CN102435679B - 一种新的硫酸依替米星有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸依替米星有关物质的检测方法，该方法包括以下步骤：精密称取硫酸依替米星有关物质对照品各适量，分别加水制成一定浓度的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷杂质混合对照品溶液，流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

Description

一种新的硫酸依替米星有关物质的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸依替米星有关物质的检测方法。具体的讲是一种新的采用HPLC-ELSD仪器、采用梯度洗脱的方法检测硫酸依替米星有关物质的方法。

背景技术：

硫酸依替米星(Etimicin sulfate)是我国科研人员自行研制的，拥有自主知识产权的高效、低毒、抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素，是唯一获得国家一类新药证书的抗感染药物。

硫酸依替米星注射液适用于对其敏感的大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、枸橼酸杆菌、肠杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、嗜血流感杆菌、绿脓杆菌和葡萄球菌等引起的各种感染。临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效：呼吸道感染：如急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染：如急性肾盂肾炎、膀胱炎、慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织和其它感染：如皮肤及软组织感染，外伤、创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。

目前，生产硫酸依替米星使用的工艺均为专利报道的工艺(申请号：93112412.3)。其主要步骤为：庆大霉素C1a碱在溶剂中加入醋酸钴、乙酸酐，生成3，2，，6，-三-N-乙酰基庆大霉素C1a(P1)，经过提取浓缩，浓缩液通入硫化氢气体除去钴离子，得到纯度为90％-95％的P1，然后加入乙醛，在0-5℃冰水浴中用还原剂氢化，得到3，2，，6，-三-N-乙酰基-1-N乙基庆大霉素C1a(P2)，经吸附型大孔树脂分离后得到纯度较高的P2，纯度较高的P2加入1N的氢氧化钠溶液，水解回流48小时，水解液经吸附型大孔树脂分离得到纯度为90％以上的1-N-乙基庆大霉素C1a(依替米星)溶液，加酸成盐，活性炭脱色，冷冻干燥，即得依替米星盐。

硫酸依替米星是一种多结构产品，生产中难于提纯，主要杂质为：ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3，它们的结构分别为：

ETM-10结构式：

ETM-7结构式：

ETM-12结构式：

ETM-6结构式：

ETM-5结构式：

ETM-3结构式：

2010版中国药典公开了一种硫酸依替米星有关物质的测定方法，该方法采用HPLC法，用0.2mol/L三氟乙酸-甲醇(84∶16)作为流动相，但这个流动相腐蚀性过强，有关物质检测的灵敏度和准确度偏低，且三氟乙酸不适用于LC-MS测定，影响后续一些研究工作的开展。

本发明通过对流动相的缓冲体系、梯度条件及ELSD参数进行优化，建立了依替米星的有关物质定量分析的色谱条件，提供一种全新的有关物质检测方法。本发明所述的方法，其流动相腐蚀性低，灵敏度和准确度高，并且不干扰后续的LC-MS测定，为依替米星后续的一些研究工作开展创造有利条件。

发明内容：

本发明提供一种硫酸依替米星杂质含量检测方法：该方法步骤如下：精密称取氨基糖苷有关物质对照品(ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％)各适量，分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为1-1000μ g/ml)。色谱柱：Gemini NX C18(4.6mm×150mm，5μm)。流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(98～75∶2.0～5.0∶0.1～1.0)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

优选的：

精密称取氨基糖苷有关物质对照品(ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％)各适量，分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为1-500μg/ml)。色谱柱：Gemini NX C18(4.6mm×150mm，5μm)。流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(98～85∶2.0～4.0∶0.1～0.5)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

更优选的：

精密称取氨基糖苷有关物质对照品(ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％)各适量，分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为10-300μg/ml)。流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

流动相梯度

在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件；

流速0.8ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μl；

ELSD参数：

漂移管温度：105℃；

载气流速：2.6L/min；

Gain值：1。

以下试验可以表明本发明上述的检测方法的优点以及该方法的优越的可行性、准确性和可靠性。

一：专属性试验

取硫酸依替米星原料药适量，精密称定，加水溶解制成约2mg/ml的供试品溶液，按照上述方法进行测定；取有关物质对照品各适量，精密称定，加水溶解制成约1～2mg/ml的杂质对照品溶液。按照上述方法进行测定。测定图谱见图1-7：

以上实验图谱检测表明，采用该方法测定各硫酸依替米星有关物质的含量，分离度良好，峰对称性良好，无明显干扰。

二：精密度试验

取以上氨基糖苷杂质混合对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，进样量为10μl，ETM-10峰面积的RSD值为2.73％，ETM-7的RSD值为1.84％，ETM-12的RSD值为1.70％，ETM-6的RSD值为1.72％，ETM-5的RSD值为1.45％，ETM-3的RSD值为1.93％，结果见Tab.2。

Tab.2精密度试验结果

三：定量限

当样品峰高约为噪音的10倍，即S/N为10的进样量作为定量限。6个氨基糖苷杂质对照品的定量限试验结果分别为：ETM-10：100ng；ETM-7：100ng；ETM-12：250ng；ETM-6：130ng；ETM-5：130ng，ETM-3：150ng。

四.线性关系考察：

取氨基糖苷杂质混合对照品溶液，分别进样1，2，5，10，20，40μl，以峰面积的对数值为横坐标，进样量(μg)的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，6个氨基糖苷有关物质的回归方程分别为：

y＝0.6983x-2.1021，r＝0.9991(ETM-10)；

y＝0.6894x-2.1366，r＝0.9993(ETM-7)；

y＝0.7514x-2.1383，r＝0.9964(ETM-12)；

y＝0.7158x-2.1673，r＝0.9988(ETM-6)；

y＝0.7290x-2.2268，r＝0.9990(ETM-5)；

y＝0.7754x-2.1775，r＝0.9990(ETM-3)。

标准曲线图分别见图8-图13。

五：样品的有关物质含量测定

取杂质混合对照品溶液、供试品溶液，按2项色谱条件进样分析(进样体积为10μl)，用外标法计算得到各氨基糖苷有关物质的含量。氨基糖苷有关物质混合对照品的HPLC-ELSD色谱图见Fig.7，硫酸依替米星(样品1)的HPLC-ELSD色谱图见Fig.8，硫酸依替米星(样品2)的HPLC-ELSD色谱图见Fig.9。氨基糖苷有关物质含量测定结果如下。

硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果(样品1)

硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果(样品2)

附图说明：

图1、硫酸依替米星的HPLC-ELSD色谱图

图2、有关物质ETM-10的HPLC-ELSD色谱图

图3、有关物质ETM-7的HPLC-ELSD色谱图

图4、有关物质ETM-12的HPLC-ELSD色谱图

图5、有关物质ETM-6的HPLC-ELSD色谱图

图6、有关物质ETM-5的HPLC-ELSD色谱图

图7、有关物质ETM-3的HPLC-ELSD色谱图

图8、ETM-10的标准曲线图

图9、ETM-7的标准曲线图

图10、ETM-12的标准曲线图

图11、ETM-6标准曲线图

图12、ETM-5的标准曲线图

图13、ETM-3的标准曲线图

图14、氨基糖苷有关物质混合对照品的HPLC-ELSD色谱图

[ETM-10(4.9min)，ETM-7(5.4min)，ETM-12(13.4min)，

ETM-6(19.3min)，ETM-5(20.6min)，ETM-3(27.9min)]

图15、硫酸依替米星(样品1)的HPLC-ELSD色谱图

图16、硫酸依替米星(样品2)的HPLC-ELSD色谱图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

精密称取氨基糖苷有关物质对照品(ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％)各适量， 分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为500μg/ml)。色谱柱：Gemini NX C18(4.6mm×150mm，5μm)。流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

实施例2

精密称取氨基糖苷有关物质对照品(ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％)各适量，分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为300μg/ml)。色谱柱：Gemini NX C18(4.6mm×150mm，5μm)。流动相：A相：水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)，B相：甲醇。采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量。

Claims (1)

1.一种硫酸依替米星杂质含量检测方法，其特征在于，经过以下步骤：精密称取氨基糖苷有关物质对照品适量，分别加水制成每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液；精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量，转移至同一容量瓶中，加水稀释至刻度，制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液，其中各有关物质浓度为10-300μg/ml，色谱柱：Gemini NX C18，型号为4.6mm×150mm，5μm，流动相：A相：水-氨水-冰醋酸＝96∶3.6∶0.4，B相：甲醇，采用梯度洗脱的方法，用HPLC-ELSD进行测定，面积归一化法计算其含量，

其中，所述对照品为：ETM-10，ETM-7，ETM-12，ETM-6，ETM-5，ETM-3；均从原料药硫酸依替米星中分离得到，纯度均＞95％，

流动相梯度：

在上述的方法中采用如下的色谱条件：

流速0.8ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μl；

ELSD参数：

漂移管温度：105℃；

载气流速：2.6L/min；

Gain值：1。