Primero se obtuvieron resultados alentadores con esta proteína GPVI soluble en un modelo murino de trombosis, pero estos resultados no se confirmaron. Además, este enfoque implica desventajas estructurales, funcionales y farmacológicas. Primero, este compuesto es una proteína quimérica de alto peso molecular (~ 160 kDa). GPVI-Fc se dirige al colágeno expuesto en el sitio de la lesión vascular, cuya cantidad y accesibilidad son poco predecibles y, por lo tanto, la cantidad de producto a inyectar constituye una limitación potencial para el uso de GPVI-Fc. Otra limitación podría ser el riesgo de inmunización frente a neoepítopos potencialmente expuestos en la proteína de fusión.

También se describieron en la técnica anticuerpos monoclonales neutralizantes dirigidos contra la GPVI humana.

Por ejemplo, los documentos EP 1224942 y EP 1228768 describen el anticuerpo monoclonal anti-GPVI de rata JAQ1, que se une específicamente a la GPVI de ratón, para el tratamiento de la enfermedad trombótica. El anticuerpo JAQ1 induce la internalización irreversible del receptor de GPVI en plaquetas de ratón.

El documento EP 1538165 describe otro anticuerpo monoclonal anti-GPVI de rata (hGP 5C4), cuyo fragmento Fab demostró tener marcados efectos inhibitorios sobre las principales funciones fisiológicas de las plaquetas inducidas por la estimulación con colágeno: la estimulación de los marcadores de activación fisiológica mediada por colágeno PAC-I y CD62P-Selectina se previno completamente por Fab de 5C4 de hGP, y Fab de 5C4 de hGP inhibió potentemente la agregación plaquetaria humana ex vivo sin ninguna actividad intrínseca. Sin embargo, 5C4 es un anticuerpo de rata y, por lo tanto, solo presenta un potencial terapéutico muy limitado.

El documento WO 2005/111083 describe 4 anticuerpos monoclonales anti-GPVI de ratón OM1, OM2, OM3 y OM4, que se descubrió que inhibían la unión de GPVI al colágeno, la secreción inducida por colágeno y la formación de tromboxano A2 (TXA2) in vitro, tanto como la agregación plaquetaria inducida por colágeno ex vivo después de la inyección intravenosa a monos Cangrejeros. OM4 también parece inhibir la formación de trombos en un modelo de trombosis en ratas.

El documento WO 2001/000810 también describe varios anticuerpos anti-GPVI monoclonales murinos denominados 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, 9O12.2, 7H14.1, y 9E18.2, así como varios fragmentos scFv de anticuerpos de fagos humanos denominados A9, A10, C9, A4, C10, B4, C3 y D11. Se descubrió que algunos de estos anticuerpos y fragmentos scFv inhibían la unión de GPVI al colágeno, incluidos los anticuerpos 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, y 9O12.2, y fragmentos scFv A10, A4, C10, B4, C3 y D11. Además, se encontró que los fragmentos Fab 9O12.2 bloquean completamente la agregación y secreción de plaquetas inducidas por colágeno, bloquean la agregación plaquetaria inducida por fibrina, inhiben la actividad procoagulante de las plaquetas estimuladas con colágeno o estimuladas con fibrina y la adhesión de las plaquetas al colágeno o la fibrina en condiciones estáticas, para deteriorar la adhesión plaquetaria y para prevenir la formación de trombos en condiciones de flujo arterial.

El documento WO 2008/049928 describe un fragmento scFv derivado de 9O12.2, constituido por los dominios VH y VL del anticuerpo monoclonal 9O12.2 unidos a través de un péptido (Gly4Ser)3. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos anti-GPVI actualmente conocidos demostró ser eficaz in vivo para prevenir y/o tratar enfermedades cardiovasculares. En particular, la mayoría de los anticuerpos anti-GPVI que se han reportado no parecían aptos para el desarrollo de un antitrombótico para uso médico en humanos, especialmente debido a su origen animal.

En particular, se ha informado que algunos anticuerpos scFv de fagos humanos dirigidos a la GPVI humana son inhibidores, pero su afinidad parece ser baja. Además, el entrecruzamiento de GPVI en la superficie de las plaquetas por un ligando divalente o multivalente tal como la IgG completa 9O12.2 da como resultado la activación plaquetaria mediante la dimerización de GPVI y mediante el entrecruzamiento de GPVI con el receptor Fc de baja afinidad (FcyRIIA). Por el contrario, los fragmentos Fab 9O12.2 monovalente y scFv son inhibidores.

Sin embargo, estos fragmentos no podrían ser utilizados en terapéutica debido a su tamaño y su origen animal lo que los hace inmunogénicos en pacientes humanos. Además, los fragmentos scFv presentan una vida media corta, lo que limita su potencial terapéutico.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de neutralizar antagonistas de GPVI sin inmunogenicidad en humanos.

El documento EE. UU. 2006/0088531 describe un fragmento scFv 10B12 humano, que presenta una K^dpara unirse a GPVI humana de aproximadamente 7.9 x 10'7 M. Smethurst et al., 2004, describe además el epítopo unido por 10B12 en el dominio 1 (D1) de tipo C2 similar a Ig de GPVI humana. Este epítopo comprende los residuos R58, K61, R66, K79 y R80 de GPVI humana (numeración basada en el número de acceso de UniProtKB Q9HCN6).

O'Connor et al., 2006, también describe un fragmento scFv 1C3 humano, de baja afinidad por GPVI (5.4 x 10'7 M), que no bloqueó la agregación plaquetaria inducida por colágeno ni la unión de GPVI al colágeno, pero que potenció el efecto inhibidor del anticuerpo 10B12. El epítopo 1C3 en GPVI comprende el aminoácido 1168 y se postula además que este epítopo podría abarcar una región entre los residuos S164 y S182, una región que está muy conservada desde el ratón hasta el ser humano.

Por lo tanto, existe la necesidad de un anticuerpo humanizado (es decir, un anticuerpo sin inmunogenicidad en humanos) con afinidad, eficacia y vida media mejoradas en comparación con los antagonistas de la técnica anterior, como un medio para prevenir y/o tratar de forma eficaz y satisfactoria la enfermedad cardiovascular en humanos. Además, estos antagonistas preferiblemente deberían purificarse fácilmente.

En la técnica, se describieron anticuerpos anti-GPVI que inducen un fenotipo de agotamiento de GPVI (documentos WO 2006/118350, WO 2011/073954, EP 2363416). En particular, el documento WO 2006/118350 describe un anticuerpo anti-GPVI dirigido contra todos los mamíferos. El epítopo de GPVI unido por este anticuerpo se describe y corresponde a los bucles 9 y 11 del dominio 2 de tipo C2 similar a Ig de GPVI, correspondientes a los residuos de aminoácidos 136-142 y 158-162, respectivamente.

Sin embargo, el agotamiento de GPVI es indeseable ya que no se puede controlar y es irreversible (es decir, dura la vida de las plaquetas, o incluso más debido al agotamiento de GPVI en los megacariocitos).

En terapia, se requiere un efecto antiplaquetario rápido y seguro. Por lo tanto, los anticuerpos que no inducen un fenotipo de agotamiento de GPVI y, preferiblemente, no inducen una disminución en el recuento de plaquetas in vivo (es decir, con un efecto reversible) debe ser desarrollado.

El solicitante desarrolló un anticuerpo anti-GPVI que se une a un nuevo epítopo conformacional no descrito. Dicho anticuerpo anti-GPVI tiene una fuerte afinidad por la GPVI humana y bloquea la interacción de la GPVI con sus ligandos (incluidos el colágeno y la fibrina), sin disminuir el recuento de plaquetas ni agotar la GPVI in vivo. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo neutralizante humanizado mejorado específico para la GPVI humana.

Resumen

La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o a un fragmento de anticuerpo del mismo, en donde la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 8.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo de cadena sencilla, un Fv, un fragmento de anticuerpo que carece de la región bisagra de los anticuerpos IgG4 y que tiene una región de unión univalente y un Fab.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es monovalente.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es para uso como medicamento.

La presente invención se refiere además a una composición que comprende el anticuerpo que se une a la GPVI humana o a un fragmento de anticuerpo del mismo como se definió anteriormente en el presente documento.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo que se une a la GPVI humana o fragmento de anticuerpo del mismo como se definió anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición farmacéutica de la invención es para uso en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, en la que dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de trombosis arterial y venosa, reestenosis, síndrome coronario agudo, accidentes cerebrovasculares isquémicos, accidentes vasculares cerebrales, enfermedades tromboembólicas venosas, microangiopatías trombóticas y púrpura vascular.

En una realización, la composición farmacéutica de la invención es para usar en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, en la que dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de enfermedades de las arterias coronarias y enfermedades de las arterias cerebrales.

En una realización, la composición farmacéutica de la invención es para uso en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, en donde dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de aterotrombosis, eventos isquémicos, síndrome de arteria coronaria aguda, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, intervención coronaria percutánea, trombosis de cánula intraluminal, reestenosis isquémica, isquemia aguda, isquemia crónica, enfermedades de la aorta y sus ramificaciones, arteriopatía periférica, trombosis venosa, flebitis aguda, embolia pulmonar, trombosis asociada al cáncer, trombosis inflamatoria y trombosis asociada a infección.

Otro objetivo de la invención es un vector de expresión que comprende secuencias nucleicas que codifican el anticuerpo que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o un fragmento de anticuerpo de la misma como se definió anteriormente, en donde dicho vector comprende una secuencia nucleica que codifica la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de ácido nucleico que comparta al menos el 75 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 10, y una secuencia nucleica que codifica la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de ácido nucleico que comparta al menos el 75 % de identidad con dicha ^sE^qID NO: 11

Descripción detallada

Cualquier referencia a métodos de tratamiento se considera una referencia a los compuestos y composiciones de la presente invención para su uso en un método de tratamiento practicado en el cuerpo humano/animal.

"Glicoproteína VI (GPVI)" es una glicoproteína de la membrana de las plaquetas que participa en las interacciones entre las plaquetas y el colágeno. GPVI es un receptor de colágeno transmembrana expresado en la superficie de las plaquetas. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la GPVI humana es la SEQ ID NO: 13 (número de acceso: BAA89353.1) o cualquier secuencia de aminoácidos que presente al menos aproximadamente un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 13, preferiblemente al menos aproximadamente 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad o más con la SEQ ID ⁿO: 13

(SEQ ID NO: 13)

MSPSPTALFCLGLCLGRVPA (péptido señal)

QS GPLPKPS LQ ALPS S LVPLEKP VTLRCQGPPG VDLYRLEKLS S S R Y QDQ A VLFI

PAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGG

DVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCY

SFS S RDP YFW S APS DPFEF V VTGT S VTPS RFPTEPPS S V AEFS E AT AEFT V S FTNK

VFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN (Dominio extracelular)

FVRICFGAVIFIIFAGFFAEDWHSRRKRFRHRGRAVQRPFPPFPPFPQTRKSHGG

QDGGRQDVHSRGFCS (Dominios transmembrana y citoplasmático)

El dominio extracelular de GPVI está compuesto por dos dominios de tipo C2 similares a Ig, a saber, D1 y D2, unidos por un interdominio bisagra. En una realización, D1 comprende los residuos de aminoácidos 21 a 109 de la SEQ ID NO: 13. En una realización, el interdominio bisagra entre D1 y D2 comprende los residuos de aminoácidos 110 a 113 de la SEQ ID NO: 13. En una realización, D2 comprende los residuos de aminoácidos 114 a 207 de la SEQ ID NO: 13

"Aproximadamente" que precede a una cifra significa más o menos el 10% del valor de dicha cifra.

"Anticuerpo" o "inmunoglobulina" - Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" incluye una proteína que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos ligeras, posea o no alguna inmunorreactividad específica relevante. "Anticuerpos" se refiere a dichos ensamblajes que tienen una actividad inmunorreactiva específica significativa conocida frente a un antígeno de interés (por ejemplo, GPVI humana). El término "anticuerpos anti-GPVI" se usa en el presente documento para referirse a anticuerpos que exhiben especificidad inmunológica por la proteína GPVI humana. Como se explica en otra parte del presente documento, la "especificidad" por la GPVI humana no excluye la reacción cruzada con especies homólogas de la GPVI. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellas. Las estructuras básicas de inmunoglobulina en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. El término genérico "inmunoglobulina" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención; la siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 Dalton y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular de aproximadamente 53,000-70,000 Dalton. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras entrecruzan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable. Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican como kappa o lambda ([k], [A]). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí, y las regiones de la "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, células B o células huésped modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo terminal N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo terminal C en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, p, a, 5, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1 - y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la materia en vista de la presente divulgación y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Como se indicó anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a los epítopos en los antígenos. Es decir, el dominio variable de cadena ligera (dominio VL) y el dominio variable de cadena pesada (dominio VH) de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la "Y". Más específicamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las cadenas VH y VL.

"Un anticuerpo aislado" - Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros componentes proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) a más del 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 % o más en peso de anticuerpo determinado por el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 99 % en peso; (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o del extremo terminal N mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) a la homogeneidad como se muestra por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras y usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

"Variantes de afinidad" - Tal como se usa en el presente documento, el término "variante de afinidad" se refiere a una variante de anticuerpo que muestra uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo anti-GPVI de referencia, donde la variante de afinidad muestra una afinidad alterada por la proteína GPVI humana en comparación al anticuerpo de referencia. Normalmente, las variantes de afinidad mostrarán una afinidad mejorada por la GPVI humana, en comparación con el anticuerpo anti-GPVI de referencia. La mejora puede ser una Kd más baja para GPVI humana, una Ka más alta para GPVI humana, una tasa de asociación más rápida para GPVI humana o una tasa de disociación más lenta para GPVI humana o una alteración en el patrón de reactividad cruzada con homólogos de GPVI no humanos. Las variantes de afinidad muestran típicamente uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en las CDR, en comparación con el anticuerpo anti-GPVI de referencia. Tales sustituciones pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido original presente en una posición dada en las CDR con un residuo de aminoácido diferente, que puede ser un residuo de aminoácido natural o un residuo de aminoácido no natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras.

"Sitio de unión" - Como se usa en el presente documento, el término "sitio de unión" comprende una región de una proteína que es responsable de la unión selectiva a un antígeno diana de interés (por ejemplo, GPVI humana). Los dominios de unión o las regiones de unión comprenden al menos un sitio de unión. Los ejemplos de dominios de unión incluyen un dominio variable de anticuerpo. La proteína de la invención puede comprender un solo sitio de unión a antígeno o múltiples (por ejemplo, dos, tres o cuatro) sitios de unión a antígeno. Preferiblemente, sin embargo, la proteína de la invención comprende un único sitio de unión a antígeno.

"Sustitución conservadora de aminoácidos" - Como se usa en el presente documento, una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluidas cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina puede reemplazarse con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. En otra realización, una cadena de aminoácidos se puede reemplazar con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

"Quimérica" - Como se usa en el presente documento, una proteína "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está unida de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en la proteína de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en la proteína de fusión. Se puede crear una proteína quimérica, por ejemplo, mediante síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en donde las regiones peptídicas se codifican en la relación deseada.

"CDR" - Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o "región determinante de complementariedad" se refiere a los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR se identificaron de acuerdo con las siguientes reglas como se deduce de Kabat et al., (1991) y Chothia y Lesk (1987):

- CDR-L1:

Inicio - Residuo aproximado 24

El residuo anterior siempre es una Cys

El residuo posterior siempre es un Trp. Típicamente TRP-TYR-GLN, pero también TRP-LEU-GLN, TRP-PHE-GLN, TRP-TYR-LEU

Longitud 10 a 17 residuos

- CDR-L2:

Inicio: siempre 16 residuos después del final de L1

Los residuos anteriores son generalmente ILE-TYR, pero también, VAL-TYR, ILE-LYS, ILE-PHE

Longitud siempre 7 residuos.

- CDR-L3:

Inicio: siempre 33 residuos después del final de L2

El residuo anterior siempre es Cys

Los residuos posteriores siempre son PHE-GLY-XXX-GLY (SEQ ID NO: 21)

Longitud 7 a 11 residuos

- CDR-H1:

Inicio - aproximados 26 residuos (siempre 4 después de una CYS) [Definición de Chothia /AbM]. La definición de Kabat comienza 5 residuos después

Los residuos anteriores siempre son CYS-XXX-XXX-XXX (SEQ ID NO: 22)

Los residuos posteriores siempre son TRP. Típicamente TRP-VAL, pero también TRP-ILE, TRP-ALA

Longitud 10 a 12 residuos (definición de AbM). La definición de Chothia excluye los últimos 4 residuos

- CDR-H2:

Inicio: siempre 15 residuos después del final de la definición de Kabat/AbM) de los residuos de CDR-H1 normalmente antes de l Eu -GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO: 23), pero con una serie de variaciones

Residuos posteriores LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA. Longitud de la definición de Kabat 16 a 19 residuos (la definición de AbM termina 7 residuos antes)

- CDR-H3:

Inicio: siempre 33 residuos después del final de CDR-H2 (siempre 2 después de un CYS)

Los residuos posteriores siempre son CYS-XXX-XXX (típicamente CYS-ALA-ARG)

Los residuos posteriores siempre son TRP-GLY-XXX-GLY (SEQ ID NO: 24)

Longitud 3 a 25 residuos.

"Dominio CH2" - Como se usa en el presente documento, el término "dominio CH2" incluye la región de una molécula de cadena pesada que generalmente se extiende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340. El dominio CH2 es único en el sentido de que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, se interponen dos cadenas de carbohidrato ramificadas unidas a N entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio CH2 (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206). "Derivado de" - Como se usa en el presente documento, el término "derivado de" una proteína designada (por ejemplo, un anticuerpo anti-GPVI o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se refiere al origen de la proteína. En una realización, la secuencia de proteínas o aminoácidos que se deriva de una proteína de inicio particular es una secuencia de CDR o una secuencia relacionada con la misma. En una realización, la secuencia de aminoácidos que se deriva de una proteína de inicio particular no es contigua. Por ejemplo, en una realización, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR se derivan de un anticuerpo de inicio. En una realización, la secuencia de proteínas o aminoácidos que se deriva de una proteína o secuencia de aminoácidos de inicio particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de inicio, o una región de la misma en la que la región consta de al menos 3 -5 aminoácidos, al menos 5 -10 aminoácidos, al menos 10 -20 aminoácidos, al menos 20 - 30 aminoácidos o al menos 30 -50 aminoácidos, o que sea identificable de otro modo para un experto en la materia por tener su origen en la secuencia inicial. En una realización, la una o más secuencias de CDR derivadas del anticuerpo de inicio se alteran para producir secuencias de CDR variantes, por ejemplo, variantes de afinidad, en las que las secuencias de CDR variantes mantienen la actividad de unión a GPVI.

"Diacuerpos" - Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo de sFv) con enlazadores cortos (aproximadamente 5 - 10 residuos) entre los dominios VH y VL de tal manera que logre el emparejamiento entre cadenas pero no dentro de las cadenas de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen más detalladamente, por ejemplo, en los documentos EP 0404097; WO 1993/011161; y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448 (1993).

"Modificado" - Como se usa en el presente documento, el término "modificado" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, por técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas). Preferiblemente, los anticuerpos de la invención están modificados, incluidos, por ejemplo, anticuerpos humanizados y/o quiméricos, y anticuerpos que han sido modificados para mejorar una o más propiedades, tales como unión a antígeno, estabilidad/vida media o función efectora.

"Epítopo" - Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a una disposición específica de aminoácidos ubicados en una proteína o proteínas a las que se une un anticuerpo. Los epítopos a menudo consisten en una agrupación superficial químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, es decir, involucrar dos o más secuencias de aminoácidos en varias regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas.

"Región marco" - Como se usa en el presente documento, el término "región marco" o "región FR" incluye los residuos de aminoácidos que son parte de la región variable, pero no son parte de las CDR (por ejemplo, usando la definición de las CDR de Kabat/Chothia). Por lo tanto, un marco de región variable tiene de aproximadamente 100 - 120 aminoácidos de longitud, pero incluye solo aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de una región variable de cadena pesada y para las CDR definidas por Kabat/Chothia, la región marco 1 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1 - 25; la región marco 2 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36 - 49; la región marco 3 puede corresponder al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 67 - 98, y la región marco 4 puede corresponder al dominio de la región variable desde los aminoácidos 110 hasta el final de la región variable. Las regiones marco para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las CDR de la región variable de cadena ligera. En los anticuerpos naturales, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestran una menor variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina [beta] y las CDR forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina [beta]. Por lo tanto, estas regiones marco actúan para formar una estructura que proporciona el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo. La posición de las CDR puede se identificada fácilmente por un experto en la materia.

"Fragmento" - Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a una parte o región de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de proteína de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaron) por la unión al antígeno (es decir, la unión específica a la GPVI humana). Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento de anticuerpo de dominio único (DAb), un anticuerpo de un solo brazo (monovalente), diacuerpos o cualquier molécula de unión a antígeno formada por combinación, ensamblaje o conjugación de dichos fragmentos de unión a antígeno. Los fragmentos se pueden obtener, por ejemplo, mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo o por medios recombinantes.

"Fv" - Como se usa en el presente documento, el término "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consta de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (tres bucles de cada cadena H y L) que contribuyen a la unión al antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

"Región de cadena pesada" - Como se usa en el presente documento, el término "región de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una proteína que comprende una región de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento del mismo. En una realización, una molécula de unión de la invención puede comprender la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una porción bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En otra realización, una molécula de unión de la invención carece de al menos una región de un dominio constante (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). En ciertas realizaciones, al menos uno, y preferiblemente todos, de los dominios constantes se derivan de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en una realización preferida, la región de la cadena pesada comprende un dominio bisagra completamente humano. En otras realizaciones preferidas, la región de la cadena pesada comprende una región Fc completamente humana (por ejemplo, secuencias de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana). En ciertas realizaciones, los dominios constantes constituyentes de la región de cadena pesada son de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región de cadena pesada de una proteína puede comprender un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, los dominios constantes son dominios quiméricos que comprenden regiones de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una bisagra puede comprender una primera región de una molécula de IgG1 y una segunda región de una molécula de IgG3 o IgG4. Como se establece anteriormente, un experto en la técnica entenderá que los dominios constantes de la región de la cadena pesada pueden modificarse de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina natural (de tipo silvestre). Es decir, las proteínas de la invención descritas en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los dominios constantes de cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 o CH3) y/o el dominio constante de cadena ligera (CL). Los ejemplos de modificaciones incluyen adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios.

"Región bisagra" - Como se usa en el presente documento, el término "región bisagra" incluye la región de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión al antígeno del extremo terminal N se muevan de forma independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 1998 161: 4083).

Los términos "bucle hipervariable" y "región determinante de complementariedad" no son estrictamente sinónimos, ya que los bucles hipervariables (HV) se definen en función de la estructura, mientras que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se definen en función de la variabilidad de la secuencia (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD., 1983) y los límites de los HV y los CDR pueden ser diferentes en algunos dominios VH y VL. Las CDR de los dominios VL y VH normalmente se pueden definir mediante la definición de Kabat/Chothia (véase más arriba). En una realización, las CDR de los dominios VL y VH pueden comprender los siguientes aminoácidos: residuos 24 - 39 (CDRL1), 55 - 61 (CDRL2) y 94- 102 (CD^rL3) en el dominio variable de cadena ligera y residuos 26 - 35 (CDRH1), 50 - 66 (CDRH2) y 99 -109 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada. Por lo tanto, los HV pueden estar comprendidos dentro de las CDR correspondientes y las referencias en el presente documento a los "bucles hipervariables" de los dominios VH y VL deben interpretarse como que también abarcan las CDR correspondientes y viceversa, a menos que se indique lo contrario. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan región marco (FR), como se define a continuación. Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración de lámina [beta], conectadas por los tres bucles hipervariables. Los bucles hipervariables de cada cadena se mantienen unidos en estrecha proximidad por los FR y, con los bucles hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. El análisis estructural de los anticuerpos reveló la relación entre la secuencia y la forma del sitio de unión formado por las regiones determinantes de complementariedad (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215: 175-182 (1990)). A pesar de su alta variabilidad de secuencia, cinco de los seis bucles adoptan solo un pequeño repertorio de conformaciones de cadena principal, llamadas "estructuras canónicas". Estas conformaciones están determinadas, en primer lugar, por la longitud de los bucles y, en segundo lugar, por la presencia de residuos clave en ciertas posiciones de los bucles y en las regiones marco que determinan la conformación a través de su empaquetamiento, enlaces de hidrógeno o la capacidad de asumir conformaciones inusuales de cadena principal.

"Humanizadas" - Como se usa en el presente documento, el término "humanizadas" se refiere a inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab' u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina murina. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donante) mientras se mantiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas del anticuerpo original.

"Sustituciones humanizantes" - Como se usa en el presente documento, el término "sustituciones humanizantes" se refiere a sustituciones de aminoácidos en las que el residuo de aminoácido presente en una posición particular en el dominio VH o VL de un anticuerpo anti-GPVI no humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-GPVI murino) se reemplaza con un residuo de aminoácido que se encuentra en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia. El dominio VH o VL humano de referencia puede ser un dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana, en cuyo caso los residuos sustituidos pueden denominarse "sustituciones de línea germinal". Las sustituciones humanizantes/de línea germinal pueden realizarse en las regiones marco y/o las CDR de un anticuerpo anti-GPVI, definido en el presente documento.

"Alta homología humana" - Se considerará que un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una alta homología humana si los dominios VH y los dominios VL, tomados en conjunto, exhiben al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana más coincidentes. Los anticuerpos que tienen una alta homología humana pueden incluir anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos nativos no humanos que exhiben secuencias de línea germinal humana con un porcentaje de identidad de secuencia suficientemente alto, así como variantes modificadas, especialmente humanizadas, de tales anticuerpos y también anticuerpos "completamente humanos". En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia de aminoácidos u homología de secuencia del 75 %, 80 % o más con uno o más dominios VH humanos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de secuencia de aminoácidos o la homología de la secuencia entre el dominio VH de la proteína de la invención y la secuencia del dominio VH de la línea germinal humana más coincidente puede ser del 85 % o más, del 90 % o más, del 95 % o más, del 97 % o más, o hasta el 99 % o incluso el 100%. En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede contener uno o más (por ejemplo, 1 a 20) falta de coincidencia de secuencias de aminoácidos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VH humano más coincidente. En otra realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia u homología de secuencia del 80 % o más con uno o más dominios VL humanos a través de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de la secuencia de aminoácidos o la homología de la secuencia entre el dominio VL de la proteína de la invención y la secuencia del dominio VL de la línea germinal humana más coincidente puede ser del 85 % o más, del 90 % o más, del 95 % o más, del 97 % o más, o hasta el 99% o incluso el 100%.

En una realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede contener uno o más (por ejemplo, 1 a 20, preferiblemente 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5) faltas de coincidencia de la secuencia de aminoácidos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VL humano más coincidente. Antes de analizar el porcentaje de identidad de secuencia entre el anticuerpo con alta homología humana y VH y VL de línea germinal humana, se pueden determinar los pliegues canónicos, que permiten identificar la familia de segmentos de línea germinal humana con la misma combinación de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3). Posteriormente, el miembro de la familia de la línea germinal humana que tiene el mayor grado de homología de secuencia con la región variable del anticuerpo de interés se elige para puntuar la homología de secuencia. La determinación de las clases canónicas de Chothia de bucles hipervariables L1, L2, L3, H1 y H2 se puede realizar con las herramientas bioinformáticas disponibles públicamente en la página web www.bioinf.org.uk/abs/chothia.htmL.page. La salida del programa muestra los requisitos clave de residuos en un archivo de datos. En estos archivos de datos, las posiciones de residuos clave se muestran con los aminoácidos permitidos en cada posición. La secuencia de la región variable del anticuerpo de interés se proporciona como entrada y primero se alinea con una secuencia de anticuerpo de consenso para asignar el esquema de numeración de Kabat/Chothia. El análisis de los pliegues canónicos utiliza un conjunto de plantillas de residuos clave derivadas de un método automatizado desarrollado por Martin y Thornton (Martín et al., J. Mol. Biol. 263: 800-815 (1996)). Con el segmento V de la línea germinal humana particular conocido, que usa la misma combinación de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3), se puede determinar el miembro de la familia que mejor coincide en términos de homología de secuencia. Con herramientas bioinformáticas, se puede determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos del marco del dominio VH y VL del anticuerpo de interés y las secuencias correspondientes codificadas por la línea germinal humana, pero también se puede aplicar la alineación manual de las secuencias. Las secuencias de inmunoglobulina humana se pueden identificar a partir de varias bases de datos de proteínas, tales como VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o la base de datos Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/ Sequences/Germlines). Para comparar las secuencias humanas con las regiones V de los dominios VH o VL en un anticuerpo de interés, se puede usar un algoritmo de alineación de secuencias como el disponible en sitios web como www.expasy.ch/tools/#align, pero también se puede realizar la alineación manual con el conjunto limitado de secuencias. Las secuencias de cadena ligera y pesada de la línea germinal humana de las familias con las mismas combinaciones de pliegues canónicos y con el mayor grado de homología con las regiones marco 1, 2 y 3 de cada cadena se seleccionan y comparan con la región variable de interés; también se compara el FR4 con las regiones JH y JK o JL de la línea germinal humana. Téngase en cuenta que en el cálculo del porcentaje general de homología de secuencias, los residuos de FR1, FR2 y FR3 se evalúan utilizando la secuencia coincidente más cercana de la familia de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos. Solo puntúan los residuos diferentes de la coincidencia más cercana u otros miembros de la misma familia con la misma combinación de pliegues canónicos (NB - excluyendo cualquier diferencia codificada por cebador). Sin embargo, para los efectos de la humanización, los residuos en las regiones marco idénticas a los miembros de otras familias de la línea germinal humana, que no tienen la misma combinación de pliegues canónicos, pueden considerarse "humanos", a pesar de que estos se califican como "negativos" de acuerdo con las estrictas condiciones descritas anteriormente. Esta suposición se basa en el enfoque de "mezclar y combinar" para la humanización, en el que cada uno de FR1, FR2, FR3 y FR4 se compara por separado con su secuencia de línea germinal humana más coincidente y, por lo tanto, la molécula humanizada contiene una combinación de diferentes FR como lo hicieron Qu y sus colegas (Qu et al., Clin. Cancer Res. 5: 3095-3100 (1999)) y Ono y sus colegas (Ono et al., Mol. Immunol. 36: 387-395 (1999)). Los límites de las regiones marco individuales se pueden asignar utilizando el esquema de numeración IMGT, que es una adaptación del esquema de numeración de Chothia (Lefranc et al., Nucleic Acid Res 27: 209-212 (1999); http://im.gt.cines.fr). Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender bucles hipervariables o CDR que tienen pliegues canónicos humanos o similares a los humanos, como se analiza en detalle a continuación. En una realización, al menos un bucle hipervariable o CDR en el dominio VH o el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana se puede obtener o derivar de un dominio VH o VL de un anticuerpo no humano, y aún así exhibir un valor predicho o estructura real de pliegue canónico que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegue canónico que se presenta en anticuerpos humanos. Está bien establecido en la técnica que aunque las secuencias de aminoácidos primarias de los bucles hipervariables presentes tanto en los dominios VH como en los dominios VL codificados por la línea germinal humana son, por definición, muy variables, todos los bucles hipervariables, excepto CDR H3 del dominio VH, adoptan solo unas pocas conformaciones estructurales distintas, denominadas pliegues canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al., Proteins 6: 382-94 (1989)), que dependen tanto de la longitud del bucle hipervariable como de la presencia de los denominados residuos de aminoácidos canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las estructuras canónicas reales de los bucles hipervariables en dominios VH o VL intactos pueden determinarse mediante análisis estructural (por ejemplo, cristalografía de rayos X), pero también es posible predecir la estructura canónica sobre la base de residuos de aminoácidos clave que son característicos de una estructura particular (discutida más adelante). En esencia, el patrón específico de residuos que determina cada estructura canónica forma una "firma" que permite reconocer la estructura canónica en bucles hipervariables de un dominio VH o VL de estructura desconocida; por lo tanto, las estructuras canónicas pueden predecirse basándose únicamente en la secuencia de aminoácidos primaria. Las estructuras de plegamiento canónico pronosticadas para los bucles hipervariables de cualquier secuencia VH o VL dada en un anticuerpo con alta homología humana pueden analizarse utilizando algoritmos que están disponibles públicamente en www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html,www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html y www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html. Estas herramientas permiten que las secuencias de VH o VL de consulta se alineen con secuencias de dominio VH o VL humano de estructura canónica conocida, y se realiza una predicción de la estructura canónica para los bucles hipervariables de la secuencia de consulta. En el caso del dominio VH, los bucles H1 y H2 pueden clasificarse como si tuvieran una estructura de plegamiento canónico "sustancialmente idéntica" a una estructura de plegamiento canónico que se sabe que ocurre en los anticuerpos humanos si se cumple al menos el primero, y preferiblemente ambos, de los siguientes criterios:

1. Una longitud idéntica, determinada por el número de residuos, con la clase estructural canónica humana más coincidente.

2. Al menos 33 % de identidad, preferiblemente al menos 50 % de identidad con los residuos de aminoácidos clave descritos para las clases estructurales canónicas humanas H1 y H2 correspondientes (obsérvese que, para los fines del análisis anterior, los bucles H1 y H2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana más coincidente). El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles H1 y H2 del anticuerpo de interés. Si se conocen las estructuras reales de los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés, por ejemplo con base en la cristalografía de rayos X, entonces los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés también se pueden calificar como si tuvieran una estructura de plegamiento canónico "sustancialmente idéntica" a una estructura de plegamiento canónico que se sabe que ocurre en los anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de la de la clase estructural canónica humana más coincidente (típicamente por 1 o 2 aminoácidos), pero la estructura real de los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés coincide con la estructura de un pliegue canónico humano. Los residuos de aminoácidos clave que se encuentran en las clases estructurales canónicas humanas para el primer y segundo bucle hipervariable de los dominios VH humanos (H1 y H2) son descritos por Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992), cuyo contenido se incorpora en el presente documento en su totalidad como referencia. En particular, la Tabla 3 en la página 802 de Chothia et al., que se incorpora específicamente en el presente documento como referencia, enumera los residuos de aminoácidos preferidos en sitios clave para las estructuras canónicas H1 que se encuentran en la línea germinal humana, mientras que la Tabla 4 en la página 803, también incorporada específicamente como referencia, enumera los residuos de aminoácidos preferidos en sitios clave para estructuras canónicas de CDR H2 encontradas en la línea germinal humana. En una realización, tanto H1 como H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana exhiben una estructura de plegamiento canónico predicha o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de plegamiento canónico que ocurre en los anticuerpos humanos. Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender un dominio VH en donde los bucles hipervariables H1 y H2 forman una combinación de estructuras de plegamiento canónicas que es idéntica a una combinación de estructuras canónicas que se sabe que ocurren en al menos un dominio VH de línea germinal humana. Se ha observado que solo ciertas combinaciones de estructuras de plegamiento canónicas en H1 y H2 ocurren realmente en los dominios VH codificados por la línea germinal humana. En una realización, H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana se pueden obtener a partir de un dominio VH de una especie no humana, pero forman una combinación de estructuras de plegamiento canónicas predichas o reales que es idéntica a una combinación de estructuras de plegamiento canónico que se sabe que ocurren en una línea germinal humana o en un dominio VH mutado somáticamente. En realizaciones no limitantes, H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana pueden obtenerse de un dominio VH de una especie no humana y formar una de las siguientes combinaciones de plegamiento canónico: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 y 3-5. Un anticuerpo con alta homología humana puede contener un dominio VH que presenta una alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VH humano y que contiene bucles hipervariables que presentan homología estructural con VH humano. Puede ser ventajoso que los pliegues canónicos presentes en H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana, y la combinación de los mismos, sean "correctos" para la secuencia de la línea germinal VH humano que representa la coincidencia más cercana con el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana en términos de identidad completa de secuencia de aminoácidos primaria. A modo de ejemplo, si la coincidencia de secuencia más cercana es con un dominio VH3 de la línea germinal humana, entonces puede ser ventajoso que H1 y H2 formen una combinación de pliegues canónicos que también ocurre naturalmente en un dominio VH3 humano. Esto puede ser particularmente importante en el caso de anticuerpos con alta homología humana que se derivan de especies no humanas, por ejemplo, anticuerpos que contienen dominios VH y VL que se derivan de anticuerpos convencionales de camélidos, especialmente anticuerpos que contienen dominios VH y VL de camélidos humanizados. Por lo tanto, en una realización, el dominio VH del anticuerpo anti-GPVI con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia u homología de secuencia de 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, o hasta 99 % o incluso 100 % con un dominio VH humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además H1 y H2 en el mismo anticuerpo se obtienen de un dominio VH no humano, pero forman una combinación de estructuras de pliegues canónicos predichos o reales que es lo mismo que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que ocurre naturalmente en el mismo dominio VH humano. En otras realizaciones, L1 y L2 en el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana se obtienen cada uno de un dominio VL de una especie no humana, y cada uno exhibe una estructura de pliegue canónico predicha o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegue canónico que ocurre en los anticuerpos humanos. Al igual que con los dominios VH, los bucles hipervariables de los dominios VL de los tipos VLambda y VKappa pueden adoptar un número limitado de conformaciones o estructuras canónicas, determinadas en parte por la longitud y también por la presencia de residuos de aminoácidos clave en ciertas posiciones canónicas. Dentro de un anticuerpo de interés que tiene una alta homología humana, los bucles L1, L2 y L3 obtenidos de un dominio VL de una especie no humana, por ejemplo, una especie Camelidae, puede calificarse como que tiene una estructura de pliegue canónico "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegue canónico que se sabe que ocurre en anticuerpos humanos si se cumple al menos el primero, y preferiblemente ambos, de los siguientes criterios:

1. Una longitud idéntica, determinada por el número de residuos, a la clase estructural humana más coincidente.

2. Al menos un 33 % de identidad, preferiblemente al menos un 50 % de identidad con los residuos de aminoácidos clave descritos para las clases estructurales canónicas L1 o L2 humanas correspondientes, ya sea del repertorio VLambda o VKappa (obsérvese, para los fines del análisis anterior, que los bucles L1 y L2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana más cercana). El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles L1, L2 y L3 en el dominio VL del anticuerpo de interés. Si se conoce la estructura real de los bucles L1, L2 y L3, por ejemplo, basándose en cristalografía de rayos X, entonces los bucles L1, L2 o L3 derivados del anticuerpo de interés también se pueden calificar como si tuvieran una estructura de plegamiento canónico "sustancialmente idéntica" a una estructura de plegamiento canónico que se sabe que ocurre en los anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de la de la clase estructural canónica humana más coincidente (típicamente por 1 o 2 aminoácidos) pero la estructura real de los bucles en el anticuerpo de interés coincide con un pliegue canónico humano. Los residuos de aminoácidos clave que se encuentran en las clases estructurales canónicas humanas para las CDR de los dominios VLambda y VKappa humanos son descritos por Morea et al., Methods, 20: 267-279 (2000) y Martin et al., J. Mol. Biol., 263: 800-815 (1996). El repertorio estructural del dominio VKappa humano también es descrito por Tomlinson et al., EMBO J. 14: 4628-4638 (1995), y la del dominio VLambda por Williams et al., J. Mol. Biol., 264: 220-232 (1996). El contenido de todos estos documentos debe incorporarse en el presente documento como referencia. L1 y L2 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden formar una combinación de estructuras de plegamiento canónicas predichas o reales que es idéntica a una combinación de estructuras de plegamiento canónico que se sabe que ocurre en un dominio VL de línea germinal humana. En realizaciones no limitantes, LI y L2 en el dominio VLambda de un anticuerpo con alta homología humana pueden formar una de las siguientes combinaciones de plegamiento canónico: 11-7, 13-7(A,B,C), 14-7(A,B), 12-11, 14-11 y 12-12 (como se define en Williams et al., J. Mol. Biol. 264: 220-32 (1996) y como se muestra en http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). En realizaciones no limitativas, L1 y L2 en el dominio VKappa pueden formar una de las siguientes combinaciones de plegamiento canónico: 2-1, 3-1, 4-1 y 6-1 (como se define en Tomlinson et al., EMBO J. 14: 4628-38 (1995) y como se muestra en http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html).

En una realización adicional, los tres L1, L2 y L3 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden exhibir una estructura sustancialmente humana. Se prefiere que el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana muestre identidad de secuencia alta/homología de secuencia con VL humano, y también que los bucles hipervariables en el dominio VL muestren homología estructural con VL humano.

En una realización, el dominio VL del anticuerpo anti-GPVI con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia del 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, o hasta el 99 % o incluso el 100 % con un dominio VL humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además el bucle hipervariable L1 y el bucle hipervariable L2 pueden formar una combinación de estructuras de plegamiento canónicas predichas o reales que es lo mismo que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que ocurre naturalmente en el mismo dominio VL humano. Por supuesto, se prevé que los dominios VH que exhiben una alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VH humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VH humano se combinarán con dominios VL que exhiben una alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VL humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VL humano para proporcionar anticuerpos con alta homología humana que contienen emparejamientos VH/VL con secuencia máxima y homología estructural con emparejamientos VH/VL codificados humanos.

"Inmunoespecífico", "específico para" o para "unirse específicamente" - Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo es "inmunoespecífico", "específico para" o que "se une específicamente" a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con el antígeno, preferiblemente con una constante de afinidad, KA, mayor que o igual a aproximadamente 106 M-1, mayor o igual a aproximadamente 107 M-1, o mayor o igual a 108 M-1, o mayor o igual a 1.5 x 108 M-1,, o mayor o igual a 109 M'1 o mayor o igual a 5 x 109 M-1. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno afín también se expresa comúnmente como una constante de disociación K^d, y en ciertas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente al antígeno si se une con una K^dmenor o igual a 10-6 M, menor o igual a 10-7 M, o menor o igual a 1.5 x 10-8 M, o menor o igual a 10-8 M, o menor o igual a 5 x 10-9 M o menor o igual a 10-9 M. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard G et al., (The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann NY Acad Sci 1949; 51: 660-672). Las propiedades de unión de un anticuerpo a antígenos, células o tejidos del mismo generalmente pueden determinarse y evaluarse utilizando métodos de inmunodetección que incluyen, por ejemplo, ELISA, ensayos basados en inmunofluorescencia, tales como inmunohistoquímica (IHC) y/o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o por resonancia de plasmón superficial (SPR, BIAcore).

"Ácido nucleico aislado" - Como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que está sustancialmente separado de otras secuencias de ADN del genoma, así como de proteínas o complejos tales como ribosomas y polimerasas, que acompañan naturalmente a una secuencia nativa. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha eliminado de su entorno natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Un ácido nucleico sustancialmente puro incluye formas aisladas del ácido nucleico. Por supuesto, esto se refiere al ácido nucleico tal como se aisló originalmente y no excluye los genes o las secuencias añadidas posteriormente al ácido nucleico aislado por la mano del hombre.

El término "polipéptido" se utiliza en su significado convencional, es decir, como una secuencia de menos de 100 aminoácidos. Un polipéptido generalmente se refiere a una entidad monomérica. El término "proteína" se refiere a una secuencia de más de 100 aminoácidos y/o a una entidad multimérica. Las proteínas de la invención no se limitan a una longitud específica del producto. Este término no se refiere ni excluye modificaciones posteriores a la expresión de la proteína, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales. Una proteína puede ser una proteína completa o una subsecuencia de la misma. Las proteínas particulares de interés en el contexto de esta invención son las subsecuencias de aminoácidos que comprenden CDR y que son capaces de unirse a un antígeno. Una "proteína aislada" es aquella que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su entorno natural. En realizaciones preferidas, la proteína aislada se purificará (1) a más del 80, 85, 90, 95 % en peso de proteína de acuerdo con lo determinado por el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 96, 97, 98 o 99 % en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o del extremo terminal N mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. La proteína aislada incluye la proteína in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural de la proteína no estará presente. Normalmente, sin embargo, la proteína aislada se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

"Identidad" o "idéntico" - Como se usa en el presente documento, el término "identidad" o "idéntico", cuando se usa en una relación entre las secuencias de dos o más secuencias de aminoácidos, se refiere al grado de relación de secuencia entre las secuencias de aminoácidos, de acuerdo con lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hay) abordadas por un modelo matemático o programa de ordenador en particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de las secuencias de aminoácidos relacionadas se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo et al., SIa M J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para producir la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol.

215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., citado anteriormente). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.

"Anticuerpo modificado" - Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo modificado" incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de manera que no se producen de forma natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos regiones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como, anticuerpos o minicuerpos de dominio eliminado); formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos, etc.) alterados para unirse a dos o más antígenos diferentes o a diferentes epítopos en un único antígeno; moléculas de cadena pesada unidas a moléculas de scFv y similares. Las moléculas de scFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,892,019. Además, el término "anticuerpo modificado" incluye formas multivalentes de anticuerpos (por ejemplo, trivalentes, tetravalentes, etc., anticuerpos que se unen a tres o más copias del mismo antígeno). En otra realización, un anticuerpo modificado de la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una región de cadena pesada que carece de un dominio CH2 y que comprende un dominio de unión de una proteína que comprende la región de unión de un miembro de un par de ligandos receptores.

"Mamífero" - Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, para deportes o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un primate, más preferiblemente un ser humano.

"Anticuerpo monoclonal" - Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita por primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o puede hacerse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucariotas o vegetales (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No.

4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222 : 581-597 (1991), por ejemplo.

"Secuencia nativa" - Como se usa en el presente documento, el término nucleótido de "secuencia nativa" se refiere a un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos que un polinucleótido derivado de la naturaleza. En consecuencia, una proteína de "secuencia nativa" es aquella que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) derivada de la naturaleza (por ejemplo, de cualquier especie). Dichos polinucleótidos y proteínas de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. Una "variante" de polinucleótido, como se usa el término en el presente documento, es un polinucleótido que normalmente difiere de un polinucleótido descrito específicamente en el presente documento en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ocurrir de forma natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polinucleótidos de la invención y evaluando una o más actividades biológicas de las proteínas codificadas como se describe en el presente documento y/o usando cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en el arte. Una "variante" de proteína, como se usa el término en el presente documento, es una proteína que normalmente difiere de una proteína descrita específicamente en el presente documento en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ocurrir de forma natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de proteínas anteriores de la invención y evaluando una o más actividades biológicas de la proteína como se describe en el presente documento y/o usando cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en el arte. Se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y proteínas de la presente invención y aun así obtener una molécula funcional que codifique una proteína variante o derivada con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de una proteína para crear una variante o región equivalente, o incluso mejorada, de una proteína de la invención, un experto en la técnica normalmente cambiará uno o más de los codones de la secuencia codificante de ADN. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin una pérdida apreciable de su capacidad para unirse a otras proteínas (por ejemplo, antígenos) o células. Dado que es la capacidad de unión y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente y, sin embargo, obtener una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que se pueden realizar varios cambios en las secuencias de aminoácidos de las composiciones descritas, o las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichas proteínas sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. En muchos casos, una variante de proteína contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática de la proteína permanecieran sustancialmente sin cambios. Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los ejemplos de sustituciones que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse además con base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1 ) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede, o alternativamente, contener cambios no conservadores. En una realización preferida, las proteínas variantes se diferencian de una secuencia nativa por sustitución, eliminación o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también pueden (o alternativamente) modificarse, por ejemplo, mediante la eliminación o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática de la proteína.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" - Como se usa en el presente documento, el término "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. Dicho excipiente no produce una reacción adversa, alérgica o de otro tipo cuando se administra a un animal, preferentemente a un ser humano. Para la administración en humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares generales de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza requeridos por las oficinas reguladoras, tales como, por ejemplo, la Oficina de la FDA o EMA.

"Especificidad" - Como se usa en el presente documento, el término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente (por ejemplo, inmunorreaccionar con) un objetivo dado, por ejemplo, GPVI. Una proteína puede ser monoespecífica y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a un objetivo, o una proteína puede ser multiespecífica y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a los mismos o diferentes objetivos. En una realización, un anticuerpo de la invención es específico para más de un objetivo. Por ejemplo, en una realización, una molécula de unión multiespecífica de la invención se une a GPVI y a una segunda molécula.

"Fv de cadena sencilla" también abreviado como "sFv" o "scFv" - Como se usa en el presente documento, los términos "Fv de cadena sencilla", "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL conectados en una sola cadena de aminoácidos. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del sFv comprende además un enlazador peptídico entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, citado más abajo.

"Sujeto" - Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente a un ser humano. En una realización, un sujeto puede ser un "paciente", es decir, un animal de sangre caliente, más preferiblemente un ser humano, que está esperando recibir, o está recibiendo atención médica o fue/es/será objeto de una procedimiento médico, o es controlado para el desarrollo de una enfermedad.

"Sintético" - Como se usa en el presente documento, el término "sintético" con respecto a las proteínas incluye proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que no se produce de forma natural. Por ejemplo, las proteínas de origen no natural son formas modificadas de proteínas de origen natural (por ejemplo, que comprenden una mutación tal como una adición, sustitución o eliminación) o proteínas que comprenden una primera secuencia de aminoácidos (que puede o no ser de origen natural) que están enlazadas en una secuencia lineal de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos (que puede o no ser natural) a la que no está enlazada naturalmente en la naturaleza.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa nivel o cantidad de agente que tiene como objetivo, sin causar efectos secundarios negativos o adversos significativos al objetivo, (1 ) retrasar o prevenir la aparición de enfermedades relacionadas con GPVI; (2) ralentizar o detener la progresión, agravamiento o deterioro de uno o más síntomas de la enfermedad relacionada con GPVI; (3) provocar mejoras de los síntomas de la enfermedad relacionada con GPVI; (4) reducir la gravedad o incidencia de la enfermedad relacionada con GPVI; o (5) curar la enfermedad relacionada con GPVI. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz antes de la aparición de la enfermedad relacionada con GPVI, para una acción profiláctica o preventiva. Como alternativa o adicionalmente, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede administrar después del inicio de la enfermedad relacionada con GPVI, para una acción terapéutica.

"Región variable" o "dominio variable" - Como se usa en el presente documento, el término "variable" se refiere al hecho de que ciertas regiones de los dominios variables VH y VL difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno diana. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados "bucles hipervariables" en cada uno de los dominios VL y VH que forman parte del sitio de unión al antígeno. Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de la cadena ligera VLambda se denominan en el presente documento como L1(A), L2(A) y L3(A) y pueden definirse como que comprenden los residuos 24-33 (L1(A), que consta de 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos), 49-53 L2(A), que consta de 3 residuos) y 90-96 (L3(A), que consta de 6 residuos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20: 267-279 (2000)). Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de la cadena ligera de VKappa se denominan en el presente documento L1(k), L2(k) y L3(^k) y pueden definirse como que comprenden los residuos 25-33 (L1(^k), que consta de 6, 7, 8, 11, 12 o 13 residuos), 49-53 (L2(^k), que consta de 3 residuos) y 90-97 (L3(^k), que consta de 6 residuos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20: 267-279 (2000)). Los bucles hipervariable primero, segundo y tercero del dominio VH se denominan en el presente documento como H1, H2 y H3 y pueden definirse como que comprenden los residuos 25-33 (H1, que consta de 7, 8 o 9 residuos), 52-56 (H2 , que consta de 3 o 4 residuos) y 91-105 (H3, de longitud altamente variable) en el dominio VH (Morea et al., Methods 20: 267-279 (2000)). A menos que se indique lo contrario, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente a los bucles hipervariables primero, segundo y tercero de un dominio VL y abarcan bucles hipervariables obtenidos de los isotipos VKappa y VLambda. Los términos H1, H2 y H3 se refieren respectivamente a los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio VH y abarcan bucles hipervariables obtenidos de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos, incluidos [gamma], [épsilon], [delta], [alfa] o [mu]. Cada uno de los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1, H2 y H3 puede comprender parte de una "región determinante de complementariedad" o "CDR", como se ha definido anteriormente en el presente documento.

"Valencia" - Tal como se usa en el presente documento, el término "valencia" se refiere al número de sitios de unión objetivo potenciales en una proteína. Cada sitio de unión objetivo se une específicamente a una molécula objetivo o sitio específico en una molécula objetivo. Cuando una proteína comprende más de un sitio de unión a la diana, cada sitio de unión a la diana puede unirse específicamente a las mismas moléculas o a moléculas diferentes (por ejemplo, puede unirse a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno). Las moléculas de unión en cuestión tienen preferiblemente al menos un sitio de unión específico para una molécula de GPVI humana. Preferiblemente, las proteínas proporcionadas en el presente documento son monovalentes.

"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" - Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas; en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o el trastorno patológico objetivo. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno. Un sujeto o mamífero es "tratado" con éxito para la afección o trastorno patológico objetivo si, después de recibir una cantidad terapéutica de una proteína de acuerdo con la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células patógenas; reducción en el porcentaje de células totales que son patógenas; y/o alivio hasta cierto punto, de uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o afección específica; reducción de la morbilidad y la mortalidad, y mejora en los problemas de calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos de rutina familiares para un médico.

La presente invención se refiere a proteínas humanizadas aisladas que se unen a la GPVI humana, preferiblemente a anticuerpos humanizados aislados contra la GPVI humana. En una realización, se purifica la proteína aislada de la invención.

La proteína de la invención se une al dominio extracelular de GPVI.

La proteína de la invención se une al dominio 2 (D2) de tipo C2 similar a Ig de la GPVI humana.

La proteína de la invención puede unirse a un epítopo que comprende al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 207 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 207 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ,43, 44, 45 ,46, 47, 48, 49, 50 o más residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 de residuos de aminoácidos del 114 al 142, preferiblemente del 115 al 141, más preferiblemente del 116 al 140, más preferiblemente del 117 al 139, más preferiblemente del 118 al 138, más preferiblemente del 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 de residuos de aminoácidos de 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 de residuos de aminoácidos de 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

La proteína aislada de la invención puede unirse a un epítopo conformacional.

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de GPVI humana.

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido del dominio 2 (D2) de tipo C2 similar a Ig de GPVI humana.

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido del 114 al 207 de la GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ,23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ,48 , 49, 50 o más residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 187, preferiblemente de 115 a 187, más preferiblemente de 116 a 187, más preferiblemente de 117 a 187, más preferiblemente de 118 a 186, más preferiblemente de 119 a 185, más preferiblemente de 120 a 184, aún más preferiblemente de 121 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 aminoácidos residuos de los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13), o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender:

- al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y

- al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender:

- al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 142, preferiblemente de 115 a 141, más preferiblemente de 116 a 140, más preferiblemente de 117 a 139, más preferiblemente de 118 a 138, más preferiblemente de 119 a 137, más preferiblemente de 120 a 136, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO:

13); y

- al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 residuos de aminoácidos de residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GpV i humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender:

- al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y

Dicho epítopo conformacional puede comprender:

al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 114 a 135, preferiblemente de 115 a 135, más preferiblemente de 116 a 135, más preferiblemente de 117 a 135, más preferiblemente de 118 a 135, más preferiblemente de 119 a 135, más preferiblemente de 120 a 135, aún más preferiblemente de 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y

al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 165 a 187, preferiblemente de 166 a 186, más preferiblemente de 167 a 185, más preferiblemente de 168 a 184, aún más preferiblemente de 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SeQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Por lo tanto, la proteína de la invención puede unirse a un epítopo conformacional que comprende al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 121 a 135 de la GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede comprender al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (Se Q ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Por lo tanto, la proteína de la invención puede unirse a un epítopo conformacional que comprende al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Dicho epítopo conformacional puede consistir en:

- residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 121 a 135 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13); y

- residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 183 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

Por lo tanto, la proteína de la invención puede unirse a un epítopo conformacional que consta de:

Dicho epítopo conformacional puede consistir en:

- residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13) o de una secuencia que comparte al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad sobre los residuos de aminoácidos 169 a 180 de GPVI humana (SEQ ID NO: 13).

La proteína aislada que se une a la GPVI humana puede tener una K^dpara unirse a GPVI humana, preferiblemente GPVI humana soluble, menor o igual a 15 nM, preferiblemente menor o igual a 10 nM y más preferiblemente menor o igual a 5 nM.

La proteína aislada de la invención puede tener un kdesactivación para unirse a GPVI humana de menos o igual a aproximadamente 8 x 10-4 s-1, preferiblemente menor o igual a aproximadamente 6 x 10-4 s-1, y más preferiblemente menor o igual a aproximadamente 4 x 10-4 s-1.

La proteína aislada de la invención puede tener un kactivación para unirse a la GPVI humana de al menos aproximadamente 5 x 104 M-1s-1, preferiblemente al menos aproximadamente 5.5 x 104 M-1s-1, y más preferiblemente al menos aproximadamente 5.9 x 104 M-1s-1 y más preferiblemente al menos aproximadamente 6 x 10-4 s-1.

La K^dpuede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, BIAcore), usando GPVI soluble inmovilizada en una dosis que oscila de aproximadamente 700 a aproximadamente 1600 unidades de resonancia (RU) (correspondientes a aproximadamente 8.5 a aproximadamente 11.3 fmol/mm2), preferiblemente de aproximadamente 850 a aproximadamente 1200 RU, más preferiblemente de aproximadamente 950 a aproximadamente 1075 RU y/o usando PBS pH 7.4 como tampón de procesamiento, y/o usando el software BIA Evaluation versión 3.0 para analizar datos. En una realización, la GPVI soluble corresponde al dominio extracelular de la GPVI fusionada en su extremo C mediante un enlazador (tal como, por ejemplo, mediante un enlazador Gly-Gly-Arg) a una secuencia de hFc. Esta GPVI soluble puede denominarse GPVI-Fc soluble.

A continuación se muestra un método para determinar la afinidad de la proteína de la invención por GPVI soluble:

La unión de la proteína de la invención a GPVI humana soluble se analiza con resonancia de plasmón superficial utilizando un sistema BIAcore 2000 (Uppsala, Suecia).

GPVI-Fc soluble se inmoviliza a una dosis que varía de aproximadamente 700 a aproximadamente 1600 RU (que corresponde a aproximadamente 8.5 a aproximadamente 11.3 fmol/mm2), preferiblemente de aproximadamente 850 a aproximadamente 1200 RU, más preferiblemente de aproximadamente 950 a aproximadamente 1075 RU, e aún más preferiblemente de aproximadamente 960 a aproximadamente 1071 RU en un chip sensor de Carboxi-Metil Dextrano CM5 usando el método de acoplamiento de amina (procedimiento de Wizard). A continuación, la proteína se pasa sobre GPVI-Fc inmovilizado en PBS pH 7.4 (fosfato 10 mM, NaCl 138 mM, KCl 2.7 mM, pH 7.42 a 25.4°C) a un caudal de 20 pL/min a 25 °C. Constantes cinéticas (kactivación, kdesactivación) y las afinidades se determinan utilizando el software BIAevaluation versión 3.0, ajustando los datos al modelo de unión. PBS pH 7.4 es el tampón de procesamiento.

Dicha proteína puede ser una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo dimérico monocatenario, un Fv, un Fab, un F(ab)'2, un anticuerpo defucosilado, un anticuerpo biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo y un tetracuerpo.

Dicha proteína puede ser un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un unicuerpo, un dominio de anticuerpo y un nanocuerpo.

Otro aspecto de la divulgación es un mimético de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un aficuerpo, una afilina, una afitina, una adnectina, un atrímero, una evasina, una DARPina, una anticalina, un avímero, un finómero, un versacuero y una duocalina.

Un anticuerpo de dominio es bien conocido en la técnica y se refiere a las unidades de unión funcionales más pequeñas de anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada o ligera de anticuerpos.

Un nanocuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a una proteína terapéutica derivada de un anticuerpo que contiene las propiedades estructurales y funcionales únicas de los anticuerpos de cadena pesada de origen natural. Estos anticuerpos de cadena pesada pueden contener un solo dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3).

Un unicuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a un fragmento de anticuerpo que carece de la región bisagra de los anticuerpos IgG4. La eliminación de la región bisagra da como resultado una molécula que es esencialmente la mitad del tamaño de los anticuerpos IgG4 tradicionales y tiene una región de unión univalente en lugar de la región de unión bivalente de los anticuerpos IgG4.

Un aficuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a proteínas de afinidad basadas en un dominio de proteína de 58 residuos de aminoácidos, derivado de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A estafilocócica.

Las DARPinas (proteínas de repetición de anquirina diseñadas) son bien conocidas en la técnica y se refieren a una tecnología DRP (proteína de repetición diseñada) mimética de anticuerpos desarrollada para explotar las capacidades de unión de proteínas que no son anticuerpos.

Las anticalinas son bien conocidas en la técnica y se refieren a otra tecnología mimética de anticuerpos, en la que la especificidad de unión se deriva de las lipocalinas. Las anticalinas también se pueden formatear como proteínas de doble direccionamiento, llamadas duocalinas.

Los avímeros son bien conocidos en la técnica y se refieren a otra tecnología mimética de anticuerpos.

Los versacuerpos son bien conocidos en la técnica y se refieren a otra tecnología mimética de anticuerpos. Son pequeñas proteínas de 3-5 kDa con >15% de cisteínas, que forman una estructura de alta densidad de disulfuro, reemplazando el núcleo hidrofóbico que tienen las proteínas típicas.

En una realización, la proteína es monovalente y se selecciona preferiblemente de un anticuerpo monovalente completo, un anticuerpo monovalente humanizado, un anticuerpo monocatenario, un Fv, un Fab o un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un unicuerpo, un anticuerpo de dominio y un nanocuerpo; o un mimético de anticuerpo monomérico seleccionado del grupo que consiste en un aficuerpo, una afilina, una afitina, una adnectina, un atrímero, una evasina, una DARPina, una anticalina, un avímero, un finómero y un versacuerpo. Dicha proteína puede ser un inmunoconjugado que comprenda un anticuerpo o un fragmento del mismo conjugado con un agente terapéutico.

Dicha proteína puede ser un conjugado que comprenda la proteína de la invención conjugada con un agente de formación de imágenes. Dicha proteína podría usarse, por ejemplo, para aplicaciones de formación de imágenes. Dicha proteína puede ser un anticuerpo monoclonal.

Dicha proteína puede ser un anticuerpo policlonal.

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención tiene una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: GYTFTSYNMH (SEQ ID NO: 1);

VH-CDR2: GIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2); y

VH-CDR3: GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3).

La numeración y definición de CDR están de acuerdo con la definición de Kabat/Chothia.

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención tiene una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR1: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 4);

VL-CDR2: RVSNRFS (SEQ ID NO: 5); y

VL-CDR3: LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención comprende:

- en la cadena pesada, al menos una de las siguientes CDR: GYTFTSYNMH (SEQ ID NO: 1), GIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2) y GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3), y/o

- en la cadena ligera, al menos una de las siguientes CDR: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 4), RVSNRFS (SEQ ID NO: 5), y LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las 3 CDR, la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las 3 CDR, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6.

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las 3 CDR, la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, y en su cadena ligera las 3 CDR, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6.

El anticuerpo anti-hGPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las 3 CDR, la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, y en su cadena ligera las 3 CDR, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, donde opcionalmente uno, dos, tres o más de los aminoácidos en cualquiera de dichas secuencias pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.

Cualquiera de las CDR 1, 2 y 3 de las cadenas pesada y ligera puede caracterizarse por tener una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99% de identidad con la CDR particular o conjuntos de CDR enumeradas en la SEQ ID NO correspondiente.

El anticuerpo anti-hGPVI o el fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo que tiene:

(i) las secuencias de aminoácidos de CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) como se muestra en la SEQ ID NO: 1, 2 y 3 respectivamente; y

(ii) las secuencias de aminoácidos de CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en la SEQ ID NO: 4, 5 y 6 respectivamente;

donde opcionalmente uno, dos, tres o más de los aminoácidos en cualquiera de dichas secuencias pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.

De acuerdo con la invención, el anticuerpo anti-GPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7.

(SEQ ID NO: 7)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGGI

YPGNGDTSYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTVVG

D W YFD VWGQGTL VT VS S

De acuerdo con la invención, el anticuerpo anti-GPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención comprende una región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 8.

(SEQ ID NO: 8)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIY

RVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDTATYYCLQLTHVPWTFGQGTKV

E1TR

En una realización no abarcada por las reivindicaciones, el anticuerpo anti-GPVI o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9.

(SEQ ID NO: 9)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIY

RVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTTSSLQPEDFATYYCLQLTHVPWTEGQGTKV

E1KR

En una realización de la invención, el anticuerpo anti-GPVI (anticuerpo ACT017) o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 8.

En una realización no abarcada por las reivindicaciones, el anticuerpo anti-GPVI (anticuerpo ACT006) o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9.

Uno, dos, tres o más de los aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada o de cadena ligera como se describió anteriormente en el presente documento pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

Un anticuerpo de la invención puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo ACT017 descrito en el presente documento, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la proteína de la invención.

En una realización no abarcada por las reivindicaciones, un anticuerpo comprende regiones variables de cadena ligera y pesada que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo ACT006 descrito en el presente documento, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de la proteína.

La región variable de cadena pesada puede abarcar secuencias que tienen 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 7.

La región variable de cadena ligera puede abarcar secuencias que tienen 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9.

En cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, ACT017 o ACT006, la región variable especificada y las secuencias de CDR pueden comprender modificaciones de secuencia conservadoras. Las modificaciones de secuencia conservadoras se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en el arte, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son típicamente aquellas en las que un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. La región variable especificada y las secuencias de CDR pueden comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos. Cuando se realicen sustituciones, las sustituciones preferidas serán modificaciones conservadoras. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede analizarse para determinar la función retenida (es decir, las propiedades establecidas en el presente documento) utilizando los ensayos descritos en el presente documento.

La divulgación también proporciona un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo que los anticuerpos ACT017 o ACT006. Un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo que los anticuerpos ACT017 o ACT006 se denominará anticuerpo similar a ACT017 o similar a ACT006, respectivamente.

Los anticuerpos anti-hGPVI que comprenden dominios VH y VL, o sus CDR, pueden comprender dominios CH1 y/o dominios CL, cuya secuencia de aminoácidos es total o sustancialmente humana. Cuando la proteína de unión a antígeno de la invención es un anticuerpo destinado al uso terapéutico humano, es típico que toda la región constante del anticuerpo, o al menos una parte del mismo, tenga una secuencia de aminoácidos completa o sustancialmente humana. Por lo tanto, una o más o cualquier combinación del dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) pueden ser total o sustancialmente humanos con respecto a su secuencia de aminoácidos. Ventajosamente, el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) pueden tener todos una secuencia de aminoácidos completa o sustancialmente humana. En el contexto de la región constante de un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo, el término "sustancialmente humana" se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %. o al menos el 95%, o al menos el 97%, o al menos el 99% con una región constante humana. El término "secuencia de aminoácidos humana" en este contexto se refiere a una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen de inmunoglobulina humana, que incluye genes de línea germinal, reordenados y mutados somáticamente. La invención también contempla proteínas que comprenden dominios constantes de secuencia "humana" que han sido alterados, por una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia humana, excepto aquellas realizaciones donde la presencia de una región bisagra "totalmente humana" se requiere expresamente. La presencia de una región bisagra "totalmente humana" en los anticuerpos anti-hGPVI de la invención puede ser beneficiosa tanto para minimizar la inmunogenicidad como para optimizar la estabilidad del anticuerpo. Se considera que se pueden realizar una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos dentro de la región constante de la cadena pesada y/o ligera, particularmente dentro de la región Fc. Las sustituciones de aminoácidos pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido sustituido por un aminoácido natural diferente, o por un aminoácido no natural o modificado. También se permiten otras modificaciones estructurales, como por ejemplo cambios en el patrón de glicosilación (por ejemplo, mediante la adición o eliminación de sitios de glicosilación unidos a N a O). Dependiendo del uso previsto del anticuerpo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a sus propiedades de unión a los receptores de Fc, por ejemplo, para modular la función efectora. Por ejemplo, se pueden introducir un residuo o residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una función efectora mejorada. Véase Caron et al., J. Exp. Med.

176: 1191 - 1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)).

Otro objetivo de la divulgación es una secuencia nucleica aislada que codifica la región variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO: 7. Preferiblemente, dicha secuencia nucleica es la SEQ ID NO: 10:

(SEQ ID NO: 10)

CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCA

GTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGC

ACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGGTATTT

ATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCCAGGGCCGAGTTA

CTATGACTCGGGACACTTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTCAGCAGCCT

GAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGCACCGTGGTCGG

CGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTGAGCAG

T

Otro objetivo de la divulgación es una secuencia nucleica aislada que codifica la región variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO: 8. Preferiblemente, dicha secuencia nucleica es la SEQ ID NO: 11:

(SEQ ID NO: 11)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGAC

AGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGA

AACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTG

CTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCG

GTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAG

AGGAC ATCGCC ACCT ACT ACTGCCTCC AGCTG ACTC ATGTCCC AT GG ACCTT

CGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCACCCGG

Otro objetivo de la divulgación es una secuencia nucleica aislada que codifica la región variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO: 9. Preferiblemente, dicha secuencia nucleica es la SEQ ID NO: 12

(SEQ ID NO: 12)

G ACATCCAG ATG ACCCAG AG CCCAAG CAG CCTG AG CG CCAG CG TG G G TG AC

AG AG TG ACC ATC ACC TG TAG TG C CAG TC AG AG C CTTG AG AACAG C AACG G A

AACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTG

CTG ATCTAC AG AG TTTCC AAC CG ATTC TC TG G TG TG CC AAG C AG ATTCAG C G

G TAG CG G TAG CG G TACCG ACTTCACCCTCACCATCAG CAG CCTCCAG CCAG

AGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTT

CGGT CAG G G CACCAAG G TG G AG ATCAAACG C

Otro objetivo de la invención es un vector de expresión que comprende las secuencias nucleicas que codifican el anticuerpo anti-GPVI de la invención. En una realización, el vector de expresión de la invención comprende al menos uno de la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de ácido nucleico que comparta al menos el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 10-12.

El vector puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 10 y una secuencia que codifica una región constante de una cadena pesada. Un ejemplo no limitativo de una secuencia que codifica una región constante de una cadena pesada es la SEQ ID NO: 14

(SEQ ID NO: 14)

GCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTCiGCACCCTCCTCCAAGAGCA

CCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGA

ACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC

CTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG

ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT

CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCTAAGTCATG

CGACAAGACTCAC

El vector puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12 y una secuencia que codifica una región constante de una cadena ligera. Un ejemplo no limitativo de una secuencia que codifica una región constante de una cadena ligera es la SEQ ID NO: 15.

(SEQ ID NO: 15)

ACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGA

AATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGA

GGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCA

GGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCA

GCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCT

GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACC

GGGGAGAGTGT

El vector puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal. Los ejemplos no limitantes de secuencias de péptidos señal incluyen, pero no se limitan a, la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17

(SEQ ID NO: 16)

ATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTC

GTGGTGCTAGATGT

(SEQ ID NO: 17)

ATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAGCTACAGGTGCTC

ATTCA

El vector puede comprender la SEQ ID NO: 10, y una secuencia que codifica una región constante de una cadena pesada (tal como, por ejemplo, la SEQ ID NO: 14), y una secuencia de péptido señal. Un ejemplo de dicho vector es un vector que comprende la SEQ ID NO: 18. La SEQ ID NO: 18 comprende además sitios de clonación.

(SEQ ID NO: 18)

GCGGCCGCCACCATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAG

CTACAGGTGCTCATTCACAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGA

AGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACAT

TTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGG

AATGGATGGGAGGTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGA

AGTTCC AGGGCCG A GTT ACT ATG ACTCGGG AC ACTTCC ACCTCTAC AGTGT A

CATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGC

AAGAGGCACCGTGGTCGGCGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCAC

CCTGGTCACCGTGAGCAGTGCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTG

GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGG

TCAAGGACTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTA

CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC

CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAA

AGTCGAGCCTAAGTCATGCGACAAGACTCACTGATGAGGATCC

El vector puede comprender la SEQ ID NO: 8, y una secuencia que codifica una región constante de una cadena ligera (tal como, por ejemplo, la SEQ ID NO: 15), y una secuencia de péptido señal. Un ejemplo de dicho vector es un vector que comprende la SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 19 comprende además sitios de clonación.

(SEQ ID NO: 19)

GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGC

TTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCA

GCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTC

AGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGA

AGCC AGGT A AGGCTCC A A AGCTGCT G AT CT AC AGAGTTTCC A ACCGATTCTC

TGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTT

CACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTCCA

GCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAC

CCGGACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAG

TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCAC

GGGAGGCCAAGGT AC AGT GGA AGGTGGAT A ACGCCCTCC A ATCCGGT A ACT

CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTAC

GCCTGCG A AGT C ACCC ATC AGGGCCTG AGTTCCCCTGTC AC A A AG AGCTT C

AACCGGGGAGAGTGTT G ATGAT ATC

El vector puede comprender la SEQ ID NO: 9, y una secuencia que codifica una región constante de una cadena ligera (tal como, por ejemplo, la SEQ ID NO: 15), y una secuencia de péptido señal. Un ejemplo de dicho vector es un vector que comprende la SEQ ID NO: 20. La SEQ ID NO: 20 comprende además sitios de clonación.

(SEQ ID NO: 20)

GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGC

TTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCA

GCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGTGCCAGTC

AGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGA

AGCC AGGT AAGGCTCC A A AGCTGCTGATCT ACAG AGTTTCC A ACCGATTCTC

TGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCCT

CACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAG

CTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAA

CGCACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGT

TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACG

GGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTC

CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA

GCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACG

CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCA

ACCGGGG AGAGTGTTGATG AT ATC

La célula huésped puede usarse para la producción recombinante de los anticuerpos de la invención. Las células huésped pueden ser células procariotas, levaduras o eucariotas, preferiblemente células de mamífero, tales como, por ejemplo: línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977))); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de mieloma de ratón SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) o NSO (colecciones de cultivos de HPA n.° 85110503); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (Md CK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2), así como la línea celular PERC-6 de DSM. Los vectores de expresión adecuados para su uso en cada una de estas células huésped también son generalmente conocidos en la técnica. Cabe señalar que el término "célula huésped" generalmente se refiere a una línea celular cultivada. Los seres humanos completos en los que se ha introducido un vector de expresión que codifica una proteína de unión a antígeno de acuerdo con la invención están explícitamente excluidos de la definición de "célula huésped".

Un método que se puede utilizar para producir un anticuerpo anti-hGPVI o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende cultivar células huésped que contienen la secuencia polinucleotídica aislada que codifica el anticuerpo anti-hGPVI en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-hGPVI, y recuperar el anticuerpo antihGPVI expresado. Este proceso recombinante se puede utilizar para la producción a gran escala de anticuerpos antihGPVI de acuerdo con la invención, incluidos los anticuerpos monoclonales destinados a usos terapéuticos, diagnósticos in vitro, ex vivo, in vivo. Estos procesos están disponibles en la técnica y serán conocidos por los expertos.

La proteína de la invención se puede purificar por cromatografía, preferiblemente por cromatografía de afinidad, más preferiblemente por cromatografía de afinidad en proteína L agarosa.

La proteína de la invención puede comprender un dominio para unirse a la proteína L (PpL). Los métodos para transferir la actividad de unión de PpL a las proteínas de la invención se describen en Muzard et al., Analytical Biochemistry 388, 331-338, 2009 y en Lakhrif et al., MAbs. 2016; 8(2): 379-88, que se incorporan en el presente documento como referencia.

Los fragmentos y derivados de anticuerpos de esta divulgación (que están abarcados por el término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto), en particular un anticuerpo similar a ACT017 o similar a ACT006, puede producirse mediante técnicas conocidas en el arte. Los "fragmentos" comprenden una porción del anticuerpo intacto, generalmente el sitio de unión al antígeno o la región variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea una proteína que tenga una estructura primaria que consista en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en el presente documento "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "proteína de cadena sencilla"), incluidos, pero no se limitan a, (1) moléculas de Fv de cadena sencilla, (2) proteínas de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un residuo de cadena pesada asociado y (3) proteínas de cadena sencilla que contienen solo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin un residuo de cadena ligera asociado; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Pueden obtenerse fragmentos de los presentes anticuerpos usando métodos estándar. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos Fab o F(ab')2 mediante digestión con proteasa de los anticuerpos aislados, de acuerdo con técnicas convencionales. Se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos pueden modificarse utilizando métodos conocidos, por ejemplo, para ralentizar la eliminación in vivo y obtener un perfil farmacocinético más deseable, el fragmento puede modificarse con polietilenglicol (PEG). Los métodos para acoplamiento y conjugación específica del sitio de PEG con un fragmento Fab' se describen, por ejemplo, en Leong et al., Cytokines 16 (3): 106-119 (2001) y Delgado et al., Br. J. Cancer 73 (2): 175-182 (1996), cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia.

Alternativamente, el ADN que codifica un anticuerpo de la divulgación, en particular un anticuerpo similar a ACT017 o similar a ACT006, puede modificarse para codificar un fragmento. Luego, el ADN modificado se inserta en un vector de expresión y se usa para transformar o transfectar una célula apropiada, que luego expresa el fragmento deseado.

Un objetivo de la invención es una composición que comprende al menos una de las proteínas de la invención como se describió en el presente documento anteriormente.

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas de la invención descritas anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica), polietilenglicol, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque en polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Otro objetivo de la invención es un medicamento que comprende al menos una de las proteínas de la invención tal como se describió en el presente documento anteriormente.

En una realización, dicha proteína es un anticuerpo anti-hGPVI o un fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe la señalización de GPVI y/o la señalización de un ligando de GPVI. Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" significa que la proteína es capaz de bloquear, reducir, prevenir o neutralizar la interacción de GPVI con sus ligandos, la señalización de GPVI y/o la activación de moléculas de la ruta de señalización de GPVI.

Los ejemplos de ligandos de GPVI incluyen, pero no se limitan a, colágeno, fibrina, fibronectina, vitronectina y lamininas.

En una realización, dicha proteína es un anticuerpo anti-hGPVI neutralizante.

En una realización, dicha proteína inhibe la unión de GPVI a un ligando de la misma (tal como, por ejemplo, colágeno, fibrina o cualquier otro ligando de GPVI capaz de inducir la activación de plaquetas y la señalización secuencia abajo).

En una realización, dicha proteína inhibe y/o previene la agregación plaquetaria en respuesta a un ligando de GPVI, tal como por ejemplo el colágeno. En una realización, dicha proteína inhibe y/o previene la adhesión plaquetaria a un ligando de GPVI, tal como por ejemplo colágeno.

En una realización, dicha proteína inhibe y/o previene la producción de trombina dependiente de GPVI en respuesta a un ligando de GPVI, tal como por ejemplo la fibrina. En una realización, dicha proteína inhibe y/o previene la producción de trombina catalizada por plaquetas en respuesta al colágeno y/o al factor tisular.

En una realización, dicha proteína inhibe y/o previene el reclutamiento de plaquetas por un ligando de GPVI (tal como, por ejemplo, fibrina) a través de GPVI.

En una realización, la proteína de la invención induce la saturación de plaquetas en sangre completa o en plasma rico en plaquetas cuando está presente en una concentración que oscila de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 |jg/mL, preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 jg/mL, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 jg/m L (que corresponde a aproximadamente 2 a aproximadamente 200 nM, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM, y más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nM).

En una realización, la proteína de la invención inhibe la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuando se usa a una concentración de al menos aproximadamente 15 jg/mL, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 |jg/mL, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 5 jg/mL. Preferiblemente, la proteína de la invención inhibe completamente la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuando se usa a tales concentraciones.

En una realización, la IC50 de la proteína de la invención para inhibir la agregación plaquetaria inducida por colágeno varía de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 jg/mL, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 jg/mL, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 3.2 jg/mL.

En una realización, la concentración de la proteína de la invención que reduce en un 50 % la velocidad de agregación plaquetaria inducida por colágeno oscila de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 jg/mL, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 jg/mL, más preferiblemente de aproximadamente 2 jg/mL.

En una realización, la concentración de la proteína de la invención que reduce la intensidad de la agregación plaquetaria inducida por colágeno varía de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 jg/mL, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 jg/mL, más preferiblemente de aproximadamente 3.2 jg/mL. En una realización, la proteína de la invención no induce el agotamiento de GPVI cuando se administra in vivo, tal como, por ejemplo, cuando se administra a una dosis que oscila entre 0.01 y 500 mg.

En una realización, la proteína de la invención no induce una disminución en el recuento de plaquetas, es decir, trombocitopenia, cuando se administra in vivo, tal como, por ejemplo, cuando se administra a una dosis que oscila entre 0.01 y 500 mg.

La presente invención también se refiere a una proteína, una composición, una composición farmacéutica o un medicamento como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la GPVI.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se ha descrito anteriormente en el presente documento se usa para modular las interacciones leucocitos-plaquetas y plaquetasendotelio en la inflamación y/o trombosis. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar la inflamación y/o la trombosis.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para modular, preferiblemente para prevenir, la agregación y desgranulación de las plaquetas.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos asociados con megacariocitos y/o proliferación, diferenciación, morfología, migración, agregación, desgranulación y/o función anormal o aberrante. Los ejemplos de estos trastornos incluyen, pero no se limitan a, trastornos hemorrágicos (tales como, por ejemplo, tendencia al sangrado y/o tiempo de sangrado prolongado) tal como trombocitopenia tal como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) o trombocitopenia inmunitaria.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos trombóticos (tales como, por ejemplo, la oclusión trombótica de las arterias coronarias), trastornos hemorrágicos, enfermedades que muestran disfunción plaquetaria cuantitativa o cualitativa y enfermedades que muestran disfunción endotelial. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades de las arterias coronarias y de las arterias cerebrales.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar enfermedades vasculares cerebrales, que incluyen accidente cerebrovascular e isquemia, enfermedades de tromboembolismo venoso (tales como, por ejemplo, enfermedades que involucran hinchazón, dolor y ulceración de piernas, embolismo pulmonar, trombosis venosa abdominal), microangiopatías trombóticas, púrpura vascular.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar síntomas asociados con trastornos y/o enfermedades plaquetarias (tales como, por ejemplo, trastornos hemorrágicos). En particular, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se puede usar para modular los síntomas asociados con la ITP tales como púrpura y problemas hemorrágicos graves.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar enfermedades coronarias (tales como, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares que incluyen angina de pecho inestable, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, enfermedad arterial coronaria, revascularización coronaria, reestenosis coronaria, tromboembolismo ventricular, aterosclerosis, arteriopatía coronaria (por ejemplo, trastornos arteriales oclusivos), formación de placa, isquemia cardíaca, incluidas las complicaciones relacionadas con los procedimientos coronarios, tales como los procedimientos de angioplastia arterial coronaria percutánea (angioplastia con balón)). Con respecto a los procedimientos coronarios, dicho tratamiento se puede lograr mediante la administración de una proteína de la invención antes, durante o después del procedimiento. En una realización preferida, dicha administración se puede utilizar para prevenir la isquemia cardíaca aguda después de la angioplastia.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos resultantes de cualquier daño a los vasos sanguíneos que puede dar como resultado la agregación plaquetaria. Dichas agresiones a los vasos sanguíneos incluyen, pero no se limitan a, lesiones en las paredes de los vasos, tales como lesiones en los vasos que dan como resultado una superficie altamente trombogénica expuesta dentro de un vaso sanguíneo por lo demás intacto, por ej., lesiones en la pared del vaso que resultan en la liberación de ADP, trombina y/o epinefrina, tensión de cizallamiento del fluido que ocurre en el sitio del estrechamiento del vaso, rupturas y/o desgarros en los sitios de las placas ateroscleróticas, y lesión resultante de la angioplastia con balón o aterectomía

Además, en ciertas realizaciones, se prefiere que la proteína de la invención no afecte otros atributos o funciones de las plaquetas, tales como el cambio de forma de las plaquetas inducido por agonistas (por ejemplo, activación de plaquetas mediada por GPIb-vWF), liberación de componentes de gránulos plaquetarios internos, activación de vías de transducción de señales o inducción de la movilización de calcio tras la activación plaquetaria por agonistas que no interactúan con GPVI.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos asociados con la transducción de señales aberrantes en respuesta a ligandos de GPVI (que incluyen, pero no se limitan a, colágeno, fibrina, fibronectina, vitronectina y lamininas) o para otras proteínas de la matriz extracelular.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos asociados con niveles aberrantes de expresión y/o actividad de GPVⁱen células que normalmente expresan GPVI o en células que no expresan GPVI. Por ejemplo, la proteína de la invención se puede usar para modular trastornos asociados con la expresión aberrante de GPVI en células cancerosas (por ejemplo, tumorales) que normalmente no expresan GPVI. Dichos trastornos pueden incluir, por ejemplo, los asociados con la migración de células tumorales y la progresión a metástasis.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para modular las funciones inmunorreguladoras de las plaquetas.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos del hígado, la médula ósea y la sangre periférica.

En otra realización, la proteína, composición, composición farmacéutica o medicamento como se describió anteriormente en el presente documento se usa para tratar trastornos en los que las plaquetas contribuyen modulando las respuestas inflamatorias que incluyen, sin limitación, inflamación sostenida o prolongada asociada con infección, artritis, fibrosis o trastornos en los que las plaquetas modulan las funciones celulares incluyendo, sin limitación, la proliferación y/o diseminación de células cancerosas.

Otros ejemplos de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con GPVI incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardiovasculares y/o eventos cardiovasculares, tales como, por ejemplo, trombosis arterial que incluye aterotrombosis, eventos isquémicos, síndrome de arteria coronaria aguda, infarto de miocardio (ataque cardiaco isquemia cerebrovascular aguda (accidente cerebrovascular), intervención coronaria percutánea, trombosis por colocación de cánula intraluminal isquémica, restenosis, isquemia (aguda y crónica), enfermedades de la aorta y sus ramificaciones (tales como aneurisma aórtico, trombosis), enfermedad arterial periférica, trombosis venosa, flebitis aguda y embolismo pulmonar, trombosis asociada a cáncer (síndrome de Trousseau), trombosis inflamatoria y trombosis asociada a infección.

En una realización, la composición farmacéutica o medicamento de la invención es para uso en el tratamiento de trombosis arterial o venosa, restenosis, síndrome coronario agudo o accidentes cerebrovasculares debidos a aterosclerosis, preferiblemente trombosis.

Preferiblemente, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la invención al sujeto que la necesita.

Se entenderá que el uso diario total de la proteína de la invención, composición, composición farmacéutica o medicamento de la presente invención lo decidirá el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la enfermedad que se está tratando y la gravedad de la enfermedad; actividad de la proteína específica empleada; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción de la proteína específica empleada; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentes con la proteína específica empleada; y factores similares bien conocidos en las artes médicas. Por ejemplo, está bien dentro de la experiencia en la técnica comenzar las dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de la proteína puede variar en un amplio intervalo de aproximadamente 0.01 a 500 mg por adulto por día. Preferiblemente, las composiciones contienen aproximadamente 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Un medicamento contiene típicamente de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1000 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo.

En una realización, el sujeto está afectado por, preferiblemente se le diagnostica una enfermedad, trastorno o afección relacionada con GPVI, preferiblemente una enfermedad y/o evento cardiovascular.

En otra realización, el sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con GPVI, preferiblemente una enfermedad y/o evento cardiovascular. Los ejemplos de riesgo incluyen, pero no se limitan a, antecedentes familiares (tales como, por ejemplo, predisposición genética), origen étnico, edad, exposición al tabaco, presión arterial alta (hipertensión), colesterol alto, obesidad, inactividad física, diabetes (en particular diabetes tipo 2 ), dietas poco saludables y consumo nocivo de alcohol.

Para uso en administración a un sujeto, la composición se formulará para administración al sujeto. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, por atomización para inhalación, por vía rectal, nasal o a través de un reservorio implantado. El término administración utilizado en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Los ejemplos de formas adaptadas para inyección incluyen, pero no se limitan a, soluciones, tales como, por ejemplo, soluciones acuosas estériles, geles, dispersiones, emulsiones, suspensiones, formas sólidas adecuadas para usar para preparar soluciones o suspensiones al agregar un líquido antes de su uso, tales como, por ejemplo, polvo, formas liposomales y similares.

Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser acuosas o una suspensión oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en el arte usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras formas de dosificación farmacéuticamente aceptables también se pueden usar para fines de formulación.

Los programas y dosis para la administración de la proteína en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden determinar de acuerdo con métodos conocidos para estos productos, por ejemplo, utilizando las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, una proteína presente en una composición farmacéutica de esta invención se puede suministrar a una concentración que oscila de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/mL, tal como, por ejemplo, a una concentración de 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 50 mg/mL o 100 mg/mL. En una realización, la proteína se suministra a una concentración de aproximadamente 10 mg/mL en viales de un solo uso de 100 mg (10 mL) o 500 mg (50 mL). En una realización, la composición farmacéutica de la invención puede comprender una proteína de la invención en PBS pH 7.2 - 7.7. Se apreciará que estos programas son ejemplos y que se puede adaptar un programa y un régimen óptimos teniendo en cuenta la afinidad y tolerabilidad del anticuerpo particular en la composición farmacéutica que se debe determinar en los ensayos clínicos.

La proteína de la invención se puede utilizar in vitro o in vivo para identificar muestras, tejidos, órganos o células que expresan GPVI.

Los ejemplos de ensayos en los que se puede utilizar la proteína de la invención incluyen, pero no se limitan a, ELISA, ELISA tipo sándwich, RIA, FACS, inmunohistoquímica tisular, transferencia Western e inmunoprecipitación.

La muestra es una muestra biológica. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, preferiblemente sangre, más preferiblemente suero sanguíneo, plasma, líquido sinovial, líquido de lavado broncoalveolar, esputo, linfa, líquidos ascíticos, orina, líquido amniótico, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido pericárdico y macrófagos alveolares, lisados de tejidos, biopsias y extractos preparados a partir de tejidos enfermos.

El término "muestra" pretende significar una muestra tomada de un individuo antes de cualquier análisis.

La proteína de la invención se puede marcar con fines de diagnóstico o detección. Por etiquetado en el presente documento se entiende que un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico unido para permitir la detección del compuesto. Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas isotópicas tales como isótopos radiactivos o pesados; etiquetas magnéticas, eléctricas o térmicas y tintes coloreados o luminiscentes. Los ejemplos de colorantes luminiscentes incluyen, pero no se limitan a, complejos de lantánidos, puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo Lucifer, azul cascada, rojo Texas, tintes Alexa y tintes cy.

Otro objetivo de la divulgación es un kit que comprende al menos una proteína de la invención.

Por "kit" se entiende cualquier fabricación (por ejemplo, un empaque o un contenedor) que comprende al menos un reactivo, es decir, por ejemplo, un anticuerpo, para detectar específicamente la expresión de GPVI. El kit puede promocionarse, distribuirse o venderse como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. Además, cualquiera o todos los reactivos del kit pueden proporcionarse dentro de recipientes que los protejan del entorno externo, tal como en recipientes sellados. Los kits también pueden contener un prospecto que describa el kit y los métodos para su uso.

En una realización, la administración de una proteína de la invención a un sujeto no induce el agotamiento de GPVI in vivo.

En una realización, la administración de una proteína de la invención a un sujeto no induce una disminución del recuento de plaquetas. Por lo tanto, en una realización, la administración de una proteína de la invención a un sujeto no induce trombocitopenia.

En una realización, la administración de una proteína de la invención a un sujeto no induce un aumento del tiempo de sangrado.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía de un gel teñido con azul de Coomassie, que muestra la proteína de la invención. MM: marcador de peso molecular, FT: fracción de flujo continuo, PX: proteína purificada (eluida de la columna de agarosa con Proteína L). CM: medios acondicionados para cultivo de células.

La Figura 2 es un gráfico que muestra las curvas de unión de isotermas de dos Fab humanizados de la invención. La GPVI-Fc purificada se revistió sobre placas de microtitulación y las proteínas purificadas se añadieron a concentraciones crecientes. Después del lavado, las proteínas unidas se revelaron utilizando un anticuerpo específico acoplado a fosfatasa alcalina frente al fragmento Fab humano y se midió la hidrólisis del sustrato de fosfatasa alcalina a 485 nm.

La Figura 3 es una curva obtenida por citometría de flujo con ACT017 acoplado a Alexa488. El ACT017 se acopló al A488 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió A488-ACT017 en concentraciones crecientes a sangre humana completa anticoagulada o plasma rico en plaquetas de un voluntario sano. Después de 20 min a temperatura ambiente, las muestras se diluyeron y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. La fluorescencia media de las plaquetas se representa en función de la concentración de ACT017 acoplada a A488. Datos de un experimento representativo de 3.

La Figura 4 es una curva que muestra la agregación plaquetaria medida en plasma rico en plaquetas (PRP) humanas. El PRP se incubó previamente con concentraciones crecientes de ACT017 purificado durante 10 min a 37 °C sin agitación antes de que el colágeno desencadenara la agregación plaquetaria (1 pg.mL-1). La incubación se prolongó a 37 °C con agitación y registro continuo de cambios en la transmisión de luz. Datos de un experimento representativo de 3.

La Figura 5 es un gráfico que muestra la capacidad de ACT017 para inhibir la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuantificada en la velocidad y la intensidad de la respuesta. La intensidad y la velocidad de la agregación plaquetaria se midieron en cada concentración de ACT017. Las respuestas residuales se calcularon como la relación entre la respuesta en presencia de ACT017 y la respuesta en ausencia de ACT017 x100 y se representan en función de la concentración de ACT017 utilizando la curva de competencia de regresión no lineal (log (inhibidor) frente a la respuesta) (tres parámetros) del software Graph Pad Prism (5.0). Las curvas son de un experimento representativo de 3.

La Figura 6 es una combinación de gráficos que muestran la agregación plaquetaria inducida por colágeno. Se informa el grado máximo de agregación plaquetaria provocada por la adición de colágeno (1 pg/mL) al plasma rico en plaquetas (PRP) de ratones que recibieron un vehículo o dosis crecientes de ACT017.

La Figura 7 es una combinación de gráficos que muestran la expresión de GPVI en plaquetas. La sangre obtenida antes de la inyección y 30 minutos después de la inyección del vehículo o de dosis crecientes de ACT017 se incubó con un anticuerpo monoclonal 3J24 anti-GPVI acoplado con FITC. Panel izquierdo: fluorescencia media de plaquetas de ratones tratados con vehículo (ACT170 mg/kg) o ACT017 a diferentes dosis. Paneles medio y derecho: se informa la evolución de la expresión de GPVI entre el tiempo previo a la inyección y 30 min después de la inyección para animales individuales tratados con el vehículo o con ACT017 (4 mg/kg).

La Figura 8 es un gráfico que muestra el número de plaquetas en sangre de ratones después de la administración de ACT017 (4 mg/kg) o del vehículo (ACT170 mg/kg).

La Figura 9 es una combinación de gráficos que muestran el tiempo de sangrado (A) y la pérdida de sangre (B) de ratones 30 min después de la administración de vehículo (Ctrl), ACT017 (4 mg/kg) o clopidogrel, un antagonista del receptor de ADP de P2Y12 en plaquetas (10 mg/kg).

La Figura 10 es una combinación de gráficos que muestran la intensidad media ± SEM (A) y velocidad (B) de agregación plaquetaria inducida por colágeno medida 30 minutos y 2 horas después del final de una infusión de 15 minutos de dosis crecientes de ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) a monos cangrejeros (n = 4).

La Figura 11 muestra el recuento de plaquetas en sangre de cangrejeros medido antes de cualquier tratamiento (T0) o 24 horas después de la infusión de vehículo o ACT017 en dosis crecientes (1, 2, 4, 8 mg/kg).

La Figura 12 es una combinación de gráficos que muestran el tiempo de sangrado medido en 4 sujetos, antes del tratamiento (Tiempo = 0) y 30 min y 2 horas después de la infusión de ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) o vehículo a monos cangrejeros.

La Figura 13 es una combinación de gráficos que muestran la intensidad media ± DE (A) y la velocidad (B) de la agregación plaquetaria inducida por colágeno medida en diferentes momentos después del comienzo de una infusión de una hora de dos dosis de ACT017 (2 y 8 mg/kg) a monos cangrejeros (n = 8).

La Figura 14 es un gráfico que muestra el nivel de expresión de GPVI medido por citometría de flujo en las plaquetas de monos cangrejeros (n = 8) en diferentes momentos después del comienzo de una infusión de una hora de ACT017 a razón de 2 mg/kg (MFI: Intensidad media de fluorescencia).

Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Producción de ACT017 y ACT006

Los anticuerpos ACT017 y ACT006 (fragmentos Fab) se produjeron en células CHO-S (Invitrogen) mediante transfección transitoria, usando condiciones estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En resumen, inmediatamente antes de la transfección, las células CHO-S se dividieron y sembraron en 10 mL de medio de cultivo sin suero a una densidad de 0.5 -1.0 x 106 células/mL. A continuación, las células se transfectaron con un vector que comprende una secuencia que codifica una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de la invención. Los sobrenadantes de cultivo se recuperaron 4 a 5 días después de la transfección, cuando la viabilidad celular era inferior al 80 %.

Para ACT017, las células se transfectaron usando un vector que comprende la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 18, donde la SEQ ID NO: 19 comprende secuencias que codifican las regiones constante y variable de la cadena ligera de ACT017 fusionadas a una secuencia de péptido señal y sitios de clonación, y en donde la SEQ ID NO: 18 comprende secuencias que codifican las regiones constante y variable de la cadena pesada de ACT017 fusionadas con una secuencia de péptido señal y sitios de clonación.

Para ACT006, las células se transfectaron usando un vector que comprende la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 18, donde la SEQ ID NO: 20 comprende secuencias que codifican las regiones constante y variable de la cadena ligera de ACT006 fusionadas a una secuencia de péptido señal y sitios de clonación, y en donde la SEQ ID NO: 18 comprende secuencias que codifican las regiones constante y variable de la cadena pesada de ACT006 fusionadas con una secuencia de péptido señal y sitios de clonación.

Para la purificación, los medios acondicionados de células transfectadas transitoriamente con el ADNc del Fab humanizado se aplicaron en una columna de proteína L - agarosa (Proteína L Agarosa PIERCE catálogo n° 20510017) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Fab se eluyó utilizando Glicina 0.1 M pH 2.5 y las fracciones se recogieron en Tris 1 M pH 11 para neutralizar el pH. Después de la diálisis contra PBS, la concentración de Fab se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm y 320 nm para corregir la dispersión de la luz y usando un valor de absorbancia para soluciones al 0.1 % (A280nm, 01%) de 1.5 como se determina a partir de la secuencia. La concentración de proteína se confirmó mediante un ensayo BCA. La pureza del Fab se evaluó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.

Como se muestra en la Figura 1, en condiciones no reductoras, el Fab humanizado purificado migró como una banda principal de 42 kDa de acuerdo con su secuencia de aminoácidos. Después de la reducción del puente de disulfuro, se observó un doblete a 23-24 kDa correspondiente a las cadenas pesada y ligera.

Ejemplo 2: Unión a GPVI-Fc

La GPVI-Fc soluble se produjo como sigue: el marco de lectura abierto del dominio extracelular predicho de GPVI se amplificó por PCR a partir de la secuencia de Kozak antes de la primera metionina hasta la asparagina 269, inmediatamente antes de la secuencia transmembrana predicha. El fragmento de PCR se ligó en un vector huésped pCDM8 que contenía la secuencia genómica del dominio Fc de IgG1 humana, de modo que la parte extracelular del ADNc de hGPVI se fusionó en su extremo terminal C mediante un enlazador de 3 alaninas a la secuencia de hFc. El constructo de ADN secuenciado se transfectó en células HEK 293T. La GPVI-Fc se purificó a partir de los medios acondicionados de las células mediante cromatografía de afinidad en proteína A agarosa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las placas de microtitulación se recubrieron con GPVI-Fc en PBS (2 pg/mL, 100 pL por pozo) durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión no específicos se saturaron con 100 pL de BSA al 1 % en PBS durante 120 min. A continuación, las placas se incubaron con concentraciones crecientes de las preparaciones de anticuerpos (100 pL en PBS que contenía BSA al 0.1 % y Tween 20 al 0.1 %) durante 120 min. Después de 4 ciclos de lavado, las placas se incubaron con un anticuerpo de ratón acoplado a fosfatasa alcalina contra Fab humano (100 pL, en PBS que contenía BSA al 0.1 % y Tween 20 al 0.1 %) durante 120 min. Finalmente, se agregaron 100 pL de la solución de sustrato (fosfato de paranitrofenilo) a cada pocillo durante 5 min y la reacción colorimétrica se detuvo con 25 pL de NaOH 3 M antes de leer la absorbancia a 405 nm. Alternativamente, los anticuerpos unidos a GPVI se detectaron usando proteína L acoplada a peroxidasa y diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD) como sustrato, realizándose luego la lectura a 485 nm.

La Figura 2 muestra las curvas de unión de isotermas de dos Fab humanizados de la invención en GPVI-Fc inmovilizado. El análisis de las curvas permitió calcular una constante de semisaturación de 1 nM para ACT006 y 0.5 nM para ACT017.

Ejemplo 3: Resonancia de plasmón superficial (BIAcore)

La unión de ACT017, ACT006 y Fab 9012 a GPVI humana soluble se analizó con resonancia de plasmón superficial utilizando un sistema BIAcore 2000 (Uppsala, Suecia).

La GPVI-Fc soluble (producida como se describe en el Ejemplo 2) se inmovilizó en tampón de acetato 10 mM pH 6 a una dosis que oscilaba entre 960 y 1071 RU (correspondiente a aproximadamente 6.4 a 7.15 fmol/mm2) en un chip sensor de carboxi-metil-dextrano CM5 utilizando el método de acoplamiento de amina (procedimiento de Wizard). A continuación, la proteína se pasa sobre la GPVI-Fc inmovilizada en PBS pH 7.4 (fosfato 10 mM, NaCl 138 mM, KCl 2.7 mM, pH 7.42 a 25.4 °C) a un caudal de 20 pL/qmin a 25 °C. Las constantes cinéticas (KA, Kd, kasociación, kdisociación) y la afinidad se determinan utilizando el software BIAevaluation versión 3.0, ajustando los datos al modelo de unión. PBS pH 7.4 es el tampón de procesamiento.

Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1

Los anticuerpos de la invención (ACT017 y ACT006) presentan así una mayor afinidad por la GPVI soluble en comparación con el Fab 9012 monoclonal descrito en la técnica anterior y estudiado en las mismas condiciones experimentales.

Ejemplo 4: Datos biológicos

Materiales y métodos

Plaquetas humanas: Se recogió sangre de voluntarios sanos que no habían tomado medicación durante 10 días mediante venopunción en citrato de sodio al 3.2% (Vacutainer Beckton Dickinson, Le Pont-de-Clais, Francia). Todos los donantes de sangre fueron voluntarios que dieron su consentimiento libre e informado por escrito para este estudio de investigación, que se ajusta a las normas éticas de la Declaración de Helsinki.

Citometría de flujo: El Fab ACT017 humanizado se acopló a Alexa488 (Molecular Probes) de acuerdo con la recomendación del fabricante. La separación se realizó utilizando un kit de purificación de conjugados de anticuerpos (Molecular Probes) y la concentración se determinó a 280 y 494 nm. El Fab humanizado acoplado a A488 a diferentes concentraciones se incubó con plaquetas humanas en sangre completa o plasma rico en plaquetas durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la dilución en PBS, las células se analizaron mediante un citómetro de flujo clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS LSR II BD).

Agregación plaquetaria: Se obtuvo plasma humano rico en plaquetas (PRP) después de centrifugación (120 x g; 15 min; 20 °C) y se usó inmediatamente. La agregación plaquetaria se midió con el agregómetro APACT® y se inició por la adición de 1 pg.mL-1 de colágeno tipo I (colágeno Horm, Nycomed, DE) al PRP que contenía varias concentraciones de Fab humanizado y se registraron continuamente. Se midieron la velocidad y la intensidad de la agregación.

Ratones humanizados con GPVI: La línea de ratones mutantes con activación de los gp6 se estableció como se informó anteriormente al introducir la secuencia del gen gp6 humano en el exón 1 en ATG del gen gp6 de ratón (Mangin P et al., A Humanized Glycoprotein VI (GPVI) Mouse Model to Assess the Antithrombotic Efficacies of Anti-GPVI Agents. J Pharmacol Exp Ther. 2012;341(1): 156-63 doi: 10.1124/jpet.111.189050. Epub, 11 de enero de 2012). Los ratones eran viables y fértiles y no presentaban defectos hematológicos. Se detectaron aproximadamente 3700 copias de GPVI humana en la superficie de las plaquetas.

Recuento de plaquetas: Se recogió sangre completa en EDTA (6 mM) después de cortar la cola del ratón. El recuento de plaquetas se determinó en un contador celular automático scil Vet abc (Scil Animal Care Company, Holtzheim, Francia) ajustado a parámetros murinos.

Agregación plaquetaria ex vivo: Se recogió sangre en citrato trisódico antes de la inyección y 30 minutos después de la inyección de dosis crecientes de ACT017 o un volumen equivalente de vehículo y PRP obtenido por centrifugación. El recuento de plaquetas se ajustó a 300 x 109 L-1 y agregación plaquetaria desencadenada por 1 pg.mL-1 de colágeno tipo I se registró continuamente en un agregómetro CARAT TX4 de cuatro canales.

Expresión de GPVI: Las muestras de sangre se recolectaron en EDTA antes de la inyección y 30 minutos después de la inyección de dosis crecientes de ACT017 o un volumen equivalente de vehículo y se incubaron con el anticuerpo monoclonal 3J24 anti-GPVI acoplado con FITC (10 pg.mL-1) que reconoce GPVI humana en un epítopo diferente del epítopo de ACT017, y se midió la fluorescencia en un citómetro de flujo Beckman Coulter Gallios.

Tiempo de sangrado de cola y sangre perdida: La extremidad de la cola de los ratones anestesiados se cortó transversalmente con un bisturí (3 mm) y se sumergió inmediatamente en un tubo que contenía 13 mL de solución salina isotónica al 0.9% a 37 °C. Se observó y midió el sangrado durante 30 minutos y, cuando fue necesario, se detuvo manualmente el sangrado en el punto de tiempo de 10 minutos para evitar la muerte. El volumen de sangre perdida se midió con base en el contenido de hemoglobina.

Monos cangrejeros: En el estudio se utilizaron 8 monos cangrejeros libres de cualquier tratamiento previo. Las mediciones de agregación plaquetaria se realizaron principalmente como se describe para las plaquetas humanas y utilizando una concentración de colágeno de 2.5 mg.mL-1. El recuento de plaquetas se midió en sangre anticoagulada con EDTA. El tiempo de sangrado se midió en monos de vigilia en la superficie del antebrazo, de acuerdo con el procedimiento clínico estándar y usando un dispositivo de tiempo de sangrado SurgicuttMC de 0.5 cm. La expresión de GPVI se midió principalmente como se describió anteriormente utilizando un anticuerpo monoclonal comercial anti-GPVI humano acoplado con FITC (clon 1G5, Biocytex) que reacciona de forma cruzada con GPVI de cangrejeros.

Resultados

Unión de ACT017 a plaquetas humanas in vitro - En la Figura 3 se muestra una curva típica de unión de ACT017 acoplado con Alexa488 a plaquetas humanas determinada por citometría de flujo. La saturación de plaquetas se obtiene en sangre completa y PRP para una concentración de anticuerpos de 1 a 2 pg/mL (20 a 40 nM).

Inhibición, in vitro, de agregación plaquetaria humanas inducida por colágeno - En la Figura 4 se muestran las curvas de agregación típicas obtenidas después de la preincubación de PRP humano con concentraciones crecientes de ACT017. En estas condiciones, ACT017 inhibió por completo la agregación plaquetaria inducida por colágeno para una concentración > 5 pg/mL.

La capacidad de ACT017 para inhibir la agregación plaquetaria inducida por colágeno se cuantificó en la velocidad y la intensidad de la respuesta, como se muestra en la Figura 5. En tres donantes diferentes, la IC50 media fue de 3.2 ± 2.5 y 2 ± 0.7 pg.mL-1 para la intensidad y la velocidad respectivamente, mientras que se observó una inhibición total para una concentración de 6.7 ± 2.9 pg.mL'1 en ambos casos que está en buen acuerdo con los resultados de la unión a las plaquetas.

Estos resultados demuestran por lo tanto que las proteínas de la invención son potentes inhibidores de la agregación plaquetaria inducida por colágeno.

Con el deseo de analizar ex vivo el efecto de ACT017 sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno, el recuento de plaquetas y la expresión de GPVI, los ratones humanizados con GPVI recibieron una inyección intravenosa de ACT017 (1,2 o 4 mg/kg) o de vehículo. 30 minutos después de la inyección, se recogió sangre para el análisis de la agregación plaquetaria inducida por colágeno, el recuento de plaquetas y la expresión de GPVI.

Como se muestra en la Figura 6, se observa una inhibición completa de la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuando los ratones recibieron ACT017 a una dosis > 0.5 mg/kg.

En cuanto a la expresión de GPVI, no hubo diferencia estadística en la fluorescencia media de las plaquetas en las muestras recuperadas antes y después del tratamiento, así como entre las muestras de ratones tratados con vehículo (ACT0170 mg/kg) o ACT017 a diferentes dosis (Figura 7), panel izquierdo). Los paneles central y derecho de la Figura 7 muestran la evolución de la expresión de GPVI entre el tiempo previo a la inyección y 30 min después de la inyección en animales individuales tratados con el vehículo o 4 mg/kg de ACT017.

Estos resultados demuestran que ACT017 no induce el agotamiento de GPVI in vivo.

Además, se midieron los recuentos de plaquetas de ratones que habían recibido vehículo (ACT0170 mg/kg) o ACT017 (4 mg/kg). Como se muestra en la Figura 8, no se evidenció diferencia estadística entre los dos grupos (media ± DE: 847.7 ± 110.5 frente a 842 ± 115.5).

El tiempo de sangrado y la pérdida de sangre medidos por sección transversal de la cola de ratones 30 min después de la administración de ACT017 (4 mg/kg) no se modificaron en comparación con los valores obtenidos en ratones de control (inyección de vehículo) (Figura 9). A modo de comparación, el tiempo de sangrado de los ratones tratados con clopidogrel (10 mg/kg el día anterior y dos horas antes del experimento) aumentó significativamente, así como la pérdida de sangre.

Este resultado demuestra que ACT017 no induce una disminución en el recuento de plaquetas, es decir, trombocitopenia in vivo.

El efecto de la administración de ACT017 se caracterizó aún más en primates no humanos. Ocho monos cangrejeros se inscribieron en el estudio. En primer lugar, se administraron por vía intravenosa dosis crecientes de ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) durante 15 minutos. A los 30 minutos y 2 horas después de la administración, se recogió sangre. La agregación plaquetaria se inhibió de manera reversible de manera dependiente de la dosis (Figura 10). El aumento de la dosis de 1 a 2 y de 2 a 4 mg/kg aumentó el efecto, mientras que 8 mg/kg no tuvo ningún efecto adicional en comparación con 4 mg/kg. El recuento de plaquetas medido 24 horas después de la inyección no se modificó con respecto a los valores obtenidos antes de la inyección (Figura 11). No se observó un aumento significativo en el tiempo de sangrado después del tratamiento con vehículo o 2, 4 u 8 mg/kg de ACT017 (Figura 12). A continuación, después de un período de lavado, el mono cangrejero recibió ACT017 (2 u 8 mg/kg) administrado como una perfusión de una hora. La agregación plaquetaria y la expresión de GPVI se midieron en diferentes momentos después del inicio del tratamiento: (1, 1.5, 2, 4 y 7 horas) (Figuras 13 y 14). La agregación plaquetaria inducida por colágeno se inhibió reversiblemente y la duración del efecto se prolongó en monos cangrejeros tratados con 8 mg/kg en comparación con 2 mg/kg (Figura 13). La expresión de GPVI en las plaquetas se mantuvo estable en los diferentes tiempos después del comienzo del tratamiento en comparación con los valores previos al tratamiento (Figura 14).

Juntos, estos resultados confirman en primates no humanos que la administración de ACT017 inhibe de manera eficiente y reversible la función de GPVI sin afectar el recuento de plaquetas, la expresión de GPVI en la superficie de las plaquetas ni el tiempo de sangrado.

Ejemplo 5: Mapeo de epítopos

Materiales y métodos

Para reconstruir epítopos de la molécula objetivo, es decir, GPVI humana, se sintetizó una biblioteca de péptidos. Se obtuvo un soporte de polipropileno funcionalizado con amino mediante el injerto con una formulación de polímero hidrofílico patentada, seguida de la reacción con t-butiloxicarbonil-hexametilendiamina (BocHMDA) usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) con N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y la posterior escisión de los grupos Boc usando ácido trifluoroacético (TFA). Se utilizó la síntesis de péptidos Fmoc estándar para sintetizar péptidos en el soporte sólido funcionalizado con amino mediante estaciones de manipulación de líquidos JANUS modificadas a medida (Perkin Elmer).

La síntesis de los miméticos estructurales se realizó utilizando la tecnología patentada de péptidos ligados químicamente en estructuras (CLIPS) de Pepscan. La tecnología CLIPS permite estructurar péptidos en bucles simples, bucles dobles, bucles triples, pliegues en forma de lámina, pliegues en forma de hélice y combinaciones de los mismos. Los moldes CLIPS se acoplan a residuos de cisteína. Las cadenas laterales de múltiples cisteínas en los péptidos se acoplan a uno o dos moldes CLIPS. Por ejemplo, una solución 0.5 mM de CLIPS P2 (2,6-bis(bromometil)piridina) se disuelve en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7.8)/acetonitrilo (1:3 (v/v)). Esta solución se agrega a las matrices de péptidos. La plantilla CLIPS se une a las cadenas laterales de dos cisteínas presentes en los péptidos unidos en fase sólida de las matrices de péptidos (placa de 455 pocillos con pocillos de 3 pL). Las matrices de péptidos se agitan suavemente en la solución durante 30 a 60 minutos mientras están completamente cubiertas por la solución. Finalmente, las matrices de péptidos se lavan extensamente con exceso de H2O y se sonicó en tampón disruptivo que contenía SDS al 1 %/beta-mercaptoetanol al 0.1 % en PBS (pH 7.2) a 70 °C durante 30 minutos, seguido de sonicación en H2O por otros 45 minutos. Los péptidos portadores de CLIPS T3 se prepararon de manera similar pero con tres cisteínas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o un fragmento de anticuerpo del mismo, en donde la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 8.

2. El anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo de cadena sencilla, un Fv, un fragmento de anticuerpo que carece de la región bisagra de anticuerpos IgG4 y que tiene una región de unión univalente y un Fab.

3. El anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que es monovalente.

4. El anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso como medicamento.

5. Una composición que comprende el anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para usar en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, donde dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de trombosis arterial y venosa, reestenosis, síndrome coronario agudo, accidentes cerebrovasculares isquémicos, enfermedades vasculares cerebrales, enfermedades tromboembólicas venosas, microangiopatías trombóticas y púrpura vascular.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para uso en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, donde dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de enfermedades de las arterias coronarias y enfermedades de las arterias cerebrales.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para usar en el tratamiento de una afección relacionada con GPVI, donde dicha afección relacionada con GPVI es una enfermedad cardiovascular seleccionada de aterotrombosis, eventos isquémicos, síndrome agudo de la arteria coronaria, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, intervención coronaria percutánea, trombosis por colocación de cánula intraluminal, reestenosis isquémica, isquemia aguda, isquemia crónica, enfermedades de la aorta y sus ramificaciones, arteriopatía periférica, trombosis venosa, flebitis aguda, embolismo pulmonar, trombosis asociada al cáncer, trombosis inflamatoria y trombosis asociada a infección.

10. Un vector de expresión que comprende secuencias nucleicas que codifican un anticuerpo humanizado aislado que se une a la glicoproteína VI humana (hGPVI) o fragmento de anticuerpo de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho vector comprende una secuencia nucleica que codifica la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de ácido nucleico que comparta al menos el 75 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 10, y una secuencia nucleica que codifica la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de ácido nucleico que comparta al menos el 75 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 11.