CN105372204B - 一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法，包括以下步骤：(1)采集不同批次硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品；(2)采用液相色谱法或离子色谱法测定洗脱液样品中的硫酸依替米星、C1a组份等；(3)洗脱液样品近红外光谱数据采集；(4)关键指标快速分析模型的建立；(5)未知洗脱液样品中硫酸依替米星、C1a组份和液相总峰面积的快速测定。本发明将近红外光谱技术应用于硫酸依替米星柱分离过程，与传统的液相和气相色谱法相比，所建立的分析方法快速、有效，能用于硫酸依替米星柱分离过程中硫酸依替米星、C1a组份和总物质量的快速测定，适用于硫酸依替米星的生产过程中实时分析和在线监测。
Description
技术领域
本发明属于近红外检测领域，具体涉及一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法。
背景技术
硫酸依替米星，是最新一代氨基糖苷类抗生素，也是建国以来唯一拥有自主知识产权的抗生素类国家一类新药。该产品是治疗革兰氏阴性菌感染和耐药性病原菌感染的重要药物。临床表明：硫酸依替米星对细菌感染疾病疗效好，不良反应发生率低，是近年来开发的氨基糖苷类抗生素中安全有效的优良新品种，在防治感染性疾病上发挥了重要作用
近红外(NIR)光谱技术作为一种快速无损的绿色分析技术，具有快速分析、样品处理简单、无需消耗试剂等特点。近年来，近红外光谱技术已经越来越多的被应用于中药研究，包括药材产地鉴别、有效组分含量测定和制药过程的在线检测和监控。近红外光谱技术的引入为解决复杂中药体系蒸馏过程的质量快速评价及在线检测提供了可能。
在药品质量控制及生产应用领域，将近红外光谱技术应用于原药材、化药分离、成品以及蒸馏、浓缩、醇沉、层析等过程中关键指标的检测已有相关专利文献，如专利(专利申请号：200510130631.6，200810050095.2，201010125515.6，200910228468.5，201010577454.7)等，然而，将近红外光谱技术用于硫酸依替米星柱分离过程中关键指标的测定仍未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法。
本发明采用近红外光谱技术能够快速测定硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品中硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量，实现柱分离过程质量的快速评价。该方法准确，快速，稳定，操作简单，适应工业化生产。
本发明提供一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)洗脱液样品收集
收集硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品；
(2)近红外光谱数据采集
采用透射法采集洗脱液样品的近红外光谱，得到光谱图；
(2)含量测定
通过标准近红外光谱图和步骤(2)所得光谱图，通过公式计算洗脱液样品中硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量；
其中近红外光谱条件为：扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1。
本发明进一步提供一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)液相色谱法对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定；
(2)离子色谱法对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定；
(3)采用透射法采集多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品的近红外光谱，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1；
(4)采用5600～10000cm-1波段区间的近红外数据，选择一阶导数、Savitzky-Golay平滑和数据归一化算法用于预处理近红外光谱数据，采用偏最小二乘回归建立近红外数据与硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量之间的定量校正模型，采用相关系数R、校正集均方差RMSEC和主成分数Factor优化建模参数，考察模型性能，模型对未知样品的预测效果用预测均方差RMSEP、相对偏差RSEP和相关系数R确定。
其中，相关系数R、校正集均方差RMSEC、预测均方差RMSEP和相对偏差RSEP的具体计算公式：
各式中Ci——传统分析方法测量值；
——通过NIR测量及数学模型预测的结果；
Cm——Ci均值；
n——建立模型用的校正集样本数；
m——用于检验模型的验证集样本数。
其中，所述采集多批次硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品；是采集5-20个批次。
本发明的模型建立方法如下：
(1)洗脱液样品收集
采集多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品；
(2)含量测定
对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定，测定采用液相色谱法；
对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定，测定采用离子色谱法；
通过以上方法得到洗脱液样品中的硫酸依替米星含量、C1a含量和它们的总物质含量这3个质控指标数据；
(3)近红外光谱数据采集
采用透射法采集上述多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品的近红外光谱，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1；
(4)定量模型的建立
采用5600～10000cm-1波段区间的近红外数据，选择一阶导数、Savitzky-Golay平滑和数据归一化算法用于预处理近红外光谱数据，采用偏最小二乘回归建立近红外数据与硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量这3个质控指标之间的定量校正模型，
采用相关系数R、校正集均方差RMSEC和主成分数Factor优化建模参数，考察模型性能，模型对未知样品的预测效果用预测均方差RMSEP、相对偏差RSEP和相关系数R来考核；
(5)采集供试品近红外光谱数据
采集硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品，作为供试品，按建模样品相同近红外光谱采集参数采集供试品的近红外光谱数据，选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱分别输入已经建立的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量模型，计算得到供试品中硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量。
其中，步骤(2)液相色谱法，色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(84：16)为流动相；流速为每分钟0.5ml；用蒸发光散射检测器检测，取依替米星对照品和奈替米星对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的混合溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依替米星峰和奈替米星峰之间的分离度应大于1.2，连续5次进样，依替米星峰面积相对标准偏差应不大于2.0％，
测定法取依替米星对照品适量，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含依替米星1.0mg、0.5mg和0.25mg的溶液作为对照品溶液(1)、(2)、(3)，精密量取上述三种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值对相应的峰面积的对数值计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.99；另取本品适量，同法测定，用线性回归方程计算供试品中含量。
其中，步骤(2)离子色谱法，色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用0.2mol/L三氟乙酸-乙腈＝96:4为流动相，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，用积分脉冲安培电化学检测器检测，检测电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl复合电极，钛合金对电极，四波形检测电位(见下表)，柱后加碱流速0.5ml/min，分别取依替米星和奈替米星对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中各含0.025mg的混合溶液，作为溶液(1)，另取依替米星对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.0025mg的溶液，作为溶液(2)，分别取溶液(1)、溶液(2)各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，溶液(1)的色谱图中，依替米星和奈替米星峰之间的分离度应不小于5.5；溶液(2)中，依替米星峰的信噪比(S/N)应不小于10，
测定法：取洗脱液样品过滤，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取依替米星对照品，精密称定，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
其中，相关系数R、校正集均方差RMSEC、预测均方差RMSEP和相对偏差RSEP的具体计算公式：
各式中Ci——传统分析方法测量值；
——通过NIR测量及数学模型预测的结果；
Cm——Ci均值；
n——建立模型用的校正集样本数；
m——用于检验模型的验证集样本数。
其中，所述采集多批次硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品；是采集5-20个批次。
优选的，模型建立方法，包括以下步骤：
(1)洗脱液样品收集
采集多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品；如采集5-20个批次的样品，批次越多越能反映准确度。
(2)含量测定
对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定，测定采用液相色谱法；
测定方法如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH范围0.8～8.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(84：16)为流动相；流速为每分钟0.5ml；用蒸发光散射检测器检测(参考条件；漂移管温度100℃，载气流速为每分钟2.6L)。取依替米星对照品和奈替米星对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的混合溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依替米星峰和奈替米星峰之间的分离度应大于1.2，连续5次进样，依替米星峰面积相对标准偏差应不大于2.0％。
测定法取依替米星对照品适量，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含依替米星1.0mg、0.5mg和0.25mg的溶液作为对照品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述三种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值对相应的峰面积的对数值计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.99；另取本品适量，同法测定，用线性回归方程计算供试品中依替米星含量；同法测定C1a含量和总物质含量(因主要杂质结构类似，按照总峰面积计算)。
对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定，测定采用离子色谱法；
测定方法如下：
色谱条件测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用0.2mol/L三氟乙酸(含0.05％五氟丙酸，1.5g/L无水硫酸钠，每1L中加50％氢氧化钠溶液8ml，用氢氧化钠调节pH值至3.5)-乙腈＝96:4为流动相，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，用积分脉冲安培电化学检测器检测，检测电极为金电极(推荐使用3mm直径)，参比电极为Ag/AgCl复合电极，钛合金对电极，四波形检测电位(见下表)，柱后加碱(50％氢氧化钠溶液1→25)流速0.5ml/min。分别取依替米星和奈替米星对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中各含0.025mg的混合溶液，作为溶液(1)，另取依替米星对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.0025mg的溶液，作为溶液(2)，分别取溶液(1)、溶液(2)各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，溶液(1)的色谱图中，依替米星和奈替米星峰之间的分离度应不小于5.5；溶液(2)中，依替米星峰的信噪比(S/N)应不小于10。
测定法：取洗脱液样品过滤。精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取依替米星对照品，精密称定，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得C1a含量和总物质含量可同法测定。
通过以上方法可以得到硫酸依替米星柱分离过程洗脱液样品中的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量共3个质控指标数据。
(3)近红外光谱数据采集
采用透射法采集上述硫酸依替米星柱分离过程洗脱液样品的近红外光谱，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1；
(4)定量模型的建立
采用5600～10000cm-1波段区间的近红外数据，选择一阶导数、Savitzky-Golay平滑和数据归一化算法用于预处理近红外光谱数据。采用偏最小二乘回归(PLSR)建立近红外数据与硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量这3个质控指标数据之间的定量校正模型。3指标各自独立建模。
采用相关系数R、校正集均方差RMSEC和主成分数Factor优化建模参数，考察模型性能。模型对未知样品的预测效果用预测均方差RMSEP、相对偏差RSEP和相关系数R来考核。当R值接近于1，RMSEC和RMSEP值较小而且互相接近时，评价模型稳定性好、预测精准度高。当RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足工艺过程实时分析的预测精度要求。以下为相关系数R、校正集均方差RMSEC、预测均方差RMSEP和相对偏差RSEP的具体计算公式：
各式中Ci——传统分析方法测量值；
——通过NIR测量及数学模型预测的结果；
Cm——Ci均值；
n——建立模型用的校正集样本数；
m——用于检验模型的验证集样本数；
(5)采集供试品近红外光谱数据
采集硫酸依替米星柱分离过程洗脱液样品的近红外光谱，作为供试品，按建模样品相同近红外光谱采集参数采集供试品的近红外光谱数据，选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱分别输入已经建立硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量模型，计算得到供试品中硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量。
本发明将近红外在线分析技术引入到硫酸依替米星柱分离过程，实现对各质控指标(硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量)的快速测定，有利于提高硫酸依替米星柱分离过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。
附图说明
附图1是硫酸依替米星洗脱液近红外图谱
附图2是硫酸依替米星柱分离洗脱液中硫酸依替米星预测值与实际测得值的相关图
附图3是硫酸依替米星柱分离洗脱液中C1a含量预测值与实际测得值的相关图
附图4是硫酸依替米星柱分离洗脱液中总物质含量预测值与实际测得值的相关图
附图5是硫酸依替米星柱分离洗脱液中硫酸依替米星预测值与实际测得值的趋势对照图
附图6是硫酸依替米星柱分离洗脱液中C1a含量预测值与实际测得值的趋势对照图
附图7是硫酸依替米星柱分离洗脱液中总物质含量预测值与实际测得值的趋势对照图
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
(1)洗脱液样品收集
采集多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品；
依替米星水解液上样于一根分离柱，无盐水冲柱、低浓度乙醇洗脱、无盐水冲柱。洗脱液样品分别测定硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量。重复5批，每批次的实验都以相同方式进行取样，共获得600份样品。
(2)关键指标的测定
液相色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH范围0.8～8.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(84：16)为流动相；流速为每分钟0.5ml；用蒸发光散射检测器检测(参考条件；漂移管温度100℃，载气流速为每分钟2.6L)。取依替米星对照品和奈替米星对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的混合溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依替米星峰和奈替米星峰之间的分离度应大于1.2，连续5次进样，依替米星峰面积相对标准偏差应不大于2.0％。
测定法取依替米星对照品适量，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含依替米星1.0mg、0.5mg和0.25mg的溶液作为对照品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述三种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值对相应的峰面积的对数值计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.99；另取本品适量，同法测定，用线性回归方程计算供试品中含量。
离子色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，用0.2mol/L三氟乙酸(含0.05％五氟丙酸，1.5g/L无水硫酸钠，每1L中加50％氢氧化钠溶液8ml，用氢氧化钠调节pH值至3.5)-乙腈＝96:4为流动相，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，用积分脉冲安培电化学检测器检测，检测电极为金电极(推荐使用3mm直径)，参比电极为Ag/AgCl复合电极，钛合金对电极，四波形检测电位(见下表)，柱后加碱(50％氢氧化钠溶液1→25)流速0.5ml/min。分别取依替米星和奈替米星对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中各含0.025mg的混合溶液，作为溶液(1)，另取依替米星对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.0025mg的溶液，作为溶液(2)，分别取溶液(1)、溶液(2)各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，溶液(1)的色谱图中，依替米星和奈替米星峰之间的分离度应不小于5.5；溶液(2)中，依替米星峰的信噪比(S/N)应不小于10。
测定法：取洗脱液样品过滤。精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取依替米星对照品，精密称定，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
(3)近红外光谱数据采集
采集样本的透射光谱，光谱扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1。液体样品池采用2mm光程的石英比色皿。每个样品采集三张光谱后取平均光谱作为该样品的光谱图。
(4)定量模型的建立
选择一阶导数、Savitzky-Golay平滑和数据归一化算法用于预处理近红外光谱数据。一阶导数能有效消除基线偏移，减少峰与峰之间的重叠并使有效信息显现出来，Savitzky-Golay平滑可以降低高频随机噪声，数据归一化算法可以改善数据质量，获得更好的定量分析结果，其中，归一化算法包括mean centering technique和variancescaling technique，两种算法同时使用能在很大程度上提高模型性能。
由于是低浓度乙醇溶液，水含有OH基，极性很强，在近红外谱区的1940nm(5155cm-1)附近有很强的合频与倍频吸收谱带，形成强烈的“水峰”，即4500～5500cm-1光谱区间。在这个波段内，其它各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱，因此选择5500～10000cm-1光谱区间的近红外数据进行建模。近红外光谱波段对性能的影响见表1。通过模型性能对比发现，采用5600～10000cm-1波段时所有模型性能均达到最佳。因此，本研究选择5600～10000cm-1波段用于依替米星含量、C1a含量和总物质含量定量模型的建立。
表1不同建模波段对模型性能的影响
采用偏最小二乘回归(PLSR)建立近红外数据与依替米星含量、C1a含量和总物质含量这3个质控指标之间的定量校正模型。依替米星含量、C1a含量和总物质含量近红外预测值和实际测定值的相关图见图2～4。从图中可看出，模型的校正相关系数均大于0.96，说明各关键指标模型均具有较好的校正效果。
(5)未知样品中各关键指标的快速测定
采集硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品，按建模样品相同近红外光谱采集参数采集样品的近红外光谱数据，选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱分别输入已经建立的模型，便可快速计算得到各关键指标值，模型预测结果见图5～7。
由图可见，各关键指标模型具有较高的预测准确度，近红外预测趋势与实际测定值的变化趋势基本一致，因此，硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品模型能够满足中药生产过程实时分析的预测精度要求。
本发明提出一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法。结果表明，使用近红外光谱分析技术可以对硫酸依替米星柱分离过程中依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行快速分析。本方法快速、无损，能及时反映硫酸依替米星柱分离过程各指标变化趋势，为硫酸依替米星柱分离过程的质量控制提供新的方法。
Claims (4)
1.一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)洗脱液样品收集
收集硫酸依替米星柱分离过程中的洗脱液样品；
(2)近红外光谱数据采集
采用透射法采集洗脱液样品的近红外光谱，得到光谱图；
(3)含量测定
通过标准近红外光谱图和步骤(2)所得光谱图，通过公式计算洗脱液样品中硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量；
其中近红外光谱条件为：扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1。
2.一种硫酸依替米星柱分离过程的近红外光谱在线检测的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)离子色谱法对多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品各自的硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量进行测定；
(2)采用透射法采集多个批次的硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品的近红外光谱，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，光纤透射式探头光程2mm，以空气为参比，扫描光谱范围为4000～10000cm-1；
(3)采用5600～10000cm-1波段区间的近红外数据，选择一阶导数、Savitzky-Golay平滑和数据归一化算法用于预处理近红外光谱数据，采用偏最小二乘回归建立近红外数据与硫酸依替米星含量、C1a含量和总物质含量之间的定量校正模型，采用相关系数R、校正集均方差RMSEC和主成分数Factor优化建模参数，考察模型性能，模型对未知样品的预测效果用预测均方差RMSEP、相对偏差RSEP和相关系数R确定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，相关系数R、校正集均方差RMSEC、预测均方差RMSEP和相对偏差RSEP的具体计算公式：
各式中Ci——传统分析方法测量值；
——通过NIR测量及数学模型预测的结果；
Cm——Ci均值；
n——建立模型用的校正集样本数；
m——用于检验模型的验证集样本数。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采集多个批次硫酸依替米星柱分离过程中洗脱液样品是采集5-20个批次。
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