CN102798674B - 一种快速的硫酸依替米星中控检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种依替米星的检测方法，本方法采用UPLC或UHPLC-ELSD，以分离纯化后的含乙醇的依替米星解吸液作为样品直接进行分析，以达到进行生产过程的控制。本发明采用超高效液相色谱法与蒸发光散射联用技术，可实现生产过程中在线快速检测，从而达到指示分离纯化工艺中流份收集及检测的目的，本方法方便快速、准确可靠。

Description

一种快速的硫酸依替米星中控检测方法

技术领域

本发明涉及一种硫酸依替米星生产过程中间控制的快速检测方法，具体涉及一种以耐受压力不低于600bar的液相色谱仪器与蒸发光检测器联用技术快速测定硫酸依替米星生产过程中的中间产品，达到对硫酸依替米星生产过程控制的目的。

背景技术

超高效液相色谱（UPLC）技术是随着waters公司2003年推出的采用小颗粒填料高压下运行的色谱仪Acquity UPLC而兴起的新的色谱分离技术。相较于高效液相色谱（HPLC）技术，它具有更高的柱效、更快的分离速度等优点，从而使分析技术跨入到高效、高通量时代。超高效液相色谱技术，采用亚2μm粒径的填料的色谱柱，精确梯度控制的超高压液相色谱泵，低扩散、低交叉污染的自动进样器及高速检测器，使UPLC的峰容量、分析效率、灵敏度都得到很大提高。

蒸发光散射检测（ELSD）技术兴起于上世纪80年代，是一种通用型检测器，不仅弥补了紫外检测器不能检测无紫外吸收或只有紫外末端吸收物质的缺陷，而且相较于用于无紫外吸收物质检测的示差折光检测器，它具有高灵敏度、不受温度等实验条件影响、可用于梯度洗脱等优点。ELSD由雾化器、加热漂移管、光散射池和散射光检测器组成，其工作原理主要包括雾化、蒸发、光散射及检测等3个过程。

硫酸依替米星(Etimicin sulfate)，结构式如下：

硫酸依替米星是我国科研人员自行研制的，拥有自主知识产权的高效、低毒、抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素，是唯一获得国家一类新药证书的抗感染药物。本品适用于对其敏感的大肠埃希杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、枸橡酸杆菌、肠杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和葡萄球菌等引起的各种感染。临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效:呼吸道感染:如急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染:如急性肾盂肾炎、膀胱炎、慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织和其它感染:如皮肤及软组织感染、外伤、创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。同时具有较低的耳、肾毒性不良反应发生率，证明了硫酸依替米星是临床应用中高效、安全的新一代半合成氨基糖苷类抗生素。硫酸依替米星由于无紫外生色基团，因此只具有很弱的紫外末端吸收，不能用紫外-可见光检测器直接测定，故本方法采用通用型检测器蒸发光散射检测技术。硫酸依替米星生产过程需要进行中控检测，目的是检测依替米星在分离纯化中的洗脱流分中依替米星含量，以监测硫酸依替米星的分离纯化过程，获得纯度较高的依替米星终产品。

中控检测是针对硫酸依替米星制备过程中的分离纯化过程的不同浓度乙醇解吸液，分离纯化后的含乙醇的依替米星解吸液的制备方法如下：取原料车间不同时间段收集的中间产品依替米星解吸液，以0.22μm滤膜过滤，即得。目前硫酸依替米星生产过程中控检测方法为柱前衍生化高效液相色谱法，由于衍生化反应复杂不可控、衍生化产物的不稳定性影响测定结果的准确性，同时检测时间至少要半个小时以上，严重影响了硫酸依替米星的生产效率。因此发明一种快速、准确的中控检测方法，对硫酸依替米星的生产和工艺开发都有非常积极的意义。

正是由于超高效液相色谱技术以及蒸发光散射技术满足我们对于硫酸依替米星测定要求，我们开发了硫酸依替米星UPLC-ELSD分析方法。

发明内容

本发明的目的是研究开发一种快速测定硫酸依替米星生产过程中分离纯化工序中的中控检测方法。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供一种硫酸依替米星检测方法，该方法采用超高效液相色谱法，同时使用蒸发光散射检测器实现快速检测。

本发明的检测方法，所用的色谱条件如下：

1、液相色谱仪耐受压力不低于600bar，仪器型号包括但不限于Waters H-Class或Agilent 1260或Agilnet 1290。

2、色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径1.7~3.5μm，柱规格为50mm～150mm×1.0~4.6mm，柱孔径为80-120A°。

3、流动相分为有机相和水相，有机相为甲醇或乙腈，水相为水-氨水-冰醋酸混合溶液体积比范围为（88~98）:（1~5）：（0.1~1）。有机相与水相的体积比按时间顺序从20:80变化到90:10。

4、流动相流速为0.5~2ml/min，进样量为1μl~10μl。

5、检测器为蒸发光散射检测器，参数为漂移管温度为45~70℃，氮气流速1.5~3.0L/min，Gain值1~7。

本发明的检测方法，步骤如下：

步骤1，配制供试品溶液：含乙醇的依替米星中间产品解吸液的制备，方法如下：

取原料车间不同时间段收集的中间产品依替米星解吸液，以0.22μm滤膜过滤，即得。

步骤2，对照品溶液：精密称取依替米星对照品适量，用水配制成每ml含依替米星0.5mg，并逐步稀释，其中每ml含依替米星0.03mg作为对照溶液1，每ml含依替米星0.05mg作为对照溶液2，每ml含依替米星0.10mg作为对照溶液3，每ml含依替米星0.20mg作为对照溶液4，每ml含依替米星0.40mg作为对照溶液5，每ml含依替米星0.50mg作为对照溶液6。

步骤3，注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中依替米星的含量。

本发明的方法，优点在于：

1、检测时间非常短，12min以内即完成检测，可以快速检测，满足中控检测快速方便的要求。

2、蒸发光散射检测器为通用型检测器，能避免因硫酸依替米星及其杂质紫外吸收弱而导致的谱图信息不全面，能够全面准确的反应中间体质量信息。

3、方法准确度、灵敏度高，线性范围宽，满足中控检测准确灵敏的要求。

附图说明

图1:实施一色谱图

图2:实施二色谱图

图3:实施三色谱图

图4:实施四色谱图

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1，

实验器材及试剂：

1、实验仪器：

Agilent 1260 infinity series，Waters acquity H-class UPLC

2、实验试剂：

硫酸依替米星中间产品解吸液（无锡济民可信山禾药业），依替米星对照品（中检所），甲醇（色谱纯，Merck），乙腈（色谱纯，Merck），氨水（分析纯，国药），冰醋酸（分析纯，国药），醋酸铵（分析纯，国药），超纯水（自制）。

3、色谱条件：

色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径1.7~3.5μm，柱规格为50mm～150mm×1.0~4.6mm，柱孔径为

流动相：分为有机相和水相，有机相为甲醇或乙腈，水相为水-氨水-冰醋酸混合溶液体积比范围为（88~98）:（1~5）：（0.1~1）。有机相与水相的体积比按时间顺序从20:80变化到90:10。流速为0.5~2ml/min，进样量为1μl～10μl。检测器为蒸发光散射检测器，参数为漂移管温度为45~70℃，氮气流速1.5~3.0L/min，Gain值1~7。

4、样品溶液配制

供试品溶液：含乙醇的依替米星中间产品解吸液，以0.22μm滤膜过滤，即得。

对照品溶液：精密称取对照品适量，用水配制成每ml含依替米星0.5mg，并逐步稀释，其中每ml含依替米星0.03mg作为对照溶液1，每ml含依替米星0.05mg作为对照溶液2，每ml含依替米星0.10mg作为对照溶液3，每ml含依替米星0.20mg作为对照溶液4，每ml含依替米星0.40mg作为对照溶液5，每ml含依替米星0.50mg作为对照溶液6。

实施例1

1.1色谱条件

色谱仪：Agilent 1260 infinity series；色谱柱：Phenomenex SynergiFusion-RP(50×4.6mm，2.5μm)；流动相A：甲醇，流动相B：水-氨水-冰醋酸（96:3.6:0.4），按如下表中进行梯度洗脱。

表1-1  梯度洗脱程序

时间（min）	B相比例（%）
		0	25
1	30
		4	30
6	60
		8	60
9	90
		10	90
11	25

流速：0.8ml/min；进样量5μl；蒸发光散射检测器漂移管温度为45℃，氮气流速1.5L/min，Gain值5。

1.2专属性

将含乙醇的依替米星中间产品过0.45μm膜，按上述条件进样。依替米星及其相关杂质均达到基线分离，色谱峰型良好。见附图1。

1.3线性范围

对照品：精密称取硫酸依替米星对照品适量，以水制成每1ml含依替米星100mg/ml，分别稀释成一系列浓度（1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml，100mg/ml），以10μl进样量进样分析，绘制标准曲线，线性方程为：

y=0.7099x-1.3369，r=0.9998

确定依替米星线性范围为10μg~1000μg。

1.4准确度

样品：8907解吸液

对照品：硫酸依替米星对照品

回收率试验：以水稀释样品成每ml中含依替米星1.0mg，作为供试品溶液，按前述色谱条件进行测定，计算出含量（89.06%），然后按样品的含量分别加入80%、100%、120%的对照品，每个浓度平行制备3份供试品溶液。试验结果见表2，平均回收率为99.62%，相对标准偏差为0.77%。

表1-2  加样回收率试验结果

1.5进样精密度

样品：硫酸依替米星对照品，ETM10、ETM7、ETM12、ETM6、ETM5、ETM3杂质对照品。

精密度试验：取以上各对照品溶液，按碱性色谱系统色谱条件，连续进样6次，进样量为10μl，以峰面积计算精密度，检测结果见表1-3。

表1-3  精密度试验数据

	ETM-10	ETM-7	ETM-12	ETM-6	ETM-5	ETM-3	ETM
								1	667.4	1008	518.7	767.8	1022.1	637.5	613.4
2	665.4	1013.8	520.2	749.2	1035.8	643.4	608
								3	658	973.2	529	776.2	1034.5	653.3	610.2
4	674.3	987.2	541.1	788.1	1056.7	662.9	638

5	674.2	1020.4	537.6	780.1	1052.4	649.9	627.6
								6	654.5	987.6	531.3	769.8	1060.4	643	619.4
均值	665.6	998.4	529.7	771.9	1043.7	648.3	619.4
								RSD/%	1.23	1.84	1.70	1.72	1.45	1.40	1.86

1.6重复性

重复性试验：由三名操作人员，检验同一个样品，平行检验10次，所得检验结果见表1-4、5。对测定数据进行统计分析，相对误差和相对标准偏差均小于1.0%。

表1-4  含量测定结果

表1-5  数据统计分析结果

实施例2

2.1色谱条件

色谱仪：Agilent 1260 infinity series；色谱柱：Phenomenex Kinetex-C18(50×4.6mm，2.1μm)；流动相A：甲醇，流动相B：水-氨水-冰醋酸（98:2.0:1.0），按如下表中进行梯度洗脱。

表2-1  梯度洗脱程序

时间（min）

B相比例（%）

0	20
		1	25
4	25
		6	60
8	60
		9	90
10	90
		11	20

流速：0.5ml/min；进样量10μl；蒸发光散射检测器漂移管温度为55℃，氮气流速2.0L/min，Gain值1。

2.2专属性

将含乙醇的依替米星中间产品过0.45μm膜，按上述条件进样。依替米星及其相关杂质均达到基线分离，色谱峰型良好。见附图2。

2.3线性范围

对照品：精密称取硫酸依替米星对照品适量，以水制成每1ml含依替米星100mg/ml，分别稀释成一系列浓度（1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml，100mg/ml），以10μl进样量进样分析，绘制标准曲线，线性方程为：

y=0.7009x-1.3062，r=0.9998

确定依替米星线性范围为10μg~1000μg。

2.4准确度

样品：8907解吸液

对照品：硫酸依替米星对照品

回收率试验：以水稀释样品成每ml中含依替米星1.0mg，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算出含量（89.06%），然后按样品的含量分别加入80%、100%、120%的对照品，每个浓度平行制备3份供试品溶液。试验结果见表2-2，平均回收率为100.0%，相对标准偏差为0.54%。

表2-2  加样回收率试验结果

2.5进样精密度

样品：硫酸依替米星对照品，ETM10、ETM7、ETM12、ETM6、ETM5、ETM3杂质对照品。

精密度试验：取以上各对照品溶液，按碱性色谱系统色谱条件，连续进样6次，进样量为10μl，以峰面积计算精密度，检测结果见表2-3。

表2-3  精密度试验数据

	ETM-10	ETM-7	ETM-12	ETM-6	ETM-5	ETM-3	ETM
								1	669.4	1008.2	511.7	767.2	1022.8	632.5	610.5
2	660.9	1003.8	527.2	749.9	1037.8	645.4	608.5
								3	659.8	978.2	529.9	776.5	1035.8	651.3	610.2
4	674.3	987.2	531.5	782.1	1057.7	658.9	633.9
								5	676.2	1010.4	537.2	780.1	1054.4	650.9	627.6
6	655.5	989.6	530.3	762.8	1064.4	633.9	614.4
								均值	666.0	996.2	528.0	769.8	1045.5	645.5	617.5
RSD/%	1.3	1.3	1.6	1.6	1.5	1.6	1.7

2.6重复性

重复性试验：由三名操作人员，检验同一个样品，平行检验10次，所得检验结果见表2-4、5。对测定数据进行统计分析，相对误差和相对标准偏差均小于1.0%。

表2-4  含量测定结果

表2-5  数据统计分析结果

实施例3

3.1色谱条件

色谱仪：Waters Acquity UPLC；色谱柱：Waters XBridge C18(100×3.5mm，1.7μm)；流动相A：甲醇，流动相B：水-氨水-冰醋酸（90:4.8:0.2），按如下表中进行梯度洗脱。

表3-1  梯度洗脱程序

时间（min）	B相比例（%）
		0	25
1	30
		4	30
5	60
		8	60
9	90

10

25

流速：2ml/min；进样量1μl；蒸发光散射检测器漂移管温度为70℃，氮气流速3.0L/min，Gain值5。

3.2专属性

将含乙醇的依替米星中间产品过0.45μm膜，按上述条件进样。依替米星及其相关杂质均达到基线分离，色谱峰型良好。见附图3。

3.3线性范围

对照品：精密称取硫酸依替米星对照品适量，以水制成每1ml含依替米星100mg/ml，分别稀释成一系列浓度（1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml，100mg/ml），以10μl进样量进样分析，绘制标准曲线，线性方程为：

y=0.70909x-1.2862，r=0.9998

确定依替米星线性范围为10μg~1000μg。

3.4准确度

样品：8907解吸液

对照品：硫酸依替米星对照品

回收率试验：以水稀释样品成每ml中含依替米星1.0mg，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算出含量（89.06%），然后按样品的含量分别加入80%、100%、120%的对照品，每个浓度平行制备3份供试品溶液。试验结果见表3-2，平均回收率为100.1%，相对标准偏差为0.32%。

表3-2  加样回收率试验结果

3.5进样精密度

样品：硫酸依替米星对照品，ETM10、ETM7、ETM12、ETM6、ETM5、ETM3杂质对照品。

精密度试验：取以上各对照品溶液，按碱性色谱系统色谱条件，连续进样6次，进样量为10μl，以峰面积计算精密度，检测结果见表3-3。

表3-3  精密度试验数据

	ETM-10	ETM-7	ETM-12	ETM-6	ETM-5	ETM-3	ETM
								1	670.1	1008.8	517.1	757.5	1032.2	637.5	615.3
2	660.2	1005.2	529.2	779.9	1035.8	655.8	628.2
								3	669.5	975.2	539.0	776.6	1030.8	654.3	612.2
4	684.3	989.2	535.5	787.1	1052.9	658.5	631.9
								5	676.2	1000.2	532.7	760.1	1055.4	652.9	637.6
6	665.9	985.6	530.8	772.8	1066.4	634.7	618.4
								均值	671.0	994.0	530.7	772.3	1045.6	649.0	623.9
RSD/%	1.2	1.3	1.4	1.5	1.4	1.6	1.6

3.6重复性

重复性试验：由三名操作人员，检验同一个样品，平行检验10次，所得检验结果见表3-4、5。对测定数据进行统计分析，相对误差和相对标准偏差均小于1.0%。

表3-4  含量测定结果

表3-5  数据统计分析结果

实施例4

4.1色谱条件

色谱仪：Agilent 1260 infinity series；色谱柱：Agilent Extend-C18(50×4.6mm，3.0μm)；流动相A：甲醇，流动相B：水-氨水-冰醋酸（98:2.0:1.0），按如下表中进行梯度洗脱。

表4-1  梯度洗脱程序

时间（min）	B相比例（%）
		0	20
1	25
		4	25
6	60
		8	60
9	90
		10	90
11	20

流速：0.8ml/min；进样量2μl；蒸发光散射检测器漂移管温度为60℃，氮气流速2.0L/min，Gain值7。

4.2专属性

将含乙醇的依替米星中间产品过0.45μm膜，按上述条件进样。依替米星及其相关杂质均达到基线分离，色谱峰型良好。见附图4。

4.3线性范围

对照品：精密称取硫酸依替米星对照品适量，以水制成每1ml含依替米星100mg/ml，分别稀释成一系列浓度（1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml，100mg/ml），以10μl进样量进样分析，绘制标准曲线，线性方程为：

y=0.69809x-1.2986，r=0.9998

确定依替米星线性范围为10μg~1000μg。

4.4准确度

样品：8907解吸液

对照品：硫酸依替米星对照品

回收率试验：以水稀释样品成每ml中含依替米星1.0mg，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算出含量（89.06%），然后按样品的含量分别加入80%、100%、120%的对照品，每个浓度平行制备3份供试品溶液。试验结果见表4-2，平均回收率为100.0%，相对标准偏差为0.67%。

表4-2  加样回收率试验结果

4.5进样精密度

样品：硫酸依替米星对照品，ETM10、ETM7、ETM12、ETM6、ETM5、ETM3杂质对照品。

精密度试验：取以上各对照品溶液，按碱性色谱系统色谱条件，连续进样6次，进样量为10μl，以峰面积计算精密度，检测结果见表4-3。

表4-3  精密度试验数据

	ETM-10	ETM-7	ETM-12	ETM-6	ETM-5	ETM-3	ETM
								1	675.8	1018.2	518.1	772.5	1022.2	639.2	618.8
2	658.8	1015.5	532.2	769.5	1039.8	659.5	629.7
								3	679.5	1005.8	542.0	778.6	1035.8	658.8	618.2
4	684.3	999.8	538.5	797.1	1058.9	658.5	635.3
								5	676.2	1000.2	536.7	769.1	1059.4	653.6	637.6
6	686.9	1009.6	538.8	792.8	1068.4	634.2	628.7
								均值	676.9	1008.2	534.4	779.9	1047.4	650.6	628.1
RSD/%	1.5	0.8	1.6	1.6	1.7	1.7	1.3

4.6重复性

重复性试验：由三名操作人员，检验同一个样品，平行检验10次，所得检验结果见表4-4、5。对测定数据进行统计分析，相对误差和相对标准偏差均小于1.0%。

表4-4  含量测定结果

表4-5  数据统计分析结果

Claims (1)

1.一种依替米星的检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，配制供试品溶液：含乙醇的依替米星中间产品解吸液的制备，方法如下：取原料车间不同时间段收集的中间产品依替米星解吸液，以0.22μm滤膜过滤，即得；

步骤2，对照品溶液：精密称取依替米星对照品适量，用水配制成每ml含依替米星0.5mg，并逐步稀释，其中每ml含依替米星0.03mg作为对照溶液1，每ml含依替米星0.05mg作为对照溶液2，每ml含依替米星0.10mg作为对照溶液3，每ml含依替米星0.20mg作为对照溶液4，每ml含依替米星0.40mg作为对照溶液5，每ml含依替米星0.50mg作为对照溶液6；

步骤3，注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中依替米星的含量；

其中，色谱条件如下：

色谱仪：Agilent1260infinity series；色谱柱：Phenomenex SynergiFusion-RP，型号50×4.6mm，2.5μm；流动相A：甲醇，流动相B：水-氨水-冰醋酸=96:3.6:0.4，按如下表中进行梯度洗脱：

时间（min） B相比例（%） 0 25 1 30 4 30 6 60 8 60 9 90 10 90 11 25

流速：0.8ml/min；进样量5μl；蒸发光散射检测器漂移管温度为45℃，氮气流速1.5L/min，Gain值5。

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