CN101899083B

CN101899083B - 青钱柳酸a的制备方法

Info

Publication number: CN101899083B
Application number: CN2010102388795A
Authority: CN
Inventors: 吴彩娥; 方升佐; 范龚健; 杨万霞; 李婷婷; 徐琳
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Zhongnong Kangzheng Technology Service Co.,Ltd.
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-07-28
Also published as: CN101899083A

Abstract

本发明涉及青钱柳酸A的制备方法，包括如下步骤：①将青钱柳叶的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到青钱柳叶粗提物水溶液；②将上述粗提物水溶液过D101型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用蒸馏水洗脱，再用1L50％乙醇洗脱，收集50％乙醇部分进行浓缩，然后用氯仿萃取，氯仿层经旋转蒸发浓缩至无溶剂排出，得到氯仿萃取物浸膏；③将氯仿萃取物浸膏样品用氯仿溶解，过硅胶柱，氯仿的质量体积比为2∶1～3∶2，然后用氯仿和甲醇梯度洗脱，收集氯仿∶甲醇＝90∶10洗脱部分进行浓缩干燥，得粉末，用氯仿溶解，过硅胶柱，再用氯仿和甲醇梯度洗脱，在氯仿∶甲醇＝90∶10部分获得青钱柳酸A样品。本发明利用青钱柳叶为原料，制备得到青钱柳酸A。

Description

青钱柳酸A的制备方法

技术领域

本发明涉及一种青钱柳酸A的制备方法。

背景技术

青钱柳酸A(3，23-β-epoxy-olean-12-en-28-oic acid)，是青钱柳特有的一种三萜类活性成分，结构如下所示：

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal)Ijinskaja]是我国特有的一种单属种植物，极具医疗保健价值，用其叶子于配制成的降血糖茶在临床上已使用多年。青钱柳叶中含有多糖、黄酮、三萜、甾体、酚类、内酯、香豆精等活性成分。研究表明，青钱柳提取物具有降血糖、降血压、降血脂、抗氧化、抗菌、抗癌和增强机体免疫力等生物活性功能。青钱柳三萜类成分作为青钱柳主要生物活性成分之一，目前已取得一定的研究进展，但关于青钱柳三萜类成分的分离纯化方法研究鲜见报道。且在市场上也未见青钱柳三萜单体样品流通。因此，寻找一种更好的提取率高、成本低和易于工业化生产的青钱柳酸A分离纯化工艺，能为青钱柳的特征生物活性研究奠定基础，为构效关系的研究提供前提。

发明内容

本发明提供一种青钱柳酸A的制备方法。

所述青钱柳酸A的制备方法包括如下步骤：

①将青钱柳叶的乙醇提取物浸膏350～500g粗提物，溶于1L蒸馏水中，得到青钱柳叶粗提物水溶液；

②将上述粗提物水溶液过D101型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用3～5L蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质，再用1L50％乙醇洗脱，收集50％乙醇部分进行浓缩至0.1～0.2倍体积，然后用300～500ml氯仿萃取，氯仿层经旋转蒸发浓缩至无溶剂排出，得到氯仿萃取物浸膏；

③将上述获得的氯仿萃取物浸膏样品10～15g用氯仿溶解，过硅胶柱，氯仿的质量体积比为2∶1～3∶2，然后用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇＝100∶0、95∶5、90∶10、80∶20；收集氯仿∶甲醇＝90∶10洗脱部分进行浓缩干燥，得粉末0.15～0.30g，用0.5ml氯仿溶解，过硅胶柱，再用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇＝95∶5～90∶10，收集洗脱峰，在氯仿∶甲醇＝90∶10部分获得青钱柳酸A样品。

青钱柳叶的乙醇提取物浸膏的制备方法为：将3～5kg青钱柳叶干燥粉碎，加入10倍重量的90％乙醇中，在50℃下浸泡5h，过滤，滤液浓缩后得到青钱柳叶乙醇提取物浸膏350～500g。

本发明的特点是：

①利用青钱柳叶为原料，制备得到青钱柳特有的三萜类物质——青钱柳酸A，对青钱柳的生物活性功能的构效关系研究意义深远；

②将大孔树脂用于青钱柳三萜的初步提纯，使青钱柳三萜的纯度大幅度提高；③通过硅胶柱层析进行反复分离纯化，得到较高纯度的青钱柳三萜单体样品——青钱柳酸A。

附图说明

图1是实施例1所得青钱柳酸A的液相色谱图；

图2是实施例1所得青钱柳酸A的质谱图。

具体实施方式

实施例1

1.以5kg青钱柳叶为原料，干燥粉碎，加入10倍重量的90％乙醇中，在50℃下浸泡5h，过滤，滤液浓缩并干燥后得到500g粗提物，溶于1L蒸馏水中，备用。

2.将上述水溶液过D101型大孔吸附树脂柱(4.5cm×40cm)，使树脂对提取液中的青钱柳三萜类化合物进行充分吸附：先用5L蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质，再用1L50％乙醇洗脱，收集50％乙醇部分进行浓缩至0.2倍体积，然后用500ml氯仿萃取，氯仿层经旋转蒸发浓缩至无溶剂蒸发，得到氯仿萃取物浸膏245g。

3.将上述获得的样品10g用5ml氯仿溶解，过硅胶柱(2.5cm×40cm)，用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇＝100∶0、95∶5、90∶10、80∶20(阶段梯度)。收集氯仿∶甲醇＝90∶10洗脱部分进行浓缩干燥，得粉末0.15g，用0.5ml氯仿溶解，过硅胶柱(1.2cm×40cm)，洗脱剂梯度：氯仿∶甲醇＝95∶5～90∶10(线性梯度)，收集洗脱峰，获得青钱柳酸A样品54.9mg，经高效液相色谱-质谱分析(ZORBAX SB-C₁₈色谱柱，流动相：乙腈和水，流速：0.4mL/min，检测波长：210nm；质谱条件：电离方式：ESI(positive)；干燥气(N₂)流速：25L·min^-1；辅助气(N₂)流速：0.75L·min^-1；离子传输管温度：300℃；离子传输管电压：7V；电离电压：4.5KV)，该样品为青钱柳酸A，纯度达95.01％。

实施例2

1.将青钱柳叶3kg干燥粉碎，加入10倍重量的90％乙醇中，在50℃下浸泡5h，过滤，滤液浓缩并干燥后得到359g粗提物，溶于1L蒸馏水中，备用。

2.将上述水溶液过D101型大孔吸附树脂柱(4.6cm×40cm)，使树脂对提取液中的青钱柳三萜类化合物进行充分吸附：先用3L蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质，再用1L50％乙醇洗脱，收集50％乙醇部分进行浓缩至0.2倍体积，然后用300ml氯仿萃取，氯仿层经旋转蒸发浓缩，得到氯仿萃取物166g。

3.将上述获得的样品15g用10ml氯仿溶解，过硅胶柱(2.5cm×40cm)，用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇＝100∶0、95∶5、90∶10、80∶20(阶段梯度)。收集氯仿∶甲醇＝90∶10洗脱部分进行浓缩至无溶剂蒸发，得粉末0.45g，用0.5ml氯仿溶解，过硅胶柱(1.2cm×40cm)，洗脱剂梯度：氯仿∶甲醇＝95∶5～90∶10(线性梯度)，收集洗脱峰，获得青钱柳酸A样品32.9mg，经高效液相色谱-质谱分析(ZORBAX SB-C₁₈色谱柱，流动相：乙腈和水，流速：0.4mL/min，检测波长：210nm；质谱条件：电离方式：ESI(positive)；干燥气(N₂)流速：25L·min^-1；辅助气(N₂)流速：0.75L·min^-1；离子传输管温度：300℃；离子传输管电压：7V；电离电压：4.5KV)，该样品为青钱柳酸A，纯度达96.31％。

Claims

1.青钱柳酸A的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

①将青钱柳叶的乙醇提取物浸膏350-500g，溶于1L蒸馏水中，得到青钱柳叶粗提物水溶液；

②将上述粗提物水溶液过D101型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用3~5L蒸馏水洗脱，再用1L50%乙醇洗脱，收集50%乙醇部分进行浓缩至0.1~0.2倍体积，然后用300~500ml氯仿萃取，氯仿层经旋转蒸发浓缩至无溶剂排出，得到氯仿萃取物浸膏；

③将上述获得的氯仿萃取物浸膏样品10~15g用氯仿溶解，过硅胶柱，氯仿萃取物浸膏样品与氯仿的质量体积比为2：1~3：2，然后用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20；收集氯仿∶甲醇=90∶10洗脱部分进行浓缩干燥，得粉末0.15~0.30g，用0.5ml氯仿溶解，过硅胶柱，再用氯仿和甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇=95∶5~90∶10，收集洗脱峰，在氯仿∶甲醇=90∶10部分获得青钱柳酸A样品。

2.如权利要求1所述的青钱柳酸A的制备方法，其特征在于青钱柳叶的乙醇提取物浸膏的制备方法为：将3~5kg青钱柳叶干燥粉碎，加入10倍重量的90%乙醇中，在50℃下浸泡5h，过滤，滤液浓缩后得到青钱柳叶乙醇提取物浸膏350~500g。