CN102839164B - 基于二硫键强化折叠的热稳定性脂肪酶突变体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于二硫键强化折叠的热稳定性脂肪酶突变体及其构建方法和应用，属于酶工程技术领域，以华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M201021脂肪酶作为模板，在脂肪酶的盖子铰链区域引入二硫键而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体，相对于亲本脂肪酶，其Tm提高了7℃，具有广阔的应用前景。

Description

基于二硫键强化折叠的热稳定性脂肪酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶工程技术领域。 
背景技术
脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且易于失活，增加了生产成本。 
脂肪酶具有特征性的界面活性，即在油水界面，脂肪酶的盖子区域发生构象变化，由“闭盖”构象转变为“开盖”构象，盖子打开后，暴露出脂肪酶催化的活性位点以及底物结合区域，从而行使催化功能。酶的热稳定性与酶结构的“刚性”与“柔性”有关，“刚性”越强则酶的结构更加趋于稳定，反之，“柔性”越强则酶的稳定性越差。针对脂肪酶，其盖子区域的“柔性”最强，但同时也是脂肪酶发挥活性的重要功能区域，如何通过增强脂肪酶盖子区域的“刚性”来提高脂肪酶的热稳定性，而同时又不影响其催化活性，成为研究的难点。 
蛋白质中的二硫键能够提高蛋白的稳定性。蛋白质二硫键的原型是双氨基酸肽的胱氨酸，它是以二硫键将两个半胱氨酸结合组成。二硫键结构是以它在Cβ-Sγ-Sγ-Cβ原子之间的χss 两面角来描述，而一般都是接近±90°。二硫键是通过以下方式稳定折叠后的蛋白质：1.它将蛋白质的两部份紧握，使蛋白质形成折叠的形状。2.它会成为折叠后蛋白质的疏水核心，亦即局部的疏水残基会凝聚在双硫键的周边，透过疏水性的相互作用而紧扣在一起。与1及2有关的，它会与蛋白质链的两段连结，增加蛋白质残基的局部有效浓度，并降低水分子的局部有效浓度。因为水分子会攻击氨基之间的氢键及打破二级结构，二硫键就可以稳定在附近的二级结构。例如，有研究显示肽的不同部份在分隔后没有结构，但在建立二硫键后就有着稳定的二级结构及三级结构。 
发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B:Enzym,2009,57:304-311）。但上述菌株产生的脂肪酶，存在热稳定性较低的问题。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高热稳定性的脂肪酶突变体。 
所述脂肪酶突变体是在脂肪酶结构的盖子及其铰链区域引入二硫键。 
所述突变位于华根霉CCTCC NO：M201021第95位及第214位氨基酸，第95位氨基酸由苯丙氨酸突变成半胱氨酸，第214位氨基酸由苯丙氨酸突变成半胱氨酸，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 
编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 
本发明还提供了一种上述脂肪酶突变体的构建方法。 
以华根霉脂肪酶基因为模板，在生物信息学软件分析的基础上，通过在脂肪酶的盖子铰链区域引入一对二硫键来提高该酶的热稳定性，而同时避免影响脂肪酶的催化活性。 
本发明还提供了一种应用上述脂肪酶突变体构建的重组毕赤酵母基因工程菌。 
以质粒pPIC9K-proRCL为模板，通过重叠延伸PCR在95位和214位引入两个半胱氨酸，得到重组质粒pPIC9K-ProRCLCYS，将重组质粒导入毕赤酵母得到表达脂肪酶突变体的重组毕赤酵母基因工程菌。 
酶分子的热稳定性用Tm来表征。即在一半酶的构象发生变化的温度。Tm值越高，则酶稳定性高。反之，则稳定性差。 
本发明通过在脂肪酶盖子铰链区域引入一对二硫键，增加了脂肪酶的刚性构象，而且对脂肪酶的催化活性并未产生影响，相对于亲本脂肪酶，其Tm提高了7℃。 
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。材料和试剂：所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，pMD19-T simple载体，PCR试剂，DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司；YPD、BMGY、BMMY以及YPD-G418均按照Invitrogen公司操作手册配制；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。 
实施例1、二硫键突变位点的设计 
首先通过软件SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）建立华根霉脂肪酶的结构模型，以该模型为对象，利用软件disulfide by design预测该脂肪酶结构中可能生成的二硫键。预测结果表明在脂肪酶盖子铰链区域可能形成二对二硫键，分别为Phe95Cys/Phe214Cys和Asn84Cys/Gly266Cys。注：华根霉脂肪酶的盖子及其铰链区域为82GTNSFRSAITDMVFT96，盖子区域由6个氨基酸组成，下划线标示。结合分析该脂肪酶的结构模型，发现Asn84Cys/Gly266Cys距离盖子区域太近，分析有可能影响盖子的打开，从而对脂肪酶活力造成巨大影响。因此选择同样位于盖子铰链区域，但是相对距离较远的一对二硫键Phe95Cys/Phe214Cys进行进一步研究。 
实施例2、脂肪酶突变体表达质粒的构建 
本发明所采用的质粒模板pPIC9K-proRCL为前期研究构建[王乐乐，喻晓蔚，徐岩，华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达，高技术通讯，(2009)，19（10）:105]，含有华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因（proRCL）。通过重叠延伸PCR的方法引入两个半胱氨酸突变Phe95Cys和Phe214Cys，所使用的引物如下： 
Figure BDA00002105399200031
Figure BDA00002105399200041
PCR扩增条件：94℃3min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。 
扩增序列与pMD19-T simple连接，热激法转化大肠感受态细胞。阳性菌株扩增培养，同时扩培含有质粒pPIC9K的大肠菌株。二者提取质粒，用AvrⅡ和NotⅠ双酶切，目的片段T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠感受态细胞。挑选阳性菌株提取质粒即可得到重组pPIC9K-ProRCLCYS质粒。 
实施例3：表达质粒电转化毕赤酵母、重组子筛选及分子验证 
阳性菌株扩培后提取质粒，用Sal Ⅰ单酶切为线性，总量为5-10μg进行电转毕赤酵母感受态。电转仪设置为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。电转后加入1mL山梨醇溶液，30℃复苏1h后涂布G418浓度为0.25mg/mL的YPD平板，长出的单菌落接种YPD液体培养基扩培后提取基因组。以基因组为模板，以RCLF和RCLR为引物进行PCR反应，得到1000bp左右条带的即确定为阳性毕赤酵母基因工程菌。 
实施例4：阳性菌株摇瓶发酵 
参考Invitrogen公司操作手册，挑取阳性菌株单菌落接种至25mL BMGY培养基中，28℃,220rpm摇床培养至OD600为2-6时转接至100mL BMMY培养基中，相同条件培养，每24h添加1mL甲醇诱导，发酵80h，取样测酶活。脂肪酶活力的测定方法为比色法，以对硝基苯酚辛酸酯为底物，脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯底物产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在水溶液中显黄色，在410nm有最大的光吸收，通过测定对硝基苯酚在410nm处的光吸收，可测得脂肪酶的活力，参考文献（Pencreach G et al.Enzyme and Microbial Technol.1996,18:417-422.）。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。 
实施例5：脂肪酶的分离纯化 
1）10KD超滤膜浓缩 
将100mL发酵液4℃4000r/min离心20min后弃掉沉淀，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10KD超滤膜浓缩至10mL左右。浓缩酶液用0.02mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.0）4℃透析过夜。 
2）SP-Sepharose FF强阳离子交换柱层析 
将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的SP-Sepharose FF强阳离子交换柱层析（Ф1.6cm×20cm），用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。后用NaCl浓度梯度为0～0.5mol/L的0.02mol/L pH5.0的HAc-NaAc缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，流速为1mL/min，每管收集4mL，分步收集，将脂肪酶活性组分集中，用含1.6mol/L硫酸铵的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液4℃透析备用。 
Sγ3）Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析 
将透析后的酶液继续用Phenyl-Sepharose 6FF疏水柱层析(Ф1.6cm×20cm)，平衡缓冲液为含1.6mol/L硫酸铵的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲，用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。然后用硫酸铵浓度梯度差为0.4mol/L的0.05mol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，最后用H2O洗脱，洗脱速率为0.8mL/min，每管收集4mL，分部收集，集中脂肪酶活性组分，透析除盐，冷冻干燥备用。 
实施例6：脂肪酶突变体的热稳定性与催化活性 
利用圆二色谱法测定脂肪酶的Tm值，结果表明脂肪酶突变体的Tm为52℃，比亲本脂肪酶的Tm高7℃；不同底物浓度条件下测定脂肪酶活力，通过双倒数作图，获得脂肪酶催化动力参数kcat，突变体脂肪酶为17.3±0.2s-1，而亲本脂肪酶为17.7±0.2s-1，两者无显著差别。研究结果说明通过在脂肪酶盖子铰链区域引入二硫键大大增强了脂肪酶的稳定性，而且在生物信息学细致分析的基础上，选择适当的位置引入二硫键，并未对脂肪酶催化活性产生影响。 
Figure IDA00002105399800011
Figure IDA00002105399800031
Figure IDA00002105399800041
Figure IDA00002105399800051

Claims (4)

1.基于二硫键强化折叠的热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，在华根霉CCTCC NO：M201021脂肪酶结构的盖子铰链区域进行突变引入二硫键，所述突变位于华根霉CCTCC NO：M201021脂肪酶第95位及第214位氨基酸，第95位氨基酸由苯丙氨酸突变成半胱氨酸，第214位氨基酸由苯丙氨酸突变成半胱氨酸，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于通过建立脂肪酶的结构模型，模拟分析后，在脂肪酶的盖子铰链区域通过氨基酸突变引入二硫键。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于以质粒pPIC9K-proRCL为模板，通过重叠延伸PCR的方法在脂肪酶中引入两个半胱氨酸突变Phe95Cys和Phe214Cys，得到重组质粒，将重组质粒导入毕赤酵母得到表达脂肪酶突变体的重组毕赤酵母基因工程菌。
4.含编码权利要求1所述脂肪酶突变体的DNA序列的基因工程菌或转基因细胞系。
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