KR20140028046A - 사이어졸계 화합물 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사이어졸계 화합물 및 그 제조 방법으로서 보다 구체적으로는 신규 천연산물인 largazole의 파생물과 그 제조방법에 관한것으로서 히스톤 디아세틸라제(HDAC)억제물로서 항종양과 다발적 경화증 치료에 응용된다.
Figure pct00077

Description

사이어졸계 화합물 및 그 제조 방법 {THIAZOLE COMPOUND AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}
이 출원은 2011년 05월 10일 중국 출원 제201110120207.9호에 대한 우선권이 주장된 2012년 05월 07일에 출원된 PCT/CN2012/075142의 국내단계출원으로, 이들 출원명세서에 개시된 내용은 참조로서 이 명세서에 포함된다.
본 발명은 사이어졸계 화합물 및 그 제조 방법으로서 보다 구체적으로는 신규 천연산물인 largazole의 파생물과 그 제조방법에 관한것으로서 히스톤 디아세틸라제(HDAC)억제물로서 항종양과 다발적 경화증 치료에 응용된다.
종양은 세계적 범위에서 신혈관질병후로 두번째 킬러로 불리우고 있다. 근년 발명율이 계속 상승추세로서 암증치료는 세계적인 큰 난제로 되고 있다. 전통적인 화학요법은 과녁의 선택성이 결핍하여 엄중한 부작용이 생길 수 있다. 현재 일부 종양세포 분화 증식(增殖)과 전이에 연관되는 세포신호 전도 통로 관건효소를 약물선택의 과녁으로 하여 선택성이 특정 과녁에 작용하는 고효, 저독, 특이성이 높은 신규강암약물을 발견하는 것은 이미 현재 항종양 약물연구 개발의 중요한 방향으로 되고 있다.
다발성경화정(Multiple Sclerosis，MS)은 전형적인 자가면역질병이다. MS질병의 병리표현으로는 중추신경계통이 급성염증으로 탈수초가 발생된다. 이는 젊은 사람들이 무상처신경계통 반신불수 지어 장애로 되는 제일 중요한 원인중의 하나이다. MS임상 표현은 다수 불균질형으로서 80%를 넘는 환자들은 반복적인 완화후 재발한다. 질병 발생기질이 불확실하고 현재 아직 영활한 진단표식이 없는 원인으로 MS진단은 질병의 시간과 공간상의 다발성에 의거할수밖에 없다. 더우기 많은 기타 질병, 예를 들면 시신경척수염 등은 MS와 극히 상사한 병증으로서 현재 MS치료와 진단은 계속 큰 곤난이 있다.
현재 연구결과 CD4+ T세포는 MS발병, 적어도 초기 질병 발생에 중요한 작용을 하고 있다고 인정되였다. 조기 연구에서 인정되였던 TH1세포(IFN--γ를 형성하는것을 특성으로 한다)의 질병발생에 중요한 작용은 TH17가 발견됨으로서 점차적으로 많은 증거들은 CD4+ T세포가 MS질병에 TH1과 못지 않는 작용을 하고 있다는 것이 증명되였다. 예를 들면 TH17세포양이 소수의 작은 쥐는 EAE를 쉽게 일으키지 않고 MS환자의 뇌조직병소 (病遯) 검증결과 TH17세포를 발견한 등이다.
염색질의 히스톤아세틸화(histone acetylation)와 틸아세틸화(deacetylation)는 유전자 표달을 조절하는 중요한 환절이다. 이상한 유전자 표달은 종양 및 일부 유전와 대사질병 발생의 분자생물학 기초이다. 히스톤아세틸화정도는 히스톤아세틸라제(HAT)와 히스톤디아세틸라제 (HDAC)가 협조하여 제어한다. HDAC가 과도 표달되고 전사인자(transcribing gene)에 모집되면 지정된 유전자가 불정상으로 억제되므로서 종양과 기타 질병을 일으킬 수 있다.
HDACs는 18종 아형(hypotype)이 있고 4개 큰 분류로 나눈다. 각각Ⅰ형(HDAC1,2,3,8)， Ⅱ형(HDAC4,5,6,7,9)，Ⅲ형(SIR1~7)과 Ⅳ형(HDAC 11) (Johnstone, R. W. 2002 Nature Rev . Drug Disc . 1:287) 이다. 보도에 의하면 HDAC의 활성은 암증발생에 연관된다(Archer, S. Y.등. 1998 Proc . Nat . Acad . Sci . USA, 95: 6791-6796). HDAC가 과도하게 표달될 때 생물체내의 천연 종양 억제인자, 예를 들면 p53인자표달(Gu, W.등. 1997 Cell, 90: 595-606)을 억제한다. HDAC억제제(HDACi)는 염색질의 히스톤아세틸화 수준을 제고하므로 지정된 인자를 활성화하고 세포의 말단분화 일으키거나 암세포를 죽일 수 있다. 임상연구에 의하면 HDAC의 활성을 억제하는 것을 통하여 히스톤아세틸화수준을 얻을 수 있다.
현재 발견된 HDACi는 구조에 따라 아래 몇 가지로 나눌 수 있다. 짧은 사슬지방산유; 히드록삼산(Hydroxamic acid)류; 친전자에폭시케톤기(Electrophilic epoxy ketone group); 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine) 및 대환펩티드(Big cyclic peptide)(Miller, T. A.등. 2003 J. Med . Chem . 46:5097; Rosato, R. R.등. 2004 Expert . Opin . Invest . Drugs 13:21; Monneret, C., 2005 Eur . J. Med . 40:1; Yoo, C. B.등. 2006 Nat . Rev . Drug Discovery 5:37). HDACi 구조활성관계 연구에 의하면 대다수 HDACi는 표면식별 구조역, 아연이온 킬러이트역（ZBG), 및 두 부분을 연결한 수소성 지방족 사슬(Marks, P. 2007 Oncogene 26:1351)로 나눈다.
히스톤 아세틸라제(HDAC)는 중요한 유전자표달 조절 단백이며 염색질 재조직 조절, 유전자 표달 및 전사 인자, 히스톤, 세포골격단백 등 여러가지 단백질 공능을 가지고 있다. HDACi는 HDAC 활성을 막을 수 있는 소분자 화합물로서 세포 주기를 차단하고 세포 분화를 일으키며 세포를 죽일수도 있어 현재 종양치료에 응용되고 있다. 실험결과에 의하면 HDACi는 염증억제와 면역력 조절할 수 있다. Camelo 등의 발견에 의하면 HDACi TSA는 MS 자가면역성 회척수염(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)에서 T세포가 작은 쥐 중추신경계통의 침략을 효과적으로 억제할 수 있다. Chung의 발견에 의하면 HDACi 페닐부티릭산(Phenylbutyric acid)과 TSA는 동물관절염 모형중TNF-alpha 표달을 억제하고 단핵세포의 침투를 절감할수 있어 질병병증을 감해준다. Bosisio 등의 연구결과에 의하면 HDACi는 앤티전 프레즌테이션(antigen presentation)의 덴드리틱(dendritic)세포 분비을 억제하여 TH1과 TH17이 유도한 IL-12, IL-23등 세포인자에 유리하다. Tao등의 연구결과에 의하면HDACi는 억제형 Treg세포 분화를 강화하고 TH1와 TH17 세포의 억제 기능을 강화한다. 상술한 연구결과에 의하면 HDAC의 억제는 자가면역성질병의 발생과 발전에 밀접한 관계가 있다. 독성이 적고 선택성이 더 좋은 HDACi을 찾는 것은 자가면역성 질병의 치료와 MS를 포함하는 질병 치료에 도움을 줄 수 있다.
Largazole는 플로리다(Florida)의 해양남조류 Symploa sp.를 분리하여 얻은 고기능화 16-맴버드 링 마크로라이드게 항생물질(16-membered ring macrolide antibiotics) (Taori,K.,등.2008 J. Am . Chem . Soc . 130:1806-1807; Ying, Y.등. 2008 J. Am . Chem . Soc . 130:8455-8459)이다. 상기 천연산물의 구조는 신규적으로서 4-메틸에 치환된 디하이드로 사이어졸 링(Hydrogen thiazole ring)과 사이어졸 링의 연결된 부분, L-발린(valine)과 (3S,4E) -3- 하이드락시(hydroxy)- 7-머캐피터(mercapto)- 4-해프토닉 산(heptenoic acid)을 포함한다. 약리실험에 따르면largazole은 유선암세포(MDA-MB-231)와 섬유모세포 골육종세포(U2OS)의 생장을 억제하고 정상적인 유선상피세포(NmuMG)와 정상적인 섬유세포(NIH3T3)에 대한 영향은 적다. 또한 Largazole는 선택적으로 Ⅰ형 HDAC를 억제한다. 발명인은 이 기초에서그 구조를 최적하고 개조및 평가함으로서 잠재력이 있는 화합물을 개발하고저 한다.
Figure pct00001
본 발명의 목적은 새로운 사이어졸계 화합물을 설계하고 합성하는 것으로서히스톤 디아세틸라제 억제제로 사용되여 항종양과 다발성 경화정을 치료하는 약물발견에 새로운 길을 개발하도록 한다.
본 발명의 다른 목적은 사이어졸계 화합물제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사이어졸계 화합물 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일반식이 Ⅰ와 같은 사이어졸계 화합물 구조는
Figure pct00002
상기 식중 R1는 R1a , R1b 혹은 R1c이고;
Figure pct00003
R4a와 R5a는 각자 독립적으로 A 혹은 Boc가 보호하는 아미노기C1-C6알킬기이고,
R4b와 R5b는 각자 독립적으로 A에서 선택거나 혹은 R4b, R5b와 상기 R4b, R5b와 연결되는 C와 같이 3-10원환(ring) 혹은 1-3개 N, O와 S에서 선택된 잡원자가 함유된 3-10 원잡환(heterocyclic)이고;
R4c, R5c와 R6는 각자 독립적으로 A에서 선택하는데;
상기 A는 아래의 라디칼(radical)중의 하나이다：H, 할로겐(halogen), 하이드락시(hydroxy), 니트로기(nitryl), C3-C6사이클로 알킬기(cyclo alkyl), C1-C6알콕시(alkoxy), C6-C10아릴(aryl) 치환 C1-C6알콕시, 아미노기, C1-C6알킬아미노기(Alkylamino), C6-C10알릴 치환C1-C6알킬아미노기, C1-C6알킬기(alkyl), 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, C1-C4알콕시 치환 C1-C6알킬기, 불소 치환 C1-C6알킬기, C6-C10알릴 치환 C1-C6알킬기, C2-C6사슬알켄닐기(alkeny), 하이드락시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C1-C4알콕시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, 알켄닐기, 불소 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C6-C10아릴이 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C2-C6사슬알키닐기, 하이드락시 치환 C2-C6사슬알키닐기(alkyny), C1-C4알콕시 치환 C2-C6사슬알키닐기, 불소가 치환C2-C6사슬알키닐기, C6-C10아릴 치환 C2-C6사슬알키닐기, C6-C10아릴, 5-7원잡 아릴이다; 상기 5-7원잡아릴에는 1-3개의 N,O와 S에서 선택된 잡원자가 함유되고;
R2는 아래 라디칼중의 하나이다: H，할로겐 원자, 하이드락시, C1-C6알콕시, C6-C10아릴 치환 C1-C8알콕시, 아미노기, C1-C6알킬아미노기, C6-C10아릴 치환 C1-C6알킬아미노기, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, C1-C6알킬기 치환 C3-C6사이클로 알킬기, 하이드락시; C1-C4알콕시 혹은 할로겐 원자 혹은 벤질기 혹은 C6-C10아릴 치환 C1-C6알킬기 혹은 C2-C8사슬 알켄닐기중에서 임이로 선택; 하이드락시 혹은C1-C4알콕시 혹은 할로겐 원자 혹은 C6-C10아릴치환 C2-C6사슬 알켄닐기 혹은C2-C6사슬알킬기 중에서 임의로 선택; 하이드락시 혹은 C1-C4알콕시 혹은 불소 원자 혹은 C6-C10아릴 치환 C2-C8사슬알키닐기 혹은C6-C10알릴중에서 임의로 선택; 불소 원자 혹은 니트로기 치환 C6-C10아릴, 5-7원잡아릴；상기 5-7원잡 알릴에는 1-3개 N, O와 S에서 선택된 잡원자가 포함되고; 우선은 R2는 아래 라디칼중의 하나이다: H， C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기,하이드락시 혹은 벤질기 혹은 C6-C10아릴 치환C2-C8사슬 알켄닐기C6-C10알릴중에서 임의로 선택; 임의로 불소 원자 혹은 니트로기 치환 C6-C10알릴에서 선택；
n은 0, 1 혹은 2이고；우선은 0이다；
X는 -N(R7)- 혹은
Figure pct00004
，그 중 R7 는 H 혹은 C1-C6알킬기에서 선택되고, X는 우선으로 -NH-이고,
Y는 존재하지 않거나 혹은 -(C1-C10알킬기)-, -(C2-C9사슬알켄닐기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)-, -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-, -(C3-C6사이클로알킬기)-, -(C1-C5알킬기)-C(O)-NH-(C1-C5알킬기)-, -(C1-C5알킬기)-C(O)-O-(C1-C5알킬기)- 혹은 -(C1-C5알킬기)-C(O)-O-(C2-C9사슬알켄닐기)-이고; 우선-(C1-C10알킬기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)- 혹은 -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-이고;
R3는 R3a, R3b, R3c, R3d 혹은 R3e이고;
Figure pct00005

그중 R8는 H 혹은 C1-C6알킬기 카보닐기(carbonyl)이며; 우선으로 H이고;
R9는 H 혹은 C1-C10알킬기 카보닐기이다.
본 발명의 다른 실시예중, 일반식 Ⅰ중,
R1은 R1a；
n=0；
R2, X, Y와 R3의 정의는 앞에서 서술한 바와 같으며 구체적으로 아래구조Ⅱa:
Figure pct00006
그중：
R4b, R5b과 Y의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 R4a과 R5a는 각자 독립적으로H, C1-C6알킬기 혹은 Boc가 보호하는 아미노기C1-C6알킬기이다.
본 발명의 또 다른 실시예중, 일반식Ⅰ중,
R1는 R1b；
n=0；
R2, X, Y와 R3의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 구체구조는 아래구조Ⅱb:
Figure pct00007
그중 ：
R4b, R5b의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 R4b과 R5b는 각자 독립적으로 H, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기 혹은 C6-C10아릴이거나 R4b, R5b와 연결된 C와 R4b, R5b이 같이 형성된 3-10원환이다.
본 발명의 또 다른 실시예중, 일반식Ⅰ중,
R1는 R1c；
n=0；
R2, X, Y와 R3의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 구체구조는 아래구조Ⅱc:
Figure pct00008
그중,
R4c과 R5c과 R6의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 R4c과 R5c과 R6는 각자 독립적으로 H 혹은 C1-C6알킬기이다.
본 발명의 더 우선적인 실시예 중 상기 X는 -NH-, 또한n=0，R2, R3, R4b, R5b과 Y의 정의는 앞에서 서술한 바와 같고 구체구조는 아래구조Ⅲ：
Figure pct00009

본 발명의 더 우선적인 실시예 중 상기 X는 -NH-, 또한n=0，R3은 구체적으로 R3a, 구체구조는 아래구조Ⅳ:
Figure pct00010
그중 R2, R4b, R5b과 Y의 정의는 앞에서 서술한바와 같다.
R2우선은 H, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, C1-C6알킬기 치환 C3-C6사이클로 알킬기, C2-C8사슬알켄닐기, 하이드락시 치환 C2-C8사슬알켄닐기, C6-C10아릴, C6-C10아릴 혹은 벤질기 치환 C1-C6알킬기, C6-C10아릴 치환 C2-C8사슬알켄닐기, C6-C10아릴이 치환 C2-C8알콕시, 할로겐이 치환 C6-C10아릴 혹은 니트로기 치환 C6-C10아릴이고；
R4b과 R5b는 각자 독립적으로우선H, F, C1-C6알킬기, 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, 불소 치환 C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, C2-C6사슬알켄닐기, 하이드락시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, 불소 치환 C2-C6사슬알켄닐기 혹은 C6-C10아릴이거나 혹은 R4b, R5b와R4b, R5b와 연결된 C와 같이 형성된 3-10원환 혹은 1-3개 N, O와 S중에서 선택된 잡원자의 3-10원잡환이 함유되고；R4b과 R5b는 각자 독립적으로 H, F, C1-C6알킬기, 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, 불소 치환 C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, C2-C6사슬알켄닐기, 하이드락시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, 불소 치환 C2-C6사슬알켄닐기 혹은 C6-C10아릴이거나 혹은 R4b, R5b와R4b, R5b와 연결된 C와 같이 형성된 3-10원환 이다.
Y우선는 -(C1-C8알킬기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)- 혹은 -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-인 사이어졸계 화합물.
본 발명의 Ⅰ구조 사이어졸계 화합물은 구체적으로：
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
본 발명은 일반식Ⅰ구조의 사이어졸계 화합물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 아래의 노선1~노선5 중의 임의의 한가지로 실현한다.
노선1 :
Figure pct00019
그중 R1, R2, n, X와 Y의 정의는 앞에서 서술한 바와 같다.,
구체적으로，화합물 1과 활성화 Zn분말이 THF에서 형성된 화합물2, 화합물2와 2-브롬 치환 사이어졸 화합물3이 팔라듐아세테이트(Palladium acetate)와 트리페닐포스핀 (Triphenylphosphine)의 촉매작용하에 톨루엔(toluene)에서 Negishi카플링(coupling)반응을 통해 화합물4를 얻고, 화합물4는 수산화나트륨/메틸알코올-물체계중 물분해한후 대응되는 산5를 얻고 화합물5와 부동한 친핵시제(Nucleophiles)HX-Y-COOMe가 축합제 EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응하여 화합물6을 얻고, 화합물6과 새로 제조한 수산화아민의 메틸알콜용액에서 반응하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ a 을 얻고;
노선2 :
Figure pct00020
그중 R1, R2, R8, n, X와 Y의 정의는 앞에서 서술한 바와 같다.
구체적으로，화합물 6이 메틸알콜 혹은 THF/물체계에서 염기（예를 들면NaOH 혹은 LiOH）물분해를 통하여 화합물Ⅰ e 을 얻고 화합물Ⅰ e 와 담 Boc가 보호하는 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)이 합축제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 합축반응을 통하여 화합물7을 얻고 화합물7이 염산초산에틸에스테르용액의 작용하에Boc보호기를 제거하고 본 발명이 상기한 사이어졸화합물Ⅰ b 을 얻고 혹은 화합물7과 부동한 친핵시제R8H와 반응하여 본 발명이 상기한 사이어졸계 화합물Ⅰ b 을 얻고;
노선 3:
Figure pct00021
그중 R1, R2, n, X과 Y의 정의는 앞에서 서술한바와 같다.
구체적으로，화합물5와 부동한 친핵시제HX-Y-NHCOCH2STrt가 축합제 EDCI, DMAP가 염기로 작용하는 조건하에 이염소메탄에서 축합반을을 일으켜 화합물8을 얻고 화합물8이 삼불소초산 조건하에서 보호기를 제거하고 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ c 얻고;
노선 4:
Figure pct00022
그중 R1, R2, R9, n, X와 Y의 정의는 앞에서 서술한 바와 같다.
구체적으로，화합물5와 부동한 친핵시제HX-Y-SR9이 축합제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응을 통하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ d 얻는다.
노선 5:
Figure pct00023
그중 R2, R3, R4c, R5c, R6, n, X와 Y정의는 앞에서 서술한 바와 같다.
구체적으로，화합물9는 Lawesson?시제의 작용하에 화합물10을 형성하고 화합물10은 부동한 R2치환Ethyl bromopyruvate 가 Hantzsch반응을 통해 사이어졸환을 만들어 화합물11을 얻고, 화합물11은 메틸알골/물체계에서 염기성조건하에 물분해를 통해 화합물12를 얻고 화합물12와 부동한 친핵시제HX-Y-R3가 축합제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응을 통하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅱ c 을 얻는다.
본 발명의 통상식Ⅰ구조의 사이어졸계 화합물은 히스톤 디아세틸라제 약물 제조에 사용되므로 항종양과 다발성 경화정을 치료하는 약물 제조에 응용될수 있다. 상기 종양세포주는 장암세포HCT-116, 췌선암세포Bx-PC3, 백혈병세포HL60 , 인페선암세포A549, 유선암세포MDA - MB -231, 유선상피세포HMEC가 포함되므로 결장암, 췌선암, 백혈병, 페암, 유선암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 새로운 사이어졸계 화합물을 설계하고 합성하는 것으로서, 히스톤 디아세틸라제 억제제로 사용되여 항종양과 다발성 경화정을 치료하는 약물발견에 새로운 길을 개발하는 효과가 있다.
도 1은 HDACi CFH367-C가EAE을 유효적으로 완화는 임상평가이다.
구체적인 실시예
아래 구제적인 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명은 단지 아래 실시예에 제한되지 않는다.
화합물 제조 실시예
아래 제조 실시예중 NMR는 Varian이 생산한 Mercury-Vx 300M 의기로 측정한다. NMR캘리브레이션(calibration)：δ H 7.26 ppm(CDCl3)，2.50 ppm(DMSO-d6)， 3.15ppm (CD3OD)；시제는 주요하게 상해화학제회사에서 제공; TLC박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography) 규소 판은 산동연태 회우규소개발유한회사에서 생산하고 모델 번호는 HSGF 254, 화합물 정화에 사용된 정상(正相) 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)규소는 산동청도해양화공공장분공장에서 생한하고 모델번호는zcx-11，200-300목。
제조 실시예1 (화합물번호 CFH367 -C)
Figure pct00024
활성화된 Zn분말(298mg, 4.58mmol)을 중복으로 증발한 무수 THF(20mL)에 용해시키고 N2를 치환한후 화합물13(875mg, 5.34mmol )을 적가한다. 적가할때 범핑을 피하여 속도를 컨트롤 한다. 다음1.5h역류한후 정제상태에서 화합물14을 냉각한다.
화합물15(1g, 3.82mmol)를 무수 메틸(20mL)에 용해한후 N2치환하고 상기 Zn시제14를 반응액에 넣은후 촉매 팔라듐아세테이트(Palladium acetate) (43mg, 0.19mmol)， 트리페닐포스핀(Triphenylphosphine) (100mg, 0.38mmol)를 가하여 80-90℃까지 원료15가 사라지도록 가열반응한다. 불용해물을 려과하고 유기상(有机相)을 농축한후CH2Cl2(50mL)을 희석, 1N HCl (30mL)를 가하여 10min 교반한후 유기상을 분해하고 수상(水相) CH2Cl2(30mL×2 차)를 추출여 유기상을 합병, 농축 칼럼크로마토그래피(column chromatography) (PE/EtOAc=4:1)를 통하여 화합물16(750g, 73.5%，황색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 7.85 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J=3.0 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.10-3.14 (m, 1H), 1.31-1.38 (m, 2H), 0.84-0.89 (m, 2H).
화합물16(700mg, 2.63mmol)을 MeOH/H2O (30/6mL)에 용해하고 NaOH(210mg, 5.26mmol)고체를 가하여 1h가열 역류한다. 반응후 MeOH를 회전 건조하고 H2O를 가하여 희석한 후 수상1N염산으로 pH=2까지 산화하고 EtOAc(20mL×3 차)를 추출후 포화식염수(30mL)로 세척하고 유기상 무수Na2SO4로 건조후 농축하여 고체17(660mg, 99.5%，담황색고체)를 얻고 아래 반응에 직접 사용한다.
화합물17(100mg, 0.40mmol)을 건조한DMF (5mL)에 용해한후 어름욕에서 0℃까지 냉각하고 EDCI(76mg, 0.40mmol), HOBt(54mg, 0.40mmol) 을 가하여 0℃에서 10min교반한후 화?물18(73mg, 0.44mmol)과 i-Pr2NEt(12 0mg, 1.20mmol) 을 가한여 실온에서 12h 교반후 20mL 물을 가하여 희석하고 EtOAc를 추출(15mL×3 차)후 유기상 합병하여 유기상을 각기 1N염산(15mL)과 포화탄산수소나트륨용액 (15mL)，포화식염수(20mL)로 세척한후 무수Na2SO4로 건조하고 감압회전으로 용제를 재거하여 규소칼럼크로마토그램정화 (PE/EtOAc=2:1)한 제품19(104mg, 71.7%，담황색유체)를 얻는다。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.74 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.42 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J=3.0 Hz 1H), 3.58 (s, 3H), 3.37 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.30 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.58-1.69 (m, 4H), 1.19-1.25 (m, 2H), 0.68-0.74 (m, 2H)。
수산화아민(Hydroxylamine)산염산(197mg, 2.8mmol)을 MeOH (15mL)위에 띄운후 KOH (235mg, 4.20mmol)를 가하여 5min간 교반하고 불용해물을 려과하고 려과액을 수집하여 준비하여 둔다. 화합물19(104mg, 0.28mmol)를 무수MeOH (10mL)에 용해한후 상기 새로 제조한 수산화아민의 MeOH용액에 가한후 상온에서 1h 교반한다. TLC검측반응 완전히 진행후 EtOAc로 희석하고 1N염산에 pH=5-6까지 중화한후 MeOH을 감압 농축 회전 건조하여 EtOAc을 추출(15mL×3 차)하고 포화식염수(10mL)에 세척한 후 무수Na2SO4에 건조하고 농축하여 초?을 얻으후 칼럼크로마토그램정화(CHCl3/MeOH=20:1-10:1)한 제품 CFH367 -C(71mg, 68.3%，담황색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ8.36 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.74 (d, J=3.0 Hz 1H), 3.41 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31-3.36 (m, 1H), 2.16 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.64-1.69 (m, 4H), 1.29-1.34 (m, 2H), 0.82-0.86 (m, 2H)。
동일한 방법으로 아래와 같은 화합물을 합성한다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
제조 실시예2(화합물 번호 CFH494 )
Figure pct00040
화합물20(90mg, 0.24mmol)을 THF/H2O(5mL, 4:1)에 용해한후 NaOH(12mg, 0.29mmol)을 가하고 온수에 2h 교반한후 반응액1N 염산으로 pH=2-3까지 산화하고 EtOAc로 추출(10mL×3 차)후 포화식염수로 세척하고 (20mL) 무수 Na2SO4로 건조 농축하여 화합물 21(85mg, 98%，백색고체)를 얻는다。1H NMR (300 MHz, CD3OD)δ7.86 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J=3.3 Hz, 1H), 3.38 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.20 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (t, J=6.9 Hz, 2H), 1.89-2.00 (m, 1H), 1.66-1.68 (m, 4H), 0.96 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
화합물21(93mg,0.25mmol)을 건조한 CH2Cl2(5mL)에 용해한후 화합물22(74mg,0.35mmol)， HOBt(41mg, 0.30mmol)과 Et3N(36mg, 0.35mmol)에 각기 넣고 0℃에서 10min 교반한후 EDCI(82mg, 0.43mmol)을 가하여 상온에서 하루밤 반응하도록 한다. 반응액을 각기 1N염산(10mL), 포화탄산수소나트륨용액(10mL), 포화식염수에 세척한후 무수Na2SO4에 건조하고 농축 EtOAc-hexane (PE/EtOAc=2:1-1:1)하여23(74mg, 52.5%，무색 투명 유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.86 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.66 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.45 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.06-7.14 (m, 2H), 3.40 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (d, J=6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.98-2.01 (m, 1H), 1.66-1.76 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 0.98 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
화합물23(73mg, 0.13mmol)을 CH2Cl2(2mL)에 용해한 후 1N염산EtOAc용액(2mL)을 가하여 상온에서 10min 교반 농축하여 CFH494(60mg, 93.8%，백색고체)산물을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ7.93 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J=3.3 Hz 1H), 7.47-7.52 (m, 2H), 7.35-7.42 (m, 3H), 3.45 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.59 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.81-2.00 (m, 1H), 1.74-1.79 (m, 4H), 0.98 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
동일한 방법으로 아래와 같은 화합물을 합성한다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
제조 실시예3 (화합물 번호 CFH412 )
Figure pct00044
화합물24(500mg,1.87mmol)을 건조한 CH2Cl2(15mL)에 용해한 후 화합물25(754mg,1.87mmol), EDCI(488mg, 2.80mmol), DMAP (23mg, 0.19mmol)에 각기 넣고 상온에서 하루밤 반응하도록 한다. 반응액을 각기 포화탄산수소나트륨용액(10mL), 포화식염수로 세척한 후 수상 CHCl3(10mL×2 차)을 사용하여 추출한 후 유기상을 합병하고 무수Na2SO4로 건조시킨후 농축 EtOAc-hexane (PE/EtOAc=2:1-1:1)분리하여26(640mg, 52.5%，황색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.78 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.51 (t, J=6.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J=8.1 Hz, 6H), 7.29 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.11-7.23 (m, 9H), 6.15 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.32 (q, J=6.0 Hz, 2H), 3.22 (d, J=7.2 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.96 (q, J=6.0 Hz, 2H), 1.94-1.96 (m, 1H), 1.44-1.46 (m, 2H), 1.35-1.40 (m, 2H), 0.94 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
화합물26(320mg,0.5mmol)을 CH2Cl2 (5mL)에 용해시킨 후 Et3SiH(188mg, 1.65mmol)와 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) (5.6g, 0.05mol)을 넣고 상온에서 2h 교반하고 농축EtOAc-hexane(PE/EA=1:1-1:5)하여 CFH412(150mg, 74.4%，담황색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.78 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.59 (t, J=5.7 Hz, 1H), 7.38 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.31 (t, J=5.7 Hz, 1H), 3.36 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H), 3.17 (d, J=7.2 Hz, 2H), 1.86-1.97 (m, 1H), 1.47-1.58 (m, 4H), 0.89 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
동일한 방법으로 아래와 같은 화합물을 합성한다.
Figure pct00045
Figure pct00046
제조 실시예4 (화합물 번호 CFH538 )
Figure pct00047
화합물27(100mg, 0.47mmol)을 건조한 DMF (5mL)에 용해한후 어름욕에 0℃까지 냉각하고 EDCI(108mg, 0.57mmol), HOBt(76mg, 0.57mmol)을 넣어 0℃이하를 보정하면서 10min 교반하고 화합물28(81mg, 0.52mmol)과 i-Pr2NEt(91mg, 0.71mmol)을 가하고 상온에서 12h 교반한 후 물20mL로 희석하고EtOAc추출(15mL×3 차), 유기상을 합병한 후 유기상 포화식염수(20mL)로 세척하고 무수Na2SO4로 건조시킨 후 감압 회전으로 용제를 제거한 후 규소 EtOAc-hexane 정화(PE/EtOAc=3:1)하여 제품29(129mg, 77.9%，무색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.83 (s, 1H), 8.10 (s,1H), 8.05 (s,1H), 7.81 (d, J=9.0 Hz, 1H ), 5.87 (dddd, J=17.1, 10.5, 5.7, 5.1 Hz, 1H), 5.31 (d, J=17.1 Hz, 1H), 5.23 (d, J=10.5 Hz, 1H), 4.73 (dd, J=9.3, 5.1 Hz, 1H), 4.65 (dd, J=17.1, 5.7 Hz, 2H), 2.23-2.33 (m, 1H), 0.96 (t, J=6.9 Hz, 6H)。
화합물29(55mg,0.16mmol)을 재증발한 메타놀(toluene)(5mL)에 용해한 후 N2치환하고 Grubbs2대촉매(66mg,0.08mmol)의 메타놀(1mL)용액과 화합물30(100mg,0.48mmol)의 메타놀(1mL)용액에 각기 넣고, 110℃ 가열 회류12h하고 농축EtOAc-hexane(PE/EtOAc=2:1) 하여 CFH538(23mg,50%，담황색 유체) 제품을 얻고 원료2 9(25mg)을 회수한다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.86 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.83 (d, J=9.0 Hz, 1H), 5.74 (dt, J=15.3, 6.6 Hz, 1H), 5.63 (dt, J=13.2, 6.0 Hz, 1H), 4.74(dd, J=9.0, 5.4 Hz, 1H), 4.66 (dd, J=15.3, 5.4 Hz, 2H), 2.91 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.52 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.35-2.43 (m, 2H), 2.22-2.32 (m, 1H), 1.60-1.67 (m, 2H), 1.19-1.26 (m, 8H), 1.04 (t, J=6.3 Hz, 6H), 0.86 (t, J=6.9 Hz, 3H)。
동일한 방법으로 아래와 같은 화합물을 합성한다.
Figure pct00048
Figure pct00049
제조 실시예5 (화합물 번호 CFH325 -B)
Figure pct00050
화합물31(1g, 7.86mmol)을 건조한 DME(30mL)에 용해한 후 N2기체 보호하에Lawesson's 시제(1.6g, 3.9mmol)를 넣고 실온에서 12h 반응한 후 여과하고 용제를 제거한 후 EtOAc-hexane(PE/EtOAc=10:1-2:1)하여 화합물32(1.0g, 88.8%，백색고체) 을 얻고 직법 다음 반응에 사용한다.
화합물32(500mg, 3.49mmol)을 건조한 DME(30mL)에 넣고KHCO3(2.1g, 21mmol)을 가한 후 실온에서 10min 교반하고 트리플루오로아세트산앤하이드라이드(trifluoroacetic acid anhydride) (2.2g, 10.48mmol)과 2,6-2 메틸기피리딘(Dimethyl pyridine)(1.87g, 17.46mmol)의 DME(10mL)용액을 적가한 후 0℃에서 1h반응하고 실온까지 올려 하루밤 반응시킨다. TLC검측 화합물32 완전히 반응한 후 용액을 회전 건조한 후 EtOAc(50mL)희석한 후 유기상 각각1N염산(20mL), 포화탄산수소나트륨(20mL)과 포화식염수(20mL)로 세척하고 무수Na2SO4로 건조시키고 농축EtOAc-hexane(PE/EtOAc=4:1-2:1)하여 화합물34(647mg, 77.4%，담황색고체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.00 (s, 1H), 7.50 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.00 (dd, J=4.8, 3.9 Hz, 1H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 1.33 (t, J=7.2 Hz, 3H)。
화합물34(447mg, 1.87mmol)을 EtOH/H2O(20/5mL)에 용해시킨 후 0℃에서NaOH(149mg, 3.74mol)고체를 가하고 실온에서 교반하여 밤을 지낸다. 반응 완성후EtOH을 회전건조하고 H2O를 넣고 희석한 후 1N염산으로 pH=2까지 산화하고 EtOAc(20mL×3 차)추출 후 유기상 무수Na2SO4로 건조한후 농축하여 35(314g, 79.5%，백색고체)을 얻어 직접 다음 반응에 사용한다.
화합물35(110mg, 0.52mmol)을 건조한 DMF (5mL)에 용해시킨 후 어름욕에서 0℃까지 냉각 후 EDCI(150mg, 0.78mmol)과 HOBt(106mg, 0.78mmol)을 가하여 0℃에서10min 교반한 후 화합물18(96mg, 0.57mmol)과 i-Pr2NEt (134mg, 1.04mmol)을 가하여 상온에서 12h 교반한 후 물20mL넣어 희석하고 EtOAc추출(15mL×3 차)한 후 유기상 각기1N염산(15mL), 포화탄산수소나트륨용액(15mL)과 포화식염수(20mL)로 세척한 후 무수Na2SO4로 건조시키고 감압 회전으로 용제를 제거하고 규소EtOAc-hexane 정화(PE/EtOAc=2:1)하여 제품36(146mg, 86.4%，담황색유체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.95 (s, 1H), 7.47 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.39 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.03 (dd, J=5.1, 3.9 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.31 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.65-1.71 (m, 4H)。
수산화아민염산염(215mg, 3.1mmol)을 MeOH (15mL)에 띄우고 KOH (260mg, 4.65mmol)을 가한 후 5min교반하고 려과하여 불용용액을 제거한 후 여과액을 수집하여 준비해둔다. 화합물36(100mg, 0.31mmol)을 무수MeOH (10mL)에 용해한 후 상기 새로 제조한 하이드록실MeOH용액을 가하고 실온에서 1h 교반한다. TLC측정 반응을 완전히 진행한 후 EtOAc희석하고 1N염산으 로pH=5-6까지 중화한 후 MeOH을 감압농축하고 회전 건조하여 EtOAc추출(15mL×3 차)한후 포화식염수세척(10mL)와 무수Na2SO4로 건조한 후 농축하여 초품을 얻고 EtOAc-hexane 정화(CHCl3/MeOH=20:1-10:1)하여 CFH325-B(86mg, 86%，백색고체)을 얻는다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ8.09 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.66 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.14 (dd, J=3.9, 5.1 Hz, 1H), 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.16 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.68-1.71 (m, 4H)。
생물실험 실시예
실시예1: 히스톤 디아세틸라제1,3,6(HDAC1,3,6) 활성화 억제 실험.
1. 실험목적:
본 발명의 화합물인 인원(人源) 히스톤 디아세틸라제1,3,6의 활성을 억제하는 실험.
2. 원료
인원 HDAC1, HDAC3와 HDAC6, 간상병독 표달식계을 응용하여 얻는다.
3. 실험원리
Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC(HDAC1,3)와 Boc-lys(Ac)-AMC(HDAC6)을 밑물로 형광 검측법으로 96공 혹은 384공 평평한 밑바닥인 미공(微孔)판에서 효소 활성을 측정한다. 밑물은HDAC탈아세틸을 거친후 췌장효소 가수분해를 통해 얻은 AMC가 형광검측기의 355nm이 460nm를 격발하는 발사광하에 형광신호를 검측해 낼 수 있다. 측정 시간에 따라 변하는 형광신호를 통하여 반응 초속도를 계산해낸다.
4. 실험과정
샘플처리: 샘플을 DMSO에 용해시킨후 저온에서 보관한다. DMSO가 최종체계에서 측정활성을 영향하지 않는 범위에서 농도를 컨트롤 한다.
데이터 처리와 결과 설명: 처음 선택한 단일한 농도조건, 예를 들면 20㎍/ml 에서 샘플의 활성을 측정한다. 일정한 조건하에서 활성이 표현되는 샘플, 예를 들면 억제율%이 50보다 큰 조건에서 활성제 양의 의지관계, 즉IC50/EC50를 측정한다. 샘플의 활성을 통해 샘플 농도를 비선형 수학 모형으로 얻는다. 계산에 사용되는 소프트웨어는 Graphpad Prism 4이고 수학모형은 sigmoidal dose-response (varible slope)이다. 다수의 억제제 선택 모형은 수학모형 곡선의 저부와 정부를 각각 0과 100으로 설정한다. 일반적으로 매개 샘플 측정은 복공 (n≥2)을 설치하고 결과에서 표준편차(Standard Deviation, SD) 혹은 표준오차(Standard Error, SE)를 표시한다. 매차의 실험은 모두 이미 보도된 화합물SAHA(Vorinostat)을 참고로 한다.
5. 실험결과:
Figure pct00051
Figure pct00052
상기 실험결과로부터 R2부위의 변화, 생물결과로 부터 보면 알킬기, 일킬렌과 방향족치환은 모두 양호한 HDAC활성억제를 표현하였다. 치환기의 다양화는 화합물의 생물활성에 유리하다. Isobutenyl치환 화합물CFH395이HDAC1에 대한 활성억제가 제일 좋다. 화합물CFH355, CFH437, CFH417 은 선택적으로HDAC1(HDAC1/HDAC6=～30배) 를 억제한다. 동시에 화합물CFH355이 HDAC1와 HDAC3의 선택성은 8배이다.
화합물 활성이 나타내는 바와 같이 R2부위 치환기는 같고 Y는 -(C1-C10알킬기)-，사슬길이는 활성에 영향이 비교적 크다. 예를 들면 isobutenyl치환 일련의 화합물은 사슬길이가 7개 아메틸일 경우 HDAC1의 활성억제가 제일 좋다. 그러나 환프로필기 치환시 사슬길이는 6개 아메틸(methene)일 경우HDAC1의 활성 억제가 제일 좋다.
고정R2라디칼이소부틸 (isobutyl) 치환, 본 발명인은 측계열편단Y와 부동한Zn이온 킬레이션(chelation group) 기단(ZBG)에 대해 연구했다. HDAC1 억제 작용에 대해서는 ZBG가 히드록삼산일 경우 활성이 제일 좋다. α-sulfydryl ketone일 경우, 특별히 화합물 CFH398-S, 선택성적으로 HDAC6을 억제한다.
고정R2라디칼시클로프로필(cyclopropyl)치환R4b과 R5b치환과 HDAC 활성 억제 관찰을 통하여 R4b과 R5b이 C와 연결되여 륙원환을 형성한 경우, 즉 화합물 CFH421-C이 HDAC1에 대한 활성억제가 제일 강하고 선택적으로 HDAC1(HDAC1/HDAC6=～75배)을 억제함을 발견할 수 있다.
실시예2 : 세포수준 항 종양 활성 측정실험
1. 실험목적
본 발명의 화합물의 항종양 활성을 측정한다. 화합물이 인원 결장암HCT-116 세포주의 생장 활성 억제에 대한 측정을 통하여 화합물의 체외 항종양 활성을 평가한다.
2. 측정원리
MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) 색비교법을 사용한다. 이 분석방법은 대사 환원3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2와 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 기초로 한다. 산세포의 선입체중NADP상과 관계되는 탈수소효소는 황색 MTT를 환원하여 불용성 남자색의 포르마잔(Formazan)을 형성하고 죽은 세포 효소가 소실되고 MTT가 환원되지 않는다. DMSO로 Formazan을 용해한 후 효소표기기로 550/690nm파장처에서 광밀도를 측정한다.
3. 실험과정:
샘플처리: 샘플을 DMSO로 용해하고 저온에서 보존하며 DMSO가 최종체계에서 측정활성을 영향하지 않는 범위로 농도를 컨트롤 한다.
다음 MTT법을 사용하여 세포 생존율을 검측한다. 즉 짝수성장기에서 성장하는 세포를 0.05％의 췌효소로 소화시킨후 계산을 시작한다. 2.0×103/공의 세포밀도로 96공판100mL에서 접종한 후 5%CO2 배양함내에서 37℃로 밤을 지내며 배양한다. 매개 화합물을 6개 밀도경도로 설치하고 매개 농도를 삼복공으로 하고 매개 농도별로 대응되는 공에 가한 후 5% CO2 37℃ 배양함내에서 72시간 배양한 후 20 Ml의 5 mg/mL MTT을 넣는다. 37℃에서 3시간 부화한 후 표면에 뜨는 물질을 흡수해버리고100 mL의 DMSO용에 넣고 SpectraMAX 340을 사용하여 550 nm（L1） 광흡수치를 측정한다. 참고 파장은 690 nm（L2）, （L1- L2）치가 억제재의 부동한 농도에 따라 그림을 그리고 공식으로 수학모형을 하여IC50를 얻는다.
데이터 처리와 결과 설명: 처음 선택한 단일한 농도조건, 예를 들면 20 ㎍/ml 에서 샘플의 활성을 측정한다. 일정한 조건하에서 활성이 표현되는 샘플, 예를 들면 억제율%이 50보다 큰 조건에서 활성제 양의 의지관계, 즉 IC50/EC50를 측정한다. 샘플의 활성을 통해 샘플 농도를 비선형 수학 모형으로 얻는다. 계산에 사용되는 소프트웨어는 Graphpad Prism 4이고 수학모형은 sigmoidal dose-response (varible slope)이다. 다수의 억제제 선택 모형은 수학모형 곡선의 저부와 정부를 각각 0과 100으로 설정한다. 일반적으로 매개 샘플 측정은 복공 (n=2)을 설치하고 결과에서 표준편차(Standard Deviation, SD) 혹은 표준오차(Standard Error, SE)를 표시한다. 매번 측정은 모두 독소루비신(doxorubicin)을 참고로 한다.
4. 실험결과:
4.1 화합물이HCT-116인 결장암세포주에서의 활성결과:
Figure pct00053

4.2 화합물이BxPC-3인 췌선암세포주에서의 활성결과
Figure pct00054

4.3: 화합물이 기타 종양세포주에서의 활성결과
Figure pct00055
5. 결론: HDAC1의 활성을 억제하는 화?물이 모두 양호한 종양세포 번식활성을 억제작용을 나타낸다. 특별히 결장암, 췌선암, 페선엄, 유선암 등에 좋은 작용을 한다. 종양세포주의 생장활성에 대한 억제로 보면 화합물이 세포에서의 활성은 기본적으로 효소와 일치하다.
실시예3 : HDAC 억제제가 다발성 경화증( MS ) 치료약물로 사용
1. 실험방법과 결과:
HDACi CFH367-C는 EAE의 임상평가를 효과적으로 완화한다. 본 발명인은 8주의 자성C57작은 쥐에 100㎕ 프로인트 완전아쥬반트유화(Freund's complete adjuvant emulsion)의 MOG35 -55(150㎍/개)와 열불활성의MT독소(5mg/mL) 를 피하주사한 후 그날과 제삼일에 두번 복강 주사PTX(200ng/개/차，PBS용해)를 진행한다. 면역후 제삼일차에 약을 위관영양법으로 먹이는데 매일 2차, 매차에 양은 10mg/kg체중이다. 매일 작은 쥐를 관찰하면서 아래의 평가표준으로 평가한다. 0점: 발병 징조가 없다; 꼬리부가 힘이 없거나(0.5점) 반신불치(1점); 사지가 힘이 없거나(0.5점) 반신불치(1점). 상기 점수를 가한 후 최종 점수를 얻는다. 결과는 도 1과 같다. CFH367-C는EAE의 임상증상에서 양호한 치료효과를 보이고 치료세트 쥐의 질병의 엄중한 정도가 용기 대조세트(P <0.01)보다 많이 낮다.
HDACi CFH367-C이 EAE동물 척수의 탈수초 증상을 뚜렷이 감소한다. 정상 대조용, EAE(실험성 자가 면역성 최척수염) 및 EAE치료세트의 작은 쥐 척수세플을 취하여 고정후 일반적인 파라핀에 싸맨후 5미크로으로 조각내고 탈랍수화하여 95％알콜로 한후블루(luxol fast blue) 로 염색후 56도에서 밤을 지낸다; 95%알콜로 씻고 물로 씻은 후 0.05％탄산리튬용액으로 분색한 후 70%알콜로 두 번 씻고 증류수로 씻은 후에 오신으로 2분간 염색한 후 경도 에탄올로 탈수 한 후 두 메틸기로 투명화하고 중성풀로 조각을 봉한다. 블루염색하는 부위는 주요하게 척수백질로서 주요하게 신경섬유와 수초로 조성된다. 실험결과 정상적인 작은쥐의 백질은 남색으로 염색되고 그 구조가 비교적 긴밀해진다. 그러나 EAE작은쥐의 척수백질구역은 대량의 거품이 나타나고 염색정도가 떨어지고 엄중한 탈수초현상이 나타난다. 그러나CFH367-C을 먹인 작은쥐의 척수백질구조는 긴밀하고 염색이 균일하고 정상적인 대조 쥐의 수준에 이르며 치료효과가 선명하다.
HDACi CFH367 -C은 EAE 동물 척수중 외주 면역세포의 침투현상을 뚜렷히 감소한다. 정상 대조용, EAE및 EAE치료세트의 작은 쥐 척수세플을 취하여 고정후 일반적인 파라핀에 싸맨후 5미크로으로 조각내고 두 메틸로 탈랍한후 부동한 에틸알콜로 복수후 헤마톡실린(hematoxylin)로 5분간 염색후 수돗물로 씻고 염산으로 분색한 후 다시 수돗물로 씻은 후 에오신으로 2분간 염색하고 경도 에탄올로 탈수 한후 두 메틸기로 투명화하고 중성풀로 조각을 봉한다. 실험결과는 정상 작은 쥐의 척수는 거의 침투되어 외주면역세포가 없다. 그러나 EAE작은 쥐의 척수 백질구역은 대량의 외주면역세포 침투를 발견할 수 있으며 부속조직 손상을 초래하며 거품이 나타난다. 그러나 CFH367-C를 먹인 작은 쥐의 척수백질구조는 긴밀하고 선명한 외주면역세포침투 현상이 없으며 선명한 치료작용을 나타낸다.
HDACi CFH367 -C는 EAE 동물 척수중CD45양성백세포의 침투현상을 뚜렷이 감소한다. 작은 쥐의 척수를 취하여 고정후 OCT로 싸맨 후 10㎛냉동조각을 낸다. 조각을 PBS로 매번 5분씩 세번 씻고 항CD45의 항체(일항)으로 4℃에서 밤을 지내면서 부화한다; PBS로 세번 씻고 형광표기가 있는 이항(二抗)으로 37℃에서 1h염색한 후PBS로 세번 씻고 글리세린로 봉한다. CD45는 백세포 공동항원으로서 실험결과는 세포핵염색후 EAE실험 작은 쥐의 척수중 대량의 세포가 밀집되며 대부분은 CD45양성 백세포이다. 이 현상은 정상 작은 쥐에는 존재하지 않지만 CFH367C약을 먹인 작은 쥐에도 CD45양성백세포의 밀집현상을 발견할 수 없으므로 CFH367-C는 백세포가 EAE작은 쥐의 척수의 침투현상을 억제할 수 있다.
HDACi CFH367 -C가 EAE 동물 척수중CD4 양성T세포의 침투현상을 뚜렷이 감소한다. 앞 연구에서 CD4양성T세포가 EAE발병에 대해서 중요한 작용을 한다. 본 발명인은 약물이 CD4양성T세포침투 작용을 관찰했다. 작은 쥐의 척추를 취하여 고정한 후OCT로 싸맨 후 10㎛냉동조각을 낸다. 조각을PBS로 매번 5분씩 세번 씻고 항CD45의 항체(일항)으로 4℃에서 밤을 지내면서 부화한다; PBS로 세번 씻고 형광표기가 있는 이항(二抗)으로 37℃에서 1h염색한 후 PBS로 세번 씻고 글리세린로 봉한다. 실험결과 세포핵염색후 EAE실험 작은 쥐의 척수 중 대량의 세포가 밀집되고 대부분은 CD4양성T세포이다. 이 현상은 정상 작은 쥐에는 존재하지 않는다. 그러나 CFH367-C약을 먹인 EAE 작은 쥐의 척수중CD45양성T세포의 침투와 밀집이 뚜렷이 감소한다.
2. 결론:
히스톤 디아세틸라제제제CFH367-C는 MS의 실험용 작은 쥐모형의 EAE임상 증상을 유효적으로 완화한다. EAE작은 쥐의 척수염색 실험으로부터 보면 CFH367-C은 외주 면역 세포 특별히 CD4양성T세포는 작은 쥐의 중수신경계통 시트템의 침투를 억제하고 EAE동물 신경원의 탈수초 현상을 감소하며 EAE임상 표현을 완화할 수 있다. 본 연구결과 히스톤 디아세틸라제제제CFH367-C 는 MS질병의 치료에 사용될 수 있고 널리 보급 응용 될 수 있으며 기타 자가면역질병 풍습성 관절염, 마른버짐, 계통성 홍반성 낭창 등을 치료할 수 있다.

Claims (11)

  1. 일반식이 Ⅰ와 같은 사이어졸계 화합물에 있어서,
    Figure pct00056

    상기 식중 R1는 R1a , R1b 혹은 R1c이고;
    Figure pct00057

    R4a와 R5a는 각자 독립적으로 A 혹은 Boc가 보호하는 아미노기C1-C6알킬기이고,
    R4b와 R5b는 각자 독립적으로 A에서 선택거나 혹은 R4b, R5b와 상기 R4b, R5b와 연결되는 C와 같이 3-10원환(ring) 혹은1-3개N, O와 S에서 선택된 잡원자가 함유된 3-10원잡환(heterocyclic)이고;
    R4c, R5c와 R6는 각자 독립적으로 A에서 선택하는데;
    상기 A는 아래의 라디칼(radical)중의 하나이다：H, 할로겐(halogen), 하이드락시 (hydroxy), 니트로기(nitryl), C3-C6사이클로 알킬기(cyclo alkyl), C1-C6알콕시(alkoxy), C6-C10아릴(aryl) 치환 C1-C6알콕시, 아미노기, C1-C6알킬아미노기(Alkylamino), C6-C10알릴 치환C1-C6알킬아미노기, C1-C6알킬기(alkyl), 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, C1-C4알콕시 치환 C1-C6알킬기, 불소 치환 C1-C6알킬기, C6-C10알릴 치환 C1-C6알킬기, C2-C6사슬알켄닐기(alkeny), 하이드락시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C1-C4알콕시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, 알켄닐기, 불소 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C6-C10아릴이 치환 C2-C6사슬알켄닐기, C2-C6사슬알키닐기, 하이드락시 치환 C2-C6사슬알키닐기(alkyny), C1-C4알콕시 치환 C2-C6사슬알키닐기, 불소가 치환C2-C6사슬알키닐기, C6-C10아릴 치환 C2-C6사슬알키닐기, C6-C10아릴, 5-7원잡 아릴이다; 상기 5-7원잡아릴에는 1-3개의 N,O와 S에서 선택된 잡원자가 함유되고;
    R2는 아래 라디칼중의 하나이다: H，할로겐 원자, 하이드락시, C1-C6알콕시, C6-C10아릴 치환 C1-C8알콕시, 아미노기, C1-C6알킬아미노기, C6-C10아릴 치환 C1-C6알킬아미노기, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, C1-C6알킬기 치환 C3-C6사이클로 알킬기, 하이드락시; C1-C4알콕시 혹은 할로겐 원자 혹은 벤질기 혹은 C6-C10아릴 치환 C1-C6알킬기 혹은 C2-C8사슬 알켄닐기중에서 임이로 선택; 하이드락시 혹은C1-C4알콕시 혹은 할로겐 원자 혹은 C6-C10아릴치환 C2-C6사슬 알켄닐기 혹은C2-C6사슬알킬기 중에서 임이로 선택; 하이드락시 혹은C1-C4알콕시 혹은 불소 원자 혹은 C6-C10아릴 치환 C2-C8사슬알키닐기 혹은C6-C10알릴중에서 임이로 선택; 불소 원자 혹은 니트로기 치환 C6-C10아릴, 5-7 원잡아릴；상기 5-7원잡 알릴에는 1-3개 N, O와 S에서 선택된 잡원자가 포함되고;
    n은 0, 1혹은 2이고；
    X는 -N(R7)- 혹은
    Figure pct00058
    ,그중 R7 는 H 혹은 C1-C6알킬기에서 선택되고;
    Y는 존재하지 않거나 혹은 -(C1-C10알킬기)-, -(C2-C9사슬알켄닐기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)-, -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-, -(C3-C6사이클로 알킬기)-, -(C1-C5알킬기)-C(O)-NH-(C1-C5알킬기)-, -(C1-C5알킬기)-C(O)-O-(C1-C5 알킬기)- 혹은 -(C1-C5알킬기)-C(O)-O-(C2-C9사슬알켄닐기)-이고;
    R3는 R3a, R3b, R3c, R3d 혹은 R3e이고;
    Figure pct00059

    그중 R8는 H 혹은 C1-C6알킬기 카보닐기(carbonyl)이며
    R9는 H 혹은 C1-C10알킬기 카보닐기이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    일반식 Ⅰ중:
    R2는 아래 라디칼중의 하나이다: H, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, 임이로 하이드락시 혹은 벤질기(benzyloxy) 혹은 C6-C10아릴 치환 C1-C6알킬기, C2-C8사슬알켄닐기 혹은C6-C10아릴에서 선택하고, 임이로 불소 원자 혹은 니트로기 치환 C6-C10아릴에서 선택；
    n는 0이고；
    X는 -NH-이고；
    Y는 -(C1-C10알킬기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)- 혹은 -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-이고；
    R8는 H。인 사이어졸계 화합물.
  3. 제 1항에 있어서,
    일반식Ⅱa, Ⅱb 혹은 Ⅱc：
    Figure pct00060

    그중：
    R2, X, Y와 R3의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같으며 ;
    R4a과 R5a는 각자 독립적으로 H, C1-C6알킬기 혹은 Boc가 보호하는 아미노기C1-C6알킬기이거나；
    혹은，
    Figure pct00061

    그중 ：
    R2, X, Y과 R3의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같으며;
    R4b과 R5b는 각자 독립적으로 H, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기 혹은 C6-C10아릴이거나 R4b, R5b와 연결된 C와 R4b, R5b이 같이 형성된 3-10원환이고;
    혹은,
    Figure pct00062

    그중,
    R2, X, Y와 R3의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같으며;
    R4c과 R5c과 R6는 각자 독립적으로 H 혹은 C1-C6알킬기인 사이어졸계 화합물.
  4. 제 1항에 있어서,
    일반식 Ⅳ:
    Figure pct00063

    그중 R2, R4b, R5b과 Y의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같은 사이어졸계 화합물.
  5. 제 4항에 있어서,
    R2은 H, C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, C1-C6알킬기 치환 C3-C6사이클로 알킬기, C2-C8사슬알켄닐기, 하이드락시 치환 C2-C8사슬알켄닐기, C6-C10아릴, C6-C10아릴 혹은 벤질기 치환 C1-C6알킬기, C6-C10아릴 치환 C2-C8사슬알켄닐기, C6-C10아릴이 치환 C2-C8알콕시, 할로겐이 치환 C6-C10아릴 혹은 니트로기 치환 C6-C10아릴이고；
    R4b과 R5b는 각자 독립적으로 H, F, C1-C6알킬기, 하이드락시 치환 C1-C6알킬기, 불소 치환 C1-C6알킬기, C3-C6사이클로 알킬기, C2-C6사슬알켄닐기, 하이드락시 치환 C2-C6사슬알켄닐기, 불소 치환 C2-C6사슬알켄닐기 혹은 C6-C10아릴이거나 혹은 R4b, R5b와R4b, R5b와 연결된 C와 같이 형성된 3-10원환 혹은 1-3개 N, O와 S중에서 선택된 잡원자의 3-10원잡환이 함유되고；
    Y는 -(C1-C8알킬기)-, -(C6-C10아릴)-, -(C1-C6알킬기)-(C6-C10아릴)- 혹은 -(C6-C10아릴)-(C2-C6사슬알켄닐기)-인 사이어졸계 화합물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 구체적으로 :
    Figure pct00064

    Figure pct00065

    Figure pct00066

    Figure pct00067

    Figure pct00068

    Figure pct00069

    Figure pct00070

    Figure pct00071
  7. 제1청구항에서 서술한 사이어졸계 화합물의 제조방법에 있어서 아래의 노선1~노선5 중의 임의의 한가지로 실현한다.
    노선1 :
    Figure pct00072

    그중 R1, R2, n, X와 Y의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같고 ,
    화합물 1과 활성화 Zn분말이 THF에서 형성된 화합물2, 화합물2와 2-브롬 치환 사이어졸 화합물3이 팔라듐아세테이트(Palladium acetate)와 트리페닐포스핀(Triphenylphosphine)의 촉매작용하에 톨루엔(toluene)에서 Negishi카플링(coupling)반응을 통해 화합물4를 얻고, 화합물4는 수산화나트륨/메틸알코올-물체계중 물분해한 후 대응되는 산5를 얻고 화합물5와 부동한 친핵시제(Nucleophiles)HX-Y-COOMe가 축합제 EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응하여 화합물6을 얻고, 화합물6과 새로 제조한 수산화아민의 메틸알콜용액에서 반응하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ a 을 얻고;

    노선2 :
    Figure pct00073

    그중 R1, R2, R8, n, X와 Y의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같고,
    화합물6이 메틸알콜 혹은 THF/물체계에서 염기물분해를 통하여 화합물Ⅰ e 을 얻고 화합물Ⅰ e 와 담 Boc가 보호하는 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)이 합축제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 합축반응을 통하여 화합물7을 얻고 화합물7이 염산초산에틸에스테르용액의 작용하에 Boc보호기를 제거하고 본 발명이 상기한 사이어졸화합물Ⅰ b 을 얻고 혹은 화합물7과 부동한 친핵시제R8H와 반응하여 본 발명이 상기한 사이어졸계 화합물Ⅰ b 을 얻고;

    노선 3:
    Figure pct00074

    그중 R1, R2, n, X과 Y의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같고,
    화합물5와 부동한 친핵시제 HX-Y-NHCOCH2STrt가 축합제 EDCI, DMAP가 염기로 작용하는 조건하에 이염소메탄에서 축합반을을 일으켜 화합물8을 얻고 화합물8이 삼불소초산 조건하에서 보호기를 제거하고 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ c 얻고;

    노선 4:
    Figure pct00075

    그중 R1, R2, R9, n, X와 Y의 정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같고,
    화합물5와 부동한 친핵시제HX-Y-SR9이 축합제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응을 통하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅰ d 얻고;

    노선 5:
    Figure pct00076

    그중 R2, R3, R4c, R5c, R6, n, X와 Y정의는 제1청구항에서 서술한 바와 같고,
    화합물9는 Lawesson?시제의 작용하에 화합물10을 형성하고 화합물10은 부동한 R2치환Ethyl bromopyruvate 가 Hantzsch반응을 통해 사이어졸환을 만들어 화합물11을 얻고, 화합물11은 메틸알골/물체계에서 염기성조건하에 물분해를 통해 화합물12를 얻고 화합물12와 부동한 친핵시제HX-Y-R3가 축합제EDCI, HOBt, i-Pr2Net의 작용하에 DMF에서 축합반응을 통하여 본 발명의 상기 사이어졸계 화합물Ⅱ c 을 얻는다.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 사이어졸계 화합물이 히스톤디아세틸라제(HDAC) 억제제의 약물을 제조하는 과정에서의 용도.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 사이어졸계 화합물이 항종양 약물을 제조하는 과정에서의 용도.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 종양은 결장암, 췌선암, 백혈병, 페암, 혹은 유선암이다.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 사이어졸계 화합물이 다발성 경화증 치료 약물을 제조하는 과정에서의 용도.
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