CN102875515B - 一种蓝莓锦葵色素的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蓝莓锦葵色素的提取方法，将蓝莓的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到蓝莓花青素粗提物水溶液；将粗提物水溶液过大孔吸附树脂柱，经吸附、洗杂、洗脱后，收集洗脱液浓缩，浓缩液用乙酸乙酯萃取，合并水相，减压浓缩得到花青素提取物浸膏；将上述浸膏用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸进行阶段梯度洗脱，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为蓝莓锦葵色素样品。

Description

一种蓝莓锦葵色素的提取方法
技术领域
本发明涉及一种蓝莓锦葵色素的提取方法，属于食品加工领域。
背景技术
蓝莓锦葵色素（malvidin,Mv）为蓝莓特有的一种花青素活性成分，结构式如下所示：
蓝莓是杜鹃花科越橘属(Vaccinium spp.)多年生落叶或常绿灌木，在我国主要有四大种植区域：长白山、大小兴安岭产区，辽东半岛、胶东半岛产区，长江流域产区和华南产区。蓝莓浆果富含花青素、黄酮醇、酚酸等多种活性成分，其中花青素常见有15种，主要为锦葵色素，还有少量的芍药色素、矮牵牛色素及翠雀色素等。研究表明，蓝莓花青素具有防止脑神经老化、降血糖、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌和增强机体免疫力等多种生物活性功能。
专利（申请号CN201210144875.X，公开号CN102731462A）公开了“一种纯化蓝莓中花青素的方法”，专利（申请号CN201010246735.4，公开号CN101914304A）公开了“一种蓝莓花青素的提取方法”，专利（申请号CN201110182729.1，公开号CN102285953A）公开了“以HP2MGL大孔树脂分离纯化蓝莓花色苷的方法”，均采用大孔树脂纯化蓝莓的乙醇粗提液后，进行喷雾干燥或冷冻干燥得到蓝莓花青素的混合物产品。锦葵色素作为蓝莓主要生物活性成分之一，目前已取得一定的研究进展，但关于蓝莓锦葵色素单体的分离纯化方法研究鲜见报道，且在市场上也未见蓝莓锦葵色素单体样品流通。因此，寻找一种提取率高、成本低和易于工业化生产的蓝莓锦葵色素分离纯化工艺，可为蓝莓花青素的特征生物活性研究奠定基础，为构效关系的研究提供前提。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蓝莓锦葵色素的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种蓝莓锦葵色素的提取方法，它包括如下步骤：
(1)将蓝莓的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到蓝莓花青素粗提物水溶液；
(2)将步骤(1)得到的粗提物水溶液过Amberlite-XAD-7型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用蒸馏水洗杂，再用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液浓缩至0.1～0.2倍体积，浓缩液用乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并水相，将水相减压浓缩至无水排出，得到花青素提取物浸膏；
(3)将步骤(2)得到的花青素提取物浸膏用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸梯度洗脱，甲醇、蒸馏水、甲酸的三个梯度分别为体积比99∶0∶1、90∶9∶1和80∶19∶1，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸线性梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的体积比由95∶4∶1均匀变化到90∶9∶1，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为蓝莓锦葵色素样品。
步骤(1)中，所述的蓝莓的乙醇提取物浸膏按如下方法制备得到：将3～5kg蓝莓清洗、打浆，加入10倍重量的体积百分浓度为90%乙醇水溶液中，在40℃下浸泡3h，离心，取上清液浓缩后即得。
步骤(1)中，对于1L蒸馏水，蓝莓的乙醇提取物浸膏的加入质量为300～500g。
步骤(2)中，所述的乙醇水溶液中，乙醇的体积百分浓度为50%。
步骤(2)中，每次萃取，乙酸乙酯的使用体积为浓缩液体积的1.5~5倍。
步骤(3)中，所述的乙酸水溶液的体积百分浓度为0.1%。
步骤(3)中，对于每10g花青素提取物浸膏，乙酸水溶液的加入体积为5~7mL。
步骤(3)中，对于每1g冻干粉，乙酸水溶液的加入体积为10~15mL。
步骤(3)中，阶段梯度洗脱过程中，三个梯度分别洗脱30min，线性梯度洗脱过程中，线性均匀变化的时间为30min，甲醇、蒸馏水和甲酸的体积比为90∶9∶1时保持30min。
有益效果：
1、利用蓝莓为原料，分离纯化得到蓝莓特有的花青素物质——锦葵色素，对蓝莓花青素的构效关系研究意义深远；
2、将Amberlite-XAD-7大孔树脂用于蓝莓花青素的初步提纯，使蓝莓花青素的纯度大幅度提高；
3、通过凝胶柱层析进行反复分离纯化，得到较高纯度的蓝莓花青素单体样品——蓝莓锦葵色素。
附图说明
图1是实施例1所得蓝莓锦葵色素的液相色谱图。其中，保留时间tR=12.53min为锦葵色素。
图2是实施例1所得蓝莓锦葵色素的质谱图。其中，峰tR=12.53min的质谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，蓝莓锦葵色素液相检测条件为：
BEH-C18柱(2.1×100mm，粒度1.7μm)；流动相：A液为甲醇，B液为0.4%的甲酸。线性梯度洗脱：0～30min，A液从5%升至40%；30～40min，A液从40%升至80%。流速：0.3ml/min。柱温35℃，进样量10μl。DAD检测器，200～700nm全扫描。
以下实施例中，蓝莓锦葵色素质谱检测条件为：
离子化模式为大气压电喷雾粒子源（ESI），正离子模式，毛细管电压3.0kV；锥空电压20V；离子源温度100℃。脱溶剂温度250℃，锥孔气流量45L·h-1，流量500L/h。扫描质量范围200～1500D。
实施例1：
以5kg蓝莓为原料，清洗打浆，加入10倍重量的90(v/v)%乙醇水溶液中，在40℃下浸泡3h，离心，离心上清液浓缩并冷冻干燥后得到520g蓝莓的乙醇提取物浸膏。
将500g蓝莓的乙醇提取物浸膏溶于1L蒸馏水中，得到蓝莓花青素粗提物水溶液。
将上述粗提物水溶液过Amberlite-XAD-7型大孔吸附树脂柱(4.5cm×40cm)，使树脂对粗提物水溶液中的蓝莓锦葵色素进行充分吸附，先用5L蒸馏水洗杂，再用1L 50%(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液进行浓缩至0.2倍体积，然后用500ml乙酸乙酯萃取，花青素于水相中，重复萃取3次，合并水相，减压浓缩至无水蒸发，得到花青素提取物浸膏235g。
将上述花青素提取物浸膏10g用5ml 0.1(v/v)%乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱（2.5cm×120cm），用甲醇、蒸馏水和甲酸梯度洗脱，甲醇∶蒸馏水∶甲酸=99∶0∶1、90∶9∶1、80∶19∶1（阶段梯度）。收集甲醇∶蒸馏水∶甲酸=90∶9∶1洗脱部分，进行浓缩冷冻干燥，得粉末0.15g，再用2ml 0.1(v/v)%乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱（2.5cm×120cm），洗脱剂梯度为，甲醇∶蒸馏水∶甲酸=95∶4∶1~90∶9∶1（线性梯度），收集洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，获得蓝莓锦葵色素样品524mg。
上述蓝莓锦葵色素样品经高效液相色谱-质谱分析，确定为锦葵色素，纯度达97.05%。
实施例2：
将3kg蓝莓清洗打浆，加入10倍重量的90(v/v)%乙醇水溶液中，在40℃下浸泡3h，离心，离心上清液浓缩并冷冻干燥后得到315g蓝莓的乙醇提取物浸膏。
将上述蓝莓的乙醇提取物浸膏溶于1L蒸馏水中，得到蓝莓花青素粗提物水溶液。
将上述蓝莓花青素粗提物水溶液过Amberlite-XAD-7型大孔吸附树脂柱(4.5cm×40cm)，使树脂对粗提物水溶液中的蓝莓锦葵色素进行充分吸附，先用3L蒸馏水洗杂，再用1L 50(v/v)%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液进行浓缩至0.1倍体积，然后用500ml乙酸乙酯萃取，花青素于水相中，重复萃取3次，合并水相，减压浓缩至无水蒸发，得到花青素提取物浸膏126g。
将上述花青素提取物浸膏15g用10ml 0.1(v/v)%乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱（2.5cm×120cm），用甲醇、蒸馏水和甲酸洗脱，甲醇∶蒸馏水∶甲酸=99∶0∶1、90∶9∶1、80∶19∶1（阶段梯度）。收集甲醇∶蒸馏水∶甲酸=90∶9∶1洗脱部分，进行浓缩冷冻干燥，得粉末0.45g，再用5ml 0.1(v/v)%乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱（2.5cm×120cm），洗脱剂梯度：甲醇∶蒸馏水∶甲酸=95∶4∶1~90∶9∶1（线性梯度），收集洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，获得蓝莓锦葵色素样品318mg。
上述蓝莓锦葵色素样品经高效液相色谱-质谱分析，确定为锦葵色素，纯度达96.27%。

Claims (7)

1.一种蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将蓝莓的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到蓝莓花青素粗提物水溶液；
(2)将步骤(1)得到的粗提物水溶液过Amberlite-XAD-7型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用蒸馏水洗杂，再用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液浓缩至0.1～0.2倍体积，浓缩液用乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并水相，将水相减压浓缩至无水排出，得到花青素提取物浸膏；
(3)将步骤(2)得到的花青素提取物浸膏用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸进行阶段梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的三个梯度分别为体积比99∶0∶1、90∶9∶1和80∶19∶1，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸进行线性梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的体积比由95∶4∶1均匀变化到90∶9∶1，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为蓝莓锦葵色素样品；
步骤(1)中，所述的蓝莓的乙醇提取物浸膏按如下方法制备得到：将3～5kg蓝莓清洗、打浆，加入10倍重量的体积百分浓度为90%乙醇水溶液中，在40℃下浸泡3h，离心，取上清液浓缩后即得。
2.根据权利要求1所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，对于1L蒸馏水，蓝莓的乙醇提取物浸膏的加入质量为300～500g。
3.根据权利要求1所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的乙醇水溶液中，乙醇的体积百分浓度为50%。
4.根据权利要求1所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，每次萃取，乙酸乙酯的使用体积为浓缩液体积的1.5～5倍。
5.根据权利要求1所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的乙酸水溶液的体积百分浓度为0.1%。
6.根据权利要求1或5所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，对于每10g花青素提取物浸膏，乙酸水溶液的加入体积为5～7mL。
7.根据权利要求1或5所述的蓝莓锦葵色素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，对于每1g冻干粉，乙酸水溶液的加入体积为10～15mL。
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