CN102775368B - 一类噻唑类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类通式I所示的噻唑类化合物及其制备方法和用途，更具体而言，本发明涉及新颖的天然产物largazole的衍生物，其制备方法以及作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在抗肿瘤和治疗多发性硬化症方面的应用。

Description

一类噻唑类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一类噻唑类化合物及其制备方法和用途，更具体而言，本发明涉及新颖的天然产物largazole的衍生物，其制备方法以及作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂在抗肿瘤和治疗多发性硬化症方面的应用。
背景技术
肿瘤在全球范围内是仅次于心血管疾病的第二大“杀手”，近年来发病率一直呈上升趋势，对于癌症的治疗一直以来都是困扰着人类的一个难题。传统上的化疗药物因为缺乏靶标的选择性，往往产生较为严重的毒副作用，这就要求人们开发出高效低毒的特异性分子靶标的抗肿瘤药物。以一些与肿瘤细胞分化增殖以及转移相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已经成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)正是这样一种蛋白。
多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)是一类典型的自身免疫性疾病。MS疾病的病理表现为中枢神经系统的急性炎症并导致脱髓鞘现象，是导致年轻人无创性神经系统瘫痪以及残疾的最重要的诱因之一。MS临床表现多为非均质型，超过80％的病人表现为反复的缓解复发表型。由于疾病的发生机制不明，以及目前尚缺乏灵敏的诊断标志，对于MS的诊断仍然只能依据疾病在时间和空间上的多发性。加之许多其它疾病例如视神经脊髓炎和MS有着极为相似的病症，因此，目前对于MS的治疗甚至是诊断仍然十分的困难。
目前的研究结果表明CD4+T细胞对于MS的发病，至少是早期疾病的启动有着重要作用。早先的研究认为TH1细胞(以产生IFN--γ为特征)对于疾病的发生有着重要的作用，随着TH17的发现，越来越多的证据表明后者在MS的发病中有着不次于TH1的作用，例如，TH17细胞数量少的小鼠不易得EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)，MS病人的脑组织病灶中鉴定出了TH17细胞等。
染色质的组蛋白乙酰化和去乙酰化是调节基因表达的关键环节之一，而异常的基因表达是肿瘤及一些遗传和代谢疾病发生的分子生物学基础。组蛋白的乙酰化程度，由组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)协调控制。当HDAC过度表达并被转录因子募集，就会导致特定基因的不正常抑制，从而导致肿瘤和其他疾病的发生。
HDACs有十八种亚型，可以分成四大类，分别为I型(HDAC1，2，3，8)，II型(HDAC4，5，6，7，9)，III型(SIR1～7)和IV型(HDAC11)。(Johnstone，R.W.2002Nature Rev.DrugDisc.1：287)。据报道，HDAC的活性与癌症的发生有关(Archer，S.Y等.1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA，95：6791-6796)。当HDAC过度表达时，会抑制生物体内天然的肿瘤抑制因子例如p53的基因表达(Gu，W.等.1997 Cell，90：595-606)。而HDAC抑制剂(HDACi)会使染色质组蛋白乙酰化水平提高，因此导致特定基因激活表达，相应地导致细胞的末端分化或癌细胞的凋亡。临床研究表明，可以通过抑制HDAC的活性来获得组蛋白高乙酰化水平。
目前已经发现的HDACi按结构可分为以下几类：短链脂肪酸类；异羟肟酸类；亲电环氧酮基类；邻苯二胺类以及大环肽类(Miller，T.A.等.2003 J.Med.Chem.46：5097；Rosato，R.R.等.2004Expert.Opin.Invest.Drugs 13：21；Monneret，C.，2005Eur.J.Med.40：1；Yoo，C.B.等.2006Nat.Rev.Drug Discovery 5：37)。HDACi构效关系研究表明大多数HDACi可分为表面识别结构域、锌离子螯合区(ZBG)以及连接两部分的疏水脂肪链(Marks，P.2007Oncogene 26：1351)。
组蛋白乙酰化酶(HDAC)是重要的表观遗传调控蛋白，调控染色质重塑、基因表达以及包括转录因子、组蛋白、细胞骨架蛋白等多种蛋白质的功能。HDACi是一类能阻断HDAC活性的小分子化合物，它们可以导致细胞周期阻滞、细胞分化及细胞凋亡，目前已被应用于肿瘤治疗。近期的实验结果表明，HDACi可能也具有抗炎及免疫调节作用。Camelo等人发现，HDACi TSA可以在MS的小鼠动物模型(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)上有效抑制T细胞对小鼠中枢神经系统的侵袭，从而减轻其临床症状。Chung等人发现，HDACi苯基丁酸和TSA可以在动物关节炎模型中抑制TNF-alpha的表达，减轻单核细胞的浸润，从而减轻疾病症状。Bosisio等人的研究证明HDACi可以抑制抗原递呈的树突状细胞分泌有利于TH1和TH17诱导的细胞因子，包括IL-12，IL-23等。Tao等人的研究表明HDACi可以加强抑制性Treg细胞的分化，并增强其对TH1和TH17细胞的抑制功能。上述研究表明HDAC的抑制与自身免疫疾病的发生发展密切相关。寻找毒性更低，选择性更好的HDACi将有助于自身免疫性疾病的治疗，包括MS疾病的治疗。
Largazole是从佛罗里达的海洋藻青菌Symploa sp.中分离得到的高度官能团化的十六元环肽内酯(Taori，K.，等.2008J.Am.Chem.Soc.130：1806-1807；Ying，Y等.2008J.Am.Chem.Soc.130：8455-8459)，其结构如下所示。该天然产物骨架结构新颖，其结构包括：4-甲基取代的二氢噻唑环与噻唑环的偶联部分，L-缬氨酸和(3S，4E)-3-羟基-7-巯基-4-庚烯酸。药理实验表明，largazole能够选择性抑制乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以及纤维母细胞骨肉瘤细胞(U2OS)的生长，而对于正常乳腺上皮细胞(NmuMG)以及正常成纤维细胞(NIH3T3)影响较小。随后的研究表明largazole能够选择性抑制I型HDAC。在此基础上，发明人对其结构作了优化和改造以及评价，从而得到一系列具有进一步开发潜力的化合物。
发明内容
本发明的目的在于设计与合成一类新型的噻唑类化合物，其可以作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从而为抗肿瘤和治疗多发性硬化症药物发现开辟新途径。
本发明的另一目的也在于提供上述噻唑类化合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述噻唑类化合物的用途。
本发明所述的噻唑类化合物具有以下通式I的结构：
其中：
R1为R1a、R1b或R1c；
R4a和R5a各自独立地选自A或Boc保护的氨基C1-C6烷基；
R4b和R5b各自独立地选自A中；或者R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环或含有1-3个选自N、O和S中的杂原子的3-10元杂环；
R4c、R5c和R5各自独立地选自A中；
所述A为如下基团中的一种：H、卤素、羟基、硝基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基取代的C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷氨基、C6-C10芳基取代的C1-C6烷氨基、C1-C6烷基、羟基取代的C1-C6烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C6烷基、氟代C1-C6烷基、C6-C10芳基取代的C1-C6烷基、C2-C6链烯基、羟基取代的C2-C6链烯基、C1-C4烷氧基取代的C2-C6链烯基、氟代C2-C6链烯基、C6-C10芳基取代的C2-C6链烯基、C2-C6链炔基、羟基取代的C2-C6链炔基、C1-C4烷氧基取代的C2-C6链炔基、氟代C2-C6链炔基、C6-C10芳基取代的C2-C6链炔基、C6-C10芳基、5-7元杂芳基；所述5-7元杂芳基含有1-3个选自N、O和S中的杂原子；
R2为如下基团中的一种：H，卤原子，羟基，C1-C6烷氧基，C6-C10芳基取代的C1-C8烷氧基，氨基，C1-C6烷氨基，C6-C10芳基取代的C1-C6烷氨基，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C1-C6烷基取代的C3-C6环烷基，任选被羟基、C1-C4烷氧基、卤原子、苄氧基或C6-C10芳基取代的C1-C6烷基，C2-C8链烯基，任选被羟基、C1-C4烷氧基、卤原子或C6-C10芳基取代的C2-C6链烯基，C2-C6链炔基，任选被羟基、C1-C4烷氧基、卤原子或C6-C10芳基取代的C2-C8链炔基，C6-C10芳基，任选被卤原子或硝基取代的C6-C10芳基，5-7元杂芳基；所述5-7元杂芳基含有1-3个选自N、O和S中的杂原子。优选地，R2为如下基团中的一种：H，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，任选被羟基、苄氧基或C6-C10芳基取代的C1-C6烷基，C2-C8链烯基，C6-C10芳基，任选被卤原子或硝基取代的C6-C10芳基；
n为0、1或2；优选为0；
X为-N(R7)-或其中R7选自H或C1-C6烷基；X优选为-NH-；
Y不存在或者为-(C1-C10烷基)-、-(C2-C9链烯基)-、-(C6-C10芳基)-、-(C1-C6烷基)-(C6-C10芳基)-、-(C6-C10芳基)-(C2-C6链烯基)-、-(C3-C6环烷基)-、-(C1-C5烷基)-C(O)-NH-(C1-C5烷基)-、-(C1-C5烷基)-C(O)-O-(C1-C5烷基)-或-(C1-C5烷基)-C(O)-O-(C2-C9链烯基)-；优选-(C1-C10烷基)-、-(C6-C10芳基)-、-(C1-C6烷基)-(C6-C10芳基)-或-(C6-C10芳基)-(C2-C6链烯基)-；
R3为R3a、R3b、R3c、R3d或R3e；
其中，R8为H或C1-C6烷基羰基；优选为H；
R9为H或C1-C10烷基羰基。
在本发明的进一步实施方式中，通式I中：
R1为R1a；
n＝0；
R2、X、Y和R3的定义如前所述，具体如下所示的结构IIa：
其中：
R4a和R5a的定义同上；优选R4a和R5a各自独立地为H、C1-C6烷基或Boc保护的氨基C1-C6烷基。
在本发明的进一步实施方式中，通式I中：
R1为R1b；
n＝0；
R2、X、Y和R3的定义如前所述，具体如下所示的结构IIb：
其中：
R4b和R5b的定义同上；优选R4b和R5b各自独立地为H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C6-C10芳基，或R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环。
在本发明的进一步实施方式中，通式I中：
R1为R1c；
n＝0；
R2、X、Y和R3的定义如前所述，具体如下所示的结构IIc：
其中：
R4c、R5c和R6的定义同上；优选R4c和R5c和R6各自独立地为H或C1-C6烷基。
在本发明的更优选实施方案中，所述的X为-NH-，且n＝0，R2、R3、R4b、R5b和Y的定义如前所述，具有如下所示的结构III：
在本发明的特别优选实施方案中，所述的X为-NH-，且n＝0，同时R3具体为R3a，具有如下所示的结构IV：
其中，R2、R4b、R5b和Y的定义如前所述。
R2优选为H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、羟基取代的C1-C6烷基、C1-C6烷基取代的C3-C6环烷基、C2-C8链烯基、羟基取代的C2-C8链烯基、C6-C10芳基、C6-C10芳基或苄氧基取代的C1-C6烷基、C6-C10芳基取代的C2-C8链烯基、C6-C10芳基取代的C2-C8烷氧基、卤素取代的C6-C10芳基或者硝基取代的C6-C10芳基；
R4b和R5b各自独立地优选为H、F、C1-C6烷基、羟基取代的C1-C6烷基、氟代C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C6链烯基、羟基取代的C2-C6链烯基、氟代C2-C6链烯基或C6-C10芳基，或是R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环或含有1-3个选自N、O和S中的杂原子的3-10元杂环；R4b和R5b各自独立地更优选为H、F，C1-C6烷基、C3-C6环烷基、羟基取代的C1-C6烷基、氟代C1-C6烷基或C6-C10芳基；R4b和R5b各自独立地最优选为H或C1-C6烷基(包括C1-C6直链或支链烷基)、C3-C6环烷基或C6-C10芳基，或R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环。
Y优选为-(C1-C8烷基)-、-(C6-C10芳基)-、-(C1-C6烷基)-(C6-C10芳基)-或-(C6-C10芳基)-(C2-C6链烯基)-。
本发明通式I结构的噻唑类化合物具体为：
本发明提供了具有通式I结构的噻唑类化合物的制备方法。该制备方法可以通过下述路线一～路线五中的任何一种来实现。
路线一：
其中，R1、R2、n、X和Y的定义同上；
具体来说，化合物1与活化锌粉在THF中形成化合物2，化合物2与2-溴代噻唑化合物3在醋酸钯与三苯基膦催化下于甲苯中经Negishi偶联反应得到化合物4，化合物4在氢氧化钠/甲醇-水体系中水解后得相应的酸5，化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-COOMe在缩合剂1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、二异丙基乙胺(i-Pr2NEt)的作用下于DMF中发生缩合反应得到化合物6，化合物6与新制羟氨的甲醇溶液反应制得本发明所述噻唑类化合物Ia；
路线二：
其中，R1、R2、R8、n、X和Y的定义同上；
具体来说，化合物6在甲醇或THF/水体系中经过碱(例如NaOH或LiOH)水解得到化合物Ie，化合物Ie与单Boc保护的邻苯二胺在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应得到化合物7，化合物7在盐酸乙酸乙酯溶液作用下脱去Boc保护基得到本发明所述噻唑类化合物Ib，或者化合物7与不同的亲核试剂R8H发生反应得本发明所述噻唑类化合物Ib；
路线三：
其中，R1、R2、n、X和Y的定义同上；
具体来说，化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-NHCOCH2STrt在缩合剂EDCI，4-二甲氨基吡啶(DMAP)作碱的条件下于二氯甲烷中发生缩合反应得到化合物8，化合物8在三氟乙酸条件下脱除保护基制得本发明所述噻唑类化合物Ic；
路线四：
其中，R1、R2、R9、n、X和Y的定义同上。
具体来说，化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-SR9在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应得到本发明所述噻唑类化合物Id；
路线五：
其中，R2、R3、R4c、R5c、R6、n、X和Y的定义同上。
具体来说，化合物9在Lawesson’s试剂作用下生成化合物10，化合物10与不同R2取代的溴代丙酮酸乙酯经过Hantzsch反应构建噻唑环得到化合物11，化合物11在甲醇/水体系中碱性条件下水解得到化合物12，化合物12与不同的亲核试剂HX-Y-R3在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应制得本发明所述噻唑类化合物IIc。
本发明通式I结构的噻唑类化合物可以用于制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物，从而可以在制备抗肿瘤和治疗多发性硬化症的药物中应用，所述肿瘤细胞株包括结肠癌细胞HCT-116、胰腺癌细胞Bx-PC3、白血病细胞HL60、人肺腺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺上皮细胞HMEC。从而可以用于治疗结肠癌、胰腺癌、白血病、肺癌或乳腺癌。
附图说明
图1为HDACi CFH367-C有效缓解EAE的临床评分。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。
化合物制备实施例
下述制备实施例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx 300M仪器测定，NMR定标：δH7.26ppm(CDCl3)，2.50ppm(DMSO-d6)，3.15ppm(CD3OD)；试剂主要由上海化学试剂公司提供；TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产，型号HSGF 254；化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产，型号zcx-11，200-300目。
制备实施例一(化合物编号CFH367-C)
将活化的Zn粉(298mg，4.58mmol)溶于重蒸的无水THF(20mL)中，N2置换，滴加化合物13(875mg，5.34mmol)，控制滴加速度，防止暴沸。加毕，回流1.5h，静置冷却得化合物14。
化合物15(1g，3.82mmol)溶于无水甲苯(20mL)中，N2置换，将上述Zn试剂14转入反应液中。加入催化剂醋酸钯(43mg，0.19mmol)，三苯基膦(100mg，0.38mmol)，加热至80-90℃反应直至原料15消失。过滤除去不溶物，浓缩有机相，CH2Cl2(50mL)稀释，加1NHCl(30mL)搅拌10min，分出有机相，水相CH2Cl2(30mL×2次)萃取，合并有机相，浓缩过柱(PE/EtOAc＝4∶1)得化合物16(750g，73.5％，黄色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.85(d，J＝3.0Hz，1H)，7.45(d，J＝3.0Hz，1H)，3.96(s，3H)，3.10-3.14(m，1H)，1.31-1.38(m，2H)，0.84-0.89(m，2H)。
将化合物16(700mg，2.63mmol)溶于MeOH/H2O(30/6mL)中，加入NaOH(210mg，5.26mmol)固体，加热回流1h。反应完成后，旋干MeOH，加H2O稀释，水相用1N盐酸酸化至pH＝2，EtOAc(20mL×3次)萃取，饱和食盐水(30mL)洗涤，有机相无水Na2SO4干燥，浓缩得固体17(660mg，99.5％，淡黄色固体)，直接用于下一步反应。
化合物17(100mg，0.40mmol)溶于干燥的DMF(5mL)中，冰浴冷却至0℃，加入EDCI(76mg，0.40mmol)，HOBt(54mg，0.40mmol)，保持0℃下搅拌10min，加入化合物18(73mg，0.44mmol)以及i-Pr2NEt(120mg，1.20mmol)，保持室温下搅拌12h后，加入20mL水稀释，EtOAc萃取(15mL×3次)，合并有机相，有机相分别用1N盐酸(15mL)，饱和碳酸氢钠溶液(15mL)，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化(PE/EtOAc＝2∶1)，得产品19(104mg，71.7％，淡黄色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.74(d，J＝3.0Hz 1H)，7.42(t，J＝5.4Hz，1H)，7.36(d，J＝3.0Hz 1H)，3.58(s，3H)，3.37(q，J＝6.3Hz，2H)，2.30(t，J＝6.6Hz，2H)，1.58-1.69(m，4H)，1.19-1.25(m，2H)，0.68-0.74(m，2H)。
羟氨盐酸盐(197mg，2.8mmol)悬浮于MeOH(15mL)中，加入KOH(235mg，4.20mmol)，搅拌5min后，过滤除去不溶物，收集滤液备用。将化合物19(104mg，0.28mmol)溶于无水MeOH(10mL)中，加入上述新制备羟氨的MeOH溶液，室温搅拌1h。TLC检测反应完全，EtOAc稀释，1N盐酸中和至pH＝5-6，减压浓缩旋干MeOH，EtOAc萃取(15mL×3次)，饱和食盐水洗涤(10mL)，无水Na2SO4干燥，浓缩得粗品，柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝20∶1-10∶1)得产品CFH367-C(71mg，68.3％，淡黄色固体)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.36(t，J＝5.4Hz，1H)，7.88(d，J＝3.0Hz 1H)，7.74(d，J＝3.0Hz 1H)，3.41(q，J＝6.6Hz，2H)，3.31-3.36(m，1H)，2.16(t，J＝6.6Hz，2H)，1.64-1.69(m，4H)，1.29-1.34(m，2H)，0.82-0.86(m，2H)。
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例二(化合物编号CFH494)
化合物20(90mg，0.24mmol)溶于THF/H2O(5mL，4∶1)中，加入NaOH(12mg，0.29mmol)，室温搅拌2h，反应液用1N盐酸酸化至pH＝2-3，EtOAc萃取(10mL×3次)，饱和食盐水洗涤(20mL)，无水Na2SO4干燥，浓缩得化合物21(85mg，98％，白色固体)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.86(d，J＝3.3Hz，1H)，7.70(d，J＝3.3Hz，1H)，3.38(t，J＝6.3Hz，2H)，3.20(d，J＝7.2Hz，2H)，2.36(t，J＝6.9Hz，2H)，1.89-2.00(m，1H)，1.66-1.68(m，4H)，0.96(d，J＝6.6Hz，6H)。
将化合物21(93mg，0.25mmol)溶于干燥的CH2Cl2(5mL)中，分别加入化合物22(74mg，0.35mmol)，HOBt(41mg，0.30mmol)，Et3N(36mg，0.35mmol)，0℃下搅拌10min，加入EDCI(82mg，0.43mmol)，室温反应过夜。反应液分别用1N盐酸(10mL)，饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩过柱(PE/EtOAc＝2∶1-1∶1)得23(74mg，52.5％，无色透明油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.86(d，J＝3.3Hz，1H)，7.66(t，J＝5.4Hz，1H)，7.52(d，J＝7.8Hz，1H)，7.45(d，J＝3.3Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.06-7.14(m，2H)，3.40(q，J＝6.3Hz，2H)，3.26(d，J＝6.9Hz，2H)，2.38(t，J＝6.6Hz，2H)，1.98-2.01(m，1H)，1.66-1.76(m，4H)，1.48(s，9H)，0.98(d，J＝6.6Hz，6H)。
将化合物23(73mg，0.13mmol)溶于CH2Cl2(2mL)中，加入1N盐酸的EtOAc溶液(2mL)，室温搅拌10min后，浓缩得产物CFH494(60mg，93.8％，白色固体)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.93(d，J＝3.3Hz，1H)，7.80(d，J＝3.3Hz 1H)，7.47-7.52(m，2H)，7.35-7.42(m，3H)，3.45(q，J＝6.6Hz，2H)，3.31(d，J＝7.2Hz，2H)，2.59(t，J＝6.6Hz，2H)，1.81-2.00(m，1H)，1.74-1.79(m，4H)，0.98(d，J＝6.6Hz，6H)。
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例三(化合物编号CFH412)
化合物24(500mg，1.87mmol)溶于干燥的CH2Cl2(15mL)中，分别加入化合物25(754mg，1.87mmol)，EDCI(488mg，2.80mmol)，DMAP(23mg，0.19mmol)，室温反应过夜。反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，饱和食盐水洗涤，水相用CHCl3(10mL×2次)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，柱色谱(PE/EtOAc＝2∶1-1∶1)分离得产物26(640mg，52.5％，黄色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.78(d，J＝3.0Hz，1H)，7.51(t，J＝6.3Hz，1H)，7.35(d，J＝8.1Hz，6H)，7.29(d，J＝3.0Hz，1H)，7.11-7.23(m，9H)，6.15(t，J＝6.0Hz，1H)，3.32(q，J＝6.0Hz，2H)，3.22(d，J＝7.2Hz，2H)，3.05(s，2H)，2.96(q，J＝6.0Hz，2H)，1.94-1.96(m，1H)，1.44-1.46(m，2H)，1.35-1.40(m，2H)，0.94(d，J＝6.6Hz，6H)。
将化合物26(320mg，0.5mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中，加入Et3SiH(188mg，1.65mmol)和三氟乙酸(5.6g，0.05mol)，室温搅拌2h，浓缩过柱(PE/EA＝1∶1-1∶5)得产物CFH412(150mg，74.4％，淡黄色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.78(d，J＝3.0Hz，1H)，7.59(t，J＝5.7Hz，1H)，7.38(d，J＝3.0Hz 1H)，7.31(t，J＝5.7Hz，1H)，3.36(q，J＝6.3Hz，2H)，3.26(q，J＝5.7Hz，2H)，3.19(s，2H)，3.17(d，J＝7.2Hz，2H)，1.86-1.97(m，1H)，1.47-1.58(m，4H)，0.89(d，J＝6.6Hz，6H)。
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例四(化合物编号CFH538)
化合物27(100mg，0.47mmol)溶于干燥的DMF(5mL)中，冰浴冷却至0℃，加入EDCI(108mg，0.57mmol)，HOBt(76mg，0.57mmol)，保持0℃下搅拌10min，加入化合物28(81mg，0.52mmol)以及i-Pr2NEt(91mg，0.71mmol)，保持室温下搅拌12h后，加入20mL水稀释，EtOAc萃取(15mL×3次)，合并有机相，有机相饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化(PE/EtOAc＝3∶1)，得产品29(129mg，77.9％，无色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.83(s，1H)，8.10(s，1H)，8.05(s，1H)，7.81(d，J＝9.0Hz，1H)，5.87(dddd，J＝17.1，10.5，5.7，5.1Hz，1H)，5.31(d，J＝17.1Hz，1H)，5.23(d，J＝10.5Hz，1H)，4.73(dd，J＝9.3，5.1Hz，1H)，4.65(dd，J＝17.1，5.7Hz，2H)，2.23-2.33(m，1H)，0.96(t，J＝6.9Hz，6H)。
化合物29(55mg，0.16mmol)溶于重蒸的甲苯(5mL)中，N2气置换，分别加入Grubbs二代催化剂(66mg，0.08mmol)的甲苯(1mL)溶液，化合物30(100mg，0.48mmol)的甲苯(1mL)溶液，110℃加热回流12h。浓缩，过柱(PE/EtOAc＝2∶1)得产物CFH538(23mg，50％，淡黄色油状物)，回收原料29(25mg)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.86(s，1H)，8.13(s，1H)，8.11(s，1H)，7.83(d，J＝9.0Hz，1H)，5.74(dt，J＝15.3，6.6Hz，1H)，5.63(dt，J＝13.2，6.0Hz，1H)，4.74(dd，J＝9.0，5.4Hz，1H)，4.66(dd，J＝15.3，5.4Hz，2H)，2.91(t，J＝7.5Hz，2H)，2.52(t，J＝7.5Hz，2H)，2.35-2.43(m，2H)，2.22-2.32(m，1H)，1.60-1.67(m，2H)，1.19-1.26(m，8H)，1.04(t，J＝6.3Hz，6H)，0.86(t，J＝6.9Hz，3H)。
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例五(化合物编号CFH325-B)
将化合物31(1g，7.86mmol)溶于干燥的DME(30mL)中，N2气保护下加入Lawesson’s试剂(1.6g，3.9mmol)，室温反应12h，过滤，除去溶剂，过柱(PE/EtOAc＝10∶1-2∶1)得化合物32(1.0g，88.8％，白色固体)，直接用于下一步反应。
化合物32(500mg，3.49mmol)溶于干燥的DME(30mL)中，加入KHCO3(2.1g，21mmol)，室温搅拌10min，滴加入化合物33(1.5g，7.68mmol)，反应1h后，冰浴冷却，滴加入三氟乙酸酐(2.2g，10.48mmol)和2，6-二甲基吡啶(1.87g，17.46mmol)的DME(10mL)溶液，保持0℃反应1h，升至室温反应过夜。TLC检测化合物32反应完全，旋干溶剂，EtOAc(50mL)稀释，有机相分别用1N盐酸(20mL)，饱和碳酸氢钠(20mL)，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩过柱(PE/EtOAc＝4∶1-2∶1)得化合物34(647mg，77.4％，淡黄色固体)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.00(s，1H)，7.50(d，J＝3.9Hz，1H)，7.36(d，J＝5.1Hz，1H)，7.00(dd，J＝4.8，3.9Hz，1H)，4.34(q，J＝7.2Hz，2H)，1.33(t，J＝7.2Hz，3H)。
将化合物34(447mg，1.87mmol)溶于EtOH/H2O(20/5mL)中，0℃下加入NaOH(149mg，3.74mol)固体，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干EtOH，加H2O稀释，1N盐酸酸化至pH＝2，EtOAc(20mL×3次)萃取，饱和食盐水(20mL)洗涤，有机相无水Na2SO4干燥，浓缩得35(314g，79.5％，白色固体)，直接用于下一步反应。
化合物35(110mg，0.52mmol)溶于干燥的DMF(5mL)中，冰浴冷却至0℃，加入EDCI(150mg，0.78mmol)，HOBt(106mg，0.78mmol)，保持0℃下搅拌10min，加入化合物18(96mg，0.57mmol)以及i-Pr2NEt(134mg，1.04mmol)，保持室温下搅拌12h后，加入20mL水稀释，EtOAc萃取(15mL×3次)，合并有机相，有机相分别用1N盐酸(15mL)，饱和碳酸氢钠溶液(15mL)，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化(PE/EtOAc＝2∶1)，得产品36(146mg，86.4％，淡黄色油状物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.95(s，1H)，7.47(d，J＝3.9Hz，1H)，7.39(d，J＝5.1Hz，1H)，7.03(dd，J＝5.1，3.9Hz，1H)，3.62(s，3H)，3.42(q，J＝6.3Hz，2H)，2.31(t，J＝6.6Hz，2H)，1.65-1.71(m，4H)。
羟氨盐酸盐(215mg，3.1mmol)悬浮于MeOH(15mL)中，加入KOH(260mg，4.65mmol)，搅拌5min后，过滤除去不溶物，收集滤液备用。将化合物36(100mg，0.31mmol)溶于无水MeOH(10mL)中，加入上述新制备羟氨的MeOH溶液，室温搅拌1h。TLC检测反应完全，EtOAc稀释，1N盐酸中和至pH＝5-6，减压浓缩旋干MeOH，EtOAc萃取(15mL×3次)，饱和食盐水洗涤(10mL)，无水Na2SO4干燥，浓缩得粗品，柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝20∶1-10∶1)得产品CFH325-B(86mg，86％，白色固体)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.09(s，1H)，7.87(s，1H)，7.66(d，J＝3.9Hz，1H)，7.60(d，J＝5.1Hz，1H)，7.14(dd，J＝3.9，5.1Hz，1H)，3.42(q，J＝6.3Hz，2H)，2.16(t，J＝6.6Hz，2H)，1.68-1.71(m，4H)。
生物实验实施例
实例一：组蛋白去乙酰化酶1，3，6(HDAC1，3，6)抑制活性测试实验
1.实验目的：
进行本发明化合物的人源组蛋白去乙酰化酶1，3，6的抑制活性测试。
2.材料来源
人源HDAC1、HDAC3和HDAC6，应用杆状病毒表达系统得到。
3.测试原理：
以Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC(HDAC1，3)和Boc-lys(Ac)-AMC(HDAC6)为底物，采用荧光检测法，在96孔或384孔平底微孔板中检测酶活性。底物经HDAC去乙酰化后，利用胰酶水解得到的产物AMC在荧光检测仪的355nm激发460nm发射光下可被检测到荧光信号。通过检测随时间荧光信号的变化，计算得到反应初速度。
4.实验过程：
样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
数据处理和结果说明：初筛选择单浓度条件下，例如20μg/ml，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为GraphpadPrism 4，拟合所使用的模型为sigmoidal dose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation，SD)或者标准误差(Standard Error，SE)表示。每次测试均有已报道的化合物SAHA(Vorinostat)作为参照。
5.实验结果：
由上表的实验结果可以看出：R2部位的改造，从生物结果来看，烷基、烯烃基和芳香基取代都呈现良好的HDAC抑制活性，取代基的多样化有利于化合物的生物活性。异丁烯基取代化合物CFH395对HDAC1的抑制活性最好。化合物CFH355，CFH437，CFH417选择性抑制HDAC1(HDAC1/HDAC6＝～30倍)。同时化合物CFH355对HDAC1与HDAC3的选择性为8倍。
同时，生物活性显示，R2部位取代基相同，Y为-(C1-C10烷基)-，链长的长短对活性影响较大。同样，相同侧链长度，不同的R2取代基化合物的活性也大不同。如对于异丁基取代的系列化合物，链长为7个亚甲基时HDAC1抑制活性最好，而对于环丙基取代时，链长为6个亚甲基时HDAC1抑制活性最佳。
固定R2基团异丁基取代，本发明人考察了侧链片段Y以及不同Zn离子螯合基团(ZBG)。对于HDAC1的抑制作用，ZBG为异羟肟酸活性最好，当为α-巯基酮时，选择性抑制HDAC6，特别是化合物CFH398-S。
固定R2基团环丙基取代，考察R4b和R5b取代，从对HDAC抑制活性发现，当R4b和R5b与其所连C形成六元环时，即化合物CFH421-C对HDAC1抑制活性最强，且选择性抑制HDAC1(HDAC1/HDAC6＝～75倍)。
实例二：细胞水平抗肿瘤活性测试实验
1.实验目的：
进行本发明化合物的抗肿瘤活性测试，通过测定化合物对人源结肠癌HCT-116细胞株的生长抑制活性来评价化合物的体外抗肿瘤活性。
2.测试原理：
采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法，该分析方法以代谢还原3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲臜(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在550/690nm波长处测量光密度。
3.实验过程：
样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
运用MTT法检测细胞存活率，即将生长在对数生长期的细胞，经0.05％的胰酶消化，计数，以2.0×103/孔的细胞密度接种在96孔板中100mL，置于5％CO2培养箱内37℃培养过夜。每一化合物设六个浓度梯度，每一浓度设三复孔，每一浓度分别加入到对应孔中，5％CO237℃培养箱内培养72小时，加入20mL的5mg/mL MTT。37℃孵育3小时后，吸弃上清，加入100mL的DMSO溶解，使用SpectraMAX 340测550nm(L1)光吸收值，参考波长690nm(L2)，将(L1-L2)值对抑制剂不同浓度作图，经公式拟合得IC50。
数据处理和结果说明：初筛选择单浓度条件下，例如20μg/ml，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为GraphpadPrism 4，拟合所使用的模型为sigmoidal dose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation，SD)或者标准误差(Standard Error，SE)表示。每次测试均有阿霉素(doxorubicin)作为参照。
4.实验结果：
4.1：化合物在HCT-116人结肠癌细胞株上的活性结果：
4.2：化合物在BxPC-3人胰腺癌细胞株上的活性结果：
4.3：化合物在其它肿瘤细胞株上的抑制活性结果：
5.结论：对HDAC1有抑制活性的化合物均呈现良好的抑制肿瘤细胞增殖活性，尤其是对结肠癌、胰腺癌、肺腺癌、乳腺癌等具有很好的作用。从对肿瘤细胞株的抑制生长活性看，化合物在细胞上的活性基本与在酶上的活性吻合。
实例三：HDAC抑制剂作为治疗多发性硬化症(MS)的药物
1.实验方法及结果：
HDACi CFH367-C可以有效缓解EAE的临床评分。本发明人对8周龄的雌性C57小鼠进行皮下注射100μL弗氏完全佐剂乳化的MOG35-55(150μg/只)和热灭活的MT毒素(5mg/mL)，并于当天和第三天两次腹腔注射PTX(200ng/只/次，PBS溶解)。免疫后第三天开始经由灌胃给药，每日两次，每次剂量为10mg/kg体重。每天观察小鼠的表现，并依据以下标准进行评分：0分：没有发病的任何征兆；尾部无力(0.5分)或者瘫痪(1分)；四肢无力(0.5分)或者瘫痪(1分)。以上得分相加为最后得分。结果表明(图1)，CFH367-C对于EAE的临床症状有良好的治疗作用，治疗组小鼠的疾病严重程度显著的低于溶剂对照组(P＜0.01)。
HDACi CFH367-C明显减轻EAE动物脊髓的脱髓鞘现象。取正常对照、EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)及EAE治疗组小鼠的脊髓样品，经固定后，常规石蜡包埋，5微米切片，脱蜡水化至95％酒精，用坚劳蓝染色在56度过夜；经95％酒精洗，水洗，然后用0.05％碳酸锂溶液分色；再用70％酒精洗两次，蒸馏水洗，然后用伊红染色2分钟；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片。坚劳蓝主要着色部位为脊髓白质，主要由神经纤维及其髓鞘组成。实验结果表明，正常小鼠的白质可被染成蓝色，结构比较致密；而EAE小鼠的脊髓白质区域出现大量空泡，且着色程度明显降低，显示出严重脱髓鞘现象。而CFH367-C给药的小鼠脊髓白质结构致密，着色均有，接近正常对照小鼠水平，显示其明显的治疗作用。
HDACi CFH367-C明显减轻EAE动物脊髓中外周免疫细胞的浸润现象。取正常对照、EAE及EAE治疗组小鼠的脊髓样品，经固定后，常规石蜡包埋，5微米切片，切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇复水后，苏木精染色5分钟；后经自来水冲洗，盐酸分色，自来水洗，再用伊红染色2分钟；梯度乙醇脱水后，经二甲苯透明，用中性树胶封片。实验结果表明，正常小鼠的脊髓中几乎没有浸润的外周免疫细胞；而EAE小鼠的脊髓白质区域出现大量外周免疫细胞的浸润，并造成附件组织损伤，出现空泡。而CFH367-C给药的小鼠脊髓白质结构致密，无明显外周免疫细胞浸润现象，显示其明显的治疗作用。
HDACi CFH367-C明显减轻EAE动物脊髓中CD45阳性白细胞的浸润现象。取小鼠脊髓，经固定后，OCT包埋，制作10μm冰冻切片。切片用PBS洗三次，每次5min，然后用抗CD45的抗体(一抗)在4℃孵育过夜；PBS洗三次后，用带荧光标记的二抗37℃染色1h，经PBS洗三次后，甘油封片。CD45为白细胞共同抗原，实验结果表明，细胞核染色显示EAE实验小鼠的脊髓中有大量细胞聚集，大部分为CD45阳性的白细胞。这一现象在正常小鼠中不存在，而在CFH367C给药的小鼠中也没有观察到CD45阳性白细胞的聚集，显示CFH367-C可以抑制白细胞对EAE小鼠脊髓的浸润现象。
HDACi CFH367-C明显减轻EAE动物脊髓中CD4阳性T细胞的浸润现象。前期研究表明CD4阳性T细胞对于EAE的发病有着重要作用，本发明人也观察了药物对于CD4阳性T细胞浸润的作用。取小鼠脊髓，经固定后，OCT包埋，制作10μm冰冻切片。切片用PBS洗三次，每次5min，然后用抗CD4的抗体(一抗)在4℃孵育过夜；PBS洗三次后，用带荧光标记的二抗37℃染色1h，经PBS洗三次后，甘油封片。实验结果表明，细胞核染色显示EAE实验小鼠的脊髓中有大量细胞聚集，大部分为CD4阳性的T细胞。这一现象在正常小鼠中不存在。而CFH367-C给药可以明显减轻EAE小鼠脊髓中CD4阳性T细胞的浸润和聚集。
2.结论：
组蛋白去乙酰化酶抑制剂CFH367-C可以有效缓解MS的实验小鼠动物模型EAE的临床症状。对EAE小鼠的脊髓进行染色实验发现，CFH367-C可以抑制外周免疫细胞，尤其是CD4阳性T细胞对小鼠中枢神经系统的浸润，减轻EAE动物神经元的脱髓鞘现象，从而缓解了EAE的临床表现。本研究结果显示组蛋白去乙酰化酶抑制剂CFH367-C可以用于MS疾病的治疗，并有可能推广应用到其他自身免疫疾病的治疗，包括类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮等。

Claims (6)

1.一类通式Ⅰ所示的噻唑类化合物，
其中：
R1为R1b；
通式I所示的化合物为2,2'-连接的双噻唑化合物；
R4b和R5b各自独立地选自A中；或者R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环或含有1-3个选自N、O和S中的杂原子的3-10元杂环；
所述A为如下基团中的一种：H、C1-C6烷基、硝基、C3-C6环烷基或C6-C10芳基；
R2为如下基团中的一种：H，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，C1-C6烷基取代的C3-C6环烷基，任选被羟基、苄氧基或C6-C10芳基取代的C1-C6烷基，C2-C8链烯基，任选被C6-C10芳基取代的C2-C6链烯基，C6-C10芳基，任选被卤原子或硝基取代的C6-C10芳基；
n为0；
X为-N(R7)-，其中R7为H；
Y为-(C1-C10烷基)-、-(C2-C9链烯基)-、-(C6-C10芳基)-、-(C1-C6烷基)-(C6-C10芳基)-、-(C6-C10芳基)-(C2-C6链烯基)-；
R3为R3a、R3b、R3c或R3d；
其中，R8为H；
R9为H；
所述的噻唑类化合物，其中，为通式Ⅱb：
其中：
R2、X、Y和R3的定义如前述所述；
R4b和R5b各自独立地为H、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C6-C10芳基，或R4b和R5b与其连接的C一起形成3-10元环；
所述的通式IIb的噻唑类化合物，其中，为通式III的化合物：
其中，所述的X为-NH-，且n＝0，R2、R3、R4b、R5b和Y的定义如前述所述。
2.根据权利要求1所述的噻唑类化合物，其中，所述化合物具体为：
3.权利要求1所述的噻唑类化合物的制备方法，其特征在于，通过下述路线一～路线四中的任何一种来实现；
路线一：
其中，R1、R2、n、X和Y的定义同权利要求1；
化合物1与活化锌粉在THF中形成化合物2，化合物2与2-溴代噻唑化合物3在醋酸钯与三苯基膦催化下于甲苯中经Negishi偶联反应得到化合物4，化合物4在氢氧化钠/甲醇-水体系中水解后得相应的酸5，化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-COOMe在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应得到化合物6，化合物6与盐酸羟氨的甲醇溶液反应制得本发明所述噻唑类化合物Ⅰa；
路线二：
其中，R1、R2、R8、n、X和Y的定义同权利要求1；
化合物6在甲醇/水体系中经过NaOH水解得到化合物Ⅰe，化合物Ⅰe与单Boc保护的邻苯二胺在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应得到化合物7，化合物7在盐酸乙酸乙酯溶液作用下脱去Boc保护基得到本发明所述噻唑类化合物Ⅰb，或者化合物7与不同的亲核试剂R8H发生反应得本发明所述噻唑类化合物Ⅰb；
路线三：
其中，R1、R2、n、X和Y的定义同权利要求1；
化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-NHCOCH2STrt在缩合剂EDCI，DMAP作碱的条件下于二氯甲烷中发生缩合反应得到化合物8，化合物8在三氟乙酸条件下脱除保护基制得本发明所述噻唑类化合物Ⅰc；
路线四：
其中，R1、R2、R9、n、X和Y的定义同权利要求1；
化合物5与不同的亲核试剂HX-Y-SR9在缩合剂EDCI、HOBt、i-Pr2NEt的作用下于DMF中发生缩合反应得到本发明所述噻唑类化合物Ⅰd。
4.权利要求1所述的噻唑类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物中的用途。
5.权利要求1所述的噻唑类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌、胰腺癌、白血病、肺癌或乳腺癌。
6.权利要求1所述的噻唑类化合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的用途。
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Address after: 201203 Shanghai city Pudong New Area Jing Road No. 351 Building No. 2 room A664-2

Applicant after: GYROCHEM (SHANGHAI PUYI) CO., LTD.

Address before: 201612 Shanghai Songjiang 201 min Yick Road No. 11 building 3 floor

Applicant before: Gyrochem (Shanghai Puyi) Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
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Application publication date: 20121114

Assignee: Jiangxi Longchang Pharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Shanghai Puyi Chemical Co.,Ltd.

Contract record no.: X2021310000030

Denomination of invention: A thiazole compound and its preparation method and Application

Granted publication date: 20160817

License type: Exclusive License

Record date: 20210722