CN104792686A - 近红外光谱法检测半固体制剂中微生物数量和药物含量 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用傅里叶变换近红外光谱法检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的方法，属于药物制剂分析技术领域。包括以下步骤：1.收集或制备半固体制剂样品，并记录样品中微生物数量和药物含量参考值的信息；2.测量样品的傅里叶变换近红外透反射光谱；3.根据待测项目，将样品合理地分为校正集和预测集；4.选择最优的光谱前处理方法；5.筛选最优的建模光谱范围；6.异常值的诊断和剔除；7.用化学计量学技术将校正集样品光谱与其相应检测项目的参考值相关联，分别建立预测微生物数量和药物含量的校正模型；8.评价所建校正模型的性能；9.应用所建校正模型预测未知样品中的微生物数量和药物含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的方法，具体地说是一种采用傅里叶变换近红外光谱法结合化学计量学技术快速无损检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的方法，属于药物制剂分析技术领域。
背景技术
药物半固体制剂中的微生物限度和药物含量是各国药典规定必须检测的两个项目。目前，用于该种制剂微生物限度检测的传统方法为平皿法和滤膜过滤法；药物含量测定的传统方法有色谱法(主要为高效液相色谱法)、光谱法(主要为紫外可见分光光度法)、容量法和重量法。但上述方法在检测过程中要破坏样品，只能进行抽样检验。但是，抽样检验的代表性有限，样品检验合格，并不一定代表该批药品合格，可能得出错误结论，导致药品质量失控，甚至发生质量事故。此外，这些常规分析方法的检测周期长，特别是培养基培养计数法需要经过接种、孵育等多个环节，操作繁琐耗时。因此，建立一种快速无损检测药物半固体制剂中多项质量指标的分析方法，以替代传统的破坏性方法，将抽样检验改变成在线控制，能够更好地保证药物制剂的质量，降低药品质量事故发生的可能性，同时可降低生产及检验成本。
现代近红外光谱分析法(NIRS)是光谱测量技术、计算机技术、化学计量学技术与基础测试技术的有机结合。近红外光谱源自被测物质分子含氢基团振动的倍频与合频吸收，信息丰富，几乎包含了被测物质含氢基团的全部信息(包括物理信息、化学信息和生物信息)；此外，近红外光具有较强的穿透力，可进入样品内部直接测量各种聚集状态的样品，不需要进行复杂的样品制备。近红外光谱分析法的分析速度快，单个样品的测量在几秒钟内即可完成。综上所述，近红外光谱法在药物制剂质量控制上具有明显的优势，可用于各种药物半固体制剂的在线分析。本发明采用傅里叶变换近红外透反射光谱法实现药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、高通量、无损、无污染的药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的检测方法。
本发明是通过下述技术方案实现的：
傅里叶变换近红外光谱法快速检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的方法，其特征在于利用近红外分析技术测定样品的近红外光谱，应用化学计量学技术对所测光谱进行处理，并依据处理后得到的光谱数据和样品中待测项目的参考值用化学计量学技术分别建立半固体制剂中微生物数量和药物含量的校正模型，应用所建校正模型实现对未知半固体制剂样品中微生物数量和药物含量的快速预测，具体包括以下步骤：
(1)收集或制备半固体制剂样品，并记录样品中微生物数量及药物含量参考值的信息；
(2)筛选最优的光谱测量参数值，使用傅里叶变换近红外光谱仪测量样品的傅里叶变换近红外透反射光谱；
(3)根据待测项目，将样品合理地分为校正集和预测集；
(4)选择最优的光谱前处理方法；
(5)筛选最优的建模光谱范围；
(6)异常值的诊断和剔除；
(7)用化学计量学技术将校正集样品光谱与其相应检测项目的参考值相关联，分别建立预测微生物数量和药物含量的校正模型；
(8)评价所建校正模型的性能；
(9)应用所建校正模型预测未知样品中的微生物数量和药物含量。
所述药物半固体制剂是指药物(原料药)与基质(辅料)通过混合制成的形态介于固体和液体之间的外用药物制剂，包括软膏剂、乳膏剂、糊剂和凝胶剂等剂型。
所述微生物数量是指单位质量药物制剂中存在或可能存在的、《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下规定检查的微生物种类中一种或多种微生物的数量；药物含量是指药物制剂所含疗效成分的标示量百分数或单位质量药物制剂所含疗效成分的质量。
所述步骤(1)中的半固体制剂样品应具有代表性，且校正集样品的微生物数量和药物含量均应呈现一定的梯度。样品中微生物数量参考值的测定方法可为标准加入法、平皿法或滤膜过滤法；药物含量参考值的测定方法可为标准加入法或该药品质量标准规定的方法。
所述步骤(2)中傅里叶变换近红外透反射光谱测量所用仪器为傅里叶变换近红外光谱仪，配有粘性液体测量附件(包含3个不同规格的样品夹)和积分球附件；光谱测量参数中的分辨率可为2cm-1、4cm-1、8cm-1或16cm-1，扫描次数可为32、64或128，样品夹规格可为0.5mm、1.0mm或2.0mm。
所述样品近红外透反射光谱的测定方法为：将样品从最小包装中取出适量，置于无菌透明塑料自封袋中，用样品夹将装有样品的无菌透明塑料自封袋固定于积分球的检测窗上，并使其覆盖光斑，操作中避免袋子外部的污染及皱褶；然后以选定的光谱测量参数值测定样品的傅里叶变换近红外透反射光谱。
所述步骤(4)中近红外光谱前处理方法可为未处理、多元散射校正(MSC)、标准正则变换(SNV)、一阶导数(FD)、二阶导数(SD)、Savitzky-Golay平滑(SGS)、Norris平滑(NDS)、均值中心化(MC)、方差定标(VS)中的一种或多种。
所述步骤(5)中建模光谱范围可由建模软件自动筛选或根据被分析物的近红外特征吸收对自动筛选的范围进行人为优化。
所述步骤(7)中微生物数量的校正模型包括用于识别样品是否染菌的定性模型和用于测定测定染菌样品中微生物数量的定量模型。定性模型的用途类比于《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下的“无菌检查”项，所用的建模方法可为但不限于判别分析法(DA)和人工神经网络法(ANN)；定量模型的用途类比于《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下的“微生物限度检查”项，所用的建模方法可为但不限于人工神经网络法(ANN)和偏最小二乘法(PLS)。
所述步骤(7)中药物含量的校正模型为用于测定样品中药物含量的定量模型，其用途类比于《中国药典》(2010年版)二部各论中的“含量测定”项，所用的建模方法可为但不限于偏最小二乘法(PLS)和人工神经网络法(ANN)。
所述步骤(8)中评价所建定性校正模型性能的参数可为但不限于性能指数(PI)、校正集正判率和预测集正判率；定量校正模型性能的参数可为但不限于校正集决定系数(R2)、预测集决定系数(r2)、校正集均方根误差(RMSEC)、预测集均方根误差(RMSEP)、交叉验证集均方根误差(RMSECV)和系统误差值(Bias)。
所述步骤(9)中用所建校正模型对未知样品中微生物数量和药物含量进行预测时，未知样品所用的光谱测量参数、光谱测量方法、光谱处理方法和建模光谱范围均应与建模样品一致。
本发明所涉及的近红外光谱前处理、建模光谱范围筛选、异常光谱诊断及建模所用软件可为但不限于TQ Analyst软件和MATLAB软件，其他硬件设备、软件和数学处理方法均属现有的常规技术，不再赘述。
本发明采用傅里叶变换近红外光谱法快速检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量。该方法准确快速、无损样品、无污染，与传统检测方法相比有明显的优势，不仅适用于药物半固体制剂的实验室快速检测，也适用于药物半固体制剂生产过程中的在线分析。
附图说明
图163个在无菌透明塑料自封袋中的他扎罗汀凝胶样品原始傅里叶变换近红外透反射光谱图。
图2识别他扎罗汀凝胶样品是否染菌的最优DA模型结果图。
图3测定他扎罗汀凝胶样品中大肠埃希菌数量的最优PLS模型预测值与参考值的线性相关图。
图4测定他扎罗汀凝胶样品中他扎罗汀含量的最优PLS模型预测值与参考值的线性相关图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，实施例为本发明的举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例
1.样品及其参考值信息
63个铝制包装的他扎罗汀凝胶样品委托授权的厂家采用标准加入法制备得到的，样品中他扎罗汀含量范围为0.41-0.48mg／g，相当于市售样品标示量(0.50mg／g)的82％-136％。在标准化实验室中，取40个样品，于无菌操作台上从铝制包装中挤出他扎罗汀凝胶约5g置于无菌透明塑料自封袋中，采用标准加入法加入大肠埃希菌悬液，迅速封口以防止测试过程中发生微生物污染，制得40个染菌样品，大肠埃希菌数量范围为2-271cfu／g；其余23个样品同法加入等量无菌培养液，得到无菌样品。
2.样品近红外透反射光谱的测量
仪器：美国Thermo公司的Antaris II傅里叶变换近红外光谱仪，配有粘性液体进样器(3个规格的样品夹)和积分球附件，信号采集软件为RESULT3.0。
光谱测量条件：分辨率8cm-1，扫描次数64次，样品夹规格1.0mm，扫描范围10000-4000cm-1。每次扫描样品前均采用相同参数扫描并扣除背景。
光谱采集方法：用样品夹附件将装有适量建模样品的无菌透明塑料自封袋固定在积分球的检测窗上，使其覆盖光斑，操作中避免袋子外部污染及皱褶；然后以选定的光谱测量参数测定样品的傅里叶变换近红外透反射光谱共测量得到63张光谱。
测得的在无菌透明塑料自封袋中他扎罗汀凝胶样品的原始傅里叶变换近红外透反射光谱如图1所示。
3.判别分析法(DA)识别染菌样品
将63个样品分为校正集和预测集。校正集样品47个，其中染菌样品30个，无菌样品17个；预测集样品16个，其中染菌样品10个，无菌样品6个。
使用TQ Analyst8.0软件，建立DA校正模型用于识别他扎罗汀凝胶是否染菌。建模所用光谱范围由TQ Analyst8.0软件自动筛选为9881-4119cm-1，所建模型性能由以下参数来评定：PI、校正集正判率和预测集正判率。
经过筛选得到的最优DA校正模型(模型9)的光谱前处理方法为MSC和SGS，经PCA降维后选取的主成分数(PCs)为4，光谱累积贡献率为99.8％；模型的性能指数为93.0％，校正集和预测集的正判率均为100％。光谱前处理方法的筛选见表1。最优DA校正模型的判别结果如图2所示，表明所建模型能够准确有效地识别染菌样品。
表1不同光谱前处理方法时DA校正模型的各项性能指标
4.偏最小二乘法(PLS)测定染菌样品中大肠埃希菌数量
将40个染菌样品分为校正集和预测集。校正集样品30个，大肠埃希菌数量范围为2-271cfu／g；预测集样品10个，大肠埃希菌数量范围为3-255cfu／g。
使用TQ Analyst8.0软件，选择偏最小二乘法(PLS)建立测定他扎罗汀凝胶中大肠埃希菌数量的校正模型。在软件自动筛选的范围基础上，根据被测物的特征吸收对光谱范围进行优化，最终所用建模光谱范围为8780-5400cm-1和4400-4200cm-1。光谱前处理方法的筛选见表2。经过筛选，采用MC与VS处理后得到的PLS校正模型(模型16)最优，且经Chauvenet检验无异常光谱存在。表2中模型所用主因子数为RMSEP最小时对应的主因子数，均采用留一法交叉验证。
表2不同光谱前处理方法时大肠埃希菌数量PLS校正模型的各项性能指标
由表2得所建最优大肠埃希菌数量PLS校正模型的R2和r2均大于0.95，且RMSEP小，表明近红外光谱能够反映样品中大肠埃希菌的信息，所建模型有很好的预测性能。大肠埃希菌数量PLS模型校正集预测值与参考值的线性相关图如图3所示，校正集样品的线性回归方程为y＝0.9830x+1.0248，预测集样品的线性回归方程为y＝1.0811x+6.5414。
5.偏最小二乘法(PLS)测定样品中他扎罗汀含量
从63个样品选取有代表性的染菌和无菌样品共43个分为校正集和预测集。校正集样品33个，他扎罗汀含量范围为0.41-0.68mg／g；预测集样品10个，他扎罗汀含量范围也为0.41-0.68mg／g。
使用TQ Analyst8.0软件，选择PLS建立测定他扎罗汀凝胶中他扎罗汀含量的校正模型。在软件自动筛选的范围基础上，根据被测物的特征吸收对光谱范围进行优化，最终所用建模光谱范围为8700-5200cm-1。光谱前处理方法的筛选见表3。经过筛选，采用MC与VS处理后得到的PLS校正模型(模型16)最优，且经Chauvenet检验无异常光谱存在。表3中模型所用主因子数为RMSEP最小时对应的主因子数，均采用留一法交叉验证。
表3不同光谱前处理方法时有效成分含量PLS校正模型的各项性能指标
由表3得所建他扎罗汀含量预测模型的R2和r2均大于0.95，且RMSEP小，表明近红外光谱能够反映样品中主药他扎罗汀的信息，所建模型有很好的预测性能。最优PLS模型校正集预测值与参考值的线性相关图如图4所示，校正集样品的线性回归方程为y＝0.9763x+0.0133，预测集样品的线性回归方程为y＝0.9700x+0.0101。
6.结论
傅里叶变换近红外光谱法结合化学计量学技术所建的模型能够准确地预测未知凝胶样品中的微生物数量和药物含量，且该方法快速无损，可用于他扎罗汀凝胶的实验室检测和生产过程在线分析。
Claims (10)
1.傅里叶变换近红外光谱法快速检测药物半固体制剂中微生物数量和药物含量的方法，其特征在于利用近红外分析技术测定样品的近红外光谱，应用化学计量学技术对所测光谱进行处理，并依据处理后得到的光谱数据和样品中待测项目的参考值用化学计量学技术分别建立半固体制剂中微生物数量和药物含量的校正模型，应用所建校正模型实现对未知半固体制剂样品中微生物数量和药物含量的快速预测，具体包括以下步骤：
(1)收集或制备半固体制剂样品，并记录样品中微生物数量及药物含量参考值的信息；
(2)筛选最优的光谱测量参数值，使用傅里叶变换近红外光谱仪测量样品的傅里叶变换近红外透反射光谱；
(3)根据待测项目，将样品合理地分为校正集和预测集；
(4)选择最优的光谱前处理方法；
(5)筛选最优的建模光谱范围；
(6)异常值的诊断和剔除；
(7)用化学计量学技术将校正集样品光谱与其相应检测项目的参考值相关联，分别建立预测微生物数量和药物含量的校正模型；
(8)评价所建校正模型的性能；
(9)应用所建校正模型预测未知样品中的微生物数量和药物含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：药物半固体制剂是指药物(原料药)与基质(辅料)通过混合制成的形态介于固体和液体之间的外用药物制剂，包括软膏剂、乳膏剂、糊剂和凝胶剂等剂型。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：微生物数量是指单位质量药物制剂中存在或可能存在的、《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下规定检查的微生物种类中一种或多种微生物的数量；药物含量是指药物制剂所含疗效成分的标示量百分数或单位质量药物制剂所含疗效成分的质量。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的半固体制剂样品应具有代表性，且校正集样品的微生物数量和药物含量均应呈现一定的梯度；样品中微生物数量参考值的测定方法可为标准加入法、平皿法或滤膜过滤法；药物含量参考值的测定方法可为标准加入法或该药品质量标准规定的方法。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中傅里叶变换近红外透反射光谱测量所用仪器为傅里叶变换近红外光谱仪，配有粘性液体测量附件(包含3个不同规格的样品夹)和积分球附件；光谱测量参数中的分辨率可为2cm-1、4cm-1、8cm-1或16cm-1，扫描次数可为32、64或128，样品夹规格可为0.5mm、1.0mm或2.0mm。样品近红外透反射光谱的测定方法为：将样品从最小包装中取出适量，置于无菌透明塑料自封袋中，用样品夹将装有样品的无菌透明塑料自封袋固定于积分球的检测窗上，并使其覆盖光斑，操作中避免袋子外部的污染及皱褶；然后以选定的光谱测量参数值测定样品的傅里叶变换近红外透反射光谱。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中近红外光谱前处理方法可为未处理、多元散射校正(MSC)、标准正则变换(SNV)、一阶导数(FD)、二阶导数(SD)、Savitzky-Golay平滑、Norris平滑、均值中心化(MC)、方差定标(VS)中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中建模光谱范围可由建模软件自动筛选或根据被分析物的近红外特征吸收对自动筛选的范围进行人为优化。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中微生物数量的校正模型包括用于识别样品是否染菌的定性模型和用于测定染菌样品中微生物数量的定量模型；定性模型的用途类比于《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下的“无菌检查”项，所用的建模方法可为但不限于判别分析法(DA)和人工神经网络法(ANN)；定量模型的用途类比于《中国药典》(2010年版)二部制剂通则项下的“微生物限度检查”项，所用的建模方法可为但不限于人工神经网络法(ANN)和偏最小二乘法(PLS)。所述步骤(7)中药物含量的校正模型为用于测定样品中药物含量的定量模型，其用途类比于《中国药典》(2010年版)二部各论中的“含量测定”项，所用的建模方法可为但不限于偏最小二乘法(PLS)和人工神经网络法(ANN)。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(8)中评价所建定性校正模型性能的参数可为但不限于性能指数(PI)、校正集正判率和预测集正判率；定量校正模型性能的参数可为但不限于校正集决定系数(R2)、预测集决定系数(r2)、校正集均方根误差(RMSEC)、预测集均方根误差(RMSEP)、交叉验证集均方根误差(RMSECV)和系统误差值(Bias)。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(9)中用所建校正模型对未知样品中微生物数量和药物含量进行预测时，未知样品所用的光谱测量参数、光谱测量方法、光谱处理方法和建模光谱范围均应与校正样品一致。建模过程所用软件可为但不限于TQ Analyst软件和MATLAB软件。
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