CN105348339B - 一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法，将桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到桑葚酒渣花色苷粗提物水溶液；将粗提物水溶液过大孔吸附树脂柱，经吸附、洗杂、洗脱后，收集洗脱液浓缩，浓缩液用乙酸乙酯萃取，合并水相，减压浓缩得到花色苷提取物浸膏；将上述浸膏用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH‑20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸进行阶段梯度洗脱，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH‑20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为桑葚矢车菊素花色苷样品。

Description

一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法
技术领域
本发明涉及一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法，属于食品加工领域。
背景技术
桑葚(Mulberry)系桑科、桑属植物桑的近成熟聚花果实，又称桑
果、桑枣，呈椭圆形黑色或者深紫色，自古享有“民间圣果”、“中华果王”之美称。桑起源于亚洲的温带，在我国主要产区在安徽、江苏、浙江、湖南、河北和四川等地。桑葚富含花色苷、黄酮醇、酚酸等多种活性成分，主要为矢车菊素花色苷，还有少量的芍药素花色苷。研究表明，桑葚花色苷具有防止脑神经老化、降血糖、降血脂、抗氧化、抗癌和增强机体免疫力等多种生物活性功能。历代本草也记载桑葚能滋阴补肾、黑发明目、悦颜不老。
随着消费者对桑葚营养保健功能认识的增强，桑葚酒、桑葚汁、桑葚酱等相关产品风靡世界，其中桑葚酒由于具有营养丰富、酒体醇厚、色泽艳丽、口味绵长、香气宜人等特点而备受消费者推崇。目前，桑葚酒酿造过程中产生的大量酒渣却并未得到充分利用。桑葚酒渣中含有大量的花色苷，为桑葚果酒酿造中重要副产物，目前仍被用作肥料或动物饲料，造成巨大资源浪费。因此，利用合理的方法提取桑葚酒渣中的花色苷、提高桑葚酒渣资源的综合利用率，可大大提高其应用和经济价值。
专利(申请号CN201110151594.2，公开号CN102321062A)公开了“蓝莓酒渣中花青素分离、纯化及检验方法”，采用大孔树脂纯化酒渣中花青素的乙醇粗提液后，进行冷冻干燥得到蓝莓花青素的混合物产品。专利(申请号CN201310300316.8，公开号CN103319911A)公开了“一种桑葚残渣中提取桑葚红色素的工艺”，利用减压蒸馏法得到粗桑葚红色素的固体，将粗桑葚红色素用柱层析法提纯得到桑葚红色素固体。花色苷作为桑葚主要生物活性成分之一，目前已取得一定的研究进展，但关于桑葚酒酿造中副产物桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的研究还鲜有报道。
桑葚酒渣中矢车菊素花色苷单体的分离纯化方法研究鲜见报道，且在市场上也未见桑葚酒渣中花色苷单体样品流通。因此，寻找一种提取率高、成本低和易于工业化生产的桑葚花色苷分离纯化工艺，可为桑葚酒渣中花色苷的特征生物活性研究奠定基础，为构效关系的研究提供前提。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法，它包括如下步骤：
(1)取新压榨分离的桑葚酒渣，于35～55℃(优选50℃)烘24h以去除挥发酸，-18℃下冷冻至水分含量5％以下，解冻后粉碎成粉料，于4℃下密封避光保存，待用；
(2)将步骤(1)得到的桑葚酒渣粉料加入5～10倍(优选10倍)重量的85％(v/v)乙醇水溶液中，在35～50℃(优选50℃)下浸泡4h，离心，取上清液浓缩后得到桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏；
(3)将步骤(2)得到的桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到桑葚花色苷粗提物水溶液；
(4)将步骤(3)得到的粗提物水溶液过HPD700型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用蒸馏水洗杂，再用体积百分浓度为40～60％(优选60％)的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液浓缩至0.1～0.2倍体积，浓缩液用乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并水相，将水相真空旋转蒸发浓缩至无水排出，得到花色苷提取物浸膏；
(5)将步骤(4)得到的花色苷提取物浸膏用体积百分浓度为0.1～0.5％(优选0.1％)的乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸进行阶段梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的三个梯度分别为体积比95∶4∶1、90∶9∶1和80∶19∶1，三个梯度分别洗脱30min，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用体积百分浓度为0.1～0.5％的乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸进行线性梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的体积比由95∶4∶1线性均匀变化到90∶9∶1，线性均匀变化的时间为30min，变化至90∶9∶1后再维持30min，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为桑葚矢车菊素花色苷样品。
步骤(1)中，所述的粉料粒径为40～100目。
步骤(2)中，浓缩温度为40～50℃。
步骤(3)中，对于1L蒸馏水，桑葚酒渣中花色苷的乙醇提取物浸膏的加入质量为200～600g。
步骤(4)中，每次萃取，乙酸乙酯的使用体积为浓缩液体积的2～6倍。
步骤(4)中，真空旋转蒸发浓缩的温度为40～50℃。
步骤(5)中，对于每10g花色苷提取物浸膏，乙酸水溶液的加入体积为5～8mL。
步骤(5)中，所述的浓缩后冷冻干燥，浓缩温度为40～50℃，冷冻干燥温度为-50℃～-80℃。
步骤(5)中，对于每1g冻干粉，乙酸水溶液的加入体积为10～15mL。
有益效果：
1、利用桑葚酒渣为原料，分离纯化得到桑葚酒渣特有的花色苷物质——矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-芸香糖苷，对桑葚花色苷的构效关系研究意义深远；
2、将HPD700大孔树脂用于桑葚酒渣中花色苷的初步提纯，使桑葚酒渣花色苷的纯度大幅度提高；
3、通过凝胶柱层析进行反复分离纯化，得到较高纯度的桑葚花色苷单体样品——矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-芸香糖苷。
附图说明
图1是实施例1所得桑葚花色苷的液相色谱图。其中，保留时间tR1＝10.26min为矢车菊-3-O-葡萄糖苷，保留时间tR2＝10.89min为矢车菊-3-O-芸香糖苷。
图2是实施例1所得桑葚花色苷的质谱图。其中，tR1＝10.26min的质谱图。
图3是实施例1所得桑葚花色苷的质谱图。其中，tR2＝10.89min的质谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，桑葚花色苷液相检测条件为：
BEH-C18柱(2.1×100mm，粒度1.7μm)；流动相：A液为甲醇，B液为0.4％的甲酸。线性梯度洗脱：0～30min，A液从5％升至40％；30～40min，A液从40％升至80％。流速：0.3ml/min。柱温35℃，进样量10μl。DAD检测器，200～700nm全扫描。
以下实施例中，桑葚花色苷质谱检测条件为：
离子化模式为大气压电喷雾粒子源(ESI)，正离子模式，毛细管电压3.0kV；锥空电压20V；离子源温度100℃。脱溶剂温度250℃，锥孔气流量45L·h-1，流量500L/h。扫描质量范围200～1500D。
实施例1：
取新压榨分离的桑葚酒渣，放置鼓风干燥箱50℃烘24h，去除挥发酸，放置冰柜冷冻室内(-18℃)至水分含量5％以下后解冻，粉碎至40～100目成粉料，于4℃下密封避光保存，待用。
将10kg桑葚酒渣粉料加入10倍重量的85(v/v)％乙醇水溶液中，在50℃下浸泡4h，离心，取上清液40～50℃浓缩后得到950g桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏；
将400g桑葚花色苷的乙醇提取物浸膏溶于1L蒸馏水中，得到桑葚花色苷粗提物水溶液。
将上述粗提物水溶液过HPD700型大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)柱(4.5cm×40cm)，使树脂对粗提物水溶液中的桑葚花色苷进行充分吸附，先用5L蒸馏水洗杂，再用1L 60％(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液进行40～50℃浓缩至0.2倍体积，然后用500ml乙酸乙酯萃取，花色苷于水相中，重复萃取3次，合并水相，将水相真空旋转蒸发(40～50℃)浓缩至无水排出，得到花色苷提取物浸膏235g。
将上述花色苷提取物浸膏10g用5ml 0.1(v/v)％乙酸水溶液溶解，过SephadexLH-20凝胶柱(2.5cm×120cm)，用甲醇、蒸馏水和甲酸梯度洗脱，甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝95∶4∶1、90∶9∶1、80∶19∶1(阶段梯度)，三个梯度分别洗脱30min，收集甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝90∶9∶1洗脱部分，进行40～50℃浓缩、-50℃～-80℃冷冻干燥，得粉末0.15g，再用2ml 0.1(v/v)％乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱(2.5cm×120cm)，洗脱剂梯度为，甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝95∶4∶1～90∶9∶1(线性梯度)，线性均匀变化的时间为30min，变化至90∶9∶1后再维持30min，收集洗脱峰，40～50℃浓缩后-50℃～-80℃冷冻干燥，获得桑葚花色苷样品486mg。
上述桑葚花色苷样品经高效液相色谱-质谱分析，确定为矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-芸香糖苷，纯度达96.72％。
实施例2：
取新压榨分离的桑葚酒渣，放置鼓风干燥箱50℃烘24h，去除挥发酸，放置冰柜冷冻室内(-18℃)至水分含量5％以下后解冻，粉碎至40～100目成粉料，于4℃下密封避光保存，备用。
将5kg桑葚酒渣粉料，加入10倍重量的85(v/v)％乙醇水溶液中，在50℃下浸泡4h，离心，离心上清液40～50℃浓缩并冷冻干燥后得到535g桑葚花色苷的乙醇提取物浸膏。
将300g桑葚花色苷的乙醇提取物浸膏溶于1L蒸馏水中，得到桑葚花色苷粗提物水溶液。
将上述桑葚花色苷粗提物水溶液过HPD700型大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)柱(4.5cm×40cm)，使树脂对粗提物水溶液中的桑葚花色苷进行充分吸附，先用3L蒸馏水洗杂，再用1L 60(v/v)％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液进行40～50℃浓缩至0.1倍体积，然后用500ml乙酸乙酯萃取，花色苷于水相中，重复萃取3次，合并水相，将水相真空旋转蒸发(40～50℃)浓缩至无水排出，得到花色苷提取物浸膏126g。
将上述花色苷提取物浸膏15g用10ml 0.1(v/v)％乙酸水溶液溶解，过SephadexLH-20凝胶柱(2.5cm×120cm)，用甲醇、蒸馏水和甲酸梯度洗脱，甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝95∶4∶1、90∶9∶1、80∶19∶1(阶段梯度)，三个梯度分别洗脱30min，收集甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝90∶9∶1洗脱部分，进行40～50℃浓缩、-50℃～-80℃冷冻干燥，得粉末0.15g，再用2ml 0.1(v/v)％乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱(2.5cm×120cm)，洗脱剂梯度为，甲醇∶蒸馏水∶甲酸＝95∶4∶1～90∶9∶1(线性梯度)，线性均匀变化的时间为30min，变化至90∶9∶1后再维持30min，收集洗脱峰，40～50℃浓缩后-50℃～-80℃冷冻干燥，获得桑葚花色苷样品515mg。
上述桑葚花色苷样品经高效液相色谱-质谱分析，确定为矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-芸香糖苷，纯度达98.15％。

Claims (9)

1.一种桑葚酒渣中矢车菊素花色苷的提取方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)取压榨分离的桑葚酒渣，于35～55℃烘24h以去除挥发酸，-18℃下冷冻至水分含量5％以下，解冻后粉碎成粉料，于4℃下密封避光保存，待用；
(2)将步骤(1)得到的桑葚酒渣粉料加入5～10倍重量的85％v/v乙醇水溶液中，在35～50℃下浸泡4h，离心，取上清液浓缩后得到桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏；
(3)将步骤(2)得到的桑葚酒渣花色苷的乙醇提取物浸膏溶于蒸馏水中，得到桑葚花色苷粗提物水溶液；
(4)将步骤(3)得到的粗提物水溶液过HPD700型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，先用蒸馏水洗杂，再用体积百分浓度为40～60％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液浓缩至0.1～0.2倍体积，浓缩液用乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并水相，将水相真空旋转蒸发浓缩至无水排出，得到花色苷提取物浸膏；
(5)将步骤(4)得到的花色苷提取物浸膏用体积百分浓度为0.1～0.5％的乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇、蒸馏水和甲酸进行阶段梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的三个梯度分别为体积比95∶4∶1、90∶9∶1和80∶19∶1，三个梯度分别洗脱30min，收集90∶9∶1的洗脱部分，进行浓缩后冷冻干燥，将冻干粉用体积百分浓度为0.1～0.5％的乙酸水溶液溶解，过Sephadex LH-20凝胶柱，然后用甲醇、蒸馏水和甲酸进行线性梯度洗脱，甲醇、蒸馏水和甲酸的体积比由95∶4∶1线性均匀变化到90∶9∶1，线性均匀变化的时间为30min，变化至90∶9∶1后再维持30min，收集洗脱峰，进行浓缩后冷冻干燥即为桑葚矢车菊素花色苷样品。
2.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的粉料粒径为40～100目。
3.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，浓缩温度为40～50℃。
4.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，对于1L蒸馏水，桑葚酒渣中花色苷的乙醇提取物浸膏的加入质量为200～600g。
5.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，每次萃取，乙酸乙酯的使用体积为浓缩液体积的2～6倍。
6.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，真空旋转蒸发浓缩的温度为40～50℃。
7.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(5)中，对于每10g花色苷提取物浸膏，乙酸水溶液的加入体积为5～8mL。
8.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的浓缩后冷冻干燥，浓缩温度为40～50℃，冷冻干燥温度为-50℃～-80℃。
9.根据权利要求1所述的桑葚酒渣中花色苷的提取方法，其特征在于，步骤(5)中，对于每1g冻干粉，乙酸水溶液的加入体积为10～15mL。
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