CN108195794B - 一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法。其采用的模型的建立方法为：采集不同地龙提取中间体样品的近红外光谱，采用纤维平板法检测不同地龙提取中间体样品的蚓激酶效价；采用PCA对地龙提取中间体样品的近红外光谱进行分析，剔除异常地龙提取中间体样品，通过KS算法对剔除异常样品的不同地龙提取中间体样品的近红外光谱进行分析并划分校正集和验证集；采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法进行预处理；利用SPA、UVE、CARS、GA及CC五种非连续变量选择算法的联用对预处理后的光谱进行建模变量选择；利用选择的建模变量建立地龙提取中间体中蚓激酶效价的偏最小二乘定量分析模型。
Description
技术领域
本发明涉及属于中药生产过程质量控制技术领域，涉及一种基于近红外光谱分析技术的地龙提取中间体中蚓激酶效价快速测定方法。
背景技术
近红外光谱(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是介于可见光(Vis)和中红外(MIR)之间的电磁辐射波，美国材料检测协会(ASTM)将近红外光谱区定义为780～2526nm的区域，是人们在吸收光谱中发现的第一个非可见光区。近红外光谱区与有机分子中含氢基团(O-H、N-H、C-H)振动的合频和各级倍频的吸收区一致，通过扫描样品的近红外光谱，可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息，而且利用近红外光谱技术分析样品具有方便、快速、高效、准确和成本较低，不破坏样品，不消耗化学试剂，不污染环境等优点，因此该技术受到越来越多人的青睐。
地龙别名蚯蚓、曲蟮，为我国传统中药之一，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效；蚓激酶是Mihara等从蚯蚓蛋白粗体物中分离得到6种具有纤溶酶活性的蛋白水解酶，临床研究表明，地龙药材中提取的蚓激酶具有良好的纤溶、抗凝、溶栓和改善血液流变学等药理作用，能够用于治疗血栓性疾病。
目前，现有技术对地龙中蚓激酶的活性的检测方法耗时较长，操作繁琐、费用高、易受环境影响等缺点，因而不易推广。
近红外光谱技术作为一种过程分析技术，在中药生产过程中应用广泛，包括原药材产地鉴别、种属鉴别和真伪鉴别，中药提取纯化工艺的多组分含量监测以及混合、干燥、包衣等过程的分析，近年来，微型近红外光谱仪因其体积小，价格低，便于现场快速分析等特点逐渐应用于中药生产过程中的质量控制。
NIRS属于二级分析方法，在进行定性和定量分析时需要建立校正模型，校正模型的质量决定了近红外分析方法测定结果的准确性。由于近红外光谱吸收较弱，易受外界环境影响，且光谱吸收重叠、峰形较宽，使得分析过程中有效信息难以提取，因此需要依靠化学计量学方法对物质吸收信息进行重新整合，从而建立一个良好的定性或定量分析模型。近红外光谱模型的建立主要包括校正集与验证集的划分，光谱的预处理，建模变量的选择，模型的建立与验证。由于中药产品成分复杂，利用近红外光谱建立中药定性或定量分析模型时需要通过长时间的摸索与探究提取模型建立的有效信息，目前近红外光谱分析技术已广泛应用于中药生产过程质量监测，但现有文献报道缺乏利用NIRS对蚓激酶的效价进行研究，地龙生产相关企业无法对生产过程中蚓激酶效价进行快速质量控制。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价模型的建立方法，采用多种非连续变量选择算法的联用方法优化建模过程的变量选择，所建立的模型能够快速有效地测定地龙提取中间体蚓激酶效价。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价模型的建立方法，
(1)采集不同地龙提取中间体样品的近红外光谱，采用纤维平板法检测不同地龙提取中间体样品的蚓激酶效价；
(2)采用主成分分析法(PCA)对地龙提取中间体样品的近红外光谱进行分析，剔除异常地龙提取中间体样品，通过Kennard-Stone(KS)算法对剔除异常值的地龙提取中间体样品划分校正集与验证集，其中校正集用于定量模型的建立，验证集用于验证模型的预测能力；
(3)采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法对近红外光谱进行预处理；
(4)利用连续投影算法(SPA)、无效信息变量消除法(UVE)、竞争性自适应加权算法(CARS)、遗传算法(GA)及相关系数法(CC)五种非连续变量选择算法的联用对预处理后的光谱进行建模变量选择；
(5)利用步骤(4)选择的建模变量建立地龙提取中间体中蚓激酶效价的偏最小二乘定量分析模型。
本发明通过PCA对地龙提取中间体异常样本进行分析，使建立的模型更加稳定可靠。采用基于计算样品之间欧式距离的KS算法划分校正集与验证集，与随机划分(RS)相比，该方法划分的样品集更加合理。本发明通过对比标准化(AU)、均值中心化(MC)、SG卷积求导、标准正态变换(SNV)、正交信号校正(OSC)、多元散射校正(MSC)、归一化算法(NM)的单独或组合运用对光谱预处理后模型性能参数的影响，发现采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法预处理后所建立的模型预测能力较好。本发明选择了SPA、UVE、CARS、GA、CC联用的方法选择建模变量，提高模型性能。
本发明的目的之二是提供一种上述建立方法建立的模型。采用该模型能够快速、有效的地龙提取中间体中蚓激酶效价。
本发明的目的之三是提供一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法，采用上述模型处理地龙提取中间体样品的近红外光谱。
本发明的有益效果为：
本发明建立了一种更加快速、有效的地龙提取中间体中蚓激酶效价测定方法，缩短质检时间，节省人力物力，扩大地龙提取中间体的质检范围。与传统方法相比，该方法操作简单、无需耗费昂贵的培养基，所用的MicroNIR1700微型近红外光谱仪具有体积小、携带方便等优点。该方法的建立有助于对地龙提取中间体的质量进行快速监控，保证药品的批间一致性，提高药品的安全性与有效性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明采集的地龙提取中间体原始近红外光谱；
图2为纤维平板法测定蚓激酶效价的标准曲线；
图3为地龙提取中间体异常样品判别，其中，A:PCA二维得分图，B:PCA三维得分图；
图4为本发明中五种非连续变量组合算法选择图；
图5为本发明获得的近红外光谱用于蚓激酶效价测定结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在地龙中蚓激酶的活性的检测方法耗时较长、操作繁琐、费用高、易受环境影响等不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法。
本申请一种典型实施方式，提供了一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价模型的建立方法，
(1)采集不同地龙提取中间体样品的近红外光谱，采用纤维平板法检测不同地龙提取中间体样品的蚓激酶效价；
(2)采用主成分分析法(PCA)对地龙提取中间体样品的近红外光谱进行分析，剔除异常地龙提取中间体样品，通过Kennard-Stone(KS)算法对剔除异常值的地龙提取中间体划分校正集与验证集，校正集用于模型的建立，验证集用于验证模型的预测能力。
(3)采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法对近红外光谱行预处理；
(4)利用连续投影算法(SPA)、无效信息变量消除法(UVE)、竞争性自适应加权算法(CARS)、遗传算法(GA)及相关系数法(CC)五种非连续变量选择算法的联用对预处理后的光谱进行建模变量选择；
(5)利用步骤(4)选择的建模变量建立地龙提取中间体中蚓激酶效价的偏最小二乘定量分析模型。
本发明通过PCA对地龙提取中间体样品进行分析，剔除影响模型建立的异常样本。采用基于计算样品之间欧式距离的KS算法划分校正集与验证集，与随机划分(RS)相比，该方法划分的样品集更加合理。本发明通过对比标准化(AU)、均值中心化(MC)、SG卷积求导、标准正态变换(SNV)、正交信号校正(OSC)、多元散射校正(MSC)、归一化算法(NM)的单独或组合运用对光谱预处理后模型性能参数的影响，发现采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法预处理后的建模及模型验证效果好。本发明选择了SPA、UVE、CARS、GA、CC联用选择建模变量以提高模型性能。
优选的，步骤(1)中将地龙提取中间体样品溶解于水中制备成样品溶液，然后采集样品溶液的近红外光谱。进一步优选的，所述样品溶液中地龙提取中间体样品的浓度为1mg/mL。
优选的，步骤(1)中近红外光谱采集具体参数为：波长范围908～1676nm，积分时间为28000μs，积分次数为50，仪器温度50±1℃，空白光路作为100％校正，关闭仪器光源作为调零背景。
优选的，所述纤维平板法的步骤为：
1)纤维平板制备：称取适量琼脂糖，加磷酸盐缓冲液后，加热使溶解，并加入(牛)纤维蛋白原溶液、(牛)纤维蛋白溶酶原溶液、(牛)凝血酶溶液，混匀后迅速倒入水平放置的平皿中，冷却凝固后，置于4℃保存1h，此板即为标准纤维蛋白板。
2)对照品溶液的配制：取蚓激酶标准品，制成浓度分别为每毫升中含4000、5000、8000、10000蚓激酶单位的溶液。
3)点样培养：精密量取蚓激酶标准品溶液和供试品溶液10μL，在提前打好孔的纤维平板上点样，将纤维平板在37℃条件下恒温培养18h。
4)效价的确定：培养结束后，取出纤维平板，用游标卡尺测量溶圈互相垂直的两个直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算准曲线回归方程，将供试品垂直两径乘积的对数带入标准曲线回归方程，计算供试品效价单位数。
优选的，步骤(2)中校正集的样品个数与验证集的样品个数比为3:1。
优选的，步骤(4)中遗传算法重复50次。
优选的，步骤(4)中相关系数法的阈值为0.3。
优选的，步骤(4)中建模变量的选择个数为73。消除了无关信息对光谱的影响，降低了模型的复杂程度。
本申请的另一种实施方式，提供了一种上述建立方法建立的模型。采用该模型能够快速、有效的地龙提取中间体中蚓激酶效价。
本申请的第三种实施方式，提供了一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法，采用上述模型处理地龙提取中间体样品的近红外光谱。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
1利用MicroNIR1700微型近红外光谱仪采集地龙提取中间体样品的近红外光谱。收集地龙提取中间体样品90份，精密称取，加水配制成1mg/mL的溶液作为供试品溶液。取约1.5mL供试品溶液，置于5mm光程比色皿中，以透射方式采集样品的近红外光谱。仪器参数设置如下：波长范围：908-1676nm；积分时间28000μs，积分次数：50，仪器温度：50±1℃。空白光路作为100％校正，关闭仪器光源作为调零背景。每个样品采集3张光谱，以平均光谱作为样品的原始光谱，见图1。
2参考国家药品标准“蚓激酶”效价测定办法，采取纤维平板法测定地龙提取中间体中蚓激酶效价。
(1)溶液配制：配制磷酸盐缓冲液、(牛)纤维蛋白原溶液、(牛)纤维蛋白溶酶原溶液、(牛)凝血酶溶液。
(2)纤维平板制备：称取适量琼脂糖，加磷酸盐缓冲液后，加热使溶解，并加入(牛)纤维蛋白原溶液、(牛)纤维蛋白溶酶原溶液、(牛)凝血酶溶液，混匀后迅速倒入水平放置的平皿中，冷却凝固后，置于4℃保存1h，此板即为标准纤维蛋白板。
(3)对照品溶液的配制：取蚓激酶标准品，制成浓度分别为每毫升中含4000、5000、8000、10000蚓激酶单位的溶液。
(4)点样培养：精密量取蚓激酶标准品溶液和供试品溶液10μL，在提前打好孔的纤维平板上点样，将纤维平板在37℃条件下恒温培养18h。
(5)效价的确定：培养结束后，取出纤维平板，用游标卡尺测量溶圈互相垂直的两个直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算准曲线回归方程，将供试品垂直两径乘积的对数带入标准曲线回归方程，计算供试品效价单位数。标准品与供试品各做两点，以效价平均值计算。分三次测定90份地龙提取中间体样品的效价，每次测定均以效价为4000U、5000U、6500U、8000U、10000U的蚓激酶标准溶液建立标准曲线，如图2所示，90份样品效价测定结果如表1所示。
表1地龙提取中间体样品蚓激酶效价
3根据如图3所示90份地龙提取中间体样品近红外光谱的PCA分析结果，前三个主成分变量解释率分别为55.46％，34.77％，7.88％共98.11％，20号样品远离大样本数据群，作为异常样品剔除。应用KS分类方法，将剔除异常值后的89份样品按照3：1的比例划分为校正集样品和验证集样品，划分结果如表2所示。
表2地龙提取中间体样品分类信息
| 样品集 | NO | Mean/U | Max/U | Min/U | RSD |
| Cal(校正集) | 67 | 3736.8 | 13000.00 | 400.00 | 0.5382 |
| Val(验证集) | 22 | 4181.0 | 10000.00 | 1500.00 | 0.4064 |
4在建立蚓激酶效价PLS定量分析模型前，为了消除背景信息对模型建立的干扰，需要对光谱进行预处理。校正集模型评价参数包括校正均方根误差(RMSEC)、校正集决定系数
(R2c)、验证集模型评价参数包括预测均方根误差(RMSEP)、验证集决定系数(R2p)，其中RMSEC和RMSEP的值越小，表明模型的稳健性和预测能力越好。R2反应模型的拟合度，其值越接近于1，表明近红外预测结果与参考方法所得结果之间的误差越小。
通过对比AU、MC、SG卷积求导、SNV、OSC、MSC、NM算法的单独或组合运用对光谱进行预处理后模型性能参数的影响，筛选出建模最优预处理算法，各类预处理算法运行后的结果如表3所示，其中，一阶导数能够消除基线飘移的影响，标准化可增强光谱间差异，有利于定量模型的建立，由表可知采用SG平滑+一阶导与标准化组(SG(15,2,1)-AU)预处理后，模型性能参数达到最优。SG(15,2,1)中15表示15点平滑，2表示二次多项式，1表示一阶导数。
表3地龙提取中间体蚓激酶效价分析模型预处理方法
| 编号 | 预处理方法 | LVs | R<sup>2</sup>c | R<sup>2</sup>p | RMSEC/U | RMSEP/U |
| 1 | 未处理 | 6 | 0.5921 | 0.7134 | 1274.89 | 951.533 |
| 2 | AU | 6 | 0.6662 | 0.7027 | 1153.27 | 1057.32 |
| 3 | SG(5,2,1) | 7 | 0.7410 | 0.6250 | 1015.78 | 1318.57 |
| 4 | SG(7,2,1) | 7 | 0.7047 | 0.6300 | 1084.69 | 1240.51 |
| 5 | SG(9,2,1) | 7 | 0.7002 | 0.7060 | 1092.97 | 1142.11 |
| 6 | SG(11,2,1) | 7 | 0.6960 | 0.6848 | 1100.62 | 1105.68 |
| 7 | SG(13,2,1) | 7 | 0.6845 | 0.6871 | 1121.2 | 1096.71 |
| 8 | SG(15,2,1) | 8 | 0.6919 | 0.6913 | 1107.95 | 1111.28 |
| 9 | SG(17,2,1) | 7 | 0.6492 | 0.7128 | 1182.27 | 1040.9 |
| 10 | SG(19,2,1) | 7 | 0.6462 | 0.6828 | 1187.26 | 1654.65 |
| 11 | SG(9,3,2) | 5 | 0.5356 | 0.3590 | 1360.34 | 1768.15 |
| 12 | SG(9,2,1)-AU | 6 | 0.6821 | 0.6922 | 1125.41 | 1106.93 |
| 13 | SG(15,2,1)-AU | 7 | 0.7332 | 0.7234 | 1030.97 | 1114.49 |
| 14 | OSC | 7 | 0.7595 | 0.6205 | 978.91 | 1256.14 |
| 15 | SG(17) | 7 | 0.6378 | 0.6949 | 1201.4 | 1265.05 |
| 16 | MSC | 7 | 0.7467 | 0.6871 | 1004.73 | 1153.18 |
| 17 | NM | 8 | 0.7616 | 0.6202 | 974.629 | 1258.87 |
| 18 | MC | 7 | 0.7421 | 0.6494 | 1013.62 | 1173.96 |
5为了提高模型性能，在光谱预处理的基础上，采用基于非连续变量点的变量组合算法选择建模变量，即对5种非连续变量选择算法：SPA、UVE、CARS、GA50、CC_0.3(阈值为0.3)的结果进行再分析，组合运用，提高模型性能。如图4所示，在这5种算法的变量选择结果中，共73个变量被选中，其中26个变量被选中了2次，7个变量被选中了3次，分别以这73、26、7个变量建立地龙提取中间体蚓激酶效价的NIRS分析模型，结果如表4所示，比较建模结果，当以73个变量为建模变量，主成分数为8时，模型R2c＝0.9398，RMSEC＝489.618，模型性能达到最优。
表4变量组合算法运行结果
本方法所建立的基于近红外光谱分析技术快速测定地龙提取中间体中蚓激酶效价定量分析模型见图5，从表5可知所，所建立的模型中得到蚓激酶效价预测范围为1500～10000U时，R2p＝0.9340，RMSEP＝538.313，模型预测能力较好，能够满足生产需要，证明该方法可以用来快速测定地龙提取中间体中蚓激酶的效价，缩短分析时间，扩大检验范围，为保障地龙中间体与产品质量一致性提供依据。
表5地龙提取中间体中蚓激酶效价NIRS快速分析模型性能参数
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价模型的建立方法，其特征是，
(1)采集不同地龙提取中间体样品的近红外光谱，采用纤维平板法检测不同地龙提取中间体样品的蚓激酶效价；
(2)采用主成分分析法对地龙提取中间体样品的近红外光谱进行分析，剔除异常地龙提取中间体样品，通过Kennard-Stone算法对剔除异常点的地龙提取中间体样品划分校正集与验证集，校正集用于模型的建立，验证集用于评价模型的预测能力；
(3)采用一阶导数SG15点平滑与标准化组合方法对近红外光谱进行预处理；
(4)利用连续投影算法、无效信息变量消除法、竞争性自适应加权算法、遗传算法及相关系数法五种非连续变量选择算法的联用对预处理后的光谱进行建模变量选择；
(5)利用步骤(4)选择的建模变量建立地龙提取中间体中蚓激酶效价的偏最小二乘定量分析模型；
其中，所述纤维平板法的步骤为：
1)纤维平板制备：称取适量琼脂糖，加磷酸盐缓冲液后，加热使溶解，并加入牛纤维蛋白原溶液、牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，混匀后迅速倒入水平放置的平皿中，冷却凝固后，置于4℃保存1h，此板即为标准纤维蛋白板；
2)对照品溶液的配制：取蚓激酶标准品，制成浓度分别为每毫升中含4000、5000、8000、10000蚓激酶单位的溶液；
3)点样培养：精密量取蚓激酶标准品溶液和供试品溶液10μL，在提前打好孔的纤维平板上点样，将纤维平板在37℃条件下恒温培养18h；
4)效价的确定：培养结束后，取出纤维平板，用游标卡尺测量溶圈互相垂直的两个直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算准曲线回归方程，将供试品垂直两径乘积的对数带入标准曲线回归方程，计算供试品效价单位数。
2.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(1)中将地龙提取中间体样品溶解于水中制备成样品溶液，然后采集样品溶液的近红外光谱。
3.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(1)中近红外光谱采集具体参数为：波长范围908～1676nm，积分时间为28000μs，积分次数为50，仪器温度50±1℃，空白光路作为100％校正，关闭仪器光源作为调零背景。
4.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(2)中校正集的样品个数与验证集的样品个数比为3:1。
5.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(4)中遗传算法重复50次。
6.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(4)中相关系数法的阈值为0.3。
7.如权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(4)中建模变量的选择个数为73。
8.一种权利要求1～7任一所述的建立方法建立的模型。
9.一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法，其特征是，采用权利要求8所述的模型处理地龙提取中间体样品的近红外光谱。
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