CN102827264A

CN102827264A - 蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺

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Publication number: CN102827264A
Application number: CN2012103155700A
Authority: CN
Inventors: 徐华民; 赵荣华; 赵艳琨; 徐萌
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102827264B

Abstract

蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，涉及蛋白质的分离工艺。本发明的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺是通过以下技术方案实现的：（1）以蚂蚁蛆虫为原料提取蚂蚁蛆虫蛋白质；（2）用分离机分离蚂蚁蛆虫蛋白质；（3）微滤与超滤处理；（4）超声驻波液相制备色谱或凝胶柱纯化出蚂蚁蛆虫蛋白质；（5）纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质真空冷冻干燥并包装。本工艺分离的蛋白质成份明确，一致性好，抑菌及杀菌能力较高，可以分离纯化蚂蚁蛆虫蛋白质的含量达92.1~95.2%。

Description

蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的分离工艺，尤其是涉及一种蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺。

背景技术

蛋白质是构成生物体的一类重要的有机含氮物质，是建造一切细胞和组织的基本材料，是生命的物质基础，各种不同的蛋白质，不仅成份有差别，其分子的立体结构、理化性质和生理生化功能特征也各有不同，正是由于各方面的差异，才可以将其分离。

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具有生物活性的蛋白质在分离时，保证生物活性是重要的，因此选择适当的工艺过程提取分离昆虫类蛋白质并保留生物活性是人们长期关注的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，本工艺分离的蛋白质成份明确，一致性好，抑菌及杀菌能力较高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：（1）以蚂蚁蛆虫为原料提取蚂蚁蛆虫蛋白质；（2）用分离机分离蚂蚁蛆虫蛋白质；（3）微滤与超滤处理；（4）超声驻波液相制备色谱或凝胶柱纯化出蚂蚁蛆虫蛋白质；（5）纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质真空冷冻干燥并包装。具体步骤如下：

（1）以蚂蚁蛆虫为原料提取蚂蚁蛆虫蛋白质；

（2）用分离机以8000-16500r/min连续分离蚂蚁蛆虫蛋白质，收集液相；

（3）液相泵入膜孔径0.05-0.2μm微滤机过滤再泵入膜孔径20-100nm超滤机超滤处理；

（4）超滤液加入溶剂体系，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波声强0.2~1.5kw，频率245-500kHz，流量100~500ml/min，紫外检测器波长280nm，连续纯化分离出蚂蚁蛆虫蛋白质；

（5）纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质真空冷冻干燥并包装。

本发明的分离蚂蚁蛆虫蛋白质采用低温制备虫浆液，高速固液分离，切向流微孔过滤及超滤处理，无固体固定相超声驻波液相制备色谱纯化分离的工艺过程，可以分离纯化蚂蚁蛆虫蛋白质的含量达92.1~95.2%，其分子量为85KDa，含有18种氨基酸，含水分2.5%、钾0.2%、钙0.02%、镁0.01%、锌0.15%。蚂蚁蛆虫蛋白质等电点10.62，蛋白质氮含量12.2%，脂肪含量0.20%。

附图说明

图1为膨胀溶剂体系提取装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：

（1）1000g蚂蚁用粉碎机以250-1250r/min粉碎至0.5-0.05mm，并用0.2-0.05mm孔径筛子筛选，收集粉末状物料；

（2）粉末状物料加入1-50L纯净水搅拌均匀成糊状物；

（3）糊状物在80至120℃杀菌10-30min，然后降温至30℃备用；

（4）取100g小米糠、0.2-0.5g蚂蚁糊状物，加入中药10-20g木香粉和1.0-5.0g草乌粉混合均匀，喷洒10-50ml纯净水，保持温度30至55℃、时间48-240h，生出虫卵；

（5）用孔径0.1-2.0mm筛子筛出虫卵备用；

（6）取10-200g蛋白胨、1-5g蚂蚁糊状物、5-10g酵母抽提粉、2-10g中药木香粉、2-10gNaCl，加0.5-1.0L纯净水混合成为幼蛆培养液，分装于16-20个三角烧瓶中，80-120℃灭菌10-30min，冷却到20-40℃，分别装入0.2-1.0g前面培植的虫卵，摇床1-100r/min，培养12-48h，生成幼蛆；

（7）配制培育液，培育液中加入500-3000g蚂蚁粉、10-80g酵母抽提粉、0.1-1.0gKCl、0.01-0.1gNaCl、20-100gNa₂HPO₄、0.01-0.05gCaCl₂、0.1-0.5gMgSO₄，搅拌均匀并加入10-15L水成为蛆虫培养液，加热80-100℃，时间10-60min，冷却至25-35℃，加入单独100-120℃灭菌10-20min的葡萄糖50-100g，加入含幼蛆培养液1500-2500ml进行培育；培育蚂蚁蛆虫由乳白色变为乳黄色，培育过程完成；

培育参数：pH=5.5-7，搅拌速度1-20r/min，温度25-55℃，通气量7.0 -20L/min，时间72-168h；

（8）将培育液及培育出的蚂蚁蛆虫一起放入分离机中以转速550-1250r/min虫液分离；

（9）用50-100L纯净水洗涤蚂蚁蛆虫2-3次，并用80-100℃热水喷淋灭活1-10min；

（10）灭活的蚂蚁蛆虫用真空冷冻干燥机在温度-30至30℃、真空度100-500kPa、时间5-24h干燥至含水分5-8%得到成品；

（11）包装。

实施例2：

（1）1000g蚂蚁用粉碎机以250-1250r/min粉碎至0.05-0.5mm并用0.05-0.2mm孔径筛子筛选，收集粉末状物料；

（2）粉末状物料加入10-50L纯净水搅拌均匀成糊状物；

（3）糊状物在80-120℃杀菌10-30min然后降温至25-30℃备用；

（4）取100g麦麸、30-50g蚂蚁糊状物，加入中药藿香2-8g、苍术2-5g混合均匀、喷洒10-50ml纯净水，保持温度25-55℃，时间48-240h，生成虫卵；

（5）用孔径0.1-2.0mm筛子筛出虫卵备用；

（6）取50-100g蚂蚁糊状物、5-10g酵母抽提粉、2-10g中药藿香、2-5g中药苍术、2-10gKCl，加入0.5-1.0L纯净水混合成为幼蛆培养液，分装于16-20个三角烧瓶中，80-120℃灭菌10-30min，冷却至20-40℃，每瓶分别装入0.2-1.0g前面培植的虫卵，摇床10-100次/min，培育18-48h，生成幼蛆；

（7）10-15L去离子水中加入1500-2000g蚂蚁粉，20-80g酵母抽提粉、2.0-5.0gK₂SO₄、0.01-0.05gNaCl、20-100gNa₂HPO₄、0.01-0.08gCaCl₂、0.1-0.8MgCl₂，搅拌均匀成为蛆虫培育液，用10000-15000高斯磁感强度处理培养液3-5min，处理3-5次加入含幼蛆培养液1500-2500ml进行培育；

培育参数：pH=5.5-8，搅拌速度1-30r/min，温度25-35℃，通气量5.0-20L/min，时间72-168h；

培育蚂蚁蛆虫由乳白色变为乳黄色，培育过程完成；

（8）将培育液和培育出的蚂蚁蛆虫一起放入分离机中以转速550-1250r/min虫液分离；

（9）用50-100L纯净水洗涤蚂蚁蛆虫2-3次，并用80-100℃热水喷淋灭活2.0-10min；

（10）灭活的蚂蚁蛆虫用真空冷冻干燥机在温度-30-30℃、真空度100-500kPa、时间5-24h干燥至含水分5-8%得到成品；

（11）蛆虫包装。

实施例3：

（1）1000g蚂蚁用粉碎机以250-1250r/min粉碎至0.05-0.5mm并且用0.05-0.2mm孔径筛子筛选，收集粉末状物料；

（2）粉末状物料加入1-50L纯净水搅拌均匀成糊状物；

（3）糊状物在80-120℃杀菌10-30min，然后降温至25-30℃备用；

（4）取100g荞麦麸皮加入蚂蚁糊状物5-10g、中药丁香粉5-10g、苍术粉2-5g混合均匀，喷洒10-50ml纯净水，保持温度25-55℃，时间48-240h，生成虫卵；

（5）用孔径0.1-2.0mm筛子筛出虫卵备用；

（6）取50-100g大豆分离蛋白、5-10g酵母抽提粉、20-50g蚂蚁糊状物、15-20g中药丁香粉、20-30g苍术粉、2-10gNaCl，加入0.5-1.0L纯净水混合成为幼蛆培养液，分装于16-20个三角烧瓶中，80-120℃灭菌10-30min，冷却至20-40℃，每瓶分别装入0.2-1.0g前面培养的虫卵，摇床10-100次/min，培养12-48h，生成幼蛆；

（7）取1500-2000g蚂蚁粉、10-80g酵母抽提粉、2.0-5.0g尿素、0.01-0.05gNaCl、20-100gNaH₂PO₄、0.01-0.08gCaCl₂、0.1-0.8gMgCl₂搅拌均匀并加入10-15L水成为蛆虫培育液，用超声波2450-5000kHz、1kw-10kw、处理培养液10-30min，然后加入含幼蛆培养液1500-2500ml进行培育，培育蚂蚁蛆虫由乳白色变为乳黄色，培育过程完成；

（8）将培育液及培育出的蚂蚁蛆虫一起放入分离机中，以转速550-1250r/min虫液分离；

（11)蛆虫包装。

实施例4：

（2）粉末状物料加入1-50L纯净水搅拌均匀成糊状物；

（3）糊状物在80-120℃杀菌10-30min，然后降温至25-30℃备用；

（4）取100g琼脂加入蚂蚁糊状物5-10g、中药藿香粉2-8g、木香粉2-6g混合均匀，喷洒10-50ml纯净水，保持温度25-55℃，时间48-240h，生成虫卵；

（5）用孔径0.1-2.0mm筛子筛出虫卵备用；

（6）取50-100g蛋白胨、5-10g酵母抽提粉、20-50g蚂蚁糊状物、2-10gNaCl，加0.5-1.0L纯净水混合成为幼蛆培养液，分装于16-20个三角烧瓶中，80-120℃灭菌10-30min，冷却到20-40℃，分别装入0.2-1.0g前面培养的虫卵，摇床1-10次/min，培养12h-48h，生成幼蛆；

（7）配制培育液，培育液中加入500-3000g蚂蚁粉、10-80g酵母抽提粉、0.1-1.0gKCl、0.01-0.1gNaCl、20-100gNaH₂PO₄、0.01-0.05gCaCl₂、0.1-0.5gMgSO₄搅拌均匀并加入10-15L水成为蛆虫培育液，用微波频率2450-915MHz、功率0.5-2.5kw处理培育液2-10min，加入含幼蛆培养液1500-2500ml进行培育，

培育参数：pH=5.5-8、搅拌速度1-30r/min、温度25-35℃、通气量5-20L/min、时间72-168h；

培育蚂蚁蛆虫由乳白色变为乳黄色培育过程完成；

（10）灭活的蚂蚁蛆虫用真空冷冻干燥机在温度-30-30℃、真空度100-500kpa、时间5-24h干燥至蚂蚁蛆虫含水分5-8%得成品；

（11）蛆虫包装。

实施例5：

（1）将1000g新鲜蚂蚁蛆虫装入玻璃珠研磨机内以10-50r/min研磨10-30min，再将蚂蚁蛆虫浆液放入胶体磨中以空隙0.01-0.5μm连续磨浆；

（2）磨浆液加入10-50g异抗坏血酸并加入0.02-0.20mol/L磷酸钠缓冲液500-1000mL，用0.1-1.0mol/LH₃PO₄调节溶液pH=3-8，在0-20℃条件下浸提30-150min；

（3）浸提液用分离机以8000-16500r/min连续分离，收集液相；

（4）1.0L液相加入5.0L-10L纯净水并搅拌均匀，泵入膜孔径0.05-0.2μm微滤机过滤再泵入膜孔径20-100nm超滤机超滤处理；

（5）超滤液加入由质量比16%PEG1000-12.5%K₂HPO₄组成的溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波声强0.2~1.5KW、频率245~1000kHz，流量10-500ml/min，紫外检测器波长280nm，连续纯化分离出蚂蚁蛆虫蛋白质；

（6）纯化蚂蚁蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在真空度1-50pa、温度-30~35℃，干燥至含水份3~5%成冻干粉，包装。

本实施方式分离纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质的含量为92.1%。

实施例6：

（1）将1000g干状蚂蚁蛆虫加入5L-10L纯净水在4~20℃浸泡5~24h，然后泵入高压均质机中，以压力25~60MPa，连续均质；

（2）均质后蚂蚁蛆虫浆料中加入NaCl调制成0.01-0.3mol/L NaCl溶液，控制温度0~10℃、压力0.2~05MPa，放置5h-12h；

（3）浸提液用分离机以8000~16500r/min连续分离，收集液相；

（4）液相泵入膜孔径0.05~0.2μm微滤机过滤，再泵入膜孔径20~100nm超滤机超滤处理；

（5）超滤液加入到由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水按照8﹕2﹕5﹕5体积比组成的溶剂体系中，超声驻波声强0.2~1.5kw，频率245-500kHz，流量100~500ml/min，紫外检测器波长280nm，连续纯化分离出蚂蚁蛆虫蛋白质；

（6）纯化蚂蚁蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在真空度1-50Pa，温度-30~35℃，干燥至含水份3~5%成冻干粉，包装。

本实施方式分离纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质的含量为95.2%。

实施例7：

（1）1000g干蚂蚁蛆虫加入到常温膨化装置（ZL200520108339.X）中，充入1Kg-10 Kg氮气并加压至1Mpa~3Mpa，时间5~10min，然后迅速释放压力至常压，收集蚂蚁蛆虫粉末；

（2）蚂蚁蛆虫粉末置入膨胀溶剂体系提取装置中，加入100~1000ml乙醇和5-10kgCO₂及0.2~1.0kg氨水，加压至5~8Mpa，在常温条件下，保持压力5~10min形成膨胀溶剂体系提取蚂蚁蛆虫蛋白质，然后释放气体压力至常压，收集混合液；

（3）混合液用分离机在10000-16500 r/min连续分离，收集液相；

（4）液相用膜孔径0.2~10μm微滤机过滤并用膜孔径10-100nm超滤机超滤处理；

（5）超滤液泵入Superdex200 Perpgrade柱子中，以流速50~90cm/h过滤，收集滤液；

（6）滤液用真空冷冻干燥机在真空度10.0-50Pa，温度-30~35℃，时间16~24h，干燥至蚂蚁蛆虫蛋白质含水3~5%成冻干粉，包装。

本实施方式分离纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质的含量为95.2%。

如图1所示，本实施方式中所述的膨胀溶剂体系提取装置由球形膨胀溶剂体系提取器1、原料罐2、固液分离器3、气固分离器4、成品罐5、外源二氧化碳瓶6、二氧化碳储罐7、二氧化碳循环压力泵8和溶剂罐9组成，球形膨胀溶剂体系提取器1通过管线分别与原料罐2、固液分离器3、二氧化碳循环压力泵8及溶剂罐9相连接，固液分离器3与气固分离器4相连接，气固分离器4通过管线分别与成品罐5及二氧化碳储罐 7相连接，二氧化碳储罐7通过管线分别与外源二氧化碳瓶6及二氧化碳循环压力泵8连接。

实施例8：蚂蚁蛆虫蛋白质的体外抑菌与杀菌实验

实验采用《全国临床检验操作规程》的方法，用1mg蚂蚁蛆虫蛋白质冻干粉溶解于离子纯净水中稀释成10μg/mL的溶液备用，取对数生长期的五种菌类的常规培养液分别加到含有不同浓度蚂蚁蛆虫蛋白质的肉汤培养基试管中，每毫升含活菌数为1×10⁵CFU。在培养箱中保持温度33~37℃，培养20~24h，观察各试管溶液的浊度，溶液澄清无菌生长的蚂蚁蛆虫蛋白质为最低抑菌浓度（MIC），分别吸取上述试管无菌生长的培养基50μL，接种于无菌琼脂培养基平板，35~37℃培养24h，仍然无菌类生长，其中的最低浓度则是蚂蚁蛆虫蛋白质的最低杀菌浓度（MBC）。

蚂蚁蛆虫蛋白质对不同菌类的MIC和MBC（μg/ml）

菌株	MIC	MBC
			大肠埃希菌	3.71±0.17	6.11±0.21
金黄色葡萄球菌	4.23±0.15	6.52±0.43
			绿脓杆菌	2.75±0.19	3.92±0.25
枯草芽孢杆菌	3.12±0.17	5.79±0.27
			红色毛癣菌	2.91±0.22	4.35±0.18

Claims

1.蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述分离工艺如下：

（1）以蚂蚁蛆虫为原料提取蚂蚁蛆虫蛋白质；

（5）纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质真空冷冻干燥并包装。

2.根据权利要求1所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述溶剂体系由质量比16%PEG1000-12.5%K₂HPO₄组成。

3.根据权利要求1所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水按照8﹕2﹕5﹕5体积比组成。

4.根据权利要求1所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述超滤液泵入Superdex200 Perpgrade柱子中，以流速50~90cm/h过滤，得到纯化的蚂蚁蛆虫蛋白质。

5.根据权利要求1所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述蚂蚁蛆虫按照如下步骤制备：

（1）蚂蚁粉碎至粉末状，

（2）与水混合搅拌成蚂蚁糊状物；

（3）蚂蚁糊状物高温杀菌；

（4）谷物糠麸及蚂蚁糊状物用中药处理形成虫卵培养液，所述虫卵培养液由100g谷物糠麸、蚂蚁糊状物0.2-50g、丁香粉0-10g、苍术粉0-5g、藿香0-8g、0-20g木香粉和0-5.0g草乌粉混合而成，保持温度30-55℃、时间48-240h，生成虫卵；

（5）幼蛆培殖：配制幼蛆培养液，所述幼蛆培养液由1-100g蚂蚁糊状物、0-200g蛋白胨、5-10g酵母抽提粉、0-10g木香粉、0-10g藿香、0-30g苍术粉、0-20g中药丁香粉、2-10gNaCl或KCl、0-100g大豆分离蛋白、0.5-1.0L纯净水混合而成，分装于三角烧瓶中，灭菌后分别装入前面培殖的虫卵，摇床1 -100r/min，培养12-48h，生成含蚂蚁幼蛆的培养液；

（6）蛆虫培育：配制蛆虫培育液，所述蛆虫培育液由500-3000g蚂蚁粉、10-80g酵母抽提粉、0.01-0.1gNaCl、0-1.0gKCl、0-0.8gMgCl₂、0.01-0.08gCaCl₂、0-0.5gMgSO₄、20-100gNa₂HPO₄、0-5.0K₂SO₄、0-5.0g尿素混合均匀并加入10-15L水，加入含幼蛆培养液进行培育，培育参数：pH=5.5-8，搅拌速度1-30r/min，温度25-55℃，通气量5.0 -20L/min，时间72-168h，蚂蚁蛆虫由乳白色变为乳黄色，培育过程完成；

（7）将培育液和培育出的蚂蚁蛆虫放入分离机中进行虫液分离，用纯净水洗涤蚂蚁蛆虫，并用热水喷淋灭活。

6.根据权利要求5所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述虫卵培养液由琼脂100g、蚂蚁糊状物5-10g、藿香粉2-8g、木香粉2-6g混合而成。

7.根据权利要求5所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于所述糊状物在80至120℃杀菌10-30min，然后降温至30℃备用。

8.根据权利要求5所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于分离机转速为550-1250r/min。

9.根据权利要求5所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于用纯净水洗涤蚂蚁蛆虫2-3次，并用80-100℃热水喷淋灭活1-10min。

10.根据权利要求5所述的蚂蚁蛆虫蛋白质的分离工艺，其特征在于灭活的蚂蚁蛆虫在温度-30-30℃、真空度100-500kPa、时间5-24h干燥至含水分5-8%得到成品。